DE3339408A1 - Verfahren zur elektrochemischen feststellung und klassifizierung mikrobieller zellen - Google Patents

Verfahren zur elektrochemischen feststellung und klassifizierung mikrobieller zellen

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Tadashi Ichikawa Chiba Matsunage
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Description

KABUSHIKI KAISHA ADVANCE KAIHATSU KENKYUDO
Tokio (Japan)
Verfahren zur elektrochemischen Feststellung und Klassifizierung mikrobieller Zellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur elektrochemischen Feststellung und Klassifizierung mikrobieller Zellen, insbesondere lebender mikrobieller Zellen. Es ermöglicht die Bestimmung sowohl der Anzahl der (lebenden) Zellen als auch der Art der Zellen von beispielsweise Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen»
Die Feststellung lebender Zellen von Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen ist für klinische Zxieclce, den Umweltschutz, die Bioindustrie usw. von außerordentlicher Bedeutung. Die Anzahl der Zellen wurde bisher beispielsweise mit Hilfe von Trübungsmethoden oder direkter mikroskopischer Zählmethoden bestimmt. Bei diesen Methoden ist es jedoch schwierig;, lebende von toten Zellen zu unterscheiden. Zur Feststellung lebender mikrobieller Zellen werden Kolonie-Zählverfahren angewendet, die auf der Bildung von Kolonien beruhen« Diese Methoden sind jedoch außerordentlich zeitraubend (z.B. kann es einen Tag oder langer dauern, bis Untersuchungsergebnisse vorliegen), überdies kompliziert und störanfällig.
Auch die Klassifizierung oder Identifizierung der Art von beispielsweise Mikroorganismen ist für klinische und zahlreiche industrielle Zwecke sehr wichtig. Die praktische Ausführung einer solchen Untersuchung ist
jedoch außerordentlich schwierig und langwierig, da eine klassifizierende Feststellung oder Identifizierung in der Regel mit Hilfe von Kolonie-Zählverfahren vorgenommen wird, bei denen sogenannte selektive Medien oder mikroskopische Direktzählmethoden benutzt werden.
Andererseits wurde bereits die Erscheinung beobachtet, daß ein elektrischer Strom erzeugt wird, wenn lebende mikrobielle Zellen mit einer Elektrode in Berührung kommen. Ein Zählverfahren unter Verwendung einer elektrochemischen Zelle wurde in den Zeitschriften Anal. Chim. Acta £8 (1978^j s· 25J Appl. Environ. Microbiol. _37 (1979), S. 117; und
J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 10 (1980), S. 125, beschrieben. Dieses Verfahren weist jedoch noch Nachteile auf; die Genauigkeit der Bestimmung ist nicht ausreichend, und die Bestimmung von Zellarten sowie die Unterscheidung mikrobieller Eigenschaften sind nicht geklärt.
Es stellte sich daher die Aufgabe, die Nachteile des vorstehend erwähnten Verfahrens zu beseitigen und ein Verfahren anzugeben, mit dem sowohl die Anzahl lebender mikrobieller Zellen als auch die Art der Zellen bestimmt werden kann.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die im Anspruch 1 angegebenen Maßnahmen gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen aufgeführt.
An Hand der Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1: eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zur zyklischen Voltammetrie, wie sie bei dem Verfahren gemäß der Erfindung verwendet wird; 30
Fig. 2: eine schematische Darstellung eines Differential-Impuls-Polarographen, der sich insbesondere zur Unterscheidung von Zellen nach dem Verfahren gemäß der Erfindung eignet;
35
ΟΛΟ ««**
Λ ft G Ό O Ski «9
Fig. 3: einen Graphen, der die zyklischen Voltammogramme einer Suspension lebender Zellen nach Beispiel 1 veranschaulicht;
Fig. 4: einen Graphen, der die Korrelation zwischen den Spit-
zenstromstärkea i und der Quadratwurzel der Kippge-
P /
schwindigkeiten des Potentials υ1 2 veranschaulicht;
Fig» 5: einen Graphen, der die Korrelation zwischen der Spit-ζenstromstärke Ί und der Zellenkonzentration Cq ver-
P
anschaulicht;
Fig. 6: einen Graphen, der die zyklischen Voltammogramme von
Zellensuspensionen des Beispiels 3 veranschaulicht; 15
Fig. 7: einen Graphen, der die Voltammogramme von Baoillus subti- VLs gemäß Beispiel 4 veranschaulicht;
Fig. 8: einen Graphen, der die zyklischen Voltammogramme einer Zellensuspension des Beispiels 6 veranschaulicht;
Fig. 9: einen Graphens der die Korrelation zwischen den Spitzenstromstärken % und der Zellenkonzentration Cn
P
des Beispiels 6 veranschaulicht;
Fig. 10: einen Graphen, der die Korrelation zwischen den Spitzenstromstärken % und den Konzentrationen 3P veranschaulicht;
Fig. 11: eine schematische Darstellung eines Elektrodensystems
zur Feststellung von mikrobielle Zellen nach Beispiel 9; und
Fig. 12: einen Graph, der die zyklischen Voltammogramme der mikrobiellen Zellen des Beispiels 9 veranschaulicht.
» »β
Es wurde festgestellt, daß nach dem Verfahren gemäß der Erfindung nicht nur die Anzahl von Zellen mit außerordentlich hoher Genauigkeit bestimmt werden kann, sondern daß auch Informationen erhalten werden können, die die Feststellung der Arten der mikrobiellen Zellen aus Differenzen zwischen Spitzenpotentialen ermöglichen. Dies wird dadurch erreicht, daß ein Kipp-Potential an ein Elektrodenpaar nach verschiedenen Methoden der Voltammetrie, wie der zyklischen Voltammetrie, der Differential-Impuls-Polarographie, der phasenempfindlichen Wechselstrom-Polarographie und der Rechteckwellen-Polarographie, angelegt wird, während das Elektrodenpaar in die Zellensuspension eingetaucht wird, und daß dann der zwischen den Elektroden fließende Strom gemessen wird. Besonders wenn ein allmählich zunehmendes Gleichstrom-Kipp-Potential mit einem überlappenden Feinpotential bei einer Methode der Differentialpolarographie, der phasenempfindlichen Wechselstrom-Polarographie oder der Rechteckxjellen-Polarographie in Gegenwart von 4,4'-Bipyridin als stromstärkeerhöhendes Mittel auf eine Zellsuspension angewandt wird, können verschiedene Arten von mikrobiellen Zellen mit hoher Genauigkeit festgestellt oder voneinander unterschieden werden, indem der erzeugte und durch das 4,4'-Bipyridin erhöhte Differentialstrom gemessen wird.
Die Unterscheidung und Identifizierung von mikrobiellen Zellen wird dadurch möglich, daß bei den vorstehend genannten Methoden die Potentiale, die eine maximale Stromstärke ergeben ("Spitzenstrom-Potentiale") je nach der Art der mikrobiellen Zellen verschieden sind.
Nachstehend werden Einzelheiten der Erfindung erläutert.
Praktisch alle mikrobiellen Zellen von Mikroorganismen, Tieren und Pflanzen können mit Hilfe des Verfahrens gemäß der Erfindung festgestellt werden. Beispiele sind die Zellen von Mikroorganismen, wie Bakterien, Actinomyceten, Pilzen,, Mikroalgen und Hefen sowie verschiedene Zellen von Tieren und Pflanzen, wie Erythrocyten, Leucocyten, Tumorzellen und gezüchtete tierische und pflanzliche Zellen. Die ,mikrobiellen Zellen können sowohl differenziert oder identifiziert als auch gezählt werden. Ferner kann auch eine weitgehende Unterscheidung, wie eine Trennung in gramnegative und grampositive Bakterien, eine Differenzierung von Re-
■β 7 «.
vertanten und Nichtrevertanten in einem sogenannten Arnes-Test und andere ähnliche Unterscheidungen betroffen werden, wenn die entsprechenden Untersuchungsbedingungen eingehalten werden.
Bei der Ausführung der Erfindung können verschiedene gebräuchliche VoI-tammetrie-Vorrichtungen verwendet werden. Ein typisches Beispiel einer Voltammetrie-Vorrichtung ist in Figur 1 dargestellt. Sie besteht aus einer Elektrolyseselle 4 mit einer Arbeitselektrode 1, einer Gegenelektrode 2 und einer Bezugselektrode 3, beispielsweise einer Natriumchlofid-Kalomel-Elektrode (im folgenden als "SSCE" bezeichnet), ferner einem Potentiometer 5S einem linearen Kippgenerator 6 und einem X,Y-Schreiber 7„ -Als Elektroden können verschiedene gebräuchliche Elektrode^ wie solche aus Platin, Gold, Silber und Kohle (oder Graphit), oder verschiedene modifizierte Elektroden, wie die vorgenannten Elektroden mit Polymerüberzvigen, verwendet werden= Wenn das Potential der Gegenelektrode 2 stabil und konstant ist«, kann eine gebräuchliche Schaltung ohne Bezugselektrode 3, wie sie bei der konventionellen Polarographie verwendet wird, benutzt werden.
Die Untersuchung kann in der Regel wie folgt ausgeführt werden. Eine Suspension lebender mikrobieller Zellen,, wie die Aufschwemmung einer Kultur von Mikroorganismen;, wird in die Elektrolysezelle 4 eingefüllt, ein zyklisches Kipp-Potential an die Elektroden angelegt und dann der zwischen den Elektroden fließende Strom gemessen. Als Kipp-Potential wird am besten eine sogenannte lineare Kippänderung des Potentials im Verhältnis zur Zeit angewendet.
Die so erhaltene Stromstärke-Potential-Kurve (das "Voltammogramm") zeigt nicht nur eine der Zellenkonzentration proportionale maximale Stromstärke ("Spitzenstroni" oder "Spitzenstromstärke"), sondern auch ein Spitzenpotentials, das je nach Art der mikrobiellen Zellen verschieden ist, wie weiter unten erläutert wird. Aufgrund der Spezifität der Kurven können auf diese Weise Informationen erhalten werden, die zur Identifizierung von Mikroorganismen,, wie Bakterien, ausreichen. Insbesondere für praktische Zwecks bietet die Erfindung folgende bemer-
kenswerte Vorteile gegenüber bekannten Verfahren:
1. Es kann eine genauere Bestimmung ausgeführt werden, da die Dauer der Untersuchung oder Messung wesentlich kürzer ist und verschiedene störende Faktoren bei der Elektrodenreakticn durch Verwendung des Kipp-Potentials ausgeschaltet werden.
2. Es kann nicht nur die Konzentration oder Ansahl der Zellen bestimmt, sondern gleichzeitig auch eine Identifizierung der Art der mikrobiellen Zellen vorgenommen werden. Das Verfahren eignet sich daher ausgezeichnet zur Feststellung oder Unterscheidung mikrobieller Zellen auf verschiedenen Gebieten, wie einer Realzeitkontrolle von Gärprozessens der Bestimmung einer Verunreinigung von Wasser durch Mikroorganismen sowie der Bestimmung der Anzahl von Erythrocyten und Leucocyten.
Figur 2 veranschaulicht schematisch ein Beispiel eines Differential-Impuls-Polarographen,, der sich besonders zur Unterscheidung von Zellen eignet. Die Vorrichtung besteht aus einer Zelle 14 mit einer Arbeitselektrode 11, einer Gegenelektrode 123 einer Bezugselektrode 13, einem Impulsgeber 15, einem PotentialprograiEmierer 160 einem Potentiometer 17, einem Tropfenbildner 18S einem i/E-Konverter 19, Probenhalter 110 und 111, einem Differenzverstärker. 112 sowie einem Schreiber 113. Die Arbeitselektrode 11 und die Gegenelektrode 12 bestehen aus Kohle, wie Grundflächen-Pyrolysegraphit (BPG)s hochreinem Graphit für die Spektroskopie (HPG), Platin,, Gold oder Silber. Die Bezugselektrode ist eine Natriumchlorid-Kalomel-Elektrode (SSCE) oder eine Kalomel-Elektrode (SCE).
In diesem Fall kann die Bestimmung in der Regel wie folgt ausgeführt werden. Eine Suspension lebender Zellen, wie die Aufschwemmung einer Kultur von Mikroorganismen, wird in die Elektrolysezelle 14 eingefüllt, an die Elektroden ein allmählich ansteigendes Kipp-Potential, das von einem Feinpotential überlappt wirdj, angelegt und dann der erzeugte Strom gemessen. In. der Regel wird am besten einesogenannte lineare
«ti OQ O oft α Λ λ t
^ ODO QQöO <3 ή
η & ο ο ο ο β ο ο φ β
λ 0 Q O O 0 (5 O
-<«»»α οο ι>οο ί* & ββ t
Ablenkung aagst-jsEidets die das Pofieatial proportional zur Zeit ändert.
Als Feinpotentials, das das Kipp-Potential überlappt, wird am besten ein solches gewählt,, das eins solche Wellenform und einen solchen Zy-Iclus hats daß der gewünschte Differentialstrom erhalten wird.
Die so erhaltenaa VoltsmmogrsEsa® zeigen Spitsenpotentiale, die je nach Art der HiikrobielleH Zellen deutlich voneinander verschieden sind. An Hand dieser SpitseapottentiaH-Jerte können die Arten mikrobieller ZeI-. len. unterschieden werden« Femer können durch eine Analyse der Wellenform der Spitse laforsafcioaea über elektrochemische Aktivitäten von Mikroorganismen,, wie Bakterien, gewonnen werden. Daher können verschiedene Bakterien oder andere Mikroorganismen im Vergleich zu bekanntea Verfahren in außerordentlich kurser Zeit unterschieden und identifiziert werden»
Wie bereits erwähnt,, wird bei dem Verfahren gemäß der Erfindung vorteilhafterweise 4P4S-Bipyridin (BP) als wichtiges Aktivierungsmittel zur Förderung des Elektronenübergangs zwischen Zellen und Elektrode verwendet- BP nimmt an der Reaktion zwischen den Zellen und der Elektrode teil;, wenn ©s direkt einer Suspension von Zellen zugesetzt oder an der Elektrode5 beispielsweise in einer Nitrocellulosemembran, fixiert wirdο Die Konsentration des BP in der Zellsuspension kann je nach Art der festzustellenden mikrobiellen Zellen in einem weiten Bereich schwanken,, beträgt aber in der Regel einige Millimol bis etwa 100 mtnol.
Bei Ausführung der Voltametrie in Gegenwart von BP wird die Spitzenstroaistärke um das I95*- bis 2a5-=fache erhöht,, die Wellenform wird deutlichs und im Falle des Differentialstromes wird der Gipfel scharf ausgeprägt O
Ferner kann BP in folgender Weise direkt an die Arbeitselektrode gebunden werden» Beispielsweise wurde eine Elektrode aus Grundflächen-Pyrolysegraphit mit einer Oberfläche von O9I? cm2 hergestellt. Die Elektrode
W V β «β «
b «I S β Ue ·> „aw ο α β» ^ «ί
10 -
wurde mit einer wäßrigen Suspension von Aluminiumoxid der Korngröße 3 μπι auf einem Poliertuch poliert. 1,56 g BP wurden in 100 ml Methanol gelöst, so daß die Lösung eine BP-Konzentration von 100 mmol hatte. Unter leichtem Rühren wurde die Graphitelektrode 1 Minute in diese Lösung eingetaucht. Vor jeder Bestimmung wurde die Elektrode in dieser Weise poliert und modifiziert, um unerwünschte elektrochemische Signale von an der Oberfläche adsorbierten Arten gering zu halten.
Es ist zu beachten, dafi bei der Verwendung von Zellsuspensionen, die in einem Autoklaven 10 Minuten bei 120 0C sterilisiert worden sind, oder von Protoplasten bei der Voltananetrie keine Differentialstromspitze erhalten werden kann. Die Erscheinung, auf der das Verfahren gemäß der Erfindung beruht, ist also für lebende mikrobielle Zellen spezifisch.
15
Ferner können, wie weiter unten im Beispiel 9 beschrieben wird, poröse Träger aller Art, wie Membranfilter, zum Fixieren mikrobieller Zellen verwendet werden, wodurch ein enger Kontakt zwischen den Zellen und der Arbeitselektrode erreicht wird. Bei Verwendung solcher poröser Träger können auch Suspensionen mit geringer Zellkonzentration untersucht werden, da die Zellen auf dem porösen Träger in hoher Konzentration festgehalten werden.
Der Elektronenübergang von mikrobiellen Zellen auf eine Arbeitselektrode hängt wahrscheinlich eng mit der Bildung und Regeneration von Coenzymen zusammen. Der Spitzenstroaa scheint daher mit dem Stoffwechselweg in Beziehung zu stehen. Werden Stoffwechselinhibitoren, wie Rotenon, Antimycin, Cyanid und Arsenit einer Zellsuspension, z.B. von Saaaharomyaes eevewisiae, zugesetzt;, so hemmen Rotenon, Antimycin und Cyanid die Elektronentransportkette der Mitochondrien. Obwohl Rotenon speziell den Elektronenübergang in der Nicotinsäureamid-Adenindinucleotid-(NADH)-Dehydrogenase, Antimycin den Elektronenfluß zwischen den Cytochromen b und c hemmen und Cyanid den Elektronenfluß zwischen dem Cytochromoxidase-Koraplex und Sauerstoff blockiert, vermindert der Zusatz von Rotenon (7,6 mmol), Antimycin (5,7 mmol) und Cyanid (10,8 mmol)
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ρ, r» θα I3 00 β ö ft if ββ
11 -
den Spitzenstrom des zyklischen Voltammogramms der Zellsuspension (2s4°108 Zellen/ml) nicht., Diese Ergebnisse sprechen dafür, daß die Spitzenstrom-Erzeugung nicht mit der oxidativen Phosphorylierung im Innern der Mitochoadrien korreliert ist. Vom Arsenit ist bekannt, daß es die Pyruvatdanydrogeasse aeamt., Der Spitzenstrom des zyklischen Voltammogramms nimmt von 4SS μΑ auf 3,7 μΑ ab, wenn der Zellsuspension (25,4"1O8 Zellen/al) 10 smol Arsenit zugesetzt werden. Die Erzeugung eines SpitzenstroHis hängt daher mit der Pyruvatdehydrogenase und dem Citronensäurezyklus zusammen» Wenn in der Zellwand vorkommende Verbindüngen durch Beschallen der ganzen Zellen in einer Pufferlösung eluiert werden,, nimmt der Spitzenstroa der ganzen Zellen ab. Andererseits nimmt der Spitzenstrosa des Eluats2 der bei O965 V (gegen SSCE) erscheint, allmählich zu« Da die Beschallung die Anzahl der lebensfähigen Zellen in der Pufferlösung nicht beeinflußt., deuten diese Ergebnisse darauf hin5 daß bei der Beschallung elektroaktive Substanzen aus der Zellwand in die Pufferlösung eluiert und elektrochemisch erfaßt worden sind. Die Absorption des Eluats bei 260 rau, die dem Adeninring entspricht, nimnt wie der Spitzenstrom zus wenn die Zellsuspension beschallt wird. Cofaktorens wie MADH2 Kicotinsäureamid-Adenindinucleotid-phosphat (NADPH)5, Flavinmononueleo'cid (FMiJH2) und Coenzym A (CoA), die einen Adeninring haben5 können elektrochemisch oxidiert werden. Eine Absorption bei 340 nms die dem NaDH und NADPH entspricht, sowie eine Absorption bei 445—450 nm3 die dem FMNH2 und dem Flavin-Adenindinucleotid (FADH2) entspricht,, werden jedoch bei dem Eluat nicht erhalten. Das escperimentelle Halbwellenpotential von NADH und NADPH erstreckt sich an der Kohleelektrode von 0s35 bis 0s75 V (gegen SCE). FMNH2 und FADH2 sollen bei -0s4 V (gegen SCE) elektrochemisch oxidiert werden. Die zyklischen Voltammogransie von NADH und CoA werden mit einer BP-G-Elektrode erhalten» Die Spitzenströme werden beim NADH bei 0,35 V (gegen SSCE) und beim CoA bei O965 V (gegen SSCE) beobachtet. Das Spitzenpotential von CoA entspricht demjenigen des Eluats aus den beschallten Zellen, Das CoA in dem Eluat kann nach der Methode von Stadtman und Mitarbeiter enzymatisch bestimmt werden. Gefunden wurden 3,6 mmol CoA in dem Eluat» Wenn mikrobiella Zellen beschallt xjerden, steigt mit der Konzentration des CoA in dem Eluat auch der Spitzenstrom. Die Zu-
O « 9 9
- 12 -
nähme des von dem Eluat erhaltenen Spitzenstromes ist also auf eine Zunahme der CoA-Konzentration in der Pufferlösung zurückzuführen. Andererseits nimmt der von den ganzen Zellen erhaltene Spitzenstrom ab, wenn das in der Zellwand vorhandene CoA durch Beschallen der ganzen Zellen in einer Pufferlösung eluiert wird. Diese Ergebnisse zeigen, daß das in der Zellwand vorkommende.CoA den Elektronenübergang zwischen Zelle und Graphitelektrode vermittelt. Das von dem Eluat erhaltene Spitzenpotential, das demjenigen des CoA entspricht, ist von demjenigen, das bei den ganzen Zellen erhalten wird, verschieden. Das Spitzenpotential hängt vom pH-Wert ab und scheint sich aus der Differenz zwischen dem pH-Wert der Pufferlösung und dem pH-Wert der lokalen Umgebung des CoA in der Zellwand zu ergeben.
An Hand nachstehender Beispiele wird die Erfindung näher erläutert. Alle Prozentangaben sind,, soweit nicht anders angegeben, Massen- oder Gewichtsprozente.
BEISPIEL 1
20
Sacoharomyces aereoisiae (Brothefe;, ATCC 7754) wurde aerob 8 Stunden bei 30 °C in einem Medium mit einem pH-Wert von 6,0 gezüchtet, das 2% Pepton, 2% Glucose und 1% Hefeextrakt enthielt. Die gezüchteten Zellen wurden gesammelt und mit einem 0,1-m Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen. Durch Suspendieren der Zellen in einer 0,1-m Phosphatpuffer-Lösung wurde eine Zel!suspension von einer bestimmten Zellkonzentration mit einem pH-Wert von 7,0 hergestellt. Diese Zellsuspension wurde in eine 15-ml-H-Zelle eingefüllt. Durch die Zellsuspension wurde 10 Minuten Luft geleitet; dann wurde eine Graphitelektrode von 6 mm Durchmesser eingeführt und das elektrochemische Verhalten der Suspension bei einer Temperatur von 25 0C mit einer Potentialänderungsgeschwindigkeit von 5 mV/s nach der Methode der zyklischen Voltammetrie untersucht. Als Gegenelektrode wurde ein Platindraht, als Bezugselektrode eine Kalomelelektrode verwendet. Die Temperatur bei der Voltammetrie betrug 25 0C.
Ort® O«
- 13 -
Wach dem Eintauchen der Elektroden in die Suspension lebender Zellen, die 1s5°?08 Zellen/ml enthielt,, wurden zyklische Voltammogramme in jedem Kipp-Potential erhalten^ wie in Figur 3 dargestellt. In dieser Figur bedeuten i. die Stromstärke OjA)5 E den Potentialwert (V) sowie as b und c Wellenkurven bei einer Potentialänderungeschwindigkeit von 20 mV/S9 10 mV/s und 5 mV/s» Wenn, wie aus Figur 3 ersichtlich, ein ICipp~Potential von 0 bis 1 V (gegen SSCE) angelegt wurde, erschien ein Spitzenstrom bei etwa O57 VD Dieser Gipfel wurde nicht beobachtet, wenn nur Phosphatpuffer verwendet oder die Zellsuspension in einem Autoklaven 10 min bei 110 0C sterilisiert wurde. Auch wenn die Graphitelektrode mit einer Dialysemembran bedeckt wurde, so daß die Elektrode mit den Zellen nicht in Berührung kommen konnte, wurde kein Gipfel beobachtet= Es kann somit festgestellt werden, daß ein Spitzenstrom erhalten wird,, wenn lebende Zellen mit der Elektrode in Berührung kommen.
