DE3525759A1

DE3525759A1 - Biokatalysator

Info

Publication number: DE3525759A1
Application number: DE19853525759
Authority: DE
Inventors: Joachim Prof Dr Klein; Klaus-Dieter Dr Vorlop; Hans-Juergen Steinert
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-07-19
Filing date: 1985-07-19
Publication date: 1987-01-22
Also published as: DE3525759C2

Description

Die Erfindung betrifft einen Biokatalysator mit immo bilisierten, enzymatisch aktiven Substanzen, die in eine Flüssigkeit eintauchen und durch eine für die Flüssigkeit durchlässige, für die enzymatisch aktiven Substanzen jedoch undurchlässige Materialschicht immo bilisiert sind. Derartige enzymatisch aktiven Substanzen können dabei durch Zellen, Organellen und Enzyme gebil det werden.

Biokatalsytoren werden für die verschiedensten Anwen dungsgebiete eingesetzt. Mit ihnen lassen sich beispiels weise Arzneimittel, wie Antobiotika, oder Äthanol her stellen, Abwässer reinigen o. dgl. Bekannt ist der Ein satz entsprechender Zellen bei der Sektherstellung, wo durch Zugabe von Hefe eine zweite Gärung in Gang gebracht wird. Diese Gärung wird auch in der Sektfla sche selbst vorgenommen. Die bekannten Verfahren ge stalten sich dadurch gesonders aufwendig, daß die freien, aktiven Zellen nach der Durchführung der Gärung aus der Flüssigkeit entfernt werden müssen. Bei der Flaschengärung für Sekt werden die Flaschen hierzu ge rüttelt und nach und nach auf den Kopf gestellt, so daß sich die Zellen im Flaschenhals absetzen. Durch Vereisung des Flaschenhalses wird mit den Zellen ein ent fernbarer Pfropfen gebildet.

Es ist seit einiger Zeit bekannt für derartige Anwendungs fälle für Biokatalysatoren immobiliserte Zellen zu ver wenden. Diese sind durch geeignete Maßnahmen an einen Ort gebunden, bleiben aber weiterhin lebensfähig und aktiv. Nach der Durchführung der mikrobiologischen Reaktion können sie zusammen mit der Immobilisierungsmasse im all gemeinen leicht entfernt werden. Es ist bekannt, eine der artige Immobilisierung durch in wässriger Phase vernetzende Gele zu bewerkstelligen (vgl. Klein, Wagner "Methods for the Immobilization of Microbial Cells" in Applied Bio chemistry and Bioengineering 1983, Vol. 4, Seiten 11-51).

In der Praxis hat es sich jedoch gezeigt, daß für länger währende Vorgänge, wie beispielsweise die Sektgärung, die durch die Immobilisierung angestrebten Effekte nicht erzielt werden. Es zeigt sich nämlich, daß die Zellen aus den Immobilisierungsmaterial "auswachsen". Zwar verhindern die Gele durch ihre Netzstruktur ein Auswandern der ein geschlossenen Zellen, es läßt sich aber nicht vermeiden, daß bei der Herstellung der Gele auch Zellen an der Ober fläche des Biokatalysators sitzen. Diese finden gegenüber den eingeschlossenen Zellen begünstigte Ernährungsbedin gungen vor und vermehren sich wesentlich stärker als die eingeschlossenen Zellen. Diese Zellen nehmen als freie Zellen am Gärungvorgang teil, gelangen in die Flüssigkeit und führen zu einer erheblichen Trübung.

Ein unter der Bezeichnung "Mikrokapselung" bekanntes Ver fahren eignet sich zur Immobilisierung der Zellen nicht, weil hierbei ein Polymer in einem organischen Lösungsmittel gelöst werden muß, das die Zellen praktisch vollständig abtötet. Die verbleibende Aktivität des Katalysators würde in den meisten Fällen nicht ausreichen. Darüber hinaus läßt sich auch bei der Mikrokapselung ein Auswachsen der Zellen nicht sicher verhindern.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen Biokata lysator zu erstellen, der einfach herstellbar ist und bei dem ein Auswachsen der enzymatisch aktiven Substanzen auch bei Langzeit-Verfahren sicher verhindert wird.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß bei einem Biokatalysa tor der eingangs erwähnten Art dadurch gelösten, daß die Zellen in einen oben offenen Behälter eingefüllt sind, dessen Wandung am unteren Ende zumindest teilweise durch die Materialschicht gebildet ist, die für die Zellen undurchlässig und für die Flüssigkeit durchlässig ist.

Während die bekannten Immobilisierungsverfahren von einer vollständigen Umhüllung von Zellen mit einem Material aus gehen, das für die Flüssigkeit durchlässig, für die Zellen jedoch undurchlässig ist, unterscheidet sich hiervon der Aufbau des erfindungsgemäßen Biokatalysators prinzipiell. In ganz simpler Weise wird nämlich ein oben offener Be hälter vorgefertigt, der mit seinem unteren Ende zum Eintauchen in die Flüssigkeit bestimmt ist. In diesem unteren Endbereich ist die Wandung des Behälters zumin dest teilweise durch die für die Flüssigkeit durchlässige, für die Zellen undurchlässige Materialschicht gebildet. Der Vorteil bei dieser Anordnung besteht darin, daß der Behälter mit der Materialschicht völlig zellenfrei vor gefertigt werden kann und daß die Zellen über den oberen offenen Teil des Behälters in den vorgefertigten Behälter einfüllbar sind, wodurch die Außenwand des Behälters und der Materialschicht absolut zellenfrei gehalten werden können. Somit besteht die Gefahr eines Auswachsens nicht.

Die nicht durch die Materialschicht gebildeten Wandungen des Behälters werden im allgemeinen sowohl für die Flüs sigkeit als auch für die Zellen undurchlässig sein. Es ist jedoch auch möglich, einen Behälter komplett aus einem derartigen Material zu bilden.

In einfacher und preiswerter Weise kann der Behälter durch ein an beiden Enden offenes Rohrstück gebildet sein, das an einem Ende, das zum Eintauchen in die Flüssigkeit be stimmt ist, mit der Materialschicht verschlossen ist. Das Rohrstück kann durch ein Glasrohrstück, ein Kunststoff rohrstück oder auch durch einen gewöhnlichen Trinkhalm gebildet sein. Die Materialschicht kann ein Glasfritten einsatz sein, der beispielsweise in das Rohrstück eingesetzt ist. Ein einfacher Verschluß mit einem geeigneten Material läßt sich vorzugsweise mit einer Gelschicht herstellen, die an dem Rohrstück durch Eintauchen gebildet werden kann. Dieses Verfahren läßt sich im allgemeinen einfacher ausbilden als der Einsatz eines Glasfrittenstücks in ein Rohr o. ä.

Vor dem Aufbringen der Gelschicht kann das Rohrstück durch ein Papierfilter, Watte o. ä. verschlossen sein, um das Eindringen des Gels in das Innere des Rohrs zu verhindern.

Zur Vergrößerung der Austauschfläche für die eindringende Flüssigkeit kann es vorteilhaft sein, wenn das Rohr durch ein rohrförmiges Filterstück fortgesetzt wird, das dann ebenfalls von der Gelschicht umgeben ist. Durch diese An ordnung wird die Diffusion von frischer Flüssigkeit in den Bereich der Zellen gefördert.

Für die Durchführung einer Flaschengärung bietet sich die Verwendung des Rohrstücks an. Dieses wird in die Flasche eingebracht, und die Flasche wird verschlossen. Um in einfacher Weise das Rohrstück nach Beendigung des Gärvorganges wieder entnehmen zu können, ist es vorteil haft, wenn das Rohrstück mit einem Auftriebskörper ver sehen ist, der das Rohr soweit aus der Flüssigkeit heraus hebt, daß es außerhalb der Flasche ergriffen werden kann. Dem gleichen Zweck dient in einer anderen Ausführungsform ein ringförmiger, nach unten offener Gasauffangraum, der an der Innenwand des Rohrstückes angeordnet ist. Während der Gärung entsteht CO₂ das im Rohrstück nach oben auf steigt. Ein Teil des Kohlendioxids fängt sich in dem Gasauffangraum und sorgt somit für den Auftrieb, der das gefüllte Rohr aus der Flüssigkeit heraushebt.

Die Erfindung soll im folgenden anhand von in der Zeich nung dargestellten Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. Es zeigen:

Fig. 1: ein gefülltes Glasrohr, das am un teren Ende mit einem Fritteneinsatz abgeschlossen ist;

Fig. 2: ein durch eine Gelschicht am unteren Ende abgeschlossenes Glasrohr, in dessen untere Öffnung ein Papier filter eingesetzt ist und das einen Gasauffangraum aufweist;

Fig. 3: ein gefülltes und am unteren Ende mit einer Gelschicht abgeschlossenes Glasrohr in das ein Filtereinsatz eingesetzt ist;

Fig. 4: ein gefülltes und mit einer Gelschicht abgeschlossenes Glasrohr, das am unteren Ende mit einem Papierfilter rohr fortgesetzt ist;

Fig. 5: eine Vorrichtung zur Herstellung der Gelschicht an einem Rohrstück.

In der Zeichnung sind rohrförmige Behälter dargestellt, die in erster Linien für die Flaschengärung bei der Sekt herstellung geeignet sind. Selbstverständlich können der artige Behälter auch für andere Einsatzzwecke verwendet werden und hierfür gegebenenfalls eine andere Form auf weisen.

Fig. 1 zeigt ein Rohrstück 1 das oben und unten offen ist. Die untere Öffnung ist mit einem Glasfritteneinsatz 2 verschlossen, der mit einer derartigen Dichte hergestellt ist, daß er die Diffusion einer Flüssigkeit erlaubt, nicht aber den Durchtritt von Hefezellen. Die Anordnung aus Rohrstück 1 und Glasfritteneinsatz 2 ist gefüllt mit einer Hefesuspension 3, die für die zweite Gärung eines Cuv´e geeignet ist.

In der in Fig. 2 dargestellten Ausführungsform ist das Rohrstück 1 am unteren Ende mit einem Papierfiltereinsatz 2 versehen. Um diese Anordnung ist eine Gelschicht 4 auf gebracht, deren Herstellung unten näher erläutert wird. Diese Anordnung ist anschließend mit einer Hefesuspension 3 gefüllt. Innerhalb des Füllstandes der Hefesuspension 3 befindet sich ein nach unten offener ring-förmiger Gas auffangraum 5, in dem sich bei der Gärung entstehendes Kohlendioxid sammelt. Nach dem Öffnen der Flasche nach Abschluß der Gärung sorgt das in dem Gasauffangraum 5 gesammelte CO₂ dafür, daß das Rohrstück 1 soweit aus der Flüssigkeit herausragt, daß es oberhalb der Flaschenöff nung ergriffen und aus der Flasche herausgezogen werden kann.

Bei dem in Fig. 3 dargestellten Ausführungsbeispiel ist in das untere Ende des Rohrstücks 1 ein vorgefertigtes Filterstück 6 nach Art eines Zigarettenfilters eingesetzt. Dieses poröse Filter dient im wesentlichen zur mechanischen Stabilisierung der anschließend aufgebrachten Gelschicht 4. Zur mechanischen Befestigung der Gelschicht 4 an der Außen wand des Rohrstücks 1 kann dieses mit Verzahnungsrillen 7 versehen sein.

Fig. 4 zeigt eine Ausführungsform, bei der in das Rohr stück 1 eine Hohlröhre 8 aus Filterpapier eingesetzt ist, die das Rohrstück 1 um ein beträchtliches Stück fortsetzt. In die Hohlröhre 8 ist am unteren Ende ein Wattepfropfen 9 eingesetzt, der ebenso wie das Filterstück 6 oder das Papierfilter 2′ die Aufgabe hat, zur mechanischen Stabili sierung bei der Herstellung der Gelschicht 4 beizutragen und das Eindringen der Gelschicht in das Innere der Röhre 8 bzw. des Rohrstücks 1 zu verhindern.

Anhand der Fig. 5 soll die Herstellung der Gelschicht 4 anhand von Beispielen erläutert werden.

Zur Herstellung von Silikagelen erfolgt die Darstellung der Kieselsäure aus einer 8,5%igen Na₂SiO₃-Lösung mit Hilfe eines sauren Ionenaustauscherharzes (Lewatit 100 S). Über die mit destilliertem Wasser chloridfrei gewaschene Ionenaustauscherharzsäule wird die Na₂SiO₃-Lösung gegeben. Der pH-Wert der ablaufenden Kieselsäure wird ständig mit einer pH-Elektrode kontrolliert. Die Fraktion mit einem pH-Wert unter 3,0 wird gesammelt und diese Kieselsäurelö sung mit verdünnter Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt.

Die Kieselsäure wird in einen kleinen Zylinder 10 gegossen und in eine Na₂HPO₄-Pufferlösung mit dem pH-Wert 9,0 getaucht.

Nach ca. 60 Sekunden hat sich das Gel ausgebildet.

Der das Gel enthaltende Zylinder 10 enthält einen weiteren, kleineren und mit Bohrungen versehenen Zylinder 11, der nach oben mit dem Rohrstück 1 verbunden ist. In den Zylin der 11 ist am unteren Ende ein Wattepfropfen 9 einge bracht. Diese lediglich der mechanischen Stabilisierung dienende Anordnung ist fest mit der Gelschicht 4 umgeben, wenn die Hefesuspension 3 aus Hefe und dem Cuv´e bis etwa zur halben Höhe des Rohrstücks 1 eingefüllt wird. An schließend wird das mit der Hefesuspension 3 gefüllte Rohr in eine Sektflasche die mit Cuv´e gefüllt ist, gestellt und die Flasche verschlossen. Es befinden sich dann ca. 0,14 g Trockenhefe (Lavin C 1108) in dem Rohrstück 1.

