DE3587541T2

DE3587541T2 - Stabilisierung von Vesikeln.

Info

Publication number: DE3587541T2
Application number: DE85303676T
Authority: DE
Inventors: Tin George Wing-Yiu
Original assignee: Vestar Inc
Current assignee: Nexstar Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1984-05-25
Filing date: 1985-05-24
Publication date: 1993-12-23
Anticipated expiration: 2005-05-25
Also published as: CA1263311A; IE851306L; IL75315A; IE61706B1; ES8608862A1; ATE93387T1; ES543495A0; EP0162724A2; DK234185A; JPS60258109A; DK234185D0; EP0162724B1; DK164483C; KR850008450A; AU576363B2; EP0162724A3; AU4285685A; DE3587541D1; DK164483B; JPH0696515B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Stabilisierung von Vesikeln, und insbesondere eine Stabilisierung durch Suspendieren micellarer Partikel, wie z. B. Vesikel, in einer polymeren Gelmatrix.

Beschreibung des Standes der Technik

Die Verwendung micellaler Partikel, wie z. B. von Phospholipidvesikeln (oder Liposomen, wie sie allgemein bezeichnet werden) als Träger für pharmazeutische und diagnostische Mittel, war Gegenstand intensiver Untersuchungen; B.E. Ryman, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 308, 281 (1978); G. Gregoriadis, Herausgeber, "Liposome Technology", CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, Band II (1984); J.H. Fendler, Acc. Chem. Res., 13, 7 (1980); und J.N. Weinstein, et al., Science, 204, 188 (1979). Beispiele einer möglichen Verwendung von Phospholipidvesikeln beinhalten Erwägungen, sie als Träger für Enzyme, Arzneimittel (insbesondere Antitumormittel), Geliermittel, Hormone, Radionuklide, zellmodifizierende Substanzen, Antigene, Antikörper, Interferon-Inducer und Virus-Untereinheit-Teilchen zu verwenden. Liposome (insbesondere kleine beschallte Vesikel) sind jedoch bei Temperaturen unterhalb der Phasenübergangstemperatur nicht stabil und tendieren dazu, zu aggregieren oder zu verschmelzen, um bei einer Langzeitlagerung größere unilamellare Vesikel zu bilden; M.P. Sheetz, et al., Biochemistry, 11, 4573 (1972); R.L. Lawaczeck, et al., Biochem. Biophys. Acta, 443, 313 (1976); H.L. Larrabee, Biochemistry, 18, 3321 (1978); und S.E. Shullery, et al., Biochemistry, 19, 3919 (1980).
Die Aggregation oder Verschmelzung kleiner Teilchen zu größeren Teilchen verändert die Eigenschaften der Vesikel, die ihrerseits die Permeabilität der Vesikel und die in vivo Bioverteilung modifizieren können; Y.J. Kao, et al., Biochem. Biophys. Acta., 677, 453 (1981); R.M. Abra, et al., Biochem. Biophys. Acta., 666, 493 (1981). Es ist deshalb außerordentlich wichtig, micellare Partikel lagern zu können, ohne daß sich die Partikel mit dem Resultat einer potentiellen Veränderung wichtiger Erscheinungen aggregieren oder zusammenschmelzen.

Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die vorstehend genannte Aggregation oder Verschmelzung dadurch vermieden, daß man die Phosphorlipidvesikel in einer polymeren Gelmatrix lagert. Die Matrix kann eine natürliche oder synthetische Matrix sein, die bei niederen Temperaturen geliert und dazu fähig ist, beim Schmelzen bei Raumtemperatur oder einer höheren Temperatur flüssig zu werden. Beispiele geeigneter Materialien sind Polysaccharide und Polypeptide. Bei Lagerung bei niedrigeren Temperaturen verfestigt sich das Gel und schränkt die Bewegung der Teilchen ein. Dies verringert oder verhindert die Aggregation oder das Verschmelzen.
Auf diese Weise bleiben die Größe und die Eigenschaften der Phospholipidvesikel während der Lagerung gleich, solange das Gel im verfestigten Zustand verbleibt. Bei Raumtemperatur oder höher wird das Gel jedoch schmelzen, und die Vesikel werden in ihre ursprüngliche Form als Suspension in einem wäßrigen Medium zurückkehren, die auf gleiche Weise wie frisch hergestellte Vesikel für Injektionszwecke oder eine andere Anwendung ohne Veränderung signifikanter Eigenschaften oder der in vivo-Bioverteilung verwendet werden kann.
Beispiele für Vesikel, auf die die vorliegende Erfindung anwendbar ist, sind Phospholipide, wie z. B. Distearoylphophatidylcholin (DSPC), Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), und Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC) und natürliche Phospholipide, wie z. B. Eilecithin und Sojabohnenlecithin. Die Vesikel können auch ein therapeutisches Mittel, wie z. B. ein Antibiotikum, eingeschlossen enthalten, und die Vesikel können, wie dies in den folgenden Ausführungsbeispielen gezeigt wird, nach Lagerung mit einem Radionuklid, wie z. B. ¹¹¹In, markiert sein.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Definitionen und Abkürzungen

Die hier verwendeten Ausdrücke "micellare Partikel" und "Micellen" beziehen sich auf Teilchen, die aus Aggregationen amphiphiler Moleküle stammen, und Lipide, die vorzugsweise biologische Lipide sind.
"Vesikel" bezeichnet eine Micelle mit einer im allgemeinen kugelförmigen Gestalt, die oft aus einem Lipid, das eine zweischichtige Membran bildet, erhalten wird, und als "Liposom" bezeichnet wird. Verfahren zur Bildung solcher Vesikel sind aus dem Stand der Technik gut bekannt; typischerweise werden die Vesikel aus einem Phospholipid, z. B. aus Distearoylphosphatidylcholin oder Lecithin, hergestellt, und können andere Materialien, wie z. B. neutrale Lipide und Oberflächenmodifikationsmittel, wie z. B. positiv oder negativ geladene Verbindungen, Antigene, Antikörper, Saccharide und Lectine einschließen. Abhängig von den Herstellungsmethoden kann das Vesikel eine einfache zweischichtige kugelförmige Schale sein (ein unilamellares Vesikel) oder mehrere Schichten besitzen (multilamellare Vesikel).
DSPC - Distearoylphosphatidylcholin
Chol - Cholesterin
DPPC - Dipalmitoylphosphatidylcholin
DMPC - Dimyristoylphosphatidylcholin
DTPA - Diethylentriaminpentaessigsäure
EDTA - Ethylendiamintetraessigsäure
SUV - kleine unilamellare Vesikel

Material und Verfahren zur Herstellung von Micellen

L - Distearoylphosphatidylcholin (DSPC) von Calbiochem und Cholesterin (Chol) von Sigma wurden ohne weitere Reinigung verwendet. Cholesterinoleat [Oleat-1-¹&sup4;C] (spezifische Aktivität 51 Ci/mol) und ¹&sup4;C- Ethylendiamintetraessigsäure [Acetic 2-¹&sup4;C] (EDTA); spezifische Aktivität 4,28 mCi/mmol) wurden von New England Nuclear bezogen. Das Natriumsalz von Nitrilotriessigsäure (NTA) und EDTA wurden von Baker Chemical Company bezogen. Radiochemisches ¹¹¹InCl&sub3; (Reinheitsgrad für Forschungszwecke) wurde von Medi-Physic bezogen und ohne Reinigung verwendet. Ionophon A23187 wurde von Calbiochem bezogen. Agarose (Typ IX) wurde von Sigma erhalten, und Gelatine (Knox-Gelatine) wurde kommerziell bezogen. Agarose ist die neutrale gelierende Fraktion des Polysaccharidkomplexes, Agar, extrahiert von den Agarocyten von Rhodophycae-Mgen, während Gelatine eine heterogene Mischung aus wasserlöslichen, von Kollagen abgeleiteten Proteinen mit hohem Molekulargewicht ist. BDFI-Mäuse wurden von Simonson Laboratories (Gilroy, CA) erhalten.

Herstellung und Beschickung der Vesikel

Es wurden kleine unilamellare Vesikel hergestellt und gemäß dem Verfahren von Mauk und Kollegen, M.R. Mauk & R.C. Gamble, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 76, 765 (1979) beschickt. Durch Mischen von DSPC, Chol und A23187 im Molverhältnis 2 : 1 : 0,004 wurde eine Lipidmischung hergestellt. Die Lipidmischung wurde im Vakuum über Nacht getrocknet und dann in einer Phophatgepufferten Salzlösung (PBS, pH = 7,4), die 1 mM NTA enthielt, oder wie anders angegeben, beschallt. ¹&sup4;C- oder ³H-Cholesterinoleat war als Marker für die Lipidphase enthalten. Nach Beschallung, Tempern (annealing) und Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit wurden die Vesikel vom überschüssigen NTA abgetrennt, indem sie über eine Sephadex G-50-Säule, mit PBS equilibriert, geleitet wurden.
Durch Zugabe des Radionuklids zur Vesikelzubereitung und Inkubieren bei 80ºC während 45 Minuten wurden die Vesikel mit ¹¹¹InCl&sub3; beschickt. Nach Inkubation wurde überschüssiges EDTA zugegeben, um mit freiem ¹¹¹In an der Oberfläche des Vesikels oder in der Lösung zu komplexieren. Dieser freie ¹¹¹In-EDTA-Komplex wurde dann von den beschickten Vesikeln durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex G-50 abgetrennt.

Dynamische Lichtstreuungsmessungen

Die Vesikelgröße wird durch dynamische Lichtstreuung gemessen, der das Zeitverhalten der Schwankungen in der Streuungsintensität zugrunde liegt; S Frokjaer, et al., Alfred Benzon Symp., 17, 384 (1982). Wenn die Partikel eine kontinuierliche Brownsche Bewegung durchführen, tritt eine große Schwankung der Streuungsintensität von 0 (vollständige löschende Interferenz) bis zu einem Maximalwert (keine Interferenz) auf. Der Diffusionskoeffizient der diffundierenden Partikel steht in Beziehung zur mittleren Dauer der Schwankung in der Intensität des gestreuten Lichtes. Je größer die Partikel sind, umso geringer ist im allgemeinen die Diffusion, und umso größer die Dauer der Schwankung. Für kugelförmige Partikel (wie z. B. Liposomen) steht der Diffusionskoeffizient (D) mit dem hydrodynamischen Radius (rh) über die Stokes-Einstein Beziehung zusammen: D = kB T/6 rh, worin kb die Boltzmann-Konstante ist, T die absolute Temperatur ist und die Viskosität des Lösungsmittels ist. In reinen 6 · 50 mm-Teströhrchen wurde eine verdünnte Probe der Vesikelsuspension in gefiltertem PBS hergestellt. Die Lichtstreuungsmessung wurde mit einem NiComp-Modell TC-200 Autokorrelations-Teilchengrößenanalysator (NiComp model TC-200 computingautocorrelator particle sizer) durchgeführt. Das Instrument ist mit einem 64-Kanal 4-Bit-Autokorrelator und einem 5 mW He-Ne-Laser mit niedrigem Geräuschpegel ausgestattet.

Beispiel I

Gemäß dem beschriebenen Verfahren wurden kleine unilamellare Vesikel (SUV) aus DSPC und Chol im Molverhältnis 2 zu 1 hergestellt. Als Lipidmarker wurde ¹&sup4;C-Cholesterinoleat eingeschlossen. Nach Beschallung, Annealing und Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit wurden die Vesikel in einem sterilisierten Glasgefäß entweder mit Gelatine oder Agarose gemischt, um eine Endkonzentration von (1) 10 mg SUV pro ml 1%iger Gelatinelösung; (2) 35 mg SUB pro ml 1%iger Gelatinelösung; oder (3) 10 mg SUV pro mi einer 1%igen Agaroselösung zu ergeben. Alle Glasgefäße wurden dann in einem Kühlschrank bei 4ºC gelagert. Zu verschiedenen Zeiten nach der Herstellung wurden Proben der Vesikel mit verschiedener Konzentration oder verschiedenem polymeren Medium bei Raumtemperatur geschmolzen. Es wurden verdünnte Proben dieser Vesikel in PBS hergestellt und die Größe mittels Laserlichtstreuung, wie im Verfahrensabschnitt beschrieben, gemessen. Wie die Fig. 1 zeigt, blieb die Größe unverändert, wenn die Vesikel entweder in der Gelatine- oder Agarosematrix gelagert wurden. Die Vesikel in PBS aggregierten oder verschmolzen dagegen innerhalb einer kurzen Zeit nach der Herstellung.

Beispiel II

Im vorhergehenden Beispiel wird gezeigt, daß die Größe der Vesikel in einer polymeren Matrix während eines längeren Zeitraums unverändert bleibt. Vom pharmazeutischen Gesichtspunkt aus betrachtet ist es jedoch auch sehr wichtig, daß das Liposom das eingeschlossene Material während einer angemessenen Lagerzeit innerhalb der Vesikel zurückhält. Dieses Beispiel zeigt, daß in einem Vesikel in einem 1%igen Gelatinemedium bei 4ºC kein Austritt des eingeschlossenen Materials erfolgt.
1 mM ¹&sup4;C-EDTA in PBS wurden mit DSPC und Chol (2 : 1), das mit einer Spur ³H-Cholesterinoleat markiert war, beschallt. Das freie, nicht eingekapselte EDTA wurde vom eingeschlossenen Material durch Hindurchlaufenlassen durch eine Sephadex G-50-Säule abgetrennt. Die SUVs mit eingeschlossenem ¹&sup4;C-EDTA wurden dann mit Gelatine auf eine Endkonzentration von 10 mg/ml 1%iger Gelatinelösung gemischt und bei 4ºC gelagert. Der Austritt von eingeschlossenem EDTA als Funktion der Zeit kann durch die Abnahme des Verhältnisses von ¹&sup4;C zu ³H verfolgt werden. Wie die Tabelle 1 zeigt, blieb nicht nur die Größe der Vesikel unverändert, sondern auch das in der Vesikelstruktur enthaltene Material blieb während der Lagerung eingeschlossen. TABELLE I Stabilisierungseffekt von Gelatine auf die Größe und das in Vesikeln eingeschlossene Material Tage nach der Herstellung Größe A

