DE3439345A1

DE3439345A1 - Verwendung hyperimmuner milch zur behandlung von tieren und menschen

Info

Publication number: DE3439345A1
Application number: DE19843439345
Authority: DE
Inventors: Lee R. Dr. Birmingham Ala. Beck; Ralph J. Oregonia Ohio Stolle
Original assignee: Stolle Research and Development Corp
Current assignee: Stolle Milk Biologics Inc
Priority date: 1983-10-27
Filing date: 1984-10-26
Publication date: 1986-04-24
Anticipated expiration: 2004-10-27
Also published as: NL8403248A; ATE64530T1; EP0143345A3; SE8405351D0; DE3439345C2; EP0143345A2; EP0380032B1; CH671517A5; EP0380032A1; ATE100325T1; EP0143345B1; DE3448494C2; HK1006004A1; SE466532B; SE8405351L; US4636384A

Description

VERWENDUNG HYPERIMMUNER MILCH ZUR BEHANDLUNG VON TIEREN UND MENSCHEN

Die Erfindung betrifft die Verwendung hyperimmuner Milch zur Behandlung von Erkrankungen des Gefäß- und Pulmona1systems wie z.B. der Alterung des Gefäßsystems und der Arteriosklerose sowie von mit dem Rauchen zusammenhängenden Erkrankungen der Lunge.

Das normale Gefäßsystem von Säugern, insbesondere des Menschen umfaßt sämtliche Organe wie Herz und Arterien, die am Bluttransport und -kreislauf beteiligt sind. Das Gefäßsystem von Tieren wird hauptsächlich von zwei Erkrankungen bzw. Störungen befallen, und zwar von der Arteriosklerose und der Alterung. Die Arteriosklerose, der Oberbegriff für die Erscheinungen der Verdickung und Verhärtung der Arterienwandung, ist in den Vereinigten Staaten und in den westlichen Industrieländern die häufigste Todesursache. Man unterscheidet verschiedene Typen von Arteriosklerose wie Atherosklerose, Fokalverkalkung und Arteriolosklerose. Die mit der Arteriosklerose (verschiedensten Typs) Hand in Hand gehenden Veränderungen überlappen sich teilweise mit der Alterung (siehe z.B. Harrison's "Principles of Internal Medicine", 9th Edition, SS. 156-1166).

Die normale Arterienwandung besteht aus drei recht gut definierten Schichten, der Intima, der Media und der Adventitia. Die Intima ist eine Schicht aus endothelialen Zellen, welche das Lumen sämtlicher Arterien auskleiden. Die endothelialen Zellen sind miteinander durch eine Reihe von Verbindungskomplexen verbunden und sind außerdem noch mit dem darunterliegenden Netz-

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werk aus losem Bindegewebe, der Basalmembran verbunden. Die Auskleidung durch die endothelialen Zellen bildet eine Barriere, welche den Eintritt von Stoffen aus dem Blut in die Arterienwandung kontrolliert. Die Media besteht aus glatten, in einer einzigen Schicht oder mehreren Schichten angeordneten Muskelzellen. Die äußerste Schicht der Arterie ist die Adventitia, die durch die äußere elastische Membran begrenzt wird. Diese äußerste Schicht besteht aus einem lose miteinander verwobenen Geflecht von dicken Collagenbündeln, elastischen Fasern verschiedener Größe sowie aus glatten Muskelzellen und Fibroblasten.

Die Erhaltung der Endothelzellenauskleidung hat kritischen Charakter. Es kommt zwar nur langsam zur Veränderung der Endothelzellen, fokal kann es jedoch infolge der Änderung des Strömungsmusters entlang der Gefäßwandung zu einer Beschleunigung dieser Veränderung kommen. Die intakten Endothelzellen verhindern die Blutgerinnung, insbesondere durch die Produktion von Prostacyclin, das die Blutplättchenfunktion inhibiert und dadurch das ungehinderte Strömen des Blutes begünstigt. Ist nun diese Auskleidung beschädigt, können die Blutplättchen daran haften bleiben, und zwar teilweise als Ergebnis der Produktion einer anderen Gruppe von Prostaglandinen, der Thromboxane, wodurch es zur Blutgerinnselbildung kommt. Die Fähigkeit der Arterienwandung, die Integrität seinesEndothels aufrechtzuerhalten, die Aggregation der Blutplättchen zu verhindern und die Ernährung ihrer mittleren Schicht zu gewährleisten, kann die kritischen Determinanten des arteriosklerotischen Prozesses darstellen.

Die wichtigste Veränderung, die sich im Zuge der normalen Alterung in der Arterienwandung abspielt, ist eine

langsame symmetrische Zunahme der Dicke der Intima» Dies ergibt sich aus einer Anhäufung glatter Muskelzellen. Außerdem nimmt mit zunehmendem Alter in der nichterkrankten Arterienwandung auch der Gehalt an Lipiden, hauptsächlich Cholesterinester und Phospholipid, fortschreitend zu. Während der Hauptanteil des Phospholipids in der normalen Arterienwandung aus der in situ-Synthese zu stammen scheint, scheint der mit zunehmendem Alter sich anhäufende Cholesterinester offensichtlich aus dem Plasma zu stammen, da er hauptsächlich Linolsäure, den wichtigsten Fettsaurecholesterinester des Plasmas, enthält. Mit zunehmender normaler Arterienalterung sammeln sich in der Intima glatte Muskelzellen und Bindegewebe an, was zu einer fortschreitenden Verdickung der Schicht zusammen mit einer fortschreitenden Fettsäureakkumulation führt, was wiederum eine allmähliche Zunahme der Rigidität der Gefäße bewirkt. Die größeren Arterien erweitern und dehnen sich, werden porös, wodurch es in Bereichen überhandnehmender degenerativer arteriosklerotischer Plaquebildung zu Aneurysmen kommen kann.

Bei weitem die häufigste Todesursache in den USA ist sowohl bei Menschen unter 65 Jahren als auch darüber die Atherosklerose, die atheromatose Form der Arteriosklerose. Die Läsionen werden üblicherweise in Fettstreifen, fibröse Plaques und komplizierte Läsionen eingeteilt.

Erstere sind gekennzeichnet durch eine Anhäufung von Iipidgefüllten glatten Muskelzellen und Fasergewebe in fokalen Bereichen der Intima und sind durch fettlösliche Farbstoffe deutlich angefärbt. Das Lipid ist in der Hauptsache Cholesterinoleat. Die fibrösen Plaques stellen vorgewölbte Bezirke der sich verdickenden Intima dar und sind die am stärksten kennzeichnende Läsion fortschreitender Arteriosklerose. Sie treten in der Abdominalaorta, in den Koronararterien und in den Carotiden

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im dritten LebensJahrzehnt auf und verstärken sich mit zunehmendem Alter. Komplizierte Läsionen sind verkalkte fibröse Plaques, die verschiedene Grade an Nekrose, Thrombose und Ulceration aufweisen.

Es wurde bereits eine Reihe von sogenannten Risikofaktoren festgestellt, die zur Atherosklerose führen. Der Begriff "Risikofaktor" bedeutet, daß sich bei einer Person mit mindestens einem Risikofaktor mit höherer Wahrscheinlichkeit eine klinische Atherosklerose entwickelt und außerdem noch früher als bei einer Person:, die diese Risikofaktoren nicht aufweist. Ferner beschleunigt das gleichzeitige Vorliegen mehrerer Risikofaktoren die Entwicklung einer Atherosklerose. Unter den reversiblen oder teilweise reversiblen Risikofaktoren sind zu nennen die Hyperlipidämie (Hypercholesterinämie und/oder Hypertriglyceridämie), Hyperglykämie und Diabetes, niedriger Spiegel an Lipoproteiden mit hoher Dichte, Hypertension, Korpulenz und das Rauchen von Zigaretten .

Wie Harrison (ibidem, Seite 1166) feststellt, konnte beim Menschen, obwohl das Auftreten klinischer Folgen der Atherosklerose abgeschwächt werden kann, bisher kein einziger überzeugender Fall von Regression oder Unterbrechung der Progression der Atherosklerose durch Entfernung oder Rückbildung eines einzigen Risikofaktors oder einer Gruppe von Risikofaktoren festgestellt werden. Der Trend in Richtung weniger Rauchen, weniger Cholesterin- und Fettkonsum und Verminderung des Übergewichts und Trainingsprogramme haben sich als hilfreich erwiesen. Ziel der öffentlichen Gesundheitsfürsorge ist die Verwirklichung des Grundsatzes "Vorbeugen ist besser als Behandeln". Ein wirksames Prophylaxeprogramm ist bisher jedoch nicht reali-

siert worden, obwohl hinlänglich bekannt ist, daß es einerseits notwendig ist, die Risikofaktoren zu identifizieren und andererseits Maßnahmen entwickelt werden müssen, das entsprechende Risiko zu senken.

Unter den Risikofaktoren, die zu den obengenannten gehören und für eine therapeutische Behandlung besonders in Frage kommen, ist die Hyperlipidämie zu nennen. Obwohl die Bekämpfung der Risikofaktoren wie Korpulenz und Zigarettenkonsum in hohem Maße vom Willen und von der Veranlagung des Einzelnen abhängen, wäre doch ein angemessenes Verfahren z.B. zur Verminderung des Cholesterinspiegels im Serum, des Spiegels der Lipide von niedriger Dichte (LDL) und des Triglyceridspxegels im Blut geeignet für die Behandlung einer breit gestreuten Zahl von Personen.

Aufgrund der weiten Verbreitung von Gefäßerkrankungen wie Arterioskleroseerkrankungen und die natürliche Alterung des Gefäßsystems und die damit zusammenhängenden Probleme besteht ein Bedarf an einer wirksamen Methode zur Verhinderung und gegebenenfalls auch zur Behandlung dieser Erkrankungen.

Wäre es nun möglich ein natürliches Nahrungsmittel wie z.B. Milch zu erhalten, das antiarteriosklerotische und die Alterung hemmende Wirkung aufweist, hätte man damit eine leicht zu verabreichende, leicht zugängliche und sichere therapeutische Zusammensetzung.

Ein anderes überaus wichtiges Organsystem von Säugern, insbesondere des Menschen, das gekennzeichnet ist durch die progressive Degeneration von Zellen der dieses Organsystem bildenden Organe ist das Pulmonalsystem, und

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insbesondere die Lunge und die dazugehörigen Bronchien und Alveolen.'Ähnlich wie die Arteriosklerose und die Gefäßalterung hängen auch bestimmte Lungenerkrankungen, einschließlich eines allgemeinen Zusammenbruchs des PuI-monalsystems, Kurzatmigkeit und die Verminderung der Atmungseffizienz mit Reizstoffen und Verunreinigungen in der Umwelt, wie sie auch im Zigarettenrauch enthalten sind, zusammen und sind durch sie verursacht.

Rauchen über längere Zeit führt bekanntlich zur Akkumulierung von Ablagerungen von Kohlenstoff und anderen Substanzen auf und in der Lunge, wodurch die respiratorische Funktion des betroffenen Bereichs zerstört wird. In ähnlicher Weise führen Rauchen und/oder die Anwesenheit dieser Ablagerungen zu einem starken Anstieg der Zahl der Neutrophilen und Lymphozyten in den Säugerlungen. Beide Zelltypen erzeugen Substanzen, die für das Lungengewebe schädlich sind.

Was die Arteriosklerose betrifft, so ist durch eine Verminderung der Häufigkeit des Rauchens bei den meisten Altersgruppen eine gewisse Eindämmung bzw. Abschwächung der mit dem Rauchen zusammenhängenden Erkrankungen erzielt worden. Bei manchen Teilen der Bevölkerung, insbesondere bei Heranwachsenden und Jugendlichen hat j das Rauchen stark zugenommen, wodurch sich die Häufigkeit der Fälle von mit dem Rauchen zusammenhängenden Erkrankungen sowohl bei der derzeitigen Bevölkerung als auch insbesondere in absehbarer Zukunft vervielfachen wird.

Was die Herz- und Gefäßerkrankungen betrifft, so zeitigt die auf der Vermeidung der Verunreinigungen - wie z.B. durch das Rauchen bedingt - beruhende Behandlung je nach Individuum wechselnden Erfolg. Könnte nun ein

Verfahren zur Verminderung der Menge an abgelagerter Substanz, wie z.B. ein Verfahren zur Stimulierung der Makrophagenaktivitat in den Lungen gefunden werden, so könnte man auf diese Weise ein für die meisten Mensehen günstiges Behandlungsverfahren entwickeln.

Gelänge es, ein natürliches Nahrungsmittel wie z.B. Milch zu entwickeln, das auf die dem Rauch ausgesetzte Lunge und die damit zusammenhängenden Erkrankungen eine schonende bzw. lindernde Wirkung ausübt, so hätte man damit eine leicht anwendbare, leicht zugängliche und sichere therapeutische Zusammensetzung zur Bekämpfung von Arteriosklerose und Gefäßerkrankungen.

Aus dem Stand der Technik ist bekannt, Milch zu produzieren, die eine Reihe von therapeutischen Wirkungen aufweist. So z.B. beschreibt Beck eine Milch, die einen Antikörper gegenüber Streptococcus mutans enthält und Karies inhibierende Wirkung aufweist (Beck, US-PS 4 324 782). Diese Milch erhält man durch Immunisierung einer Kuh mit S. mutans-Antigen in zwei Stufen, wonach man daraus die therapeutische Milch gewinnt. Beck beschreibt ferner eine Milch mit antiarthritischen Eigenschaften . Ferner beschreibt er eine antiinflam-

matorische Eigenschaften aufweisende Milch (US-PS 4 284 623). Heinbach hat in der US-PS 3 128 230 eine Milch beschrieben, die Ot-, ß- und >"-Gluboline enthält, erhalten durch Beimpfung einer Kuh mit Antigengemischen-Antikörper enthaltende Milchsorten wurden auch von Petersen (US-PS 3 376 198 und CA-PS 587 849), Holm, US-PA (veröffentlicht) Serien-Nr. 628 987 und Tunnak et al. (GB-PS 1 211 876) beschrieben.

In keiner der erwähnten Druckschriften wird jedoch eine Milch geoffenbart oder angenommen, die antiarterioskl erotische oder der Gefäßalterung entgegenwirkende Eigenschaften oder eine auf die dem Rauch ausgesetzte Lunge schonende Wirkung aufweist.

Eine Aufgabe der Erfindung ist somit die Bereitstellung einer Milch mit im Hinblick auf Erkrankungen des Gefäß- und Pulmonalsystems günstigen Eigenschaften.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung einer derartigen Milch.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Testen von mit der Einwirkung von Rauch auf die Lunge zusammenhängenden Erkrankungen an Tier und Mensch.

Diese und andere Aufgaben, die nachfolgend näher ausgeführt werden, wurden durch Bereitstellung einer speziellen Milch zur Behandlung von Gefäßerkrankungen an Säut gern gelöst, die darin besteht, daß man dem betreffenden Säuger Milch verabreicht, die aus einem Vertreter der Bovidae stammt, der im hyperimmunen Zustand gehalten wird, und zwar in einer Menge, die ausreicht, um eine antiarteriosklerotische, die Gefäßalterung hemmende bzw. das Gewebe schonende Wirkung zu erzielen.

Eine umfassendere Vorstellung von der Erfindung und von vielen der von ihr zu erwartenden Vorteile ergibt sich

aus der.nachfolgenden detaillierten Beschreibung im Zusammenhang mit den nachfolgend aufgeführten Zeichnungen:

Fig. 1 zeigt Mikrophotos (300-fache Vergrößerung) von Kryostatschnitten durch Kaninchenaorten, die zum spezifischen Nachweis .der Lipide mit Oil Red O angefärbt wurden:

A. Kontrollkaninchen: zahlreiche kleine Lipidtröpfchen vorhanden (siehe Pfeile);

B. Mit hyperimmuner Milch ernährte Kaninchen: Lipidtröpfchen sind in der Wandung der Aorta nicht vorhanden. Das Lipid (siehe Pfeil) im Gewebe außerhalb der Aorta ist normal und zeigt, daß die Lipide sichtbar wären, wenn sie in der Aortawandung vorhanden wären.

Fig. 2 zeigt rasterelektronenmxkroskopische Aufnahmen von Herzkammerinnenflächen von Kaninchenherzen (1.750-fache Vergrößerung):

A. Kontrolle: unterhalb des erodierten Endokardepithels liegen zwei Thromben.

B. Hyperimmune Milch: das Epithel ist intakt, Thromben sind nicht vorhanden.

Fig. 3 zeigt transmi'ssionselektronenmikroskopische (TEM) Aufnahmen von Blutgefäßen in Kaninchenherzen (3.420-fache Vergrößerung).

A. Kontrolle: in den Endothelzellen (obere Pfeile) und in den glatten Muskelzellen (untere Pfeile) sind

Lipidvakuolen vorhanden.

B. Hyperimmune Milch: Endothel und glatte Muskel zellen zeigen keine Lipidvakuolen.

Fig. 4 zeigt eine rasterelektronenmikroskopische (REM) Aufnahme der Alveolenwandung der Lunge einer Ratte, die während 3 Monaten Zigarettenrauch ausgesetzt wurde (Vergrößerung 5.750-fach);

A. Kontrolle! An der Alveolenwandung ist ein Fremdkörper (siehe Pfeil) zu sehen, außerdem ist die "Wandung gerissen, wobei ein Erythrozyt zutage tritt.

B. Hyperiminune Milch: Der Makrophage (dust cell) im Mittelpunkt des Mikrophotos phagozytiert den Fremdkörper, wodurch die Alveolenwandung von den Teilchen befreit wird, die mit dem Rauch in den unteren Atmungsweg gelangt sind.

Fig. 5 zeigt eine TEM-Aufnähme einer Ratte, die 3 Monate lang Zigarettenrauch ausgesetzt war und hyperimmune Milch erhalten hatte (Vergrößerung 5.500-fach). Die Pseudopodien (P) des Lungenmakrophagen (DC) haben |20 im AnfangsStadium der Phagozytose den im Alveolarlumen befindlichen Fremdkörper umgeben (siehe Pfeil).

Fig. 6 zeigt eine TEM-Aufnähme eines Makrophagen auf einer Alveolarzelle vom Typ 1 in der Lunge einer Ratte, die 3 Monate lang Zigarettenrauch ausgesetzt war und hyperimmune Milch erhielt (Vergrößerung 1.200-fach). Der Makrophage enthält phagozytiertes Material und ist gerade im Begriff, einen Fremdkörper (siehe Pfeil) im Alveolarlumen aufzunehmen. Die Kapillarlumina in den Alveolenwandungen werden von Erythrozyten eingenommen.

Die Erfindung betrifft ein natürliches Nahrungsmittel (Milch), das auf das Gefäß- und Pulmonalsystem von Säugern günstigen Einfluß hat, sowie ein Verfahren zur Herstellung der Milch. Da die erfindungsgemäße Milch ein na· türliches Produkt ist, kann sie zur Behandlung von mit einer Krankheit oder einer Verletzung zusammenhängenden Gefäßerkrankungen, mit dem Rauchen oder einer natürlichen Bedingung wie Gefäßalterung zusammenhängenden Lungenerkrankungen ohne die Gefahr von Nebenwirkungen verwendet werden.

Beispiele für Gefäßerkrankungen, die mit der erfindungsgemäßen Milch behandelt werden können, sind Erkrankungen infolge Alterung wie die Zunahme der Rigidität der Gefäße, die Zunahme der Häufigkeit der Erweiterung und Ausdehnung großer Arterien sowie die Zunahme von Aneurysmen, die sich in Bereichen bilden, in denen arteriosklerotische Plaques Überhand nehmen. Andere alterungsbedingte Gefäßschäden, die mit der erfindungsgemäßen Milch verhindert oder zurückgebildet werden können, sind die Zunahme der Dicke der.Arterienintima. Ferner läßt sich erfindungsgemäß die allmähliche Anhäufung an glatten Muskelzellen rückgängig machen und die Anhäufung an Lipid in der Arterienwandung vermindern.

Zu den abnormen, d.h. nicht alterungsbedingten Erkrankungen des Gefäßsystems, die mit der erfindungsgemäßen Milch behandelt, d.h. verhindert oder wieder rückgängig gemacht werden können, gehört die Arteriosklerose in ihrer atheromatosen und nichtatheromatosen Form. Zu den nichtatheromatosen Formen der mit der erfindungsgemäßen Milch behandelbaren Arteriosklerose zählt die Fokalverkalkung, d.h. die sogenannte Monckeberg-sklerose, die gewöhnlich in den unteren und oberen Extremitäten sowie im arteriellen System des Genitaltrakts bei beiden Ge-

schlechtem auftritt. Eine andere Erkrankung ist die FokalVerkalkung, verbunden mit der Degeneration von glatten Muskelzellen unter nachfolgender Calciumablagerung. Eine andere nichtatheromatose Form der Arteriosklerose ist die Arteriolosklerose, die mit hyalinen und allgemeinen Veränderungen in der Intima und Media kleiner Arterien und Arteriolen, insbesondere in der Milz, des Pankreas, der Nebenniere und der Niere verbunden ist.

Insbesondere kann die erfindungsgemäße Milch zur Behandlung von Atherosklerose verwendet werden. Diese Behandlung umfaßt die Verhinderung und Regression der Bildung der oben beschriebenen Fettstreifen, fibrösen Plaques und komplizierten Läsionen.

Obwohl es möglich ist, daß mit der erfindungsgemäßen Milch irreversible Risikofaktoren für die Atherosklerose wie mit dem männlichen Geschlecht zusammenhängende Merkmale oder genetische Merkmale (z.B. positive Familiengeschichte für frühzeitige Atherosklerose) nicht beseitigt werden können, so können damit doch die sogenannten reversiblen Faktoren beseitigt werden.

So z.B. kann die erfindungsgemäße Milch zur Verminderung der Anhäufung von Lipiden und zur Verhinderung bzw. Rückbildung von Hypercholesterinämie oder Hypertriglyceridämie verwendet werden. Es können verschiedene Formen der Atherosklerose behandelt.werden.

Außerdem kann die erfindungsgemäße Milch zur Rückbildung einiger schädlicher Wirkungen des Rauchens auf das Lungengewebe verwendet werden oder zumindest zum Schutz des Lungengewebes und verwandter Gewebe vor schädlichen

Einwirkungen und mit dem Rauch zusammenhängenden Erkran-. ' kungen, einschließlich der Verminderung der Zahl der

Makrophagen und der Verminderung ihrer Aktivität, d.h. ihres Phagozytosevermögens, der Zunahme der Zahl an Neutrophilen und Lymphozyten im Lungengewebe und der schädlichen Sekrete des Lungengewebes, der Zunahme der Stärke der Blut/Luft-Barriere und der damit möglicherweise verbundenen Kurzatmigkeit.

Der für das erfindungsgemäße Verfahren für die Milchgewinnung in Frage kommende Vertreter der Bovidae ist ein Milch produzierender. Vertreter der Gattung Bos, insbesondere Kühe. , ,

Die Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß ein Vertreter der Bovidae durch periodische Verabreichung eines Boosters aus einem Antigen oder einem Antigengemisch in einen spezifischen Immunisierungszustand gebracht, Milch mit von für die Behandlung von Gefäßerkrankungen sehr günstigen Eigenschaften produziert. Die günstigen Milcheigenschäften zeigen allerdings nicht alle immunisierten Bovidae. Die Verleihung der Immunsensibilität allein reicht noch nicht aus, um die gewünschten Eigenschäften der Milch hervorzurufen,· was die Tatsache zeigt, daß normale Kuhmilch diese Eigenschaften nicht aufweist, selbst wenn die Kuh gegen verschiedene Antigene während der normalen Immunisierung gegen Erkrankungen sensibilisiert worden ist.

Außerdem zeigt aus mit Boosterinjektionen im Immunzustand gehaltenen Boviden gewonnene Milch nicht immer diese Eigenschaften. Nur in einem spezifischen hyperimmunen Zustand zeigt die Milch die gewünschten Wirkungen. Dieser spezielle Zustand wird nur durch periodische Verabreichung von Boostern mit ausreichend hohen Dosen an Antigenen oder Antigengemischen erzielt. Der bevorzugte Dosisbereich beträgt dabei 50 % oder mehr als die

Dosis ausmacht, die für die Verleihung der primären Sensibilisierung des Vertreters der Bovidae erforderlich ist. Es liegt somit eine Schwelle für die Boosterdosierung vor, unterhalb der die Eigenschaften in der Milch nicht erzeugt werden, selbst wenn sich die Kuh in einem Zustand befindet, den man normalerweise als Immunzustand bezeichnet. Zur Erzielung des hyperimmunen Zustandes ist es wichtig, die Bovidenmilch nach einer ersten Reihe von Boosterverabreichungen zu testen. Hat die Milch nicht die gewünschten Eigenschaften, ist eine zweite Serie von Boostern in hoher Dosierung zu verabreichen. Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis die Milch die gewünschten Eigenschaften zeigt.

Das gesamte Verfahren umfaßt somit folgende Stufen:

1. Auswahl des Antigens.

2. Sensibilisierung des Vertreters der Bovidae durch primäre Immunisierung.

3. Test des Bovidenserums zum Nachweis der eingetretenen Sensibilität.

4. Verabreichung von Boostern in geeigneter Dosierung zur Verleihung und Aufrechterhaltung eines hyperimmunen Zustands.

5. Test auf Antialterungs- und antiarteriosklerotische Eigenschaften der Milch.

6. Gewinnung der Milch aus dem Vertreter der Bovidae während des hyperimmunen Zustands.

Stufe 1:

Es können beliebige Antigene oder Antigengemische verwendet werden. Die Antigene können Substanzen bakterieller, viraler, cellulärer oder anderer Herkunft sein, auf die das Iiranunsystem eines Vertreters der Bovidae anspricht. Der kritische Punkt an Stufe 1 ist, daß das Antigen die Fähigkeit haben muß, bei der Kuh den Zustand einer Immunsensibilität auszulösen. Das Antigen kann nach einem beliebigen, Sensibilisierung hervorrufenden Verfahren verabreicht werden. Vorzugsweise werden polyvalente Antigene wie Bakterien verwendet.

Stufe 2:

Das bevorzugte Verfahren der Immunisierung ist die intramuskuläre Injektion. Es kommen jedoch auch andere Verfahren wie intravenöse Injektion, intraperitoneale Injektion, orale Verabreichung, Rektalsuppositorien und andere in Frage, unter der Bedingung, daß die Dosis für die Induzierung der Sensibilität ausreicht. Die Dosis

c on

beträgt gewöhnlich Ix 10 Zellen bis 1 χ 10 Zellen,

8 10

vorzugsweise 10 Zellen bis 10 Zellen, insbesondere

2 χ 10⁸ Zellen.

In Stufe 3 wird festgestellt, ob bei der Kuh eine Sensibilisierung gegenüber dem Antigen eingetreten ist oder nicht. Aus dem Stand der Technik der Immunologie ist eine Reihe von Testverfahren zur Feststellung der Sensibilität bekannt (Methods in Immunology and ImmunoChemistry, William, CA., Chase, W.M. Academic Press, N.Y., London (Bd. 1-5) (1977)). Beispiele für derartige Tests sind Hautsensibilitätstests, Serumtests auf die Anwesenheit von Antikörpern als Reaktion auf die stimulierenden Antigene und Tests zur Bewertung der Fähigkeit von Immunzellen, aus dem Wirt auf das Antigen zu reagieren. Der zu verwendende Testtyp hängt weitgehend von der Art des

verwendeten Antigens ab. Das bevorzugte Verfahren besteht in der Verwendung eines polyvalenten Impfstoffes, bestehend aus einer Vielzahl von Bakterienarten als Antigen und im Test auf Anwesenheit agglutinierender Antikörper im Serum der Kuh vor und nach dem Immunitätstest. Das Auftreten von Antikörpern in der Milch nach der Immunisierung mit dem Impfstoff ist ein Indiz für die Sensibilität, wonach dann zu Stufe 4 übergegangen werden kann. Die für die Induzierung der Sensibilität erforderliche Minimaldosis an Antigen hängt vom verwendeten Antigentyp ab.

Stufe 4 umfaßt die Induzierung und Aufrechterhaltung des hyperimmunen Zustands. Ist der Vertreter der Bovidae einmal sensibilisiert, dann wird dieser Zustand durch wiederholte Boosterverabreichung bei geeigneter Dosierung in bestimmten Zeitabständen induziert. Diese hängen von der Art des Antigens ab. Für polyvalente bakterielle Antigene ist ein Zweiwochenintervall für die Boosterverabreichung am geeignetsten. Außerdem dürfen die Boosterverabreichungen nicht einen Zustand der Immuntoleranz hervorrufen. Dies bewirkt beim Tier einen Übergang aus einem hyperimmunen Zustand in einen Zustand der Immuntoleranz gegenüber dem Antigen, wodurch das Tier dann aufhört, Milch mit den günstigen Eigenschäften zu produzieren.

Außerdem ist z.B. auch eine Kombination aus den verschiedenen Immunisierungsverfahren möglich wie z.B. intramuskuläre Injektion für die primäre Immunisierung mit intravenöser Injektion für Boosterinjektionen usw. Zur Sensibilisierung und Induzierung des hyperimmunen Zustands kann sich der Fachmann verschiedenster Kombinationen von Immunisierungsverfahren bedienen.

Stufe 5 .dient zur Überprüfung der für die Behandlung von Gefäß- und/oder Lungenerkrankungen erforderlichen Eigenschaften der Milch. Zur Überprüfung der Wirkungen der hyperinununen Milch auf das Gefäß- und Pulmonalsystern von Tieren kann eine ganze Reihe von Untersuchungstechniken eingesetzt werden. Vorzugsweise kann als Testgewebe Kaninchen- oder Rattengewebe verwendet werden. Diese Tests umfassen in allen Fällen die Fütterung eines Kaninchens oder einer Ratte mit einer Diät, die hyperimmune Milch enthält, während eine Kontrollgruppe von Kaninchen mit einer Diät mit normaler Milch gefüttert wird. Nach einem vorher festgelegten Zeitabschnitt werden die Tiere getötet, wonach ihr Gefäß- oder Pulmonalsystem mit einer der folgenden Techniken untersucht werden kann: Rasterelektronenmikroskopie der Endokardialoberflache des Herzens bzw. der Bronchien der Lunge und der Lungenalveolen zur Feststellung von Endothelschäden bzw. der Anwesenheit von Fremdkörpern; Transmissionselektronenmikroskopie der Gefäße zur Feststellung von Lipidtröpfchen, Endotheldegeneration, Anwesenheit von Lipid in Schaumzellen oder der Tendenz von Fibrinoder Blutplättchen, der Lumenoberfläche von Endothelzellen anzuhaften; histologische Analysen an Herzen zur Feststellung von Lipiden, z.B. zum Nachweis von Lipiden mit öllöslichen Farbstoffen wie Oil Red oder Sudanschwarz an Schnitten aus gefrorenem Gewebe oder der Anwesenheit von Enzymen, insbesondere von Zytochromoxydase oder des Lungengewebes auf Phagozytose; histologische Untersuchung des Lungengewebes auf Infiltration von Neutrophilen und Leukozyten.

Stufe 6 umfaßt die Gewinnung und Verarbeitung der Milch. Die Milch kann nach den üblichen Methoden gewonnen werden, zum Schutz ihrer günstigen Eigenschaften ist je-

doch eine spezielle Behandlung erforderlich. Die günstigen Eigenschaften der Milch sind hitzeempfindlich. Daher ist die Pasteurisierung vorzugsweise bei niederen Temperaturen durchzuführen. Die Pasteurisierungstemperatur sollte 71°C während 15 Sekunden nicht übersteigen.

Nach der Pasteurisierung wird das Fett nach den üblichen Verfahren entfernt, wonach die Milch sprühgetrocknet wird. Man bedient sich dabei der üblichen Sprühtrocknungsverfahren, nur daß die Milch unter Vakuum bei niedriger Temperatur konzentriert wird, um ihre günstigen Eigenschaften nicht zu zerstören (siehe z.B. Kosikowski, F., "Cheese and Fermented Milk Products", 2nd Ed., 1977). Das Endprodukt ist ein Milchpulver, das günstige Eigenschaften aufweist.

