DE3310551A1 - Teilchenuntersuchungs- und -klassiervorrichtung - Google Patents

Description

nwfiffe Dipl.-lng. E. Eder ^DIP'-lng. K. Schieschke

8 München 40, Elisabethstraße 04

COULTER CORPORATION
Hialeah, Florida
U.S.A.

Teilchenuntersuchungs- und -klassiervorrichtung

Die Erfindung bezieht sich allgemein auf eine Teilchenunter- ; suchungs- und -klassiervorrichtung und insbesondere auf eine ^; Vorrichtung, in der Untersuchungen spezieller Systeme durch- geführt werden können, die das Impedanz-Meßprinzip anwenden und optische Messungen durchführen.

Seit seiner Entstehung in den frühen 50er Jahren dieses Jahr-^ hunderts hat das von Wallace H. Coulter erfundene Teilchen- ] zähl- und -klassierprinzip (US-PS 2,656,508) zu vielen Ver- -' fahren und Durchflußvorrichtungen für das elektronische Zählen, Klassieren und Analysieren mikroskopischer Teilchen, welche in einer Flüssigkeitssuspension abgetastet werden, geführt.

Bei dieser bekannten Vorrichtung wird ein Gleichstrom zwischen zwei Gefäßen durch Einhängen von Elektroden in die geweiligen Körper der Suspensionsflussxgkeit hergestellt. Die einzige Flüssigverbindung zwischen den beiden Teilen erfolgt über eina öffnung, die somit sowohl einen elektrischen Stromdurchfluß ■ als auch ein elektrisches Feld aufweist. Die öffnung und das

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sich in und um der Öffnung ergebende elektrische Feld sbellen eine Meßzone her. Da jedes Teilchen diese Meßzone durchläuft, verändert sich für die Dauer des Durchlaufes der Widerstand des Inhaltes dieses Meßbereiches, wodurch der Stromfluß und das elektrische Feld in der Meßzone moduliert werden und ein Signal erzeugt wird, das einem entsprechend angeordneten Detektor zugeführt wird.

Bei vielen Anwendungsmöglichkeiten automatisierter Teilchenströmungs-Untersuchungsvorrichtungen ist es nicht möglich, nur eine geringe Anzahl von Teilchendeskriptoren zur Erkennung jeder Zellenart in einer heterodispergierten Zellenpopulation einer Probe zu verwenden.

Bisher messen viele Strömungssysteme die Fluoreszenz, die LichtZerstreuung und das elektronische Zellvolumen (Widerstandsmessung). Ferner sind Untersuchungsvorrichtungen für die Teilchenströmung entwickelt worden, bei denen sich die Teilchen innerhalb von Flüssigkeitstropfen befinden und diese Tropfen durch vorstehend beschriebene Messungen klassiert werden.

Derartige Teilchenuntersuchungs- und -klassiervorrichtungen sind im US-Patent 3,710,933 sowie im Artikel "A Volume-Activated Cell Sorter" aus "The Journal of Histochemistry and Cytochemistry" von E. Menke et al., Band 25, S.796-803 beschrieben.

Die größten Probleme ergeben sich bei solchen Vorrichtungen sowohl hinsichtlich der optischen Messungen als auch hinsichtlich der Widerstandsmessungen. Bei den beschriebenen Teilchenuntersuchungs- und -klassiervorrichtungen nach dem Stand der Technik werden vor den optischen Messungen elektronische Zellvolumenmessungen durchgeführt, weshalb diese beiden Meßarten in Wechselbeziehung gesetzt werden müssen. Das Problem der Wechselbeziehung ist unbedeutend bei sehr langsamen Teichenströmungsgeschwindigkeiten; bei schnellen Strömungsgeschwindigkeiten der Teilchen jedoch können die Signale durch Gegen-

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stände, wie Zellaggregate, die nach Durchlauf durch eine Volumenmeßöffnung die vorhandenen·, nichtfluoreszierenden Teilchen verändern, beeinflußt werden. Außerdem können dadurch zwei benachbarte Zellen ihre Position im Strom vertauschen. Dafür sind spezielle Schaltkreise.zur Kompensation der Zeitverzögerung zwischen den optischen und elektronischen Signalen für ein gegebenes Teilchen notwendig.

Für den Vorgang ohne Klassierung ist eine kombinierte elektrooptische Teilchenuntersuchungsvorrichtung entwickelt worden, bei welcher sämtliche Messungen gleichzeitig durchgeführt werden. Dadurch werden die Komplexität und die Ungenauigkeit von durch nacheinander erfolgende Messungen erzielte , in Wechselbeziehung stehende Daten vermieden. Diese elektro-optische Teilchenuntersuchungsvorrichtung ist in dem Artikel "Combined Optical and Electronic Analysis of Cells with AMAC Transducers von Thomas et al. beschrieben und im Magazin "The Journal of Histochemistry and Cytochemistry", Bd. 25, Nr. 7 (1977), S. 827-835 veröffentlicht worden. Dieser Multiparameter-Teilchenanalysator hat eine quadratische Meßöffnung, in der alle Parameter gleichzeitig gemessen werden. Die quadratische Öffnung befindet sich in einem Kubus, der durch Zusammenhängen von vier Pyramiden gebildet ist.

Die Erfindung bezieht sich auf eine kombinierte elektro-optische Teilchenuntersuchungs- und -klassiervorrichtung, bei der sowohl der optische als auch der elektrische Widerstand (elektronisches Volumen) eