DE3331301A1 - Verfahren zur zytodiagnostischen untersuchung von epithelzellen und zentrifugationskammer zur ausfuehrung des verfahrens - Google Patents

Description

ν<·) Fnlifon v.iir /.yI otl l.i'jiiuiM iMfIuMi III) Ι.ι· von Epithelzellen und Zentrifuqationskammer zur Ausführung des Verfahrens

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur zytodiagnostisehen Untersuchung von in einer Untersuchungsprobe enthaltenen Epithelzellen mit den im Oberbegriff des Anspruches 1 angegebenen Verfahrensschritten a) bis i).

Es geht darum, die auf einem Abstrich erhaltenen Epithelzellen zu vereinzeln und sie auf einen Objektträger möglichst gleichmässig nebeneinander zu deponieren. Der Schmutz sowie die zahlreichen Zellkerne, Erythrozyten, Leukozyten usw. werden durch Fraktionierung weitgehend abgetrennt und als überstand abpipettiert (leichte Fraktion). Beide Fraktionen, die distale und die proximale Fraktion (überstand), werden dann separat auf je einen Objektträger aufzentrifugiert , der eine Objektträger dient zum Erkennen, Auswerten und Zählen der Epithelzellen, der andere Objektträger dient zum Nachweis, daß nicht wesentliche Teile von gesuchten Epithelzellen noch im Überstand vorhanden sind, und daß der erste Objektträger ein repräsentatives Bild des Abstrichs darstellt.

Das bisherige Verfahren ist in der Zeitschrift Biotechnische Umschau, 1978, Heft 4, unter der Überschrift "Ein Verfahren zur isolierten Deposition von Zellen der Cervix uteri auf Glasobjektträger" und in der Zeitschrift "Tumor Diagnostik 2, 1981, Seite 35-38" und in der Zeitschrift "The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Ausgabe 27, 1979, Seite 14-18" sowie in der Zeitschrift "Acta histochemica, Suppl.-Band XXI, 1980, Seite 137-145" beschrieben.

Bei den bekannten Verfahren musste also insgesamt drei Mal zentrifugiert werden. Im ersten Arbeitsgang wird nach dem Aufschütteln der Suspensionsproben mit einem Watteträger, wobei der Watteträger die zu untersuchenden Zellen enthält, der Watteträger und grobe Verunreinigungen dadurch entfernt, daß die Suspension durch ein Nylonsieb gegossen wird. Die Suspensionsproben werden dann im zweiten Arbeitsgang mit einer Zentrifuge für die Dauer von 10 Minuten bei etwa 2000 UpM absedimentiert. Die Suspensionsprobe wird dann im dritten Arbeitsgang aus dem ProbenrÖhrchen abgesaugt und auf ein Trennmedium (Plasmasteril) überschichtet. Es erfolgt im vierten Arbeitsgang ein erneuter Zentrifugationsvorgang von etwa 10 Minuten bei 500 UpM. Die so erhaltene fraktionierte Säule wird im fünften Arbeitsgang dadurch präpariert, daß die proximale Fraktion (Überstand) und die distale Fraktion (Plasma) durch Abpipettierung getrennt werden.

Hiernach wird dann im sechsten Arbeitsgang ein Objektträger in eine Zentrifugationskammer nach dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 eingelegt, wobei in die eine Bohrung die proximale Fraktion (überstand) und in die andere Bohrung die distale Fraktion (Plasma) eingegeben wird.

Es erfolgt dann mit dem siebten Arbeitsgang der dritte Zentrifugiervorgang , wobei etwa 10 Minuten bei 2000 UpM zentrifugiert wird.

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Epithelzellen in der Flüssigkeit aufgrund der auf sie 0 ausgeübten Zentrifugalkraft in Richtung zum Objektträger und lagern sich in Form eines Sedimentes an.

Nach der Auf sed.imen ta tion dor zu untersuchenden Zellen auf den Objektträger wird der flüssige Rückstand in der Zentrifugationskammer mit einer Pumpe abgesaugt und die mit den zu untersuchenden Zellen beschichteten Objektträger in eine 96%-ige Alkohollösung gestellt. Es erfolgt dann die Pap-Färbung des Objektträgers. Auf dem einen Feld des Objektträgers, dessen Bohrung mit der distalen Fraktion gefüllt wurde, werden die Epithelzellen aufsedimentiert, während auf dem benachharten Feld des gleichen Objektträgers, dem die Bohrung zugeordnet ist, die mit der proximalen Fraktion (überstand) gefüllt ist, eine andere Art von Zellen aufsedimentiert wird. Dieses aufsedimentierte Feld dient nur dem Nachweis, daß nicht wesentliche Teile von gesuchten Epithelzellen noch im überstand vorhanden sind, daß also der erste Objektträger ein repräsentatives Bild des Abstrichs darstellt.

Nachteil bei dem bekannten Verfahren ist, daß ein dreimaliger, recht arbeits- und zeitaufwendiger,Zentrifugations-Vorgang vorgenommen werden muß. Besonders störend ist der zweite ZentrifugationsVorgang, bei dem beispielsweise 4 ml der Stammlösung auf 6 ml des Trennmediums überschichtet werden, und die so hergestellte Untersuchungsflüssigkeit durch Abzentrifugieren in eine proximale Fraktion (Überstand) und eine distale Fraktion (Plasma) aufgetrennt wird, wobei dann in zeitaufwendiger Weise beide Fraktionen durch Abpipettierung getrennt werden müssen und in getrennte Bohrungen der Zentrifugationskammer eingefüllt werden müssen.

Die vorliegende Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, ein Verfahren der eingangs genannten Art weniger zeit- und arbeitsaufwendig zu gestalten, so daß ein oder mehrere Arbeitsschritte zusammengefasst in einem einzigen Arbeitsvorgang ausgeführt werden können.

Zur Lösung der Aufgabe ist die Erfindung dadurch gekennzeichnet , daß die Arbeitsgänge nach den Schritten e), f) und g) während eines einzigen Zentrifugationsvorgangs vorgenommen werden.

Erfindungsgemäss wird also die Trennung in eine distale und proximale Fraktion zusammen mit deren Einbringung in getrennte Bohrungen einer Zentrifugationskammer und die Zentrifugation der beiden Fraktionen mit Auf Sedimentation auf dem Objektträger in einem einzigen Verfahrensgang während des Zentrifugationsvorganges vorgenommen. Hiermit wird wesentlicher Arbeitsaufwand gespart, denn vorher mussten die genannten Arbeitsschritte e), f) und g) bei stehender Zentrifuge und bei herausgenommener Zentrifugationskammer vorgenommen werden. Erfindungsgemäss entfällt dies, und die Arbeitsschritte werden während des Zentrifugationsvorganges in einem einzigen Arbeitsgang nacheinanderfolgend vorgenommen .

In einer Weiterbildung des Erfindungsgedankens nach Anspruch 1 ist es vorgesehen, daß nicht nur die Arbeitsschritte e), f) und g) während eines einzigen Zentrifugationsvorganges hintereinanderfolgend ablaufen, sondern daß auch danach der Arbeitsschritt h) auch noch während des Zentrifugationsvorganges vorgenommen wird.

Eine Zentrifugationskammer zur Ausübung des Verfahrens nach Anspruch 1 ist dadurch gekennzeichnet, daß zwischen den parallel im Abstand angeordneten Bohrungen eine Fließverbindung (überlaufbohrung oder Kanal) angeordnet ist. Während den Zc-nLr i 1 uqat l oii:;v<.jr<fariyes wex_deii also die Flüssigkeiten von einer I3olirung in die benachbarte Bohrung übergeleitet.

Wie eingangs boraits ausgeführt wurde, wird der zweite Zentrifugationsvorgang (Arbeitsschritt d) deshalb eingeschaltet, um bei möglichst optimaler Zelldichte einen sauberen Hintergrund bei der Betrachtung des mit Epithelzellen aufsedimentierten (beschichteten) Bereiches des Objektträgers zu erreichen. Mit der Anordnung einer Fließverbindung zwischen den beiden Untersuchungsbohrungen wird erreicht, daß während des Zentrifugierens die Auftrennung in eine distale und proximale Fraktion erfolgt und daß während des gleichen Zentrifugiervorganges die proximale Fraktion über die erfindungsgemässe Fließverbindung in die benachbarte Bohrung der Zentrifugationskammer übergeleitet wird. Es wird also die Reinigung der Zellproben von unerwünschten Leukozyten und Zelltrümmern, sowie die Zentrifugation der Zellen in einem ersten Arbeitsgang erreicht.

Mit Anordnung einer Fließverbindung zwischen den beiden genannten Bohrungen kann also der Arbeitsgang entfallen, daß man in einem normalen Laborröhrchen die Suspensionsprobe abzentrifugiert und in eine proximale und distale Fraktion auftrennt, wonach die beiden Fraktionen durch Abpipettierung getrennt werden und in getrennte Bohrungen der Zentrifugationskammer vonhand eingefüllt werden müssen. Dies entfällt jetzt nach der Erfindung, denn es wird nach der Erfindung in die eine Bohrung der Zentrifugationskammer sofort die Plasmasteril-Lösung eingefüllt, wobei auf diese Plasmasteril-Lösung die Probensuspension aufgeschichtet wird. Die so vorbereitete Zentrifugationskammer wird in dem Zentrifugenrotor eingesetzt, wobei nachfolgend noch beschrieben wird, daß eineerfindungsgemäss ausgerüstete Zentrifugationskammer sowohl mit einer Schleuderzentrifuge mit ausschwingendem Gehänge als auch mit einem Topfrotor verwendet werden kann.

Während des Zentrifugiervorganges erfolgt die Auftrennung der überschichteten Probensuspension in eine proximale und eine distale Fraktion, wobei dank der Anordnung der Fließverbindung zwischen den beiden Bohrungen während des Zentrifugiervorganges die distale Fraktion in die benachbarte Bohrung übergeleitet wird, so daß nach Beendigung des Zentrifugiervorgangs in der einen Bohrung der Zentrifugationskammer die Epithelzellen bereits auf den darunter angebrachten Objektträger aufsedimentiert sind, während bei der benachbarten Bohrung auf den Objektträger der Überstand aufsedimentiert wird.

Das eingangs beschriebene Verfahren wird also durch die erfindungsgemäss vorgeschlagene, technische Lehre wesentlich vereinfacht.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden mehrere Lösungen vorgeschlagen, wie es gelingt, die distale Fraktion aus der einen Bohrung in die benachbarte Bohrung über die erfindungsgemässe Fließverbindung zu leiten. Eine erste Gruppe von Lösungen sieht vor, daß die Überleitung durch die Fließverbindung allein durch Zentrifugalkraft erfolgt, während eine zweite Gruppe von Lösungen vorschlägt, daß in die Bohrung, welche die distale und proximale Fraktion zusammen enthält, Preßluft eingeführt wird, welche die distale Fraktion über die beanspruchte Fließverbindung in die benachbarte Bohrung presst.

Der Erfindungsgedanke der vorliegenden Erfindung beschränkt sich jedoch nicht nur darauf, daß man zwischen zwei benachbarten Bohrungen fine 1·Ί i rßvci b i mltinq in Fpmii ι·Ιικ·Β Kan«ilfs oder einer Überlaufbohrung anordnet. Nach der Erfindung 5 können nicht nur zwei benachbarte Bohrungen durch dazwischen angeordnete Fließverb indungen miteinander verbunden werden,

rioii'loi ii ciRj \ m. duel ι vi u qtisiuiic-ii, daß iueht a lsi lawu 1 , z.B. drei, vier oder noch mehr Bohrungen jeweils in Serie durch dazwischen angeordnete Fließverbindungen geschaltet sind. Hierdurch ergeben sich unerwartete Vorteile, die nachfolgend beschrieben werden.

. Mit der Hinzufügung einer dritten Bohrung in Serie zu der zweiten Bohrung wird der Vorteil erreicht, daß nun auch eine Färbung oder eine anderweitige Behandlung der auf den Objektträger aufsedxmentierten Zellkörper möglich ist. Die dritte Bohrung wirkt hierbei als Abfallkammer für die aus der ersten und zweiten Bohrung in die dritte Bohrung abgeleitete Flüssigkeit. Nach erfolgter Absedimentation der Epithelzellen auf dem Objektträgerfeld, das jeweils unter der ersten und zweiten Bohrung angeordnet ist, werden beide Bohrungen entleert. Hierzu wird der Inhalt der ersten Bohrung durch Beaufschlagung mit Preßluft in die zweite Bohrung übergeführt und füllt diese zweite Bohrung auf. Die Preßluft wirkt über die erste Bohrung und über den Verbindungskanal zwischen der ersten und der zweiten Bohrung auf die zweite Bohrung und verdrängt dort die dort angesammelte Flüssigkeit über einen weiteren Kanal in die dritte,benachbarte Bohrung. In dieser Bohrung sammelt sich nun der Inhalt der ersten und zweiten Bohrung an.

Nachdem die erste und zweite Bohrung vollständig durch Beaufschlagung mit Preßluft entleert wurden, wird Färbeflüssigkeit in die erste Bohrung eingeführt. Nach einem ersten Ausführungsbeispiel, welches im speziellen Beschrexbungsteil in Verbindung mit Figur 2f näher 0 erläutert werden wird, wird die Zentrifuge hierzu angehalten und in die erste Bohrung wird eine geringe Menge von Färbeflüssigkeit eingeführt. Die Zentrifuge wird dann wieder in Gang gesetzt und die Färbeflüssigkeit wird durch Zentrifugalkraft gegen das Öbjektträgerfeld geführt und färbt die dort lagernden Zellkörper an.

Es wird dann während des Zentrifugiervorganges Preßluft eingeleitet und die 'gesamte Färbeflüssigkeit wird über den Verbindungskanal zwischen der ersten und der zweiten Bohrung in die zweite Bohrung eingeführt. Bei weiterdauerndem Zentrifugiervorgang werden auch die dort auf dem Objektträgerfeld lagernden Zellkörper angefärbt. Die Zentrifuge wird nun angehalten und bei stillstehender Zentrifugationskammer wird wiederum Preßluft in die erste Bohrung eingeleitet, die durch die erste, entleerte Bohrung strömt, über den Verbindungskanal in die zweite Bohrung gelangt und die an der Bodenfläche der zweiten Bohrung lagernde Färbeflüssigkeit über einen dort mündenden Kanal in die dritte Bohrung der Zentrifugationskammer einleitet.

Diese dritte Bohrung nimmt nun neben der vorher gesammelten Flüssigkeit nun auch die Färbeflüssigkeit auf.

Mit dem beschriebenen Arbeitsvorgang ist es auf einfache Weise möglich, neben der Durchführung des Zentrifugiervorganges zur Absedimentation von Zellkörpern auf verschiedenen Flächen des Objektträgerfeldes auch noch gleichzeitig einen Färbevorgang durchzuführen, ohne daß hierbei der Objektträger aus der Zentrifugationskammer gelöst werden muss und umständlichen Färbeverfahren unterworfen werden muss .

Nach erfolgter Entfärbung der Färbeflüssigkeit aus der ersten und zweiten Bohrung ist es dann in Weiterführung des Erfindungsgedankens möglich, noch weitere Flüssigkeiten einzubringen und die Objektträgerfelder der ersten und zweiten Bohrung entsprechend damit zu beaufschlagen.

Dies 1st beispielsweise mit Einbringung einer Fixierflüssigkeit möglich, welche die angefärbten Zellen auf dem Objektträgerfeld fixiert. Ebenso ist die Einbringung spezieller Spülflüssigkeiten möglich, wobei immer jeweils der vorher beschriebene Arbeitsvorgang durchgeführt wird.

In einer Weiterbi Idunq eic.« νοι-Ί Lcjond geschilderten Erfindungsgedankens ist es nach der Erfindung vorgesehen, daß das Einführen verschiedener Flüssigkeiten, z.B. Färbeflüssigkeit, Fixierflüssigkeit oder Spülflüssigkeit, während des Zentrifugationsvorganges erfolgt. Es braucht also nicht mehr - wie vorher be schrieben - die Zentrifuge angehalten zu werden, um bei geöffneter Zentrifugationskammer die Färbe.f lüssigkeit oder die sonstige Behandlungsflüssigkeit in die erste Bohrung zu bringen, sondern nach dem weiterführenden Erfindungsgedanken ist es vorgesehen, diese Flüssigkeiten bei laufender Zentrifuge in die Zentrifugationskammer einzubringen und auch bei laufender Zentrifuge diese Flüssigkeiten aus den beiden beschriebenen Bohrungen zu entfernen, um sie in eine Abfallbohrung zu befördern.

Bei der Zuführung zweier verschiedener Behandlungsflüssigkeiten erfolgt dies dadurch, daß bei einer ersten Preßluftzuführung zunächst die beiden Bohrungenin der vorher beschriebenen Weise - entleert werden.

Es wird nunauf ein an der Zentrifugationskammer angebrachtes Reservoir Preßluft aufgegeben und damit wird aus diesem Reservoir Färbeflüs'sigkeit in die erste Bohrung eingetropft.

Der Färbevorgang erfolgt nun in der oben beschriebenen Weise, wobei am Schluß des Färbevorganges die Zentrifuge angehalten werden muss, um die Färbeflüssigkeit aus der zweiten Bohrung in die dritte (Abfall-)Bohrung zu bringen.

Durch Anordnung weiterer Reservoirs, die andere Behandlungsflüssigkeiten enthalten, und die in Flüssigkeitsverbindung mit der ersten Bohrung der Zentrifugationskammer stehen, ist es mÖqlich, während des Zentrifuaa-HonR-ORIG.'NAL INSPECTED

beliebig viele Behandlungsflüssigkeiten in die erste und zweite Bohrung einzubringen und schließlich auch wieder auszutragen.

In zusammengefasster Form werden nachfolgend die verschiedenen Austreibe-Möglichkeiten erläutert, wie es nach der Erfindung gelingt, Behandlungsflüssigkeit von der ersten Bohrung in eine zweite zu bringen und ggf. die zweite Bohrung zu entleeren und die dortige Behandlungsflüssigkeit in eine dritte und von dort aus in weitere Bohrungen zu bringen.

Nach dem Gegenstand des Anspruches 4 ist es hierbei bevorzugt, wenn die Fließverbindung aus einer im Querschnitt veränderbaren Überlaufbohrung besteht, wobei die eine Bohrung in eine Bohrung größeren Durchmessers und eine mit dieser fluchtenden Bohrung kleineren Durchmessers aufgeteilt ist und ferner die Überlaufbohrung vom Ansatz der größeren in die kleinere Bohrung ausgeht. Die Kammer mit der abgesetzten Bohrung ist die Einfüllkammer für die Probensuspension und die Kammer mit der durchgehenden Bohrung stellt die Überlaufkammer dar.

Die Höhe der abgesetzten Bohrung bildet etwa die Trennschicht der beiden ungleich schweren Fraktionen. Eine Klemmschraube dient zum Einregulieren der Überlauföffnung, d.h. zur Veränderung des Querschnittes der Überlaufbohrung. Mit Beginn der Zentrifugation, d.h. Ausschwingen des Gefässträgers (Schaukel) beginnt bereits das Überströmen in der Zentrifugalkraft-entgegengesetzten Richtung. Ein winziger Spalt an der Klammschraube lässt genügend Überstand (proximale Fraktion) in die zweite Bohrung überströmen; die Kraft wird hierbei durch die Zentrifugalkraft erzeugt.

Eine zweite Ausführungsform (Anspruch 6) sieht eine überlaufkammer mit Verschlußstück vor. Dieses Verschlußstück weist am Boden eine Kerbe auf.

DIc Abmessung diener Kerbu definiert den Durchlassquerschnitt von einer Bohrung in die andere. Die Kerbe wird unter Zentrifugalkraft auf den Durchlaßquerschnitt gepresst. Man kann Verschlußstücke mit unterschiedlich tiefen Kerben verwenden, um für jeden Fall der Suspensionslösung einen bestimmten Durchgangsquerschnitt von einer Bohrung in die andere zu erreichen.

Wesentlich bei dem erstgenannten Ausführungsbeispiel mit Klemmschraube und bei dem zweitgenannten Ausführungsbeispiel mit Verschlußstück ist, daß die Probenkammern für ausschwingende Gehänge konzipiert sind, d.h. sie stehen im Ruhezustand senkrecht und im Betriebszustand waagerecht. Der Objektträger liegt mit seiner zu beschichtenden Ebene im Ruhezustand waagerecht und im Betriebszustand senkrecht.

Die dritte Gruppe von Ausführungsbexspielen sieht vor, daß das Überströmen durch die Fließverbindung von der einen Bohrung in die andere durch Druckluft erfolgt. Die hierfür vorgesehenen Probenkammern werden vorzugsweise für eine Zentrifuge mit Topfrotor verwendet, bei der die Zentrifugationskammer nicht um 90° sich während des Zentrifugationsvorganges verlagert. Die Probenkammern werden in den Topfrotor eingesetzt, wobei die Ausnehmungen für den Luftanschluß auf die Dichtungsstücke für den Luftauslass zu liegen kommen. Die Zentrifugationskammern werden dann über einen senkrechten Einfüllstutzen gefüllt und zwar, wie bei den übrigen Ausführungsbeispielen auch, zunächst mit sechs ml Plasmasteril und mit vier ml Zellsuspension hierüber geschichtet. Ein Deckel mit elastischer Platte, z.B. eine Gummiplatte, verschließt alle Kammern gemeinsam, so daß ein geschlossenes System entsteht. Beim Lauf der Zentrifuge werden durch die Schwerkraft die beiden Fraktionen umgeschichtet.

Die Trennfläche, die in Ruhe waagerecht war, orientiert sich während des Zentrifugationsvorganaes senkrecht. Der Objektträger bleibt hierbei in senkrechter Position. Bei geringer Zentrifugalkraft (ca. 60 g) dringen die Epithelzellen in das Plasmasteril ein. Der Überstand, der ansonsten gem. dem ersten Ausführungsbeispiel (Überlaufbohrung, Verschlußstück) ziemlich lange brauchen würde zum Überfließen in die andere Bohrung , wird mittels Luftdruck durch die Zentrifugenwelle über den hohlen Boden des Topfrotors und über die Anschlußstücke in den Einfüllstutzen eingeführt, so daß das Überströmen durch die Überlaufbohrung beschleunigt erfolgt.

Bei diesen mit Druckluft beaufschlagten Probenkammern gibt es zwei verschiedene Ausführungen. Die eine weist eine Probenkammer mit abgesetzter Bohrung auf, wobei diese Bohrung das Plasmasteril und die Probensuspension aufnimmt. Die Überlaufbohrung mündet hierbei am Ansatz des Übergangs der größeren Bohrung in die kleinere Bohrung.

Die zweite Lösung bezieht sich auf eine Probenkammer mit durchgehender Bohrung, in welche das Plasmasteril und die Probensuspension eingefüllt wird. Es wird ein Verbindungskanal vorgeschlagen, der parallel und in geringem Abstand zu dieser Bohrung im Material der Probenkammer eingearbeitet ist, wobei dieser Verbindungskanal zunächst keinerlei Verbindung zu dieser Bohrung aufweist, und mit seiner Stirnseite auf dem Objektträger mündet.

Das besondere an diesem separaten Verbindungskanal ist, daß man in jedem beliebigen Abstand vom Objektträger 0 entfernt mit einer Nadel ein Verbindungsloch in die Wandung zwischen der die Probensuspension aufnehmenden Bohrung und dem Verbindungskanal einstechen kann, und daß dadurch die Restflüssigkeit in der die Probensuspension aufnehmenden Bohrung yariierbar ist.

Eina solche Probenkammer kann beispielsweise aus einem gespritzten Kunststoffmaterial bestehen, so daß es ohne weiteres möglich ist, mit einer Nadel die Wandung der die Probenflüssigkeit aufnehmenden Bohrung anzustechen, um eine Verbindung zum Verbindungskanal zu schaffen.

Nach der Erfindung werden also drei verschiedene Möglichkeiten zur Steuerung des Flüssigkeitsflusses von einer Bohrung zu der benachbarten Bohrung vorgesehen.

10' Es handelt sich hierbei entweder um eine Klemmschraube oder ein Verschlußstück, welche den Durchlaßquerschnitt des Verbindungskanals verändern oder um die Einleitung von Druckluft, welche die Strömungsgeschwindigkeit im Kanal erhöht, wobei dann eine Klemmschraube oder ein Verschlußstück entfallen kann.

Statt der oben angegebenen Mittel ist es in einer Weiterbildung der Erfindung vorgesehen, im Verbindungskanal jeweils ein elektromagnetisches Ventil anzuordnen, das während des Zentrifugationsvorgangs von außen betätigt zu öffnen und zu schließen ist.

Der Erfindungsgegenstand der vorliegenden Erfindung ergibt sich nicht nur aus dem Gegenstand der einzelnen Patentansprüche, sondern auch aus der Kombination der einzelnen Patentansprüche untereinander.

Alle in den Unterlagen offenbarten Angaben und Merkmale, insbesondere die in den Zeichnungen dargestellte, räumliche Ausbildung werden als erfindungswesentlich beansprucht, soweit sie einzeln oder in Kombination gegenüber dem Stand der Technik neu sind.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von mehreren Ausführungswege darstellenden Zeichnungen näher erläutert. Hierbei gehen aus den Zeichnungen und ihrer Beschreibung weitere erfindungswesentliche Merkmale und Vorteile der

Es zeigen:

Figur 1: Schnitt durch eine Zentrifugationskammer in einer ersten Ausführungsform gemäss der Linie I-I in Figur 2, wobei die Flüssigkeitsverteilung während des Zentrifugationsvorgangs dargestellt

ist;

Figur 2: Stirnansicht der Zentrifugationskammer in Richtung des Pfeiles II in Figur 3;

Figur 3: Draufsicht auf die Zentrifugationskammer in Richtung des Pfeiles III in Figur 2;

Figur 4: schematisiert dargestellte Ansicht des Aufbaus und der Fraktionierung der Trennsäule in einem Zentrifugenröhrchen, vor (links) und nach (rechts) Sedimentation der Probe;

Figur 5: Schnitt gemäss der Linie V-V in Figur 6 durch

eine zweite Ausführungsform einer Zentrifugationskammer, wobei die Flüssigkeitsverteilung während des Zentrifugationsvorgangs dargestellt ist;

Figur 6: Stirnansicht der Zentrifugationskammer in Richtung des Pfeiles VI in Figur 7;

Figur 7: Draufsicht auf die Zentrifugationskammer des zweiten Ausführungsbeispiels gemäss dem Pfeil VII in Figur 6;

Figur 8: Bodenansicht des VerschiußStückes;

Figur 9: Seitenansicht des Verschlußstückes nach Figur 8; Figur 10: Seitenansicht einer Schaukel (Schaukelgehänge)

£ur Vnrwojiflurt'j mil <Ι«·η '/,oni \ Ifu'j.il ionakiimxrifrn nach dc>n Figuren 1 bis 3 und 5 bis 7 in der Seitenansicht;

Figur 11: Draufsicht auf die Schaukel in Richtung des Pfeiles XI in Figur 10;

Figur 12: Seiten-Teilansicht der Schaukel;

Figur 13: Schnitt durch ein drittes Ausführungsbeispiel einer Zentrifugationskainmer; gemäss Linie XIII-XIII in Figur 15; wobei die Flüssigkeitsverteilung während des Zentrifugationsvorgangs dargestellt ist;

Figur 14: Stirnansicht der Zentrifugationskainmer nach Figur 13;

Figur 15: Draufsicht auf die Zentrifugationskammer in Richtung des Pfeiles XV in Figur 13;

Figur 16: Schnitt entlang der Linie XVI-XVI in Figur durch ein viertes Ausführungsbeispiel einer Zentrifugationskammer; wobei die sich während des Zentrifugationsvorgangs ergebende Flüssigkeitsverteilung dargestellt ist;

Figur 17: Stirnansicht der Zentrifugationskammer nach Figur 16;

Figur 18: Draufsicht auf die Zentrifugationskammer in Richtung des Pfeiles XVIII in Figur 16;

Figur 19: schematisiert gezeichneter Schnitt durch einen Topfrotor mit Beispiel des Einsatzes zweier

verschiedener Zentrifugationskammern;

Figur 20: Draufsicht auf den Topf rotor nach Figur 19- mit Darstellung des Einsatzes einer Zentrifugationskammer nach dem Ausführungsbeispiel der Figuren 13 bis 15;

Figur 21: Schnitt durch ein viertes Ausführungsbeispiel einer Zentrifugationskammer gemäss der Linie XXI-XXI in Figur 23;

Figur 22: StiMansicht der Zentrifugationskammer nach Figur 21;

Figur 23: Draufsicht auf die Zentrifugationskammer nach

Figur 21 in Richtung des Pfeiles 23 in Fig. 21;

Figur 24: schematisiert gezeichneter Längsschnitt durch ein fünftes Ausführungsbeispiel einer Zentrifugationskammer ;

Figur 25: schematisiert gezeichneter Längsschnitt durch ein sechstes Ausführungsbeispiel einer Zentrifugationskammer .

Anhand der Figur 4 soll zunächst.die Herstellung der proximalen Fraktion 12 und der distralen Fraktion 16 schematisiert anhand eines Laborglases beschrieben werden. Die Probensuspension (in Figur 4 mit "Probe" bezeichnet), wird auf ein Trennmedium (Plasma-Steril) aufgeschichtet. Es wird dann der Zentrifugiervorgang durchgeführt und die schwereren Epithelzellen in der Probensuspension wandern durr:h eins Trennmedi um in Richtung zum di.st.alon Ende dos Rt>aqenzröhrchens. Nach erfolgtem Zentrifufjiervor<(cuig liegt dann eine proximale Fraktion 12 (überstand)und eine distale Fraktion 16(Plasma) vor. In der distalen Fraktion befinden sich bevorzugt und in hochkonzentrierter Form die zu untersuchenden Epithelzellen.

Bishor wurde in Höhe des Pfeiles "Fraktionierung" die proximale Fraktion 12 durch Abpipettierung von der distalen Fraktion 16 getrennt. Um danach dann die dista-Ie Fraktion erneut zu zentrifugieren, um die dort suspendierten Epithelzellen unter Einfluß der Zentrifugalkraft zu veranlassen, zum distalen Ende der Probenkammer (Bohrung) zu wandern und sich auf einem dort angeordneten Objektträger anzulegen.

Anhand der Figuren 1 bis 3 wird nun beschrieben, wie ' während des Zentrifugiervorgangs (also ohne Abpipettierung , wie üblich) die proximale Fraktion 12 von der distalen Fraktion 16 getrennt wird. Damit wird die eingang beschriebene Abpipettierung zur Trennung beider Fraktionen vermieden.

Die in den Figuren 1 bis 3 gezeigte Zentrifugationskammer besteht aus einer Probenkammer 7, die bevorzugt aus einem Kunststoff-Spritzteil besteht. Die Probenkammer 7 ist abdichtend mittels Dichtungsringen 5,6 auf einem Objektträger 2 aufgesetzt, wobei sie mittels Klemmbügeln 3, welche in Halterungen 4 an der Seite einer Trägerplatte 1 angeordnet sind, gegen diese Trägerplatte 1, auf der der Objektträger 2 angeordnet ist, festgeklemmt wird. Die linke Bohrung der Probenkammer 7 besteht aus einer oberen, kleineren Bohrung 9 und einer damit fluchtenden unteren, größeren Bohrung 8, wobei zwischen beiden Bohrungen 8,9 ein Ansatz besteht.

Neben der abgesetzten Bohrung 8,9 ist parallel im Abstand eine weitere Bohrung 10 angeordnet, in deren Bohrungswandung im Abstand oberhalb der Ebene des Objektträgers 2 eine Durchgangsbohrung 17 vorgesehen ist, die zur waagerechten Überlaufbohrung 14 fluchtet und zu deren Herstellung dient.
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Vom Übergang der kleineren Bohrung 9 in die größere Bohrung 8 ausgehend ist eine. Überlaufbohrung 14 angeordnet, welche in die rechte Bohrung 10 mündet. In der Probenkammer 7 ist in eine Gewindebohrung eine Klemmschraube 15 eingesetzt, welche mit ihrer Spitze in den lichten Querschnitt der Überlaufbohrung 14 ragt. Durch mehr oder weniger Herausdrehen oder Hereindrehen der Klemmschraube 15 kann somit der Querschnitt der Überlaufbohrung 14 eingestellt werden.

Vor Beginn des Zentrifugiervorgangs wird in die linke Bohrung 8,9 zunächst das Trennmedium (z.B. Plasma steril) (vergl. Figur 4) eingefüllt, das von der Probensuspension überschichtet wird.

Gemäss der späteren Beschreibung in Verbindung mit den Figuren 10-12 wird erläutert werden, daß die gesamte Probenkammer 7 in ein Schaukelgehänge mit einer Zentrifuge eingesetzt wird, so daß während des Zentrifugiervorgangs die Ebene des Objektträgers 2 vertikal steht und die Längsachsen der Bohrungen 8,9 bzw. 10 horizontal ausgerichtet sind. Die Probenkammer 7 wird hierbei bezüglich der Darstellung in Fig. 1 um 90° gedreht in einen Topfrotor eingesetzt, so daß die linke vertikale Wand der Bohrung 9 parallel zur Bodenfläche und die rechte, vertikale Wand der Bohrung 10 parallel zur Deckelfläche des Topfrotors zu liegen kommen. Die Zentrifugalkraft wirkt dann gemäss der Darstellung in Fig. 1 in Richtung der Längsachse der Bohrungen 9, 10 nach unten in Richtung auf den am distalen Ende angeordneten Objektträger 2 (Pfeilrichtung 44).

JO Die Figur 1 zeigt schematitiii-r t. die Trennung der Probe in eine proximale Fraktion 12 und eine distale Fraktion 16, während des Zentrifugiervorganges, wobei hinsichtlich der distalen Fraktion 16 die Epithelzellen der Probensuspension in das Trennmedium eindiffundieren und aufgrund der Zentrifugalkraft an der unteren

Stlrnsaite der Bohrung 8 auf den Objektträger 2 aufsediment iert werden.

Zur Abtrennung der proximalen Fraktion 12 (überstand) von der distalen Fraktion während des Zentrifugations-Vorganges wird die proximale Fraktion 12 allmählich aufgrund der in Längsrichtung der Bohrung 9 nach unten gerichteten Zentrifugalkraft in die Bohrung 8 gedrückt, wobei ein Überdruck entsteht, der durch die Überlaufbohrung 14, welche am Absatz 11 der Bohrung 8 mündet, entlastet wird.