Beispiel III

Um die physikalischen Eigenschaften der Vesikel nach Lagerung weiter zu veranschaulichen, wurden in einer Gelmatrix gelagerte Vesikel mit radioaktivem ¹¹¹In beschickt. Zur Messung der Unversehrtheit der Vesikel nach der Beschickung wurde ein Gammastrahlen-gestörtes Winkelkoinzidenz-Spektrometer (gamma-ray perturbed angular coincidence spectrometer) (PAC) verwendet; K.J. Kwang & MIR. Mauk, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 74, 4991 (1977); und C.F. Meares & D.G. Westmoreland, Cold Spring Harbor Symp. Quart. Biol., 36, 511 (1971). Das Spektrometer mißt die Umdrehungskorrelationszeit (rotational correlation time) von ¹¹¹In, in der die Korrelationszeit in Beziehung zur Taumelrate (tumbling rate) des Radionuklids steht. Wenn das ¹¹¹In innerhalb der Vesikel eingeschlossen ist, zeigt es aufgrund seiner Bindung an den kleinen Chelator innerhalb der Vesikel eine hohe Taumelrate (hohes G&sub2;&sub2;). Sobald die Vesikel jedoch zerstört ist (z. B. bei Zerstörung durch Zugabe von Isopropanol), oder das eingeschlossene Material aus der Vesikel auf andere Weise austritt, bindet es an irgendein in der Umgebung vorhandenes Protein, was die Taumelrate merklich verringert. Aus den nachfolgenden Angaben ist es ersichtlich, daß 1 und 20 Tage alte DSPC und Chol (2 : 1)- Vesikel, gelagert in 1% Gel bei 4ºC, Eigenschaften besitzen, die mit frisch hergestellten Vesikeln nach der Beschickung vergleichbar sind. Der G&sub2;&sub2;-Wert bleibt mit und ohne Serum der gleiche, was anzeigt, daß die lange Lagerung keine schädliche Wirkung auf die Membran der Vesikel hat. TABELLE II (G&sub2;&sub2;) 1 Tag alte Vesikel, gelagert in 1% Gel bei 4ºC 20 Tage alte Vesikel, gelagert in 1% Gel bei 4ºC frisch hergestellte Vesikel Vesikel+PBS Vesikel+Serum Vesikel+Serum+Isopropanol