Außerdem kann auch flüssige Milch verwendet werden, wie auch konzentrierte Milchprodukte oder eine Fraktion der Milch, welche den biologisch aktiven Faktor oder die biologisch aktiven Faktoren wie die saure Molkefraktion ^ enthält. /

Die Erfindung beruht teilweise auf der Entdeckung, daß die Milch aus einem hyperimmunen Vertreter der Bovidae günstige Eigenschaften auf das kardiovaskuläre System ausübt. So z.B. ist entdeckt worden, daß bei Herzen von weiblichen Kaninchen, die mit einer konstanten Diät von hyperimmuner Milch ernährt worden waren, die Endothelzellen vor ausgedehnten EndothelSchädigungen verschiedenen Grades geschützt waren, während Kaninchen, die mit normaler Milch gefüttert worden waren, starke Schädigungen zeigten. Bei letzteren zeigten sich Krater oder Hohlräume, wobei eine oder mehrere Zellen degeneriert waren oder sich losgelöst hatten, wohingegen dies bei mit hyperimmuner Milch gefütterten Kaninchen nicht der

Fall war. TEM-Aufnahmen von beiden Populationen von Kaninchen zeigten starke Unterschiede in den Blutgefäßen. Signifikante pathologische Merkmale der Blutgefäße bei den Kontrollherzen waren große Lipidtröpfchen, Endotheldegeneration, viele kleine Lipidvakuolen, einzelne oder viele große Lipidtröpfchen, die das Zytoplasma der Endothelzellen erfüllten, Schaumzellen mit Lipid und eine starke Tendenz der Fibrinplättchen, der Lumenoberfläche der Endothelzellen anzuhaften. Sämtliehe oben erwähnten Störungen begleiten die Pathogenese der Atherosklerose. Diese Störungen wurden bei . Blutgefäßen von repräsentativen Bereichen von Kaninchenpopulationen, die mit konstanter HyperimmunmiIchdiät ernährt wurden, nicht festgestellt. Histologische Schnitte durch Herzen von mit HyperimmunmiIch gefütterten Kaninchen einerseits und mit Kontrollmilch gefütterten Kaninchen andererseits zeigten, daß in den Lumina einiger Blutgefäße der Kontrollherzen Lipid war und die Herzmuskelfasern der Kontrollherzen mit Lipid erfüllt waren. Die Koronargefäße von mit HyperimmunmiIch ernährten Kaninchen zeigten keine atherosklerotischen Lipidablagerungen, wie sie bei den Kontrollgefäßen festgestellt wurden.

Die Ergebnisse zeigen eindeutig, daß die hyperimmune Milch die Pathogenese der Arteriosklerose und die Alterung des Herzens verlangsamt und/oder unterdrückt.

Die an den Kaninchenpopulationen durchgeführten Tests sowie klinische Versuche am Menschen haben eindeutig ergeben, daß eine Diät mit der erfindungsgemäßen hyperimmunen Milch zu einer Verminderung des Serumcholesterinspiegels sowie zu einer deutlichen Verringerung des Triglyceridspiegels und des Spiegels an Lipiden von geringer Dichte führt, d.h. zur Herabsetzung sämtlicher

für kardiovaskuläre Erkrankungen entscheidender Risikofaktoren.

Die Erfindung beruht teilweise auch auf der Entdeckung, daß die aus hyperiinmunen Boviden gewonnene Milch einen günstigen Einfluß auf das Pulmona1 system von Tieren ausübt, die Rauch ausgesetzt sind und insbesondere deren Lungengewebe schützt. So z.B. wurde gefunden, daß in Lungen von Ratten, die mit konstanter Hyperimmunmilchdiät ernährt wurden und Zigarettenrauch ausgesetzt waren die Zahl der Neutrophilen und Lymphozyten, die durch die Raucheinwirkung in die Lungen eingedrungen waren, verglichen mit Kontrollgruppen erheblich herabgesetzt ist. Außerdem ist die Alveolenoberflache bei Ratten, die hyperimmune Milch erhielten und Rauch ausgesetzt waren "reiner" als bei Ratten, die nur Rauch ausgesetzt waren oder Rauch + Kontrolle, d.h. normale Milch. Die hyperimmune Milch scheint die Aktivität der Lungenmakrophagen zu steigern. Die Makrophagen in den Bronchiolen und Alveolen von mit hyperimmuner Milch gefütterten Ratten waren aktiver in der Phagozytose von vom Rauch herrührenden Fremdkörpern in der Lunge von Ratten, die Rauch ausgesetzt waren, als bei Ratten, die lediglich Rauch oder Rauch + Diät aus nicht-hyperimmuner Milch ausgesetzt waren. Außerdem war die Blut/Luft-Barriere bei Ratten, die Rauch ausgesetzt waren und mit einer Hyperimmunmilchdiät gefüttert worden waren, kleiner als bei Ratten, die lediglich Rauch ausgesetzt waren oder Rauch + normaler Milchdiät.

Neben dem kardiovaskulären Gewebe wurden noch 16 andere Gewebe, die jeweils eine oder mehrere Komponenten jedes größeren Organsystems darstellten und von denselben Tieren stammten, untersucht. Die hyperimmune Milch zeigte dabei keine negative Wirkung auf eines dieser

Gewebe.-

Die erfindungsgemäße Milch kann in einer beliebigen Menge bereitgestellt werden, wie sie für die Beseitigung der Gefäßerkrankungen oder mit dem Rauchen zusammenhängenden Lungenerkrankungen an Warmblütern erforderlich ist. Je nach den besonderen Umständen der Erkrankung und der Säugerart können täglich Mengen von 1 ml bis 10 1, bezogen auf flüssige Milch, bereitgestellt werden. Dieselben Mengen können auch an gesunden Individuen zu prophylaktischen Zwecken verwendet werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Milch periodisch, z.B. täglich in Dosierungen von ca. 40 g, über längere Zeit wie z.B. während 15 bis 30 Tagen und darüber bis zu mehreren Jahren verabreicht. Es versteht sich von selbst, daß die Behandlungsdauer durch Steigerung der Tagesdosen verkürzt werden kann. Außerdem können kleinere Dosen, über den Tag verteilt, wirksamer sein als eine einzige Dosis einmal pro Tag.

Die vom Fett befreite Milch kann in jedes beliebige Nahrungsmittel eingearbeitet werden, solange dieses nicht bei einer Temperatur behandelt wird, die zu hoch ist und die gefäßtherapeutischen Eigenschaften des Produktes inaktivieren würde. Bevorzugt ist eine Temperatur von unter 150 C. Zum Beispiel können Puddings oder Yoghurt mit hyperimmuner Milch zubereitet werden.

Ferner wurde gefunden, daß die Molkefraktion den bzw. die für die festgestellten und oben beschriebenen gün-

stigen Eigenschaften verantwortlichen Stoff(e) enthält. Diese saure Molkefraktion kann ferner Sirupen, Eismischungen, Konfekt, Getränken, Futtermitteln oder ähnlichem zugesetzt werden (siehe Kosikowski,ibidem, S. 446). Für den Durchschnittsfachmann, der weiß, daß die Molkefraktion wichtige Faktoren enthält, ist einsichtig, daß zur Gewinnung wirksamer Fraktionen eine weitere Auftrennung durchgeführt werden kann.

Zur Linderung von mit dem Rauchen zusammenhängenden Erkrankungen kann ferner die Milch in die zu rauchende Substanz eingearbeitet werden, wie z.B. durch Besprühen des Tabaks mit einer Aerosolform der Milch.

Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung folgt nun eine detailliertere Beschreibung unter Bezugnahme auf bestimmte spezifische Beispiele, die jedoch die Erfindung lediglich illustrieren und, wenn nicht anders angegeben, nicht einschränken sollen.

Milchbereitung Beispiel 1 \

Fünf Holstein-Kühe wurden gegen Escherichia coli (Ame- j rican Type Culture Strain No. 13076) immunisiert. Die ^! primäre Immunisation erfolgte durch intramuskuläre Injektion eines in physiologischer Kochsalzlösung suspendierte, durch Hitze abgetötete Zellen von E. coli enthaltenden Impfstoffs. Die Konzentration der Bakterien-

8 3 3

zellen betrug 4 χ 10 /cm . Eine Dosis von 5 cm (20 χ

10 ) Zellen wurde intramuskulär einmal wöchentlich während 4 aufeinanderfolgenden Wochen injiziert. Die während der 5. Woche gewonnene Milch wurde auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen E. coli getestet. Die An-

wes.enhei.t von Antikörpern gegen E. coli wurde nach einem Mikroagglutinationsverfahren ermittelt. Dieses besteht darin, daß man verschiedene Verdünnungen der Milchmolke mit einer festgelegten Konzentration an in einem Puffer suspendierten Zellen von E. coli reagieren läßt. Die Anwesenheit von Antikörpern in der Milch verursacht die Agglutination der Bakterienzellen. Von der Milch wird eine Verdünnungsreihe hergestellt, wobei schließlich eine Verdünnung erzielt wird, bei der die Antikörperkonzentration so gering ist, daß sie keine Agglutinationsreaktion mehr hervorruft. Die maximale Verdünnung, die Agglutination auslöst, ist der Antikörpertiter. Die Anwesenheit einer hohen Antikörperkonzentration in der Milch ist ein Indiz dafür, daß die Immunisierung eine Sensibilisierung des Immunsystems gegenüber dem Antikörper auslöst. In Tabelle 1 wird der Antikörpertiter gegenüber E. coli bei 5 Kühen vor und nach der primären Immunisierung verglichen.