Die proximale Fraktion 12 wird daher langsam in Pfeilrichtung 13 durch die Überlaufbohrung 14 strömen und in die benachbarte Bohrung 1o einfliessen. Je nach Dauer des Zentrifugiervorganges und je nach Einstellung der Klemmschraube 15 wird mehr oder weniger Zeit benötigt, bis die gesamte proximale Fraktion 12 in die benachbarte Bohrung 1o eingeflossen ist.

Hier erfolgt während der Fortsetzung des Zentrifugationsvorganges eine Aufsedimentation der proximalen Fraktion 12 auf das Beobachtungsfeld des Objektträgers 2 an der Stirnseite der Bohrung 10.

Mit einem einzigen Zentrifugationsvorgang wurde also die Aufsedimentierung der proximalen und der distalen Fraktion auf einen Objektträger 2 durchgeführt, wobei das umständliche Trennen der beiden Fraktionen durch Abpipettierung und nachfolgende Präparation entfiel.

Die Figuren 5-9 zeigen eine weitere Ausführungsform einer Probenkammer 3o, wobei die mit dem Ausführunqsbeispiel in den Figuren 1 bis 3 übereinstimmenden Teile mit den gleichen Bezugszahlen versehen wurden.

Unterschiedlich ist, daß statt einer Klemmschraube ein Verschlußstück 22 verwendet wird, das in den Figuren 8 und 9 näher dargestellt ist.

Die Bodenfläche des VerschlußStückes 22 weist einen radial durchgehenden Verbindungskanal· 24 auf, der als Kerbe mit konischem Querschnitt ausgebildet ist. Das Verschlußstück ist hierbei axial in der Probenkammer 3o in einer zugeordneten Bohrung verschiebbar, wobei der Verbindungskanal 24 des VerschlußStückes 22 die Verbindung zwischen einer linken überlaufbohrung 19, welche in die größere Bohrung 8 mündet, und einer rechten Überlaufbohrung 20, welche in die rechte Bohrung 10 mündet, darstellt.
Je größer die Zentrifugalkraft ist, desto stärker wird das Verschlußstück 22 mit seinem Verbindungskanal 24 auf die ebene Fläche zwischen den Verbindungsbohrungen 19,20 gepresst und desto geringer ist der Durchlaßquerschnitt. Das Verschlußstück 22 kann aus einem elastischen Kunststoff gefertigt sein, der sich unter dem Einfluß der Zentrifugalkraft verformt, so daß hierdurch eine Verminderung des Querschnittes gegeben ist. Mit einem Griffteil 23 kann das Verschlußstück 22 aus der Probenkammer 3o entnommen werden.

Während des Zentrifugalvorganges erfolgt ebenfalls unter dem Einfluß der in Pfeilrichtung 44 wirkenden Zentrifugalkraft eine Auftrennung der in der linken Bohrung 8,9 eingefüllten Probensuspension in eine distale Fraktion 16 und eine darüber geschichtete, proximale Fraktion Nachdem dir« übe* rl.au rbnhriimf 1') wl od^ruin von Φιπι Aksst» -i0 11 zwischen den Bohrungen 8,9 ausgeht, wird aufgrund der herrschenden Zentrifugalkraft der auf die proximale Fraktion 12 wirkende Druck über die überlaufbohrung 19, den Verbindungskanal 24 und die Überlaufbohrung 20 abgeleitet, so daß die proximale Fraktion 12 in Pfeilrichtung

21 in die rechte Bohrung 10 einfließt und dort auf dom Objokthriiger 2 auE*;edimentiort wird.

Die rechte Bohrung 10 ist hierbei als abgesetzte Bohrung mit einer versetzt darüber angeordneten, kleineren Bohrung 18 ausgebildet. Hinsichtlich der Fig. 6 und 7 gelten für gleiche Teile die gleichen Bezugs zeichen, wie sie in Verbindung mit den Fig. 1-3 verwendet wurden.

Die Figuren 1o bis 12 zeigen eine Schaukelgehänge, wie es zur Verwendung mit den Probenkammern 7,30 nach den Figuren 1-3 bzw. 5-7 verwendet wird. Das dort gezeigte Schaukelgehänge 25 besteht aus einer Trägerplatte 26, an der ein seitlicher und gegenüberliegende Rand 29 angeordnet ist. Um 90° hierzu versetzt setzen am Rand der Trägerplatte 26 Schenkel 27 an, welche jeweils von einer Bohrung 28 durchsetzt sind. Die einander gegenüberliegenden Bohrungen 28 werden in nicht näher dargestellter Weise von einem Trägerzapfen durchsetzt, der am Zentrifugenrotor befestigt ist. Die Probenkammer 7,30 wird mit ihrer Trägerplatte 1 auf die Trägerplatte 26 des Schaukelgehänges 25 aufgesetzt, wobei der erhöhte Rand 29 und die seitwärts hochstehenden Schenkel 27 ein Herabfallen der Probenkammer 7,30 von dem Schaukelgehänge 25 vermieden. Während des Zentrifugiervorganges schwingt das Schaukelgehänge 25 mit seiner Bohrung 28 um den nicht näher dargestellten Zapfen, so daß die Trägerplatte 26 senkrecht steht, ebenso wie die Trägerplatte 1 und der parallel hierzu angeordnete Objektträger 2 der Probenkammer 7,30.

Die in den Figuren 13 bis 15 und 16 bis 18 beschriebenen Probenkammern 4o,5o sind zur Verwendung mit einem in den Figuren 19 und 20 gezeigten Topfrotor 45 bestimmt. Die Einbaulage dieser Probenkammern 4o,5o geht aus Figur 19 hervor. Hierbei ist wesentlich, daß ein Schaukelgehänge fehlt und stattdessen diese Probenkammern 4o,5o unmittelbar liegend in dem Topfrotor 45 eingesetzt werden.

Sowohl"l"n"^: der 'Rühe läge "als auch in der Arbeitslage wird daher die Lage der Probenkammer 4o,5o nicht verändert, d.h. die Trägerplatte 1 mit dem dahinter angeordneten Objektträger 2 steht immer senkrecht und die linke, in den Abbildungen 13 bis 15 und 16 bis 18 gezeigte, vertikale Wand der Bohrung 9 bildet die Bodenfläche der Probenkammer 4o,5o.

Die in den Figuren 13 bis 15 dargestellte Probenkammer weist wiederum eine Trägerplatte 1 mit einem darauf angeordneten Objektträger 2 auf, wobei die Probenkammer mit Hilfe der vorher beschriebenen Halterung 4 und den Klemmbügeln 3 gegen den Objektträger und gegen die Trägerplatte 1 gepresst wird.

Die Befüllung der die Probensuspension und die Plasma— Steril-Lösung aufnehmenden Bohrung 8,9 erfolgt über einen Einfüllstutzen 31, der gemäss Figur 19 in Einbaulage senkrecht nach oben mit seiner Mündung weist.

Während des Zentrifugiervorgangs bildet sich wiederum unter dem Einfluß der in Pfeilrichtung 44 wirkenden Zentrifugalkraft gemäss Figur 13 eine proximale Fraktion 12 und eine distale Fraktion 16 in den übereinanderliegenden und zueinander fluchtenden Bohrungen 8,9 der linken Kammer. Zur Abtrennung der proximalen Fraktion 12 von der distalen Fraktion 16 während des Zentrifugiervorgangs wird Druckluft verwendet. Die Druckluft wird gemäss Figur 19 über einen Druckluftschlauch 52 und einen Druckluftanschluß 53 in die Rotorwelle 51 der Topfzentrifuge 45 eingespeist, wo sie über einen am Boden des Topfrotors 4 5 angeordneten Verteilerkanal 54 in Anschlußstücke 55 gelangt, die in eine zugeordnete, konische Aufnahmebohrung (Anschlußstück 33) der Figur 13 bzw. Figur 16 eingreifen. Vom Anschlußstück 33 ausgehend (Figur 13 bzw. Figur 16) wird die Druckluft über den Druckkanal 32 '

zur Obersieito der Probenkammer 4o,5o geleitet. Die Überleitung in die Mündung des Einfüllstutzens 31 erfolgt dadurch, daß ein einseitig offenes Verbindungsstück 34 zwischen der Mündung des Druckluftkanals 32 und der Mündung des Einfüllstutzens 31 vorhanden ist, und die genannten Teile luftdicht von einer elastischen Platte 58 abgedeckt werden, die an der Unterseite des Deckels 56 des Topfrotors 45 angeordnet ist. Hierdurch wird also eine luftschlüssige Verbindung zwischen dem Druckluftschlauch 52 und dem Einfüllstutzen 31 geschaffen. Die Druckluft wirkt dann in Pfeilrichtung 44 auf die Oberfläche der proximalen Fraktion 12, die aufgrund des Druckunterschiedes über einen Verbindungskanal 36 und ein Teilstück 37 in Pfeilrichtung 39 in die rechte Bohrung 10 eingeleitet wird. Die Bohrung 38 mündet neben der elastischen Platte 58 gemäss Figur 19 und dient zur Entlüftung.