Beispiel IV

Um schließlich die Bedeutung der Aufrechterhaltung der Vesikelgröße zu unterstreichen, wurde die Bioverteilung dieser gealterten Vesikel in tumortragenden Mäusen untersucht. DSPC, Chol (2 : 1)-Vesikel mit 1 mM NTA wurden in einer 1%igen Gelatinelösung bei 4ºC gelagert. Zu bestimmten Zeiten nach der Herstellung wurde die Gelmatrix bei Raumtemperatur geschmolzen. Die in dieser wäßrigen Lösung suspendierten Vesikel wurden dann wie vorstehend beschrieben beschickt. Nach der Beschickung wurde 1 mg der beschickten Vesikel in BDFI-Mäuse mit einem 6-8 Tage alten Lewis- Lungenkarzinom injiziert. Die Mäuse wurden dann 24 Stunden nach der Injektion getötet. Durch Gammazählung wurde die Bioverteilung der injizierten Vesikel als Radioaktivitätsmenge pro Gramm Gewebe berechnet. Die Bioverteilung dieser gealterten Vesikel wurde mit der Bioverteilung von frisch hergestellten Vesikeln im gleichen Mäusestamm verglichen. Es wurde kein signifikanter Unterschied (Student t test, p 0,001) zwischen den frisch hergestellten Vesikeln und den Vesikeln in Gelatine festgestellt, wie dies in Tabelle III angegeben ist. TABELLE III Bioverteilung von In-NTA-enthaltenden Vesikeln in Tumormäusen Tage nach der Herstellung % injizierte Dosis/g Gewebe Tumor Lunge Leber Milz Niere (ohne Gelatine)
Zur erfindungsgemäßen Verwendung als Gelmatrix sind eine Vielzahl polymerer Materialien geeignet, die natürliche und synthetische Materialien einschließen. Beispiele sind Polysaccharide, wie z. B. Gummi arabicum, Ethylcellulose, hydroxylierte Stärke und Kelgin, Polypeptide, und aus Lactid oder Säure synthetisierte Polyester, Poly(βhydroxybutyrat), Poly(DL-lactid-co-glycolid). Agarose, wie in den vorausgehenden Beispielen verwendet, ist repräsentativ für geeignete Polypeptide. Für einen Fachmann auf diesem Gebiet ist es offensichtlich, daß auch andere polymere Gelmaterialien im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können, solange das Material dazu fähig ist, bei niederen Temperaturen eine Schutzgeloberfläche um die Phospholipidvesikel auszubilden, und z. B. durch Schmelzen bei etwa Raumtemperatur oder höher in eine Flüssigkeit überführt werden kann, um eine wäßrige Suspension zu bilden. Obgleich die Verendung einer Gelmatrix, die für einen solchen Übergang durch Schmelzen fähig ist, bevorzugt ist, ist es einzusehen, daß auch solche Materialien, die für den angezeigten Übergang auf andere Weise fähig sind, z. B. auf enzymatische Weise, verwendet werden können.
Es ist auch einzusehen, daß, während der Prozentgehalt des Gels in der Lösung oder Matrix zur Erreichung der gewünschten Stabilisierung der Partikel weniger bedeutsam ist, die Temperatur, bei der die Gelmatrix gebildet wird, von großer Bedeutung ist. Wenn man z. B. eine Gellösung mit ca. 1% Gelgehalt verwendet, tritt die Verfestigung bei ca. 4ºC auf, während mit einer 10%igen Gellösung die Verfestigung bei ca. Raumtemperatur auftritt. Im Hinblick auf solche Überlegungen wird die Gelmatrix typischerweise eine Lösung von ca. 0,5 Gew.-% bis ca. 10 Gew.-% Gel sein, wobei ca. 1-5 Gew.-% der bevorzugte Bereich ist. Wie vorstehend angegeben, kann in den micellaren Partikeln eine Vielzahl von therapeutischen Mitteln eingeschlossen sein. Repräsentative therapeutische Mittel umfassen Antibiotika, Stoffwechselregulatoren, Immunmodulatoren, chemotherapeutische Mittel und Toxingegengifte. Die Partikel können außerdem mit ¹¹¹In oder anderen diagnostischen Radionukliden, z. B. anderen Gamma-Strahlern, wie z. B. Ga-67, Tc-99M, Cr- 51 und J-125, und fluoreszierenden Materialien oder anderen Materialien, die in in vitro-Anwendungen bestimmbar sind, beschickt werden.
Aus den vorausgehenden Beispielen ist es ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung micellarer Partikel während der Lagerung über einen längeren Zeitraum bereitstellt. Durch Suspendieren der Partikel in einer polymeren Gelmatrix unter Bildung einer Schutzgeloberfläche um die Partikel wird eine Aggregation oder ein Verschmelzen der Partikel vermieden, ohne die Brauchbarkeit der Vesikel oder des Austrittsverhalten eines eingeschlossenen Materials einzubüßen.

Claims

1. Verfahren zur Lagerung von Phospholipidvesikeln, die ein therapeutisches oder diagnostisches Mittel eingeschlossen enthalten, dadurch gekennzeichnet, daß es die Stufen umfaßt:

Suspendieren der Phospholipidvesikel in einer pharmazeutisch annehmbaren Gel-Lösung, die um die Phospholipidvesikel eine Suspension mit einer Schutzgeloberfläche bildet, wobei die Suspension bei Raumtemperatur flüssig ist, und

Abkühlen der Suspension, um eine Gelmatrix zu bilden, die die Bewegung der Vesikel einschränkt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner umfaßt das Erwärmen der Gelmatrix auf mindestens ca. Raumtemperatur oder höher, wodurch die Gelmatrix in ihren flüssigen Zustand zurückgebracht wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Gelmatrix ein Polysaccharid oder Polypeptid ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Gelmatrix Gelatine ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Gelmatrix Agarose ist.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Gelmatrix eine Lösung ist, die 0,5 bis 10 Gewichtsprozent Gel enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die polymere Gelmatrix 1 bis 5 Gewichtsprozent Gel enthält.