Tabelle 1

Milchantikörpertiter bei 5 Kühen vor und nach der Immunisierung gegen E. coli

Kuh Nr. Vor der Immunisierung nach der Irnmunisierung

1 0 640

2 0 1.280

3 0 5.000

4 0 1.280

5 0 10.000

In jedem Falle war nach der Immunisierung ein starker Anstieg des Milchtiters gegen E. coli zu verzeichnen. Daraus wurde geschlossen, daß die Immunisierung eine

Sensibilisierung der Kuh gegen E. coli ausgelöst hat. Nach der Sensibilisierung wurden den Kühen alle 14 Tage Boosterinjektionen derselben Antigendosis verabreicht, wodurch ein hyperimmuner Zustand erreicht wurde, der während der gesamten Zeitdauer, während der die Milch täglich gewonnen und zur Gewinnung von MagermiIchpulver behandelt wurde, aufrechterhalten wurde.

Das nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene Magermilchpulver wurde mit einer Reihe von unten angeführten Tests auf seine günstigen Eigenschaften hin getestet.

Beispiel 2

Analog Beispiel 1 wurde ein identischer Versuch durchgeführt, nur daß als ausgewähltes Antigen ein polyvalenter Impfstoff verwendet wurde, der die in Tabelle angeführten Bakterienstämme enthielt. Diese wurden durch Mischen von gleichen Gewichtsanteilen von lyophilisierten Bakterienzellen miteinander vereinigt, wonach das erhaltene Gemisch in physiologischer Kochsalzlösung zur Erzielung einer mit Beispiel 1 identischen Konzentration verdünnt wurde. Der Ergebnisse der Tests an der mit diesen ausgewählten Antigenen hergestellten Milch waren, wie unten ausgeführt, positiv.

Tabelle 2
Bakterienantigene

Mikroorganismus ATTC Nr.

Staphylococcus aureus 11.631

Staphylococcus epidermidis 155

Streptococcus pyogenes, A. Typ 1 8.671

Tabelle 2 (Fortsetzung)

Mikroorganismus ATTC Nr.

Streptococcus pyogenes, A Streptococcus pyogenes, A Streptococcus pyogenes, A Streptococcus pyogenes, A Streptococcus pyogenes, A Streptococcus pyogenes, A Streptococcus pyogenes, A Aerobacter aerogenes Escherichia coli Salmonella enteritidis Pseudomonas aeruginosa Klebsieila pneumoniae Salmonella typhimürium Haemophilus influenza Streptococcus viridans Proteus vulgaris Shigella dysenteriae Streptococcus, Gruppe B Diplococcus pneumoniae Streptococcus mutans

Corynebacterium, Acne, Typ 1 und 2

Typ	3	10.389
Typ	5	12.347
Typ	8	12.389
Typ	12	11.434
Typ	14	12.972
Typ	18	12.357
Typ	22	10.403
		884
		26
		13.076
		7.700
		9.590
		13.311
		9.333
		6.249
		13.315
		11.835

* American Type Culture Collection 12301 Parklawn Drive
Rockville, Maryland 20852

Es muß festgestellt werden, daß die in diesem Beispiel hergestellte Milch identisch ist mit einer bevorzugten Ausführungsform der US-PS 4 284 623. Die dort geoffen-30 barte Milch hat antiinflammatorische Eigenschaften.

■ ■ 343934

Beispiel 3

Ein Stamm von Streptococcus mutans wurde mit bekannten Techniken gezüchtet. Kulturen von S. mutans AHT (serologische Gruppe a), BHT (Gruppe b), 10.449 (Gruppe c) und 6.715 (Gruppe d) wurden in dialysiertem Tryptosemedium gezüchtet. Danach wurden die Zellen durch Zentrifugieren bei 4.000 χ G abgeerntet und fünfmal mit 0,1 M mit Phosphat gepufferter physiologischer Kochsalzlösung bei pH 7,0 gewaschen. Dann wurden die Zellen durch Erwärmen bei 60⁰C während 30 Minuten inaktiviert und erneut suspendiert bis zu einer Endkonzentration von S-. mutans AHT, BHT, 10.449 und 6.715 bei 5 x 10⁸ Zellen/ml. Dieses Präparat wurde dann zur Immunisierung von 2 Kühen verwendet. Jede Kuh wurde bei zwei verschiedenen Gelegenheiten mit frischem Antigen aus allen 4 Gruppen von S. mutans (Gruppe a, b, c und d) immunisiert. Danach wurde eine Kuh zur Bildung eines Milchproduktes mit bekannten Techniken gemäß dieser Erfindung immunisiert. Nach der Immunisierung wurden von dieser Kuh Blutproben entnommen, bis der Serumantikörpertiter seinen höchsten Wert erreichte, wonach dann die Milch gewonnen wurde. Die Milch selbst wurde dann getrocknet und pulverisiert, wiederum mit bekannten Techniken, wodurch man ein Milchpulver mit nützlichen Eigenschaften erhielt.

Es muß festgestellt werden, daß die nach diesem Beispiel hergestellte Milch identisch ist mit der in der B-PS 1 505 513 von Beck geoffenbarten Karies inhibierenden Milch.

Beispiel 4

Zur Immunisierung einer Kuh und Erzielung einer hyperimmunen Milch mit kardiovaskulärer oder pulmonaler Wirkung wurde der in Tabelle 3 angegebene polyvalente Impf-

stoff entsprechend Beispiel 2 verwendet.

Tabelle

Bakterien

ATTC Nr.

1. Pseudomonas aeruginosa

2. Pseudomonas maltophiia

3. Streptococcus equisimili

4. Streptococcus dysgalactiae,

5. Streptococcus uberis

6. Streptococcus bovis 7. Streptococcus bovis

8. Pasteurella multocida

9. Pasteurella multocida

10. Pasteurella haemolytica

11. Pasteurella multocida 12. Moraxella bovis

13. Actinobacillus lignieresi

14. Corynebacterium renale

15. Fusobacterium necrophorum

16. Bacillus cereus 17. Salmonella dublin

18. Salmonella heidleberg

19. Salmonella paratyphi

20. Yersinia enterocolitica

14.212 17.666

9.542 27.957 27.958 15.351 27.960

9.659

6.533 14.003 15.743 10.900 13.372 10.848 25.286 25.621 15.480

8.326 1U511

9.610

Biologische Untersuchungen
A. Kardiovaskuläre Wirkungen
Material und Methoden

1. Tiere

Für die Untersuchungen wurden 9 junge adulte weibliche Kaninchen der Rasse New Zealand White verwendet. Die Kaninchen waren im College of Medicine's Vivarium der Universität von Süd-Alabama in Mobile untergebracht. Der Raum, in dem die Kaninchen gehalten wurden, wurde bei 22°C gehalten, wobei 12 Stunden lang Licht einwirkte und danach 12 Stunden Dunkelheit während jeder 24-stündigen Periode. In jedem Käfig wurde jeweils nur ein Kaninchen gehalten.

Die Kaninchen wurden mit der unten angegebenen Diät gefüttert und nach Abschluß der Fütterung während der zweiten und dritten Woche getötet.

2. Diät

Die Kaninchen waren in zwei Gruppen eingeteilt. Beide Gruppen erhielten ad libidum ausgewogenes Laborfutter.

Die Kontrollkaninchen in Gruppe 1 (N = 4) erhielten Jerrell's entfettete Trockenmilch, gelöst in Wasserleitungswasser (15 g Trockenmilch/500 ml Wasser). Die Versuchskaninchen in Gruppe 2 (N = 5) erhielten dieselbe Konzentration an trockener hyperimmuner Milch aus Beispiel 1, 2, 3 oder 4, die ebenfalls in Wasserleitungswaser gelöst wurde. Die Wasser-Milch-Mischung wurde täglich gewechselt. Die frische Mischung wurde in sterilisierten Glas- oder Plastikflaschen gegeben. Die Kaninchen erhielten keine Flüssigkeit außer das zum

Lösen der Trockenmilch verwendete Wasser.

3. Üntersuchungsmethoden

Nachdem die Kaninchen 3 Monate lang die gelöste entfettete Trockenmilche (Gruppe 1) oder hyperimmune Milch getrunken hatten, wurden sie gewogen und durch Injektion von Natriumpentabarbital in die Ohrvene anästhesiert. Das Körpergewicht jedes Kaninchens wurde zum Zeitpunkt der Tötung verglichen mit dem Körpergewicht am ersten Tag der Diät. Es wurde kein wesentlicher Unterschied zwischen dem Körpergewicht der Kaninchen, die hyperimmune Milch erhalten hatten, und dem der Kaninchen, die entfettete Trockenmilch erhalten hatten, festgestellt. Danach wurden die Herzen und die großen Gefäße an der Basis des Herzens entfernt und für die Untersuchung nach verschiedenen Verfahren präpariert. Die Proben bekamen einen Kode, so daß der Untersuchende nicht wußte, ob es sich um Kontroll- oder Versuchsmaterial handelte.

Ergebnisse und Diskussion

1. Rasterelektronenmikroskopie

Für die Rasterelektronenmikroskopie wurden die Innenflächen (Endokardialflächen) des Herzens bei verschiedenen Vergrößerungen (XlO - 40.000) abgetastet. Bereiche von speziellem Interesse (mindestens 5 willkürlich ausgewählte Bereiche pro Herz) wurden untersucht und photographiert.

Die Kontrollherzen zeigten im Gegensatz zu den Versuchsherzen ausgedehnte, nach Ausmaß und Schwere unterschiedliche Schäden. Wo eine oder mehrere Zellen degeneriert waren oder sich losgelöst hatten, zeigten sich Krater oder Hohlräume. Kleine Hohlräume waren in vielen Zellen

vorhanden. In manchen Fällen war eine fibrinähnliche Substanz mit den Blutkörperchen vermischt und in den Kratern oder um diese herum waren Blutplättchen. Dies wurde als Stadien in der Bildung von atheromatosen Thromben interpretiert.

Der Verlust an Endothelzellen in den Kontrollherzen würde das Blut in den Herzkammern der Einwirkung des Endokardbindegewebes aussetzen und zur Thrombenbildung führen. Die Rasterelektronenmikroskopie zeigt, daß demgegenüber hyperimmune Milch die Endothelzellen von Kaninchen schützt und Thrombogenese verhindert.

2. Transmissionselektronenmikroskopie Die Transmissionselektronenmikroskopie hat große Unterschiede in den Blutgefäßen zwischen den Kontroll- und Versuchsherzen ergeben. Bedeutsame pathologische Merkmale der Blutgefäße an den Kontrollherzen sind: (1) große Lipidtröpfchen, die manchmal die Gefäßlumina verstopfen; (2) Endotheldegeneration; (3) zahlreiche kleine Lipidvakuolen in den Endothelzellen; (4) einzelne oder zahlreiche große Lipidtröpfchen, die das Zyto- ' plasma der Endothelzellen fast zur Gänze erfüllen;

(5) mit Lipid beladene Schaumzellen; (6) starke Tendenz des Fibrins bzw. der Plättchen, der Lümenoberfläche der Endothelzellen anzuhaften.

Alle beschriebenen Störungen begleiten die Pathogenese der Atherosklerose. Koronar-, Nieren- und Gehirnarterien sind bekanntlich besonders anfällig für Atherosklerose. Die Blutgefäße sind eher fokal betroffen als über ihre gesamte Länge. Diese Erkrankung wurde an Blutgefäßen von repräsentativen Bereichen der Kaninchenherzen nicht festgestellt, die Immunmilch getrunken hatten.

3. Histologie

Ein Teil der Herzen von allen Kontrollkaninchen wurde in Paraffin eingebettet und ein Teil in Kunststoff. Die in Kunststoff eingebetteten Proben wurden mit einer Dicke von 1 um geschnitten und mit Toluidinblau oder Paragon gefärbt. Sie ergaben zwei Unterschiede zwischen den Kontroll- und Versuchsherzen: (1) In den Lumina einiger Blutgefäße der Kontrollherzen war Lipid vorhanden, und (2) einige Herzmuskelfasern von Kontrollherzen waren von Lipid erfüllt. Die Herzen von Kaninchen, die Immunmilch getrunken hatten, zeigten diese Merkmale nicht.

4. Nachweis der Lipide

Die Lipide wurden nach zwei Standardmethoden lokalisiert, und zwar mit Oil Red O und Sudanschwarz B. Mit beiden Methoden können an Schnitten von gefrorenem Gewebe Lipide selektiv nachgewiesen werden.

Mit jeder Methode ließen sich in der Tunica intima und Tunica media der Blutgefäße an den Kontrollherzen Lipidablagerungen nachweisen. Die Intima und die Media der Kontrollaorten waren besonders stark von Lipid infiltriert. Die Intimen der Blutgefäße an den Kontrollkaninchen enthielten für Atherosklerose typische,mit Lipid zusammenhängende Verdickungen. Die Koronargefäße der mit Hyperimmunmilch gefütterten Kaninchen zeigten demgegenüber keine atherosklerotxsche Lipidablagerungen.

5. Enzyme

Untersucht und an gefrorenen Schnitten der Kontroll- und Versuchskaninchenherzen wurden die Aktivitäten folgender Enzyme: (1) saure Phosphatase, (2) alkalische Phosphatase, (3) Isocitratdehydrogenase, (4) Succinatdehydrogenase und (5) Cytochromoxidase. Die Aktivität der sau-

ren Phosphatase wurde auch biochemisch ermittelt.

Unter den zahlreichen Enzymen, deren Aktivitäten bewertet wurde, zeigte nur die Citochromoxidase (ein mit der Alterung zusammenhängendes Enzym) eine erheblich höhere Aktivität bei den Kontrollherzen als bei den Versuchsherzen. Es ist bemerkenswert, daß die Kontrollherzen Foci von Herzmuskelfasern enthielten, die ca. 1 mm im Durchmesser maßen und sich stark anfärben ließen. Diese Bereiche waren offensichtlich sehr reich an Mitochondrien und können fokale Bereiche der Alterung darstellen.

6. Blutspiegel

Die Analyse der Cholesterinspiegel im Serum bei den untersuchten Kaninchen zeigte eine deutliche Absenkung im Serumcholesterinspiegel. Diese Kontrollkaninchen, die mit einer Diät ohne Hyperimmunmilch gefüttert worden waren, zeigten einen Durchschnittsserumcholesterinspiegel um 0,445 mg/el. Demgegenüber zeigten die mit einer Diät aus HyperinununmiIch gefütterten Kaninchen nicht einmal einen halb so hohen Serumcholesterinspiegel (0,217 mg/cl). Darauf beruhen vermutlich die oben erörterten physiologischen Verbesserungen.

7. Klinische Untersuchungen

Es wurde an drei Personen mit klinischen Untersuchungen begonnen, um den Wert der erfindungsgemäßen Hyperimmunmilch bei der Herabsetzung der Piasmalipidwerte festzustellen. Obwohl diese Untersuchungen noch nicht abgeschlossen sind, zeigen sie schon jetzt eindeutig, daß der Wert der Hyperimmunmilchdiät in der Verminderung der Lipidwerte liegt. Obwohl aus einleuchtenden Gründen keine Tests gegenüber Kontrollen durchgeführt worden waren, konnten doch bei allen 3 Personen die Lipidwerte

erheblich herabgesetzt werden. Die exakten Lipidwerte sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

B. Pulmonale Wirkungen

Ähnlich den oben beschriebenen Untersuchungen im Hinblick auf die kardiovaskuläre Wirkung wurden auch Untersuchungen zur pulmonalen Wirkung an Ratten zur Feststellung des Einflusses einer Hyperxnununmilchdiat auf Zigarettenrauch ausgesetzte Säuger durchgeführt. Die Ernährung und die Untersuchungsmethode waren im wesentliehen dieselben, wie sie oben im Zusammenhang mit den Untersuchungen der kardiovaskulären Wirkungen angewandt wurden, nur daß die Versuchstiere weibliche Albinoratten des Charles Rivers CD-Stammes waren. Insgesamt wurden für die Untersuchungen 68 Ratten verwendet.

15 Tabelle 4

Plasmalipidwerte für den Menschen

CHOL LDL 17,0 10,7

14,0 8,3

17,3 11,4 15,6 9,7 15,0 8,8

Person 3 M

Beginn 67,5 26,9

6 Wochen nach der
Immunisierung 19,0 26,4 18,1

	Person 1 F	der	TRIG
	Beginn		8,8
20	6 Wochen nach Immunisierung		6,1
	Person 2 F	der
	Beginn	der	7,1
	6 Wochen nach Immunisierung	6,9
25	12 Wochen nach Immunisierung	8,7

Tabelle 4 (Fortsetzung)

Person 3 M

12 Wochen nach der Immunisierung

TRIG

21,0

CHOl

26,5

LDL 17,8

5 Werte = mg/cl

Ergebnisse und Diskussion

Die histologischen Untersuchungen haben ergeben, daß die dem Rauch nicht ausgesetzten Lungen der Kontrollratten und die Lungen der mit Hyperimmunmilch gefütterten und dem Rauch ausgesetzten Ratten weit weniger Neutrophile enthielten als die Lungen Rauch ausgesetzter Ratten bzw. von solchen Ratten, die sowohl Rauch ausgesetzt waren als auch mit normaler bzw. Kontrollmilch gefüttert worden waren. Auch war die Zahl der Lymphozyten in den Lungen der Kontrolltiere geringer und noch weiter herabgesetzt in dem mit den Bronchien verbundenen Lymphgewebe bronchial-associated lymphoid tissue ( = BALT\J in den Lungen· von Ratten, die mit Hyperimmunmilch gefüttert worden waren und dem Rauch ausge-

20 setzt waren.

Die REM-Aufnahmen der Oberfläche der Alveolen von Rauch ausgesetzten und mit Hyperimmunmilch gefütterten Ratten war erheblich sauberer als die von Ratten, die lediglich Rauch ausgesetzt waren oder sowohl Rauch ausgesetzt als auch mit Normal- oder Kontrollmilch gefüttert worden waren. Die HyperimmunmiIchdiät scheint die Aktivität der Lungenmakrophagen (DC) zu steigern. Die Lungenmakrophagen waren in den Bronchien, Bronchiolen und Alveolen in den Lungen von Rauch ausgesetzten und

mit Hypeximitiunmilch gefütterten Ratten hinsichtlich der Phagozytose weit aktiver als nach den übrigen Versuchsbedingungen. Unter den Rauch ausgesetzten Ratten zeigten nur die mit Hyperimmunmilch gefütterten auf der Oberfläche der Alveolarzellen vom Typ 1 in den Gasaustauschpassagen und auf den Epithelzellen der luftführenden Gänge ständig Lungenmakrophagen. Die Pseudopodien der Lungenmakrophagen (DC) phagozytierten die Produkte der Epithelzellen und andere vorhandene Zelltrümmer bzw. Fremdkörper. Die physiologische Aktivität der luftführenden und respiratorischen Anteile der Lunge konnten bei mit Hyperimmunmilch gefütterten Ratten selbst bei starker Sekretion und Anwesenheit von mit dem Zigarettenrauch zusammenhängenden Fremdkörpern aufrechterhalten werden.

Die Blut/Luft-Barriere war in Lungen von Ratten, die lediglich Rauch ausgesetzt waren oder außerdem noch mit Normal- oder Kontrollmilch gefüttert worden waren, stärker als bei Rauch ausgesetzten und mit Hyperimmunmilch gefütterten Ratten. Die stärkere Blut/Luft-Barriere steht vermutlich in engem Zusammenhang mit der in Verbindung mit dem Zigarettenrauchen häufig beobachteten Kurzatmigkeit.

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Claims

ν . F O N E R E B ΈΤΊ TsI G >T A U S FINCK PATENTANWÄLTE EUROPEAN PATENT ATTORNEYS MARIAHILFPLATZ 2 & 3, MÖNCHEN 9O O / O Q O / IT POSTADRESSE: POSTFACH 95 O1 6O, D-8OÖO MÜNCHEN 95 Stolle Research and Development Corporation 26. Oktober 1984 DEAA-32298.5 VERWENDUNG HYPERIMMUNER MILCH ZUR BEHANDLUNG VON TIEREN UND MENSCHEN Patentansprüche

1. Verwendung hyperimmuner Milch zur Behandlung von Herziger äßerkrankungen an Tieren und Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß die hyperimmune .Milch aus einem in hyperimmunem Zustand gehaltenen Vertreter der Familie Bovidae gewonnen und in einer Menge und über einen Zeitraum verwendet wird, die bzw. der für die Erzielung einer antiarteriosklerotischen bzw. die Alterung hemmenden Wirkung auf die Gefäße ausreicht.

2. Verwendung hyperimmuner Milch für die Behandlung von mit Umweltfaktoren zusammenhängenden Erkrankungen des Pulmonalsystems an Tieren und Menschen, dadurch gekennzeichnet _r daß die hyperimmune Milch aus einem in hyperimmunem Zustand gehaltenen Vertreter der Familie Bovidae gewonnen und in einer Menge und über einen

Zeitraum verwendet wird, die bzw. der für die Erzielung einer Verminderung der Zahl der Neutrophilen und Lymphozyten im Lungengewebe, für die Phagozytose von Fremdkörpern im Lungengewebe sowie zur Verminderung der Blut-Luft-Barriere ausreicht.

3. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Herzgefäßerkrankung Arteriosklerose ist.

4. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Umweltfaktoren durch Verbrennung von Tabak entstandener Rauch sind.

5. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Arteriosklerose atheromatotisch oder nicht-atheromatotisch ist.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Erkrankung Atherosklerose ist.

7. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Herzgefäßerkrankung die normale Alterung des Gefäßsystems ist. · ·

8. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,, daß die Milch in Pulverform vorliegt.

9. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Milch in flüssiger Form vorliegt.

10. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge-

kennzeichnet , daß die Milch in konzentrierter Form vorliegt.

11. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Milch ein sie enthaltendes Nahrungsmittel ist.

12. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Nahrungsmittel Joghurt ist.

13. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß der Vertreter der Bovidae eine Kuh ist.

14. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß der Vertreter der Bovidae durch Verabreichung von Booster-Injektionen aus einem Antigen oder einem Gemisch von Antigenen im hyperimmunen Zustand gehalten wird.

15. Verwendung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet , daß der Booster aus Antigen oder Antigengemisch in einer Dosierung von 10 Zellen bis

20
10 Zellen injiziert wird.

16. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß die Milch durch ein Verfahren hergestellt wird, das folgende Stufen umfaßt: Sensibilisxerung eines Vertreters der Bovidae mit einem Antigen oder einem Gemisch von Antigenen,

Verabreichung von Antigen-Boostern bei einer für die Induzierung und Aufrechterhaltung eines hyperimmunen

Zustandes bei dem Vertreter der Bovidae ausreichenden Dosierung und

Gewinnung der Milch aus dem Vertreter der Bovidae.

17. Verwendung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren noch folgende Stufen umfaßt:

Pasteurisierung der gesammelten Milch und

Entfernung des Fetts aus der Milch.

18. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die Milch täglich verabreicht wird.

19. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß die Milch in eine Substanz aufgenommen wird, die bei der Verbrennung Rauch erzeugt.

20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Substanz Tabak ist.

21. Verwendung hyperimmuner Milch zur Verminderung des Lipidspiegels im Blut von Tieren und Menschen, dadurch g e kennzeichnet , daß die hyperimmune Milch eine aus einem in einem hyperimmunen Zustand gehaltenen Vertreter der Bovidae gewonnene Milch ist und in einer Menge und solange verwendet wird, bis der Lipidspiegel herabgesetzt ist.

22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Lipide ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Triglyceriden, Cholesterin,

34 3 3 3

Lipide von geringer Dichte und Gemische davon.

23. Verwendung hyperimmuner Milch zur Stimulierung der Makrophagenaktivitat im Pulmonalsystem von Tieren und Menschen, dadurch gekennzeichnet , daß die hyperimmune Milch eine aus einem in einem hyperimmunen Zustand gehaltenen Vertreter der Bovidae gewonnene Milch ist und in einer Menge und solange verwendet wird, bis die Makrophagenaktivitat ansteigt.