Mit dem Ausführungsbexspxel einer Probenkammer 5o gemäss den Figuren 16-18 wird eine pneumatisch beaufschlagte Überlaufkammer mit bis zum Objektträger 2 führenden Überlaufkanal (Verbindungskanal 42) und Entlüftung (Bohrung 38) vorgeschlagen.

Gleiche Teile, wie beim Ausführungsbexspxel nach den Figuren 13 bis 15 sind mit gleichen Bezugszeichen bezeichnet.

Die Besonderheit dieses Ausführungsbeispiels ist, daß statt einer abgesetzten Bohrung 8,9 im Ausführungsbexspxel der Figuren 13 bis 15 eine durchgehende Bohrung 48 vorgesehen ist, und daß parallel und im Abstand zu dieser Bohrung 48 der Verbindungskanal 42 im Material der Probenkammer 5o verläuft. Es ist nun möglich, mit einer Nadel die Wand 41 der Bohrung 48 anzustechen;

dies kann beispielsweise in Höhe des Pfeiles 43 geschehen, so daß in beliebig vorher bestimmbaren Höhen (Abstand vom Objektträger 2) die Verbindung zu dem Verbindungskanal 42 aus der Bohrung 48 geschaffen werden kann. Hiermit ist es möglich, die Restflüssigkeit in der Bohrung 48 zu variieren.

Der in Abbildung 16 senkrecht verlaufende Verbindungskanal 42 geht in ein horizontales Teilstück 37 über und mündet in die rechte Bohrung 1o. Eine als Entlüftung der Bohrung 10 funktionierende Bohrung 38 mündet neben der elastischen Platte 58 gemäss Figur 19.

Mit der freien Wahl der Fraktionierungsgrenze durch Anstechen des Verbindungskanals 42 in Pfeil-Richtung 43 ist es möglich, sowohl in der linken Bohrung 48 als auch in der rechten Bohrung 10 eine distale und proximale Fraktion 12,16 zu erhalten, wobei die beiden Bohrungen verschieden schwere Fraktionen beinhalten.

Die" Figur 19 zeigt auch schematisiert den Einbau einer" nach den Figuren 16-18 gezeigten Probenkammer 5o.

in der Draufsicht nach Figur 2 ο wird die Probenkammer 4o oder 5o in der in Figur 19 gezeigten Einbaulage in einen vertikalen Rotorrahmen 59 eingesetzt und darin formschlüssig festgehalten. Es wird dann der Deckel 56 mit der darunterliegenden elastischen Platte 58 aufgesetzt, so daß der Druckluftschlauch 52 luftschlüssig mit dem Einfüllstutzen 31 der Probenkammer 4o oder 5o verbunden ist. Der Deckel 56 wird mit dem Schließknopf 57 festgespannt. Der DecTcel '56 mit elastischer Platte 58 dient gleichzeitig als Spannmittel für die Probenkammern 4o oder 5o.

Es wird sodann die Zentrifuge eingeschaltet, wobei der Motor 46 auf einer Trägerplatte 47 montiert ist und über einen Treibriemen 49 die Rotorwelle 51 antreibt.

AiIRf iihrntvfFsh^ i ?;p ml η.τ·Ιι rl«-n Flcjuron 21- 23 zeigt eine Weiterentwicklung des Ausführungsbeispiels nach Figur 16.

Es ist eine große Bohrung 61 vorhanden, in der in der :. 5.. ..vorher .beschriebenen. Weise während des Zentrifugiervorganges sich die proximale Fraktion 12 und die distale Fraktion 16 absetzt. Nach erfolgter Trennung wird während des Zentrifugiervorgangs Preßluft in den Kanal 33 eingeleitet, die in Pfeilrichtung 63 in den Kanal einströmt, dort von dem in Fig. 19 dargestellten Deckel 56 in Pfeilrichtung 65 umgelenkt wird und über den Kanal 31 in Pfeilrichtung 44 in die Bohrung 61 einströmt. Dort wird die Probenflüssigkeit über den Kanal 42 verdrängt und fließt in die zweite Bohrung 1o. Die Er-Weiterung dieses Ausführungsbeispieles gegenüber dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 16 liegt nun darin, daß das Teilstück 37 nach Fig. 16 entfällt und daß stattdessen ein Teilstück 66 vorgesehen ist, was in ein weiteres Teilstück 67 des Kanals übergeht. Wichtig ist, daß die Mündung 68 des Teilstücks 67 in die kleine

Bohrung 1o bei aufrechtstehender Probenkammer, d.h. f-, wenn die Probenkammer auf der Bodenfläche 69 steht,

oberhalb des sich bei stehender Probenkammer bildenden Flüssigkeitsspiegels 7o liegt, so daß auf jeden Fall vermieden wird, daß Probenflüssigkeit 71 von der zweiten Bohrung 10 über die Teilstücke 66,67 und den Kanal 42 zurück in die erste Bohrung 61 fließt.

Eine weitere Erweiterung des Erfindungsgedankens liegt in der Anordnung einer dritten Bohrung 72. Die Bohrung 72 ist in Serie zu der zweiten Bohrung 1o geschaltet. Wichtig ist hierbei, daß ein Kanal 73 unterhalb des Flüssigkeitsspiegels 7o bei stehendem Probengefäss in die zweite Bohrung 1o mündet. Die Mündung bei dem Ausführungsbeispiel nach Fig. 21 ist unmittelbar über

dem Objektträger 2 gezeigt, wo ein geringes Spiel von 2/10 mm noch vorhanden ist; diese Mündung kann aber irgendwo im Bereich (z.B. bei Pfeil 43) des Zentrifugen-Kanals 73 eingebracht sein.

Der Kanal 73 setzt sich in einen vertikalen Kanal 74 fort, der in einen weiteren, horizontalen Kanal 75 übergeht, der in die Bohrung 72 mündet. Wesentlich ist hierbei, daß die Mündung 76 des Kanals 75 oberhalb des Flüssigkeitsspiegels 77 liegt, so daß auch aus dieser dritten Bohrung 72 keine Flüssigkeit in die zweiten Probenkammern zurückfließen kann, wenn die Zentrifuge steht.

Die Anordnung einer dritten Bohrung 72 hinter der zweiten Bohrung 10 und deren Verbindung über die Kanäle 73,74,75 bedeutet einen wesentlichen Fortschritt in der Zytologie, weil mit einem solchen - insgesamt drei Bohrungen enthaltenden - Probengefäss ein Färbevorgang während des Zentrifugiervorganges vorgenommen werden kann. Dies geht folgendermassen:

Ausgehend von der proximalen 12 und distalen Fraktion 16, die sich in der ersten Bohrung 61 bildet, wird nachfolgend Druckluft über den Kanal 33 eingeleitet, die in Pfeilrichtung 44 die gesamte Flüssigkeit der Bohrung 61 über den Kanal 42,66,67,68 in die zweite Bohrung 10 verdrängt. Die Zentrifuge wird nun angehalten und die Flüssigkeit nimmt eine Lage mit dem Flüssigkeitsspiegel 70 ein. Es wird nun wieder Druckluft über den Kanal 33 eingeleitet, die nun durch die leere Probenkammer 61 strömt, dort üIj<t den Kanal 42,66,67,68

JO in die zweite Bohrunq Io ν Lrist ι ömt , d Io Prolxmf lüssigkeit unter Druck setzt und über den Kanal 73,74,75 in die dritte Bohrung 72 verdrängt.

Die Anordnung einer dritteln Bohrung 72 ist wichtig, denn es kann - nachdem die beiden ersten Probenkammern freigemacht wurden - ein Färbevorgang stattfinden. Hierzu wird die Zentrifuge angehalten, der Deckel wird geöffnet und über den Einfüllstutzen 31 wird in die erste Bohrung 61 ein paar Tropfen einer Färbeflüssigkeit gegeben. Nachdem die Probenflüssigkeit eingefüllt wurde, wird die Zentrifuge eingeschaltet und die Probenflüssigkeit wird gegen die Objektträgerfläche der ersten Bohrung gepresst und färbt die dort lagernden Epithelzellen ein. Es wird eine bestimmte Einwirkungszeit abgewartet, dann wird Preßluft über den Kanal 33 gegeben, welche in Pfeilrichtung 44 auf die in der Nähe der Objektträgerfläche lagernde Färbeflüssigkeit einwirkt, die nun über den Kanal 42,66,67 in die zweite Bohrung 1o verdrängt wird und das dortige Objektträgerfeld einfärbt. Nach erfolgter Einwirkungszeit wird die Zentrifuge angehalten, und die Färbeflüssigkeit fließt nach unten auf die Bodenfläche, die parallel zum Flüssigkeitsspiegel 7o liegt. Der Kanal 73 von der Bohrung 72 mündet im Bereich dieser Bodenfläche in die Bohrung 10, so daß während des Stillstehens der Probenkammer 6o und während der Einleitung von Preßluft diese in Pfeilrichtung 44 in die erste Bohrung 61 einströmt, dort über den Kanal 42,66, 67 in die zweite Bohrung 10 strömt und dort die Färbeflüssigkeit über die Mündung des Kanals 73 an der Objektträgerfläche in den Kanal 73 hineingepresst und über den Kanal 74,75 und die Mündung 76 in die dritte Bohrung 72 drückt. In der dritten Bohrung 72 sammelt sich eine Abfallflüssigkeit, die aus einem Gemisch aus Probenflüssigkeit und aus Färbeflüssigkeit besteht. Um ein Ausströmen der Flüssigkeit aus der der Entlüftung dienenden Durchgangsbohrung 17 zu vermeiden, ist zwischen der Mündung 76 des Kanals 75 und der Durchgangsbohrung ein Vorsprung 86 angeordnet.