Wenn andererseits der Spitzenstrom Ί des in vorstehend beschriebener Weise erhaltenen zyklischen Voltammogranms über der Quadratwurzel der PotentialänderungeschwindigkeiffF aufgetragen wurde, wie in Figur 4 dargestellt,, so ergab sich eine lineare Korrelation zwischen i und ~§Va Das bedeutet,, daß anscheinend die Diffusion die geschwindigkeitsbestimmende Stufe beim Elektronenübergang zxiischen Zellen und Elektrode ist„ Folgende Beziehung ist erfüllt:
i = Co» W2,
tr
worin Co die Gesamtkon2entration der Zellen ist-
Die Korrelation zwischen der Zellkonzentration Cq und dem Spitzenstrom ■i ist in Figur 5 dargestellt» Wie daraus ersichtlich, besteht eine lineare Korrelation zwischen i und C0. Somit ist klar, daß die Konzentration der Hefesellen aus dem Wert von i. bestimmt werden kann. Die
P ,
Bestimmungsgrenzen für die Zellkonzentration erstreckten sich von 10
Zellen/ml bis 10B Zellen/ml^ dieser Bereich ist für die praktische Bestimmung der Zellkonzentration bei der Überwachung eines Gärprozesses ausreichend»
35
V β ■* Ψ V
tr<9
- 14 -
Die vorstehend angegebene Beziehung wurde auch bei Lactobacillus fer mentiert (das ist Lactobacillus fermentum ATCC 9938), Bacillus subtilis (das ist Bacillus subtilis ATCC 6633), Bacillus sp. und Escherichia coli (die Empfindlichkeit, d.h. Spitzenstromstärke/Zellkonzentration, betrug in den vorgenannten Fällen etwa ein Zehntel derjenigen bei der Hefe) sowie bei menschlichen Erythrocyten und Chang -Leberzellen (hergestellt von der Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd.) (in diesen Fällen war die Empfindlichkeit fast die gleiche wie bei der Hefe) erhalten.
BEISPIEL 2
Saccharomyces cevevisiae ATCC 7754 und Bacillus subtilis wurden aerob 12 Stunden bei 37 0C in zwei Nährmedien mit einem pH-Wert von 7,0 gezüchtet, die die in den Tabellen 1 und 2 angegebenen Zusammensetzungen hatten.
Tabelle 1 Glucose Tabelle 2 Glucose 40 g
Pepton Pepton 10 g
Hefeextrakt Hefeextrakt 5 g
KH2PO4 NaCl 5 g
MgSO4 Reines Wasser 2 g
Reines Wasser auf 1 Liter
10 g
10 g
5 g
5 g
auf 1 Liter
15 -
Die bei dem Verfahren des Beispiels 1 verwendeten Elektroden wurden in den Kulturbehälter eingetaucht und die Anzahl der lebenden Zellen sowie die Spitzenströme ■£_ in Realzeit überwacht. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde außerdem durch ein Kolonien-Zählverfahren bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 wiedergegeben. Wie ersichtlich, besteht eine außerordentlich gute Korrelation zwischen der Anzahl der lebenden Zellen und dem Spitzenstrom i .
Tabelle 3
10
Zeit (Stunden) Zellen (108AaI) 0, 3 o, 5 1, 7 3 9 12 2
Anzahl der lebenden O5 24 o, 52 0, 3 0 ,1 4, 76
ip (μΑ) 04 09 23 ,56 o,
Tabelle 4
Zeit (Stunden) 2 4 6 8 12
"" ~
Anzahl der lebenden Zellen (109/ml) 1,4 5,2 11,1 16,7 18,9 ip (μΑ) O528 1,05 2,21 3,35 3,77
BEISPIEL 3
Lebende Zellen von Sacohavomyces oereoisiae (d.h. Saccharomyoes oeve- visiae ATCC 7754)s Bacillus sp, und E. col/L wurden getrennt in einer 0j,1-m Phosphatpuffer-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 suspendiert. So wurden Suspensionen lebender Zellen mit Zellkonzentrationen von 1.03-109, 5s0-10s und 1s0»109 Zellen/cm3 hergestellt.
Jede Zellsuspension wurde in eine Elektrolysezelle mit einer Elektrodenflache von 0,28 cm2 und einem Zellvolumen von 15 cm3 eingefüllt; dann wurde eine £,2?—Kurve bei Umgebungstemperatur (23 0C) mit einer Poten-
tialänderungeschwxndigkeit von 10 mV/s aufgenommen. Die Ergebnisse sind in Figur 6 wiedergegeben, in der die Kurven a, b und c Saccharomyaes cevev-isi-ae, Bacillus sp. und E. coli- entsprechen. Wie aus Figur 6 ersichtlich, sind die Potentiale, bei denen die Spitzenströme auftreten, bei den Bakterien verschieden, so daß die Bakterien deutlich voneinander unterschieden werden können.
BEISPIEL 4
Bacillus subt-ilis IFO 3009 wurde aerob bei einer Temperatur von 30 0C auf einem Nährboden gezüchtet, der 1% Fleischextrakt und 1% Pepton enthielt. Die gezeüchteten Zellen wurden in einer Log-Phase gesammelt und mit einer 0,1-m Phosphatpuffer-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 gewaschen. Die Zellen wurden dann in der gleichen Phosphatpuffer-Lösung zu einer Suspension aufgeschwemmt, die eine Konzentration von 1,2·109 Zellen/cm3 hatte.
In gleicher Weise wurden getrennt Saacharomyces eevewis-iae (in einem YPD-Medium, das 1% Hefeextrakt, 2% Polypeptid und 2% Glucose enthielt), Lactobacillus fementim IFO 3071 (auf einem Nährboden), Leuaonostoc mesentevoides IFO 3832 (auf einem Tomatensaft-Nährboden, der 1% Trypton, 1% Hefeextrakt und 20% Tomatensaft enthielt) sowie Eschevichia coVi (auf einem Nährboden) 12 Stunden bei einer Temperatur von 30 0C gezüchtet. Die gezüchteten Zellen wurden in einer Log—Phase gesammelt und in der vorstehend genannten Phosphatpuffer-Lösung zu Suspensionen aufgeschwemmt, deren Konzentration an lebenden Zellen 1,03·109, 5,0·108, 1,3-1O9 und 1,0-1O10 Zellen/cm3 betrug.
Jede Suspension lebender Zellen wurde in eine 15-ml-H-Zelle gefüllt.
Dann wurde eine Differential-Impuls-Voltammmetrie mit einem Kipp-Potential von 0 bis 1,0 V (gegen SSCE), einer Sampling-Zeit von 20 ms, einem Impulshöhenpotential von 50 und 100 mV und einer Potentialänderungsgeschwindigkeit von 0,5 mV/s bei einer Temperatur von 25 0C ausgeführt, wobei eine BP-Graphit-Arbeitselektrode, eine Platindraht-Gegenelektrode
3333408
- 17
und eine SSCE-Bezugselektrode verwendet wurden. Als Polarograph wurde der "Polarograph Type 312" von Fuso Seisaku Co. benutzt.
Die von S. subtiZis erhaltenen Voltammogrannne sind in Figur 7 wiedergegeben. Sehr deutliche Potentialspitzen waren bei 0,68 V (gegen SSCE) zu beobachten. Die Kurven (a) und (b) entsprechen den Impulshöhen 100 bzw. 50 mV. Die Potentialspitzen aller Bakterien sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5 Mikroorganismus Spitzenpotential
(V""- gegen SSCE)
So subtztis 0,68
So eevewLsiae 0,74
Laet, fevmentvm 0,75
Leuco, mesentero-ides 0,80
27. aoti 0,85
Aus den in Tabelle 5 wiedergegeben Resultaten ist ersichtlich, daß die Bakterienarten deutlich und leicht voneinander unterschieden werden können. Insbesondere ist zu beachten., daß das gramnegative Bakterium SO aoVi deutlich von den grampositiven Bakterien unterschieden werden kann.
BEISPIEL 5
Salmonella typhimiwium TA 98 und TA 100 wurden unabhängig voneinander 1. in einem Bioassay-Histidin-Mediurn (hergestellt von der Takara Kohsan COoj, Ltd.)s 2. in einem Bioassay-Histidin-Medium, dem 0,075 mmol Histidin zugesetzt worden wara und 3. in einem Bioassay-Histidin-Medium, dem O9O75 mmol Histidin und 0^07 jjg/ml N~Methyl-N!-nitro-N-nitroguanidin zugesetzt worden waren, gezüchtet. Es wurden daher Varianten und Wichtvarianten von TA-98 und TA-100 erhalten.
- 18 -
Diese Mikroorganismen wurden unabhängig voneinander in einer 0,1-m Phosphatpuffer-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 aufgeschwemmt, so daß Zellsuspensionen erhalten wurden, die jeweils 2,1-1O9 Zellen/cm3 enthielten. Von diesen Zellsuspensionen wurden in der vorstehend beschriebenen Weise Differential-Impuls-Voltammograimne aufgenommen. Die Spitzenpontiale der Zellen sind, in Tabelle 6 wiedergegeben.
Tabelle 6 His" (V gegen SSCE)
Zellart HiS+ 0,70
0,60
TA 98
TA 100		 0,90
0,92
BEISPIEL 6
Saochavomyoes eerev-Lsiae (ATCC 7754) wurde aerob 8 Stunden bei 30 0C in einem Medium gezüchtet, das einen pH-Wert von 6,0 hatte (und 2% Pepton, 2% Glucose sowie 1% Hefeextrakt enthielt. Die gezüchteten Zellen wurden gesammelt und mit 0,1-m Phosphatpuffer gewaschen. Dann wurden durch Suspendieren der Zellen in dem genannten Phosphatpuffer Suspensionen mit bestimmten Zellkonzentrationen hergestellt..
Die Zellsuspension vmrde in eine 15-ml-H-Zelle gefüllt. Durch die ZeIlsuspension wurde 10 Minuten Luft geleitet; dann wurde eine BP-Graphit-Elektrode mit einem Durchmesser von 6 mm in die Zelle eingetaucht und das elektrochemische Verhalten bei einer Temperatur von 30 0C und einer Potentialänderungsgeschwindigkeit von 10 mV/s nach der Methode der zyklischen Voltammetrie untersucht. Als Gegenelektrode wurde ein Platindraht, als Bezugselektrode eine SSCE-Elektrode verwendet.
Nach dem Eintauchen der Elektroden in die Suspension, die 1s5·10a lebende Zellen/ml enthielt, wurden die in Figur 8 wiedergegebenen Voltammogramme bei jedem Kipp-Potential erhalten. In Figur 8 bedeuten Ί die Stromstärke (uA) und E das Potential; a und b sind Wellenkurven, die
339408
ohne Zusatz von BP (a) und mit Zusatz von 50 nrniol BP (b) erhalten wurden» Wie aus den in Figur 8 wiedergegebenen Resultaten ersichtlich ist, tritt beim Anlegen eines Potentials von 0 bis 1 V (gegen SSCE) bei etwa O57 V ein verstärkter Spitzenstrom auf, insbesondere bei Zugabe von BP.
Dieser Gipfel wurde nicht beobachtet, wenn nur eine Phosphatpuffer-Lösung verwendet wurde oder die Zellsuspension in einem Autoklaven 10 Minuten bei 110 0C sterilisiert worden war. Ein Gipfel wurde auch nicht beobachtet, wenn die Graphitelektrode mit einer Dialysemembran bedeckt wurde;, so daß die Elektrode mit den Zellen nicht in Berührung kommen konnte. Diese Ergebnisse bestätigen, daß ein Spitzenstrom erhalten werden lcann5 wenn lebende Zellen mit der Elektrode in Berührung kommen.
Figur 9 zeigt den Zusammenhang zwischen der Zellkonzentration Cq und dem Spitzenstrom ip im Fall der vorstehend genannten zyklischen Voltammogramme,, die in Gegenwart von 50 mmol BP erhalten wurden. Die in Figur 9 dargestellten Ergebnisse bestätigen, daß eine lineare Korrelation zwischen £„ und C0 besteht. Daraus ergibt sich, daß die Konzentration der Hefezellen aus dem i -Wert bestimmt werden kann. Der Erfassungsbereich der Zellkonzentration erstreckte sich von 106 bis 109 Zellen/ml und reichte somit aus, die Zellkonzentration bei einem Gärprozeß zu bestimmen. Die Anzahl der Zellen in einem Gärbehälter oder Fermenter können daher nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren bestimmt werden.
25
Ferner zeigt Fig. 10 den Zusammenhang zwischen dem Spitzen-
strom i und den BP-Konzentrationen 1,5 χ 10 Zeilen/ml. P
Ferner x^urden im Falle von Bacillus subtilis IFO 3009, Lactobacillus fermentum IFO 3071, Leueonostoa mesenteroides IFO 3832 und. 3. coli im Verhältnis zur BP-Konzentration um das 1,5- bis 2,5-fache verstärkt, und die Spitzenwelle bekam eine ausgeprägte Form in Gegenwart von BP.
BEISPIEL 7
Sacchavomyoes cerevisiae und Bacillus subtilis (IFO 3009) wurden aerob 12 Stunden bei 37 0C in zwei Mährmedien gezüchtet, das einen pH-Wert
•υ«
:·"··' 34-3-9408
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von 7,0 und die in den Tabelle 7 und 8 angegebenen Zusammensetzungen hatten.