Für das in Fig. 4 dargestellte Ausführungsbeispiel wird das Rohrstück 1 das am unteren Ende eine ca. 6 cm lange, unten verschlossene Hohlröhre 8 aus Filterpapier trägt, in eine Kieselsäurelösung getaucht, um auf das Papier röhrchen eine Kieselsäureschicht aufzubringen. Die Kiesel säurelösung wurde zuvor mit einer Na₂HPO₄-Lösung mit dem pH-Wert 5,0 versetzt. Auf drei Teile Kieselsäure wird ein Teil Puffer gegeben. Durch die Mischung mit dem Puffer geliert die Kieselsäure schneller, so daß sich die Kieselsäure leichter auftragen läßt.

Anschließend wird das Rohr in eine Pufferlösung pH 9,0 ge taucht. Diese Prozedur wird wiederholt, um eine zweite Schicht 4 Kieselgel aufzutragen. Anschließend wird das Rohr bis zur Hälfte mit in Cuv´e aufgeschlämmte Hefe ge füllt (ca. 0,14 g Trockenhefe je Rohrstück 1). Nun kann das oberflächensterile Rohr zur Sektgärung eingesetzt werden.

In völlig analoger Weise kann die Ausführungsform gemäß Fig. 3 mit dem Filterstück 6 oder gemäß Fig. 2 mit dem Papierfiltereinsatz 2 hergestellt werden.

Zur Bildung eines Agar-Gels als Gelschicht 4 wird eine 4%ige Agärlösung bis kurz vor dem Gelpunkt bei ca. 45°C abgekühlt. In diese Lösung wird das Rohrstück 1, das am unteren Ende beispielsweise die ca. 6 cm lange Papier röhre 8 trägt, getaucht. Mit dem daran haftenden Agar wird die Anordnung in kaltes Wasser getaucht. Durch das Abküh len geliert die Agarlösung. Diese Prozedur wird zur Her stellung einer zweiten Agarschicht wiederholt. Anschließend wird die Röhre bis zur Hälfte mit einer Hefesuspension 3 gefüllt und ist dann einsatzbereit.

Die Gelschichten 4 können in gleicher Weise aus Carrageenan, Pektin, Alginat, Gelatine usw. gebildet sein. Für die Sektherstellung sind Silikagele und Agar besonders geeignet, weil diese Stoffe als lebensmittelunbedenklich anerkannt sind.

Claims

1. Biokatalysator mit immobilisierten enzymatisch aktiven Substanzen (3), die in eine Flüssigkeit eintauchen und durch eine für die Flüssigkeit durch lässige, für die Substanzen (3) jedoch undurchläs sige Materialschicht (2, 4) immobilisiert sind, da durch gekennzeichnet, daß die Substanzen (3) in einen oben offenen Behälter (1) eingefüllt sind, dessen Wandung am unteren Ende zu mindest teilweise durch die Materialschicht (4) ge bildet ist.

2. Biokatalysator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß der Behälter durch ein an beiden Enden of fenes Rohrstück (1) gebildet ist, das an dem zum Eintauchen in die Flüssigkeit bestimmten Ende mit der Materialschicht (4) verschlossen ist.

3. Biokatalysator nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge kennzeichnet, daß die Materialschicht durch einen Glasfritteneinsatz (2) gebildet ist.

4. Biokatalysator nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß die Materialschicht durch eine Gelschicht (4) gebildet ist.

5. Biokatalysator nach Anspruch 2 und 4, dadurch gekenn zeichnet, daß in das Rohrstück (1) vor dem Aufbringen der Gelschicht (4) ein Filterstück (2′, 6, 9) eingesetzt ist.

6. Biokatalysator nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Filterstück als Hohlröhre (8) ausgebildet ist und das Rohrstück (1) fortsetzt.

7. Biokatalysator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Behälterwände aus der Materialschicht gebildet sind.

8. Biokatalysator nach einem der Ansprüche 2 bis 7, da durch gekennzeichnet, daß das Rohrstück (1) mit einem Auftriebskörper versehen ist.

9. Biokatalysator nach einem der Ansprüche 2 bis 8, da durch gekennzeichnet, daß das Rohrstück (1) an seiner Innenwand einen ringförmigen, nach unten offenen Gas auffangraum (5) aufweist.