DE3320145C2 - Verfahren zur Herstellung von Magnesiumdihydroorotatglycinaten und ihre Verwendung als Calcium-Antagonisten - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Magnesiumdihydroorotatglycinaten und ihre Verwendung als Calcium-Antagonisten

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DE3320145C2
DE3320145C2 DE19833320145 DE3320145A DE3320145C2 DE 3320145 C2 DE3320145 C2 DE 3320145C2 DE 19833320145 DE19833320145 DE 19833320145 DE 3320145 A DE3320145 A DE 3320145A DE 3320145 C2 DE3320145 C2 DE 3320145C2
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Abstract

Angegeben wird ein Verfahren zur Herstellung von Magnesiumorotatglycinat der Formel I oder II $F1 durch Umsetzen von Orotsäure, Glycin und metallischem Magnesium einem Molverhältnis von ca. 1 : 1 : 1 oder ca. 2 : 4 : 3 in Wasser. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von Eisenionen als Katalysator durchgeführt wird. Außerdem wird ein Katalysator zur Durchführung des Verfahrens beschrieben, der sich dadurch auszeichnet, daß er aus metallischem Eisen besteht, das weitgehend mit einem in Wasser schwer- oder unlöslichen Stoff beschichtet ist. Das Verfahren hat den Vorteil einer sehr guten Ausbeute der gewünschten Verbindungen, deren Wasserlöslichkeit auch noch wesentlich verbessert ist. Die hergestellten Verbindungen sind physiologisch und pharmakologisch wirksame Calcium-Antagonisten.

Description

HO OH
durch Umsetzen von Orotsäure, Glycin und metallischem Magnesium in einem Molverhältnis von ca. 1 :1 :1 oder ca. 2:4:3 in Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von Eisenionen als Katalysator erfolgt wobei die Eisenionen dem Gemisch der Reaktionspartner während der gesamten Umsetzungsdauer langsam zugeführt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Eisenionen mittels eines Eisen-Polytetrafluoräthykn-Schwammes zugeführt werden.
3. Verwendung des gemäß dem Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 hergestellten Magnesiumdihydroortatglycinats der Formei I oderii als physiologisch und pharmakologisch wirksamer Calcium-Antagonist.
Die Erfindung betrifft ein katalytisches Verfahren zur Synthese der Magnesiumdihydroorotatglycinate der im Patentanspruch 1 angegebenen Formel I oder II durch Umsetzen von Orotsäure, Glycin pt\d metallischem Magnesium in einem Molverhältnis von ca. 1 :1 :1 oder 2:4:3 in wäßriger Suspension unter Einsatz eines Eisenkatalysators sowie die Verwendung dieser Magnesiumdihydroorotatglycinat-Verbindungen als Calcium-Antagonist Das erfindungsgemäß hergestellte Magnesiumdihydroorotatglycinat der Formel I (nachfolgend »Verbindung I« genannt) wird nach den IUPAC-Nomenklaturregeln als 2,6-Dihydroxy-4,5-dihydropyrimidin-4-carboxy-magnesium-aminoacetat bezeichnet. Das Magnesiumdihydroorotat der Formel II (nachfolgend »Verbindung II« genannt) ist eine Komplexverbindung aus der Verbindung I und Magnesiumaminoacetat im Molverhältnis 2:1.
Zwei ähnliche Verbindungen, nämlich die nicht hydrierten Magnesiumorotatglycinate sind in der DE-AS 19 24 174 beschrieben. Sie sind wegen ihrer relativ schlechten Wasserlöslichkeit nicht als Calcium-Antagonisten einsetzbar. Darüber hinaus ist in der DE-AS 19 24 174 ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen beschrieben, das ohne Einsatz eines Katalysators durchgeführt wird. Die Wasserlöslichkeit dieser Verbindungen, die mit entscheidend für eine Resorption ist, betrug nur 7 — 8% für Verbindung I und 9—10% für Verbindung Il der DE-AS 19 24 174. So können die bekannten Verbindungen nur als Arzneistoff für Magnesiummangelkrankheit eingesetzt werden.
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, durch Änderung des Herstellungsverfahrens für die bekannten Verbindungen I und II der DE-AS 9 24 174 Calcium-Antagonisten zu konstruieren, die gegenüber den klassischen Calcium-Antagonisten vom Verapamil-Typ eine hohe Bioverfügbarkeit bei weitgehender Ungiftigkeit (»non-toxic drug«) haben. Hierzu müssen neue biophysikalische, biochemische und pharmakologische Eigenschaften der Substanzen, wie z. B. eine erhöhte Wasserlöslichkeit (erreicht wurde eine Wasserlöslichkeit von 24 — 25 Gew.-%) erarbeitet werden. Die erhöhte Wasserlöslichkeit der Substanzen bringt völlig veränderte pharmakologisch-biomedizinische Wirkungsqualitäten. Gleichgerichtet wird durch die erhöhte Wasserlöslichkeit der Verbindungen eine erhöhte intrazelluläre Magnesiuminkorporation im Organismus erreicht, so daß nunmehr eine Calcium-antagonistische Wirkung im Organismus zustande kommt.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die aus der DE-AS 19 24 174 bekannte Umsetzung
b5 von Orotsäure, Glycin und metallischem Magnesium im Molverhältnis von etwa 1:1:1 oder 2:4 :3 in wäßriger Suspension in Gegenwart von Eisenionen als Katalysator durchgeführt wird, wobei die Eisenionen dem Gemisch der Reaktionspartner während der gesamten Umsetzungsdauer langsam zugeführt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren verläuft relativ schnell und mit hoher Selektivität hinsichtlich der Bildung
des gewünschten Magnesiumdihydroorotatglycinats. Die erfindungsgemäß als Katalysator wirkenden Eisenionen können z. B. zwei- oder dreiwertig sein.
Die Eisenionen werden dem Gemisch der Reaktionspartner während der gesamten Umsetzungsdauer langsam zugeführt. So verläuft die Bildung der gewünschten Verbindung I oder Il selektiv, rasch und mit hoher Ausbeute, während die Entstehung von Nebenprodukten, wie z. B. Eisenorotat, nahezu völlig unterdrückt wird. Damit erübrigt es sich, Nebenprodukte in einem gesonderten Verfahrensschritt abzutrennen.
Als besonders geeignet hat sich ein Katalysator erwiesen, der aus einem mit Polytetrafluorethylen beschichteten Eisenfasergebilde besteht, wobei die Eisenfasern einen mittleren Durchmesser von ca. 3,5 bis ca. 120 μ, vorzugsweise von ca. 3,5 bis ca. 12 μ, aufweisen und die Schichtdicke des Polytetrafluoräthylens auf den Eisenfasern ca. 2 bis ca. 200 μ, vorzugsweise ca. 2 μ, beträgt Dieser Katalysator wird auch als »Eisen-Polytetrafluoräthylen-Schwamm (ET-Schwamm)« bezeichnet
Der ET-Schwamm kann z. B. durch Besprühen eines Faserknäuels aus Eisenputzwolle mit einem Polytetrafluorethylen-Aerosolpräparat hergestellt werden. An den Berührungsstellen der Eisenfasern wird der Faserknäuel nicht mit dem Kunststoff beschichtet Außerdem bricht beim Verformen des mit Kunststoff beschichteten Faserknäuels die Kunststoffschicht an den erwähnten Berührungsstellen der Eisenfasern, so daß dort dann das is metallische Eisen freiliegt und im Umsetzungsgemisch der oben erwähnten Reaktionspartner Eisenionen bilden und abgeben kann. Da die freie Eisenfläche in dem beschichteten Eisenfasergebilde sehr gering ist, wird ein unerwünschtes Überschießen der Reaktion verhindert
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Verbindungen I und Il unter Einsatz des bevorzugten ET-Schlammes als Quelle für die katalysierenden Eisenionen wird im allgemeinen so durchgeführt, daß Orotsäure oder deren Monohydrat und Glycin in destilliertem Wasser in Gegenwart eines eingelegten ET-Schwammes mit dec entsprechenden Menge an metallischem, vorzugsweise pulverförmigem Magnesium unbesetzt werden. Im Falle der Herstellung der Verbindung I werden Orotsäure, Glycin und Magnesium im Molverhältnis von ca. 1 :1 :1, im Falle der Herstellung der Verbindung II im Molverhältnis von ca. 2 :4 :3 umgesetzt. Die Konzentrationen der Reaktionspartner liegen bei ca. 03 bis 1,0 mol/1, vorzugsweise bei 03 mol/l. Das Reaktionsgemhch wird zu Beginn erwärmt, vorzugsweise auf eine Temperatur von +6O0C. Der ET-Schwamm bildet, auf etwa 100 g (4,11 Grammatome) Magnesiumpulver in dem Reaktionsgei^Jsch etwa 5 bis 100 mg (0,09 bis 1,79 mmol) Eisen(N)-ionen. Die Umsetzung ist in Abhängigkeit von der Ansatzgröße nach 1 bis 4 Stunden vollständig.
Nach dem Abkühlen und Filtrieren des Reaktionsgemisches kann das Filtrat bei Bedarf neutralisiert werden. Die erhaltene Lösung wird für den Fall ihrer intravenösen Applikation auf einen physiologischen pH-Wert, vorzugsweise auf einen pH-Wert 73, eingestellt und in üblicher Weise hitzesterilisiert Alternativ Rann aus der Lösung das Wasser vorzugsweise durch Gefriertrocknung abgetrennt werden, wobei die Verbindung I oder II in fester Form, z. B. als Salz der für die Neutralisierung eingesetzten Säure (z. B. HCI) anfällt und sich nach Trocknung für eine perorale Applikation eignet. Hier bleibt die Wasserlöslichkeit der Verbindung voll erhalten. Es entsteht ein rieselfähiges, amorphes bis feinkörniges Produkt, welches sich gaienisch gut aufbereiten läßt.
Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen I und II wirken als starke Calcium-Antagonisten. Diese Verbindungen sind in der Lage, eine große Anzahl von Calcium-Ionen, die in oder an biologischen Systemen vorliegen (Zellmembran), funktionell zu blockieren bzw. dosisabhängig zu modulieren (intrazeiiuiärer Caicium-Modulator).
An einem solchen biologischen System, nämlich der Blutgerinnung, wird der Calcium-antagonistische Wirknachweis dor Verbindungen ! und II geführt. Entsprechende experimentelle Untersuchungen werden im Abschnitt »Pharmakologische Untersuchungen« beschrieben.
Eine wesentliche Voraussetzung für die Wirkung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Verbindungen als Calcium-Antagonisten ist ihre hohe Wasserlöslichkeit. Im Vergleich zu Verapamil beträgt die Effektivität der erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen I und II als Calcium-Antagonisten in tierexperimentellen und klinischen Versuchen bei intravenöser Injektion mehr als das Vierfache, bei peroraler Applikation mehr als das Doppelte, wobei bei den Dosis-Wirkungsbeziehungen die Toxizität der Verbindung mit eingeht.
Hinzu kommt die extrem hohe Ungiftigkeit der erfindungsgemäß erhaltenen Verbindungen I und II. Beispielsweise werden Schweine, die dem Menschen gewichtsäquivalent sind, durch intravenöses Applizieren von 200 ml einer Lösung, die 21,4 g der Verbindung I enthält, nicht geschädigt. Wird diese Verbindung Ratten intravenös appliziert, liegt die akuts Toxizität in Form des LD50-Wertes bei über 220 mg/kg, im Falle von Mäusen bei über 260 mg/kg. Wird die Applikation bei diesen Tieren peroral vorgenommen, beträgt der LD50- Wert über 2 g/kg.
Die Zeichnungen und die Beispiele erläutern die Erfindung.
F i g. 1 bis 6 beziehen sich auf Thrombozytenaggregationsversuche mit dem Plasma einer Versuchsperson nach i.v.-lnfusion der Verbindung I;
F i g. 7 bis 12 beziehen sich auf solche nach oraler Applikation von Verapamil oder Verbindung I. Fi g. 1 —6; Patientin weibl. M.S., 54 Jahre (sine morbo — veg. dystonie); Fig.7 —12: Patient männl. G.S., 47 Jahre (sine morbo).
Es zeigt
F i g. 1 Aggregationskurven, die bei der mit Arachidonsäure ausgelösten Thrombozytenaggregation vor Infusion der erfindungsgemäß hergestellten Verbindung I aufgezeichnet wurden;
F i g. 2 Aggregationskurven gemäß F i g. 1, jedoch nach Infusion von Verbindung I;
F i g. 3 Aggregationskurven, die bei der mit Kollagen ausgelösten Thrombozytenaggregation vor Infusion von Verbindung I aufgezeichnet wurden;
Fig. 4 Aggregationskurven gemäß F ig. 3, jedoch nach Infusion ve. Verbindung I;
F i g. 5 Aggregationskurven, die bei der mit Adenosindiphosphat ausgelösten Thrombozytenaggregation von Infusion von Verbindung I aufgezeichnet wurden;
Fig. 6 AggregationsVirven gemäß Fig. 5, jedoch nach Infusion von Verbindung I;
"Γ"—— ■
Fig. 7 Aggregationskurven, die bei der mit Arachidonsäure ausgelösten Thrombozytenaggregation nach oraler Verabreichung von Verapamil aufgezeichnet wurden;
F i g. 8 Aggregationskurven gemäß F i g. 7, jedoch nach oraler Verabreichung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindung I;
Fig.9 Aggregationskurven, die bei der mit Kollagen ausgelösten Thrombozytenaggregation nach oraler Verabreichung von Verapamil aufgezeichnet wurden;
Fig. IO Aggregationskurven gemäß Fig. 9, jedoch nach oraler Verabreichung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindung I:
F i g. 11 Aggregationskurven, die bei der mit Adenosindiphosphat ausgelösten Thrombozytenaggregation ίο nach oraler Verabreichung von Verapamil aufgezeichnet wurden;
F i g. 12 Aggregationskurven gemäß Fig. 11, jedoch nach oraler Verabreichung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindung 1;
F i g. 13 300 MHz-Protonenresonanzspektrum von Verbindung 1, Übersichtsspektrum·,
Fig. 14 Spektrum gemäß Fig. 13, Ausschnitt;
Fig. 15 90 MHz-Protonenresonanzspektrum von DL-Dihydroorotsäure;
Fig. 16 90 MHz-Protonenresonanzspektrum von Verbindung II;
F i g. 17 Spektrum 5 als Feinauflösungsspektrum des Spektrums der Fig. 13.
Beispiel 1
Es wird die Verbindung 1 unter Verwendung eines Eisenteflon-(ET-)Schwammes
als Katalysator hergestellt
1802 g (2,4 mol) Glycin und 374,6 g (2,4 mol) wasserfreie Orotsäure werden unter Rühren in 4,8 I destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 60° C gelöst bzw. suspendiert. In das Gemisch wird ein ET-Schwamm mit den Abmessungen 40 mm χ 20 mm χ 5 mm gelegt. Im Verlauf von 50 Minuten werden insgesamt 58,92 g (2,4 Grammatome) Magnesiumpulver in Portionen von jeweils 4,5 bis 9 g in die Suspension eingetragen. Die Reaktion beginnt bei einem pH-Wert von 1 bis 2,4. Der entstehende Wasserstoff wird mit einem Stickstoffstrom aus dem Reaktionsbehälter abgeführt. Nach 2 Stunden ist fast d.u gesamte Magnesium aufgelöst, und aus der Suspension ist eine fast klare Lösung entstanden. Zur Vervollständigung der Reaktion wird noch 2 weitere Stunden bei 60°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, dann auf Raumtemperatur und schließlich auf 4 bis 8°C abgekühlt, sowie erneut filtriert. Das alkalische Filtrat mit einem pH-Wert von 9,64 wird mit 258 ml 6,1 -n Salzsäure (entspr. 57,4 g HCI) auf einen für den Menschen physiologischen pH-Wert v&n 7,3 eingestellt. Die resultierende Lösung enthält 561,6 g (berechnet aus der erhaltenen Menge Lyophilisat) der Verbindung I = 82.0% der Theorie. Bei Isolierung über Gefriertrocknung werden ca. 685 g (ca. 82% der Theorie) Verbindung I als Lyophilisat mit einem Restwassergehalt von ca. 18% erhalten.
Nach dem Trocknen der Verbindung I bei einer Temperatur von 1300C im Hochvakuum bei < ΙΟ-1 Torr wird ein Zersstz'jngsptinkt von über 300°C ermittelt.
Elementaranalyse
Die Verbindung I enthält auch nach intensivem Trocknen im Hochvakuum noch 10,87% Bindungswasser und 13,8 mol% freies Glycin (als physiologischen Puffer).
Summenformel: C7H9N3O6Mg+ 2 H2O+ 0,823 HCI+ 0,138 C2H5NO2 (Glycin)
Molekulargewicht: 33127
Berechnet (%): C 26.40, H 4,42, N 1328, Cl 8,78, Mg 7,34, H2O*) 10,87;
gefunden (%): C 26.37, H 4,45, N 1332, Cl 8,79, Mg 7,34, H2O*) 10,87.
·) H2OTitration nach Karl Fischer
Beispiel 2
Es wird die Verbindung 11 unter Verwendung eines ET-Schwammes
als Katalysator hergestellt
In 431 destilliertes Wasser werden bei 6O0C unter Rühren 2402 g (32 mol) Glycin und 249,8 g (1,6 mol) wasserfreie Orotsäure eingetragen. In die entstandene Suspension wird ein ET-Schwamm mit den Abmessungen 40 mm χ 20 mm χ 5 mm gelegt. Das Gemisch wird innerhalb von 40 Minuten unter Rühren mit 5832 g (2,4 Grammatome) Magnesiumpulver in Portionen von jeweils 4 —9 g versetzt Der sich bildende Wasserstoff wird mit einem Stickstoffstrom aus dem Reaktionsgefäß abgeführt Nachdem weitere 40 Minuten bei einer Temperatur von 6O0C gerührt worden ist, hat sich praktisch das gesamte Magnesium unter Bildung einer fast klaren Lösung aufgelöst Das noch heiße Reaktionsgemisch wird filtriert langsam auf 4 bis 8°C abgekühlt und nochmals filtriert Das Filtrat wird zur Trockene eingedampft Man erhält 541,8 g (99,1% der Theorie) der Verbindung !!. Nach dem Trocknen der Verbindung bei einer Temperatur von 130° C wird ein Festpunkt von 260 bis 264° C (Zersetzung) gemessen.
Elcmentaranalyse:Ci8H26NgOioMg3 + 4 H2O
Molckuliirgcwichl: 755,43
Berechnet(%): C 28,62, H 4,54, N 14,83, Mg 9,65, H2O*) 9,54; gefunden (%): C 28,58, H 4,57, N 14,81, Mg 9,65, H2O*) 9,54.
*) HiO Titration nach Karl Fischer
Be i s ρ iel 3
Es wird die Verbindung I mit einem galvanisierten Eisenblech als Katalysator hergestellt
60,1 g (0,8 mol) Glycin und 124,9 g (0,8 mol) wasserfreie Orotsäure werden unter Rühren in 1,6 1 destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 60°C gelöst bzw. suspendiert. Ein ca. 60 mm χ 40 mm χ 1,5 mm großes, mit Zink galvanisch überzogenes Eisenblech wird auf den Boden des Reaktionsgefäßes gelegt. Im Verlauf von 30 Minuten werden insgesamt 19.64 g (0,8 Grammatome) Magnesiumpulver in Portionen von ca. 3 g in die Suspension eingetragen. Nach weiteren 30 Minuten Rühren bei 60°C ist praktisch alles Magnesium aufgelöst. Nach Heißfiltration, Abkühlen auf Raumtemperatur und anschließend auf 4 bis 8°C wird erneut filtriert. Das Filtrat v.'ird mit 86 m! 5,!-n Salzsäure auf "H 7,3 ein^steüt. Die resultierende Lösun" enthält 187,7" '82,2% der 2c Theorie) Verbindung I, die zu 82 Molprozent als Hydrochlorid vorliegt. Durch Gefriertrocknung dieser Lösung werden ca. 229 g (82,1% der Theorie) Verbindung I mit einem Restwassergehalt von 18,0% und einem Eisenge· halt von 16 mg (0,007 Gew.-%) gewonnen. In 100 ml destilliertem Wasser lösen sich 33,1 g.
Beispiel 4
Es wird die Verbindung II mit einem galvanisierten Eisenblech als Katalysator hergestellt
In 1,61 destilliertes Wasser werden bei 60°C unter Rühren 80,1 g (1,07 mol) Glycin und 83,3 g (0,53 mol) wasserfreie Orotsäure eingetragen. In die entstandene Suspension wird das in Beispiel 5 beschriebene, galvanisie »e Eisenblech gelegt. Innerhalb von 30 Minuten werden insgesamt 19.64 g (0,8 Grammatome) Magnesiumpulver in Portionen von ca. 3 g in das Gemisch eingetragen.
Dann wird weitere 30 Minuten bei 60°C gerührt, wonach aus der Suspension eine fast klare Lösung entstanden ist. Das Reaktionsgemisch wird heiß filtriert, auf Raumtemperatur, dann auf 4 - 8°C abgekühlt und nochmals filtriert. Das Fiitrat wird zur Trockne eingedampft. Man erhält 180,8 g (99,2% der Theorie) der Verbindung II mit einem Eisengehalt von 18 mg (0,01 Gew.-%). Die Löslichkeit beträgt 25,2 g in 100 ml Wasser bei 2O0C.
Beispiel 5
Es wird die Verbindung I unter Verwendung eines mit Eisenoxid beschichteten Stückes Eisen als Katalysator hergestellt
Der in Beispiel 1 beschriebene Versuch wird durchgeführt. Anstelle des ET-Schwammes wird ein mit einer Eisenoxidschicht beschichtetes Eisenblech der Abmessungen 50 mm χ 30 mm χ 1,5 mm in das Reaktionsgemisch gelegt. Nach Aufarbeitung, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhält man nach Zerstäubungstrocknung ungefähr 644 g (82,2% der Theorie) der Verbindung I mit einem Restwassergehalt von 12,5% und einem Eisengehalt von 33 mg (0,005%). In 100 ml Wasser lösen sich 31,0 g.
B e i s ρ i e 1 6
Es wird die Verbindung 11 unter Verwendung eines mit Eisenoxid beschichteten Stückes Eisen als Katalysator hergestellt
Der in Beispiel 2 beschriebene Versuch wird durchgeführt. Anstelle des ET-Schwammes wird jedoch ein mit Eisenoxid beschichtetes Eisenblech mit den Abmessungen 50 mm χ 30 mm χ 1,5 mm in die Suspension gelegt. Nach Eindampfen zur Trockne erhält man 543,4 g (99,4% der Theorie) der Verbindung Il mit einem Eisengehalt von 27 mg (0,005 Gew.-%). 253 g dieser Verbindung lösen sich in 100 ml destilliertem Wasser bei 20° C.
Beispiel 7
Es wird die Verbindung I unter Verwendung eines dreidimensionalen, mit Teflon beschichteten Eisengitters als Katalysator hergestellt
180,2 g (2,4 mol) Glycin und 374,6 g (2,4 mol) wasserfreie Orotsäure werden unter Rühren in 4,81 destilliertem Wasser bei einer Temperatur von 6O0C gelöst bzw. suspendiert. In das Gemisch wird ein dreidimensionales, mit Teflon beschichtetes Eisengitter mit den Abmessungen 120 mm χ 80 mm χ 80 mm, einem Eisenstabdurchmesser von ca. 2 mm und einem Gitterstababstand von ca. 20 mm gestellt Im Verlauf von 40 Minuten werden insgesamt
58,92 g (2,4 Grammatome) Magnesiumpulver in Portionen von jeweils ungefähr 4,5 g in die Suspension eingetragen. Nach 4 Stunden Reaktionszeit bei 6O0C wird das Reaktionsgemisch heiß filtriert, auf Raumtemperatur, dann langsam auf 4 bis 8°C abgekühlt und erneut filtriert. Das Filtrat wird mit 6,1-n Salzsäure auf pH 7,3 eingestellt und wird dann, wie in Beispiel 1 beschrieben, zerstäubungsgetrocknet. Es resultieren ungefähr 629 g (80,3% Theorie) der Verbindung 1, zu 82 Molprozent als Hydrochlorid vorliegend, und mit einem Restwassergehalt von ca. 12,5%. Das Produkt enthält 42 mg (0,007 Gew.-%) Eisen und löst sich mit 31,2 g in 100 ml destilliertem Wasser.