Tabelle 7 40 g Tabelle 8 10 g
Glucose 10 g 10 g
Pepton 5 g 5 g
Hefeextrakt 5 g 5 g
KEi2PO4 2 g auf 1 Liter
MgSO4 auf 1 Liter
Reines Wasser
Glucose
Pepton
Hefeextrakt
NaCl
Reines Wasser
Die bei dem Verfahren des Beispiels 6 verwendeten Elektroden wurden in den Kulturbehälter eingetaucht und in Gegenwart von 10 mmol BP die Anzahl der lebenden Zellen sowie der Spitzenstrom ·£„ in Realzeit überwacht. Die Anzahl der lebenden Zellen wurde auch mit Hilfe eines KoIonien-Zählverfahrens bestimmt. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 9 und 10 wiedergegeben. Diese Ergebnisse zeigen eine außerordentlich gute Korrelation zwischen der Anzahl der lebenden Zellen und dem Spitzenstrom i>p.
Tabelle 9
Zeit (Stunden) Zellen (108/ml) o, 3 o, 5 1 7 3 9 12
Anzahl der lebenden o, 24 Ο» 52 0 ,3 1 ,1 4,2
-Cp (μΑ) 08 18 ,47 ,13 1,51
- 21 -
Tabelle 10
Zeit (Stunden) 2 4 6 8
ikssahl der lebenden Zellen (109/ml) 1,4 9,2 11,1 16,7 18,9
ip OjA) 0,50 1,89 3,98 6,03 6,78
BEISPIEL 8
Bacillus sübtiliä IFO 3009 wurde aerob bei einer Temperatur von 30 0C in einem Nährmedium gezüchtet, das 1% Fleischextrakt und 1% Pepton enthielt. Die gezüchteten Zellen wurden in einer Log-Phase gesammelt und mit einer 0,1-m Phosphatpuffer-Lösung mit einem pH-Wert von 7,0 gewasehen» Danach wurden diese Zellen in der gleichen Phosphatpuffer-Lösung 2U einer Zellsuspension aufgeschxiemmt, die eine Konzentration von 1a2«t09 Zellen/cm3 hatte.
In gleicher Weise wurden Sacahavomyces ceveoisiae (in einem YPD-Medium, das 1% Hefeextrakt, 2% Polypeptid und 2% Glucose enthielt), Lacto bacillus fermentvm IFO 3071 (in einem Nährmedium), Leuconostoc mesen- tevoides IFO 3832 (in einem Tomatensaftmedium, das 1% Trypton, 1% Hefeextrakt und 20% Tomatensaft enthielt) sowie Escherichia coli (in einem Nährmedium) getrennt 12 Stunden bei einer Temperatur von 30 °C gezüchtet. Die gezüchteten Zellen wurden in einer Log-Phase gesammelt und in dem obengenanntes Phosphatpuffer zu Zellsuspensionen aufgeschwemmt, deren Konzentration an lebenden Zellen 1,03·109, 5,ΟΊΟ8, 1,3·109 und "1,0·.1010 Zellen/cm3 betrug.
Jede Suspension der lebenden Zellen wurde in eine 15-ml-H-Zelle gefüllt. Dann wurde eine Differential-Impuls-Voltammetrie mit einem Kipp-Potential von 0 bis 1,0 V (gegen SSCE), einer Sampling-Zeit von 20 ms, einem Impulshöhenpotential von 50 und 100 mV und einer Potentialänderungsgeschwindigkeit von 0,5 mV/s bei einer Temperatur von 25 0C ausgeführte wobei eine BP-Graphit-Arbeitselektrode, eine Gegenelektrode, aus
. ■ 33 3"9 4 O
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einem Platindraht und eine SSCE-Elektrode als Bezugselektrode verwendet wurden. Als Polarograph wurde der "Polarograph Type 312" von Fuso Seisako Sho benutzt.
Die Spitzen der erhaltenen Differentialströme waren außerordentlich deutlich und scharf, und die Spitzenpotentiale waren bei den einzelnen Bakterienarten verschieden. Die Spitzenpotentiale der Bakterien sind in Tabelle 11 zusammengestellt.
Tabelle 11 Mikroorganismus Spitzenpotential
(V - gegen SSCE)
B. suibt-tVis 0,68
S. aerevieiae 0,74
Laat. fexmentum
Leuoo. mesenteroides 		0,75
0,80
E. ooVL 0,85
Aus den in Tabelle 11 wiedergegebenen Resultaten ist ersichtlich, daß nach dem Verfahren gemäß der Erfindung die Bakteriarten deutlich und leicht voneinander unterschieden werden konnten. Insbesondere ist zu beachten, daß das gramnegative Bakterium E. coli sich deutlich von den grampositiven Bakterien unterscheidet.
BEISPIEL 9
Figur. 11 zeigt ein Elektrodensystem für die Erfassung mikrobieller Zellen. Es besteht aus einer Grundflächen-Pyrolysegraphit-Elektrode 105 (Oberfläche 0,17 cm2), einer Gegenelektrode 104 in Form eines Platindrahtes, einer Bezugselektrode 106 und einem Membranfilter 108 zum Festhalten der mikrobiellen Zellen 107. Zyklische Voltammogranme wurden unter Verwendung eines Potentiometers 102 (Hokuto Denko Modell HA301), einen Funktionengenerators 101 (Hokuto Denko Modell HB104) und eines X,Y-Schreibers 103 (Riken Denshi F 35) erhalten. Sofern nicht
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anders angegeben, wurde die Elektrode vor jeder Untersuchung mit einer wäßrigen Suspension von Aluminiumoxid der Korngröße 0,3 um auf einem Poliertuch poliert, um unerwünschte elektrochemische Signale von an der Oberfläche adsorbierten Arten gering zu halten. Die Meßzelle bestand ganz aus Glas, hatte ein Volumen von 25 ml und enthielt ein gebräuchliches Dreielektroden-System. Die Bezugselektrode 106 war eine Kaliumchlorid-Kalomel-Elektrode und von der Kammer der Hauptzelle durch Eintauchen in ein Glasrohr, das an einem Ende durch eine Glassinterfritte verschlossen war, getrennt.