Nach erfolgten Färbevorgang kann in analoger Weise noch weitere Flüssigkeit eingegeben werden, z.B. eine Spülflüssigkeit, eine Fixierflüssigkeit und ähnliches, wobei sich sämtliche verbrauchten Lösungen dann nach erfolgten, durchgeführten Arbeitsvorgängen in der Bohrung 72 sammeln.

Durch die Serienschaltung von mehreren, hintereinanderliegenden Bohrungen 61,1o,72 und durch die sinnvolle Verbindung dieser Bohrungen 61,1o,72 mit Hilfe von Kanälen werden also die Objektträgerflächen des Objektträgers 2 der Bohrungen 61,1o (d.h. also die Untersuchungsfläche und die Kontrollfäche des Objektträgers) mit verschiedenen Behandlungsflüssigkeiten behandelt, ohne daß jemals die gesamte Probenkammer 6o aus dem Rotor der Zentrifuge herausgenommen werden muss.

In der Fig. 21-23 ist eine Halterung gezeigt, die es ermöglicht, daß die gesamte Bodenplatte 78, die aus zwei Teilplatten 79,8o besteht, einfach von dem Oberteil 81 abgenommen werden kann. Hierzu ist es möglieh, durch Verschieben der Probenkammer 6o eines Schiebers 82 mit einem einzigen Handgriff die Bodenplatte 78 von dem Oberteil 81 zu lösen, so daß der Objektträger 2-unmittelbar entnommen werden kann. Der Schieber ist hierbei in den Pfeilrichtungen 83 verschiebbar und arbeitet mit entsprechenden Halteriasen 84,85 des Oberteils zusammen.

In der Fig. 23 ist zur besseren Verdeutlichung des Erfindungsgedankens das Grundprinzip schematisiert dargestellt, wie die drei Bohrunqen nach der Fi q. 21 hintereinandergeschaltet sind. Ebenso Bind die· FiUsBiqkeitsströme gezeigt und die Mündungen der Kanäle. Gestrichelt bei der zweiten Bohrung 91 ist gezeigt, daß auch ein zweiter Kanal 73 angeordnet sein kann. Der in der zweiten Bohrung 91 durchgezogen gezeichnete Kanal 73 ist dafür gedacht, daß die Probenflüssigkeit nur dann aus der

zweiton Bohrung 91 entnommen wird, wenn die Zentrifuge angehalten still steht, so daß die Flüssigkeit auf die Bodenfläche fließt und dort den Flüssigkeitsspiegel 7o bildet, so daß sie über den Kanal 73 aus der zweiten Bohrung 91 in die dritte Bohrung 93 eingeleitet werden kann. Will man die Überleitung von der zweiten in die dritte Bohrung aber während des Zentrifugiervorgangs durchführen, dann wählt eine Fließverbindung entsprechend dem gestrichelt gezeichneten Kanal 73', der in der Nähe • ig des Objektträgers 2 endet. Die in die zweite Bohrung 91 einströmende Flüssigkeit wird zwar nach und nach unter Einwirkung der Druckluft sofort über diesen Kanal 73' in die dritte Bohrung 93 verdrängt werden, man kann den Querschnitt des Kanals 73' jedoch so gering wählen, daß die.geforderte Einwirkungszeit der Probenflüssigkeit auf den Objektträger 2 in der zweiten Bohrung 91 beibehalten wird.

D.h. , man wählt den Querschnitt beispielsweise so, daß erst nach etwa 2 Minuten der Inhalt der zweiten Bohrung 91 vollständig in die dritte Bohrung 93 eingeleitet wurde, so daß eine Einwirkungszeit von 2 Minuten bei der zweiten -"*■- . Bohrung 91 gewährleistet ist.

Fig. 25 zeigt ein weiteres, abgewandeltes Ausführungsbeispiel, wo gezeigt ist, daß -mit einem weiteren Reser- voir (Farbreservoir 94 für Farbflüssigkeit) ohne Anhalten der Zentrifuge und Öffnen des Zentrifugendeckels sofort ein Färbevorgang durchgeführt werden kann, sofern die beiden Probenkammern 61 und 10 vorher entleert wurden, wie es anhand der Fig. 21 - 23 erläutert wurde.

Wenn man über einen zweiten Druckluftanschluß 88, der etwa parallel zu dem Kanal 33 in der Probenkammer angeordnet ist, Druckluft in ein Farbreservoir 94 einpresst, dann wird über den Überlauf 95,96 die Farbe 87 aus dem Farbreservoir 94 verdrängt und über die Leitungen 97,98

sofort in die Bohrungen 90,91 geleitet. Es entfällt COPY

somit das Anhalten der Zentrifuge und das Einbringen der Farbe 87 zunächst in die erste Bohrung, und die Überleitung in die zweite Bohrung 91. Es wird vielmehr die Farbe 87 bei laufender Zentrifuge parallel in beide Bohrungen 91,92 verteilt.

Es wird damit auch eine Verkürzung der Verfahrenszeit erreicht.

Sobald die Färbung vorgenommen wurde, kann in der vorher beschriebenen Weise die Farbflüssigkeit aus den Bohrungen 90, 91 entfernt werden, indem auf die erste Bohrung 90 die Druckluft in Pfeilrichtung 44 aufgegeben wird, so daß die Farbe 87 von der ersten Bohrung 90 über den Kanal in die zweite Bohrung 91 übergeleitet wird. Wenn die erste Bohrung 42 entleert ist, wird auch die zweite Bohrung 91 über den Kanal 73,74,75 entleert , und sämtliche Farbe 87 fließt in die dritte Bohrung 93. In Serie hinter der dritten Bohrung 93 können noch weitere - nicht näher dargestellte - Bohrungen angeordnet sein. Als Beispiel ist noch eine Fließverbindung von der dritten Bohrung 93 in eine nicht näher dargestellte Bohrung in Form eines weiteren Kanals 101 gezeigt. Damit während der Einleitung von Druckluft in Pfeilrichtung 44 in unzulässiger Weise über die Leitungen 97, 98 Druckluft in das Farbreservoir 94 zurückgedrückt _; wird, und über den Druckluftanschluß 88 entweicht, ist dort ein Rückschlagventil 9 9 angeordnet.

In analoger Weise kann das Beispiel nach Fig. 25 beliebig viele Behandlungsflüssigkeits-Rr-servoirs aufweisen, /..Ii. (?.in /.woit-fM Ri'nnr vo I r für \\\Λ\ I f l (la jj 1.<iko i I; oder ein Jü drittes Reservoir für eine Fixierflüssigkeit und so weiter.

- * 4 f

-35-

Wesentlich bei dieser Erweiterung ist, daß jedem Reservoir 94 ein eigener Druckluftanschluß mit einem zugeordneten Rückschlagventil zugeordnet werden muss, damit das geordnete Herausfließen aus dem jeweiligen Reservoir zum richtigen Zeitpunkt gewährleistet ist.

Das vorgeschlagene System hat also den Vorteil, daß die Probenkammer 100 ständig in der Zentrifuge verbleibt und der Färbevorgang unter Zentrifugalkraft in der Zentrifuge selbst erfolgt und teure, sowie kostspielige und ungenaue automatische Färbevorrichtungen vermieden werden. Vor allem wird verhindert, daß Epithelzellen bei externen Färbeverfahren von den Objektträgerflächen abgespült werden, was als großer Nachteil bei den bisher bekannten Färbemthoden zu werten ist.

Es kann aber nicht nur der Färbevorgang nach der vorliegenden Erfindung automatisiert werden, sondern auch der Fixiervorgang und der Spülvorgang und dergleichen mehr.

Wesentlich ist ferner, daß die gesamte Probenkammer 7,80, 40,60,100 aus einem relativ billigen Kunststoff-Spritzguß besteht, einfach herzustellen ist und daß sogar die O-Ringe, die in den Zeichnungen noch angegeben sind, durch angespritzte Lippendichtungen ersetzt werden können , so daß es möglich ist, eine solche Probenkammer als Einwegartikel mit niedrigen Einkaufskosten herzustellen.

33313G1

-3g-ZEICHNUNGS-LEGENDE

1 Trägerplatte

2 Objektträger

3 Klemmbügel

4 Halterung

5 Dichtungsring

6 Dichtungsring

7 Probenkammer

8 Bohrung, groß

9 Bohrung, klein

I 0 Bohrung

I1 Absatz

12 proximale Fraktion

(Überstand)

13 Pfeilrichtung

14 überlaufbohrung

15 Klemmschraube

16 distale Fraktion

17 Durchgangsbohrung

18 kl. Bohrung (Fig.5)

19 Überlaufbohrung

20 Überlaufbohrung

21 Pfeilrichtung

22 Verschlußstück

23 Griffteil

24 Verbindungskanal

25 Schaukelgehänge

26 Trägerplatte

27 Schenkel

28 Bohrung

29 Rand

30 Probenkammer (Figur 5-9)

31 Einfüllstutzen, konisch

32 Druckkanal

3 3 Anschlußstück

34 Verbindungsstück

35 Bohrungsansatz

3 6 Verbindungskanal

37 Teilstück

38 Bohrung

39 Pfeilrichtung

40 Probenkammer(Fig. 13-15)

41 Wand

42 Kanal

43 Pfeil

44 Pfeilrichtung

45 Topfrotor

46 Motor

47 Trägerplatte

48 Bohrung, groß

49 Treibriemen

50 Probenkammer (Fig. 16-18)

51 Rotorwelle

52 Druckluftschlauch

53 Druckluftanschluß

54 Verteilerkanal·

55 Anschdußstück

56 Deckel·

57 Sctaießknopf

58 eiastische Piatte

59 Rotorrahmen, einstückig

60 Probenkammer

61 Bohrung

63 Pfeilrichtung

64 Position

65 Pfeilrichtung

66 Teilstück

67 Teilstück

68 Mündung

69 Bodenfläche

70 Flüssigkeitsspiegel

71 Probenflüssigkeit

72 Bohrung

73 Kanal 73'Kanal

74 Kanal

75 Kanal

76 Mündung

77 Flüssigkeitsspiegel

78 Bodenplatte

79 Teilplatte

80 Teilplatte

81 Oberteil

82 Schieber

83 Pfeilrichtungen

84 Haltenase

85 Haltenase

86 Vorsprung

87 Farbe

88 Druckluftanschluß

91 Bohrung

93 Bohrung

94 Farbreservoir

95 Überlauf

97 Leitung

98 Leitung

99 Rückschlagventil

100 Probenkammer

101 Kanal

90 Bohrung

Claims (9)

1. Patentansprüche

   /Ί .j Verfahren zur zytodiagnostischen Untersuchung von m einer Untersuchungsprobe enthaltenen Epithelzellen , bei dem
   a) im ersten Arbeitsgang einer die zu, untersuchenden Zellen enthaltende Suspensionsprobe durch einen ersten Zentrifugationsvorgang absedimentiert wird

   b) das entstehende Zellsediment in einem zweiten Arbeitsgang abgesaugt wird

   c) in einem dritten Arbeitsgang die abgesaugte Zellsedimenprobe auf ein Trennmedium (z.B. Plasma steril) überschichtet wird,

   d) in einem vierten Arbeitsgang die im dritten Arbeitsgang erhaltene Probensuspension einem zweiten Zentrifugationsvorgang unterworfen wird, wobei sich eine distale und eine proximale Fraktion bildet

   Postscheck!

   J331301

   e) in einem fünften Arbeitsgang die distale und proximale Fraktion getrennt wird

   f) in einem sechsten Arbeitsgang jeweils die distale und proximale Fraktion in jeweils eine Bohrung einer Zentrif ugationskanuner eingebracht wird,

   g) in einem siebten Arbeitsgang die in den getrennten Bohrungen der Zentrifugationskammer anstehende, proximale und distale Fraktion einem dritten . Zentrifugationsvorgang unterworfen wird, wobei der an der Zentrifugationskammer angeordnete Objektträger mit den Epithelzellen der distalen und proximalen Fraktion an voneinander getrennten Flächen beschichtet wird

   h) in einem achten Arbeitsgang die auf den Objektträger aufsedimentierten Zellen angefärbt werden

   i) in einem neufcen Arbeitsgang die auf dem Objektträger angeordneten und angefärbten Zellen optisch untersucht werden,

   dadurch gekennzeichnet, daß die Arbeitsgänge nach den Schritten e), f) und g) während eines einzigen Zentrifugationsvorganges vorgenommen werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß auch der Arbeitsschritt h) während des Zentrifugationsvorganges vorge- nommen wird.
3. 3. Zentrifugationskammer zur Ausführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, bestehend aus einer Trägerplatte (1) und ninoni darauf 1>γ·Γγ·ηΙ J,ql «mi Objokfctruffcic (2), auf dessen Seite abgedichtet eine Probenkammer (7,30,40,50, 60/100) aufsitzt, welche mehrere parallel im Abstand nebeneinander angeordnete und mit Probenflüssigkeit füllbare Bohrungen (8,9,1o; 9,10,18; 48,1o;61,10 und 72; 90,91 und 93) aufweist, deren stirnseitige Öffnungen jeweils dichtend auf dem Objektträger (2) aufsitzen,

   dadurch <τ ^(% k φ η η /. <■ i c h η c h , daß zwi !leben den para I l<·! hu Ab::land iirujeorilnoLen Bohrungen (8,9 und 10; 9 und 10, 18; 48 und 10; 61,1ο,72; 90,91;93;101) jeweils eine Fließverbindung (Kanal) (14,15; 19,20,24; 36,37; 42; 73,74,75,76) angeordnet ist.
4. 4. Zentrifugationskammer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fließverbindung aus einer im Querschnitt veränderbaren Überlaufbohrung (14;19,20,24) besteht, daß die eine Bohrung (8,9) in eine Bohrung (8) größeren Durchmessers und eine mit dieser fluchtende Bohrung (9) kleineren Durchmessers aufgeteilt ist, und daß die Überlaufbohrung (14.; 19,20/24) vom Ansatz der größeren (8) in die kleinere Bohrung (9) ausgeht, (Fig. 1 - 3 und 5-9).
5. 5. Zentrifugationskammer nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichn et, daß zur Veränderung des Querschnitts der Überlaufbohrung (14) eine Klemmschraube (15) vorgesehen ist, (Fig. 1-3).
6. 6. Zentrifugationskammer nach Anspruch 4, dadurch geke nn zeichnet, daß zur Veränderung des Querschnitts der Überlaufbohrung (19,20,24) ein axial in Längsrichtung der Bohrungen (8,9,10) verschiebbares Klemmstück (22) vorgesehen ist, dessen eine Stirnfläche einen radialen Verbindungskanal (24) aufweist, der die Verbindung zwischen den beiden Überlaufbohrungen (19,20) bildet, (Fig. 5-9).
7. 7. Zentrifugationskammer nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Überleitung von Flüssigkeit von einer ersten Bohrung (8,48,61,90) in benachbarte Bohrungen (10,72,91,93) jeweils der benachbarte Bohrungen (8,10,48,61,72,90,91,93) verbindende Kanal (36,37; 42,37; 42,66,67; 73,75) am Boden der

   ersten Bohrung (8,48,61,90) ansetzt und in der Deckfläche der benachbarten Bohrung (8,10,48,61,72,90,91,93) mündet, und daß die Flüssigkeit in der ersten Bohrung (8,48,61,90) jeweils unter dem Druck von Preßluft durch den Kanal (36,37; 42,37; 42,66,67; 73,75) in die benachbarte Bohrung (8,48,61,90) treibbar ist, (Fig. 13,16,20,23,24).
8. 8. Zentrifugationskammer nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere unterschiedliche Flüssigkeiten (z.B. Färbeflüssigkeit, Fixierflüssigkeit) in die erste Bohrung (8,48,61,90) einleitbar sind, die nacheinander folgend über die, die benachbarten Bohrungen (8*10,48,61,72,90,91,93) verbindenden Kanäle (36,37; 42,37;42,66,67) in die in Serie hinter der ersten Bohrung (8,48,61,90) geschalteten weiteren Bohrungen überleitbar sind, (Fig. 21.24).
9. 9. Zentrifügationskammer nach Anspruch 8, dadurch ge kennzeichnet, daß die Einleitung und Überleitung von einer oder mehreren unterschiedlichen Flüssigkeiten (z.B. Färbeflüssigkeit, Fixierflüssigkeit) in die nebeneinander angeordneten Bohrungen (90,91,93) während des Zentrifugationsvorgänges erfolgt ^Fig. 25).