Beispiel 8
Es wird die Verbindung II unter Verwendung eines mit Teflon
beschichteten Eisengitters als Katalysator hergestellt
Der in Beispiel 2 beschriebene Versuch wird durchgeführt. Anstelle des ET-Schwammes wird jedoch ein dreidimensionales, mit Teflon beschichtetes Eisengitter mit den Abmessungen 120 mm χ 80 mm χ 80 mm, einem Gitterstabdurchmesser von 2 mm und einem Gitterstababstand von 20 mm in das Reaktionsgemisch gestellt.
Nach Eindampfen zur Trockne werden 541 g (99% der Theorie) der Verbindung II mit einem Eisengehalt von 39 mg (0,007 Gew.-%) erhalten. In 100 ml destilliertem Wasser lösen sich bei 200C 25,1 g dieser Verbindung.
Strukturbeweis für die erfindungsgemäßen Verbindungen I und II
Von den Verbindungen 1 und Il wurden hochauflösende Protonenresonanzspektren mit 300 MHz bzw. 90 MHz Magnetfeldstärke gefertigt.
Verbindung I
Hierbei zeigt sich, daß es sich bei Verbindung I um Magnesiumdihydroorotatglycinat in isomeren Formen handelt. Das Konformationsisomer L (siehe F i g. 18) macht 70,8% der Verbindung I, das Konformationsisomer M 21,8% der Verbindung aus. Ein geringer Teil fällt auf die Tautomeren N und O. Tautomerie dieser Art ist charakteristisch für Naturstoffe bzw. für naturstoffähnliche Synthetika.
Das Proton am Gi-Atom (siehe Fig. 14) liegt bei <J=3,87 und weist mit dem Transproton am Cs-Atom nicht die gleiche Kopplungskonstante auf wie mit dem Cisproton : 6,8 Hz, sondern zeigt für das Transproton 6,3 Hz.
Diese Spreitung ermöglicht die hochauflösende Protonenresonanzspektroskopie.
Die NMR-Spektren Fig. 13,14,15 und Spektrum 5 der Fig. 17 als Feinauflösungsspektrum für die Spreitung zwischen 2,2 und 2,8 ppm belegen die Struktur der Verbindung I.
Verbindung II
F i g. 16 zeigt das 90 Mriz-rrotonenresonanzspekirürn der Verbindung I!. Dieses Spektrum ist deckungsgleich mit dem 90 MHz-Spektrum von Verbindung I. Der einzige Unterschied zum Spektrum der Verbindung I ist das Integralverhältnis Glycinat-CH2-Protonen:Dihydroorotat-CH2-Protonen; es beträgt hier 31,5 :16s2 :1.
Pharmakologische Untersuchungen
A) Es wird die Calcium-antagonistische Wirkung von Verbindung I
in vivo geprüft (i.V.-Applikation)
Unter den verschiedenen experimentellen Möglichkeiten zu ihrer Untersuchung wird die Hemmung der induzierten Thrombozytenaggregation in vivo ausgewählt Es besteht folgender Zusammenhang zwischen der
so Hemmung der induzierten Thrombozytenaggregation, die gemessen wird, und der Calcium-antagonistischcn Wirksamkeil:
Je stärker die Aggregation gehemmt wird, um so stärker ist der verwendete Calcium-Antagonist. Als Aggregationsmittel, d. h. die Thrombozytenaggregation auslösende Substanzen, werden Arachidonsäure, Kollagen und Adenosindiphosphat (ADP) in verschiedenen, abnehmenden Konzentrationen verwendet. Die Thrombozytenaggregation wird in einem handelsüblichen Aggregometer gemessen: Plättchenreiches Blutplasma wird in einem Meßröhrchen im Strahlengang der Lichtquelle des Aggregometers mittels eines Rührmagneten kräftig gerührt, und die Lichttransmission (T) des Plasmas wird kontinuierlich gemessen. Die Nullpunkteinstellung des Aggregometers (0% T) erfolgt mit dem zu messenden plättchenreichen Plasma, die Einstellung auf 100% T mit plättchenarmen Plasma.
Die Zugabe obengenannter Aggregationsmittel löst die Thrombozytenaggregation aus. Dabei nimmt die Lichttransmission T zu. Die entstehenden Änderungen der Lichttransmission werden als Aggregationskurven aufgezeichnet. Zur Bestimmung der Wirkung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindung I auf die induzierte Thrombozytenaggregation wird zehn gesunden Probanden (6 männliche, 4 weibliche Probanden, Alter zwischen 23 und 56 Jahren; Absetzen aller Medikamente, die die Aggregation beeinflussen, 20 Tage vor Versuchsbeginn) vor ( = Kontrolle ohne Medikament) und 30 Minuten nach Mg—DHO-Gl-Infussion (Mg—DHO-Gl = 5 ml 0,35-moIare, wäßrige Lösung von Verbindung I, verdünnt mit 200 ml physiologischer Kochsalzlösung) Venenblut entnommen, dieses mit Natriumcitratlösung vermischt und daraus plättchenreiches Plasma (PRP) gewonnen.
Ce Messung der Aggregation erfolgt innerhalb von 2 Stunden nach Blutentnahme. In der nachfolgenden Tabelle I sind die Mittelwerte aus 10 Einzelmessungen und Standardabweichungen der maximalen Aggregation vor und 30 Min. nach Mg—DHO-Gl-Infusion in Abhängigkeit von Art und Konzentration des verwendeten Aggregctionsmittels angegeben.