Esehsviokia ooVi wurde 12 Stunden bei einer Temperatur von 37 0C auf einem Agar-Nährboden gezüchtet. Die gezüchteten Zellen wurden in einer Q5I-Hi Phosphatpuffer-Lösung (pH 7,0) suspendiert, und von dieser Zellsuspension wurden 5 ml auf ein Membranfilter (Toyo-Membranfilter Typ TM-2, Nitrocellulose, 0,45 um Porengröße, 25 mm Durchmesser) getropft, *obei auf das Filter eine leichte Saugwirkung ausgeübt wurde. Die mikrobiellen Zellen wurden auf der Oberfläche des Membranfilters festgehalten, und das die Mikroorganismen tragende Filter wurde an der Graphitelektrode befestigt. Das Elektrodensystem wurde in die Phosphatpuffer-Lösung eingesetzt, und bei Umgebungstemperatur (25 ± 2 0C) wurden zyklische Voltammogramme aufgenommen.
Figur 12 zeigt zyklische Voltammogramme in dem Potentialbereich von 0 bis 1,0 V (gegen SCE). Beim ersten Abgriff in positiver Richtung trat eine anodische Welle bei o,72 V (gegen SCE) auf. Nach der Umkehr des Abgriffs wurde kein entsprechender Reduktionsgipfel beobachtet. Die Elektrodenreaktion der mikrobiellen Zellen ist daher irreversibel.
Der Spitzenstrom war in einem Bereich von 0,1 bis 1,9*109 Zellen/ml der Anzahl der Zellen auf dem Membranfilter proportional. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Anzahl der Zellen von E. coVi auf dem Membranfilter aus dem Spitzenstrom bei der zyklischen Voltammetrie bestimmt werden kann.
Die geringste erfaßbare Zellenkonzentration betrug bei E, coli
5-1O7 Zellen/ml.
35
33 3"3 408
Von verschiedenen Mikroorganismen wurden die Spitzenpotentiale bei der zyklischen Voltammetrie bestimmt. Die Anzahl der Zellen auf den Membranfiltern betrug jeweils 6·108. Bacillus subtilis (grampositiv), Lactobacillus fermentum (grampositiv), Streptococcus sanguis (grampositiv), Staphylococcus epidemridis (grampositiv), Escheriahia ooli (gramnegativ) und Salmonella typhimurium ergaben Spitzenströme bei 0,68, o,68, 0,68, 0,72 bzw. 0,70 V (gegen SCE). Die Plasmamembran der grampositiven Bakterien, wie S, subtilis^ L. fermentum, Streptococcus sanguis und Staphylococcus epidermidis, war von einer Zellwand umgeben, die typischerweise 25 nm breit war und aus Peptidoglycan und Teichosäure bestand. Gramnegative Bakterien, wie E. coli und S. typhimurium, hatten eine kompliziertere Zellhülle. Ihre Plasmamembran war von einer 3 nm breiten Peptidoglycan-Wand umgeben, die ihrerseits wieder von einer 8 nm breiten Außenmembran bedeckt war, die aus einem Mosaik von Proteinen, Lipiden und Lipopolysacchariden bestand. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Aufbau der Zellwand die Spitzenpotentiale bei der zyklischen Voltammetrie beeinflußt. Die Spitzenströme gramnegativer Bakterien bei höheren positiven Potentialen als diejenigen der grampositiven Bakterien auf.
Die Spitzenpotentiale von Bacillus subtilis MI 1-12 {Bacillus subtilis MI 112 Arg-15 leu B8 thi 5 r~m~recE4) und Bacillus subtilis MI 112 (PTL 12) bei der zyklischen Voltammetrie wurden auch nach folgender Methode gemessen.
B. subtilis MI 112 Arg-15 leu B8 thi 5 r~m~recE4, eingeimpft in Spizizen-Medium (100 ml), und 5. subtilis MI 112 (PTL 12), eingeimpft in Spizizen-Medium (100 ml), das Tmp enthielt, wurden aerob 12 Stunden bei 37 0C gezüchtet. Die gezüchteten Zellen wurden gesammelt, in einer Phosphatpuffer-Lösung (pH 7) suspendiert und auf einem Membranfilter abgeschieden, das an einer BPG-Elektrode (Grundflächen-Pyrolysegraphit, 0,17 cm2) befestigt wurde. Für die Messung wurdmeine Η-Zelle, die BPG-Elektrode als Arbeitselektrode, ein Platindraht als Gegenelektrode und eine Kalomel-Elektrode als Bezugselektrode verwendet. Das elektrochemisehe Verhalten der Zellen wurde bei einer Temperatur von 25 0C mit ei-
3329408
- 25 -
1 ner Potentialänderungsgeschwindigkeit von von 10 mV/s untersucht. Die Strom-Potential-Kurven wurden aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 angegeben.
Tabelle Spitzenpotential (V, gegen SCE)
Plasmide" 0,62
Plasmide 0,68
Leerseite

Claims (1)

  1. n oo β oo β β * β η β
    ο a ο οο « ο β* β
    COHAUSZ & FLORACK
    PATENTANWALTSBÜRO SCHUMANNSTB. 97 D-4QQ0 DÜSSELDORF 1
    Telefon:(0211) 683346 Telex:085B6513 copd
    PATENTANWÄLTE:
    Dipl.-Ing. W. COHAUSZ · Dipl.-Ing. R. KNAUF · Dipl.-Ing. H. B. COHAUSZ · DipL-lng. D. H. WERNER
    28.10.1983
    Patentansprüche
    1 ο Verfahren zur elektrochemischen Feststellung und Klassifizierung mikrobieller Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß man
    — ein Kipp-Potential an eine Arbeitselektrode und eine Gegenelektrode anlegt, während die tnikrobiellen Zellen mit der Arbeitselektrode in Berührung gebracht werden, und dann
    — den zwischen den Elektroden fließenden Strom mißt.
    2ο Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein Paar Elektroden in eine Suspension der mikrobiellen Zellen eintaucht.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Anzahl der Zellen durch Messen des Spitzenwertes des erzeugten Stromes bestimmt.
    4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Art der mikrobiellen Zellen durch Bestimmen der Korrelationskurve zwischen erzeugtem Strom und Kipp-Potential feststellt.
    5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß der erzeugte Strom durch Anlegen eines zyklischen Kipp-Potentials an die Elektroden gemessen wird.
    299
    U/ -
    1 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , daß ein allmählich ansteigendes Kipp-Potential und ein dieses überlappendes Feinpotential (minute potential) zur Messung des erzeugten DifferenzStromes gleichzeitig
    5 an die Elektroden angelegt werden.
    7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Stromstärkemessungen in Gegenwart von 4,4'-Bipyridin als stromstärkeerhöhendes Mittel vorgenommen 10 werden.
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