Definition des Begriffs maximale Aggregation: In den Fällen, in denen die Aggregationskurve ein ausgepi äglcs Maximum aufweist, d. h. die Aggregation partiell reversibel verläuft, wie z. B. bei Verwendung von ADP in niedrigen Konzentationen, wird unter maximaler Aggregation die Lage dieses Maximums verstanden, in allen anderen Fällen der höchste Punkt der Aggregationskurve. Die maximale Aggregation wird in % Z (% Lichttransmission) angegeben. In den Fig. 1 bis 6 sind die Aggregationskurven dargestellt, die durch Messung des Plasmas eines der IO Probanden erhalten worden sind.
1. Mit Arachidonsäure induzierte Thrombozytenaggregation (Fig. 1 und 2)
Bei Arachidonsäurekonzentrationen von 1000,750 und 500 μΜ beträgt die maximale Aggregation sowohl von (Kontrolle) als auch nach Mg— DHO-Gl-lnfusion über 100% T. Wird die Arachidonsäurekonzentration weiter auf 250 μΜ gesenkt, so beträgt die maximale Aggregation beim Kontrollversuch immer noch über 100% T während sie nach Mg—DHO-Gl-Infusion auf 10±2% T reduziert ist. Das bedeutet, daß die erfindungsgemäß hergestellte Verbindung I die durch Arachidonsäure induzierte Thrombozytenaggregation in vivo signifikant hemmt.
2. Mit Kollagen induzierte Thrombozytenaggregqtion (F i g. 3 und 4)
Bei Anwendung von Kollagen in Konzentrationen von 2,5; 1,5 und 1,0 μg/ml beträgt die maximale Aggregation vor und nach Mg—DHO-Gl-Infusion über 100% T. Wird Kollagen in der nächstniedrigen Konzentration von 0,5 μg/ml eingesetzt, so beträgt die maximale Aggregation im Kontrollversuch noch über 100% T, während nach Mg—DHO-Gl-Infusion nur noch 70±9,9% T erreicht werden. Auch die durch Kollagen induzierte Thrombozytenaggregation wird also durch die erfindungsgemäß hergestellte Verbindung I signifikant gehemmt.
3. Mit Adenosindiphosphat (ADP) induzierte Thrombozytenaggregation (F i g. 5 und 6)
Wird die ADP-Konzentration von 2,0 μM über 1,6 und 1,2 μΜ auf 0,8 μΜ abgesenkt, so werden vor Applikation von Mg—DHO-GI irreversible Aggregationen mit in allen Fällen maximalen Aggregationen von über 100% T beobachtet. Nach Applikation von Mg—DHO-Gl hingegen liegen für dieselben ADP-Konzentrationen die maximalen Aggregationen bei über 100, 87±: 12,9; 74± 10,6 und 34±4,2% Transmission. Um beim Kontrollversuch unter 100% T zu kommen, muß die ADP-Konzentration auf 0,4 μM reduziert werden; die maximale Aggregation beträgt dann 55 ±7,3% T. Aus dieser Gegenüberstellung ist ersichtlich, daß die erfindungsgemäß hergestellte Verbindung I in therapeutischen Dosen die durch ADP induzierte Thrombozytenaggregation signifikant hemmt.
Tabelle 1
Aggregationsmittel Maximale Aggregation (% Transmission)*)
Art Endkonzentration Kontrolle ohne Medikament Mg—DHO-Gl-Infusion
(30 Min.)
>100 >100 >100 10 = 2 50
>100 >100 >100 70 ±9,9 55
> 100 87 ±12,9 74 ±10,6 34 ±4,2 60
*) Mittelwerte und Standardabweichungen aus jeweils 10 Messungen an 10 Probanden
In Orientierungsversuchen mit Verbindung II wurde die gleiche Hemmung der Thrombozytenaggregation festgestellt wie Verbindung I. Es zeigten sich keine erfaßbaren Unterschiede zwischen beiden Verbindungen. Von Verbindung I wurden i.v. oder peroral 517,8 mg Substanz pro Dosis appliziert. Diese Menge entspricht 447,1 mg Magnesiumdihydroortatglycinat. Von dieser Verbindung ist die gleiche Menge in 598 mg Verbindung
Arachidonsäure
Arachidonsäure
Arachidonsäure
Arachidonsäure		 1000 μΜ
750 μΜ
500 μΜ
250 μΜ		 OQOO
O O O O
Λ Λ Λ Λ
Kollagen
Kollagen
Kollagen
Kollagen		 2,5 μg/ml
1^g/ml
l^g/ml
0,5 μg/mi		 > 100
>1ΰΟ
> 100
> 100
Adenosindiphosphat
Adenosindiphosphat
Adenosindiphosphat
Adenosindiphosphat
Adenosindiphosphat		 2,0 μΜ
1,6 μΜ
1,2 μΜ
0,8 μΜ
0,4 μΜ		 >100
>100
> 100
>100
55 ±7,3
20 25
II enthalten. Der Magnesiumgehalt von Verbindung I beträgt 42,5 mg, in Verbindung II sind jedoch, auf 517,8 mg bezogen, 552 mg Magnesium enthalten. Hier ist das Magnesium sozusagen funktionell kompensierend wirksam.
B) Es wird die Caicium-antagonistische Wirkung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindung I in vivo bei oraler Verabreichung an zehn Probanden an Hand der Hemmung der induzierten Thrombozytenaggregation bestimmt und rut derjenigen von Verapamü verglichen.
Es werden die unter A) beschriebenen Versuche durchgeführt. Die Ergebnisse der Kontroll-Aggregationsversuche (ohne Medikament) mit dem den zehn Versuchspersonen zu Versuchsbeginn entnommenen Blut sind bereits in der Tabelle 1 aufgeführt. Anstelle der Mg—DHO-Gl-Infusion erhalten die Probanden jedoch 80 mg Verapamil bzw. 5 ml 035-molare, wäßrige Lösung der erfindungsgemäß hergestellten Verbindung I per os. In beiden Fällen wird den Probanden zwei Stunden nach Einnahme Venenblut entnommen. Daraus wird plättchenreiches Plasma gewonnen, und mit dem Plasma werden Aggregationsversuche durchgeführt mit Arachidonsäure, Kollagen und Adenosindiphosphat als auslösende Substanzen. Aggregationskurven, die durch Messung des Plasmas eines Probanden erhalten wurden, sind in den F i g. 7 bis 12 dargestellt. Die F i g. 7 und 8 beziehen sich auf Arachidonsäure, die Fig.9 und 10 auf Kollagen und die Fig. 11 und 12 auf Adenosindiphosphat als Aggregationsmittel.
Die in der nachfolgenden Tabelle 2 aufgeführten Meßergebnisse der Thrombozytenaggregation (Mittelwerte und Standardabweichungen der maximalen Aggregationen von zehn Probandenplasmen) zeigen, daß im Falle von Arachidonsäure als Aggregationsmittel die Aggregation durch Verapamil und die erfindungsgemäß hergestellte Verbindung I praktisch in gleichem Maße gehemmt wird. Bei Einsatz von Kollagen (0,25 μg/ml) bzw. Adenosindiphosphat (1,2 μΜ) hingegen beträgt die nach oraler Applikation von Verbindung I erreichte maximale Aggregation nur 80 ± 12,8 bzw. 69 ± 10,2% Transmission, nach oraler Applikation von Verapamü jedoch noch 97 ±16,1 bzw. 85 ±13.1% Transmission, d. h. fiie erfindungsgemäß hergestellte Verbindung I hemmt bei oraler Verabreichung die durch Kollagen und Adenosindisphosphat ausgelöste Thrombozytenaggregation stärker als VerapamiL Ähnlich Ergebnisse werden erzielt, wenn anstelle der erfindungsgemäß hergestellten Verbindung I die erfindungsgemäß hergestellte Verbindung II oral appliziert wird.
Tabelle 2
Aggregationsmittel Art
Maximale Aggregation (% Transmission)*)
Endkonzentration 2 Std. nach 80 mg Verapamil 2 Std. nach 5 ml 0,35-molarer
per os Mg—DHO-Gl-Lösungperos
>100 >100 28 ±3,7 18±3,2
>100 >100 >100 94 ±15,4 80 ±12,8
>100 >100 82±12,5 69 ±10,2 53 ±73
Arachidonsäure 1000 μΜ >100
35 Arachidonsäure 750 μΜ >100
Arachidonsäure 500 μΜ 26 ±3,4
Arachidonsäure 250 μΜ 15±23
Kollagen 23 μg/mI >100
40 Kollagen l^g/ml >100
Kollagen \,0μξ/νη\ >100
Kollagen 03 μg/ml >100
Kollagen 0,25 μg/mI 97 ±16,1
45 Adenosindiphosphat 2,0 μΜ >100
Adenosindiphosphat 1.6 μΜ >100
Adenosindiphosphat 1,4 μΜ —
Adenosindiphosphat 1,2 μΜ 85 ±13,1
Adenosindiphosphat 1,0 μΜ —
50 Adenosindiphosphat 0,8 μΜ 59 ±83
*) Mittelwerte und Standardabweichungen aus jeweils 10 Messungen an 10 Probanden
55
Hierzu 8 Blatt Zeichnungen
60 65

Claims (1)

  1. Patentansprüche:
    1. Verfahren zur Herstellung von Magnesiumdihydroorotatglycinat der Formel I oder II
    V \ / NCH,
    \ O J \ O N
    \/ \ / NCH2 V \ / \
    I Mg ι ·2 ι Mg ι
    cn / \ A λ / \ Λ
    N O V ^N O V.
    H2 O J ,ι Ο
DE19833320145 1983-06-03 1983-06-03 Verfahren zur Herstellung von Magnesiumdihydroorotatglycinaten und ihre Verwendung als Calcium-Antagonisten Expired DE3320145C2 (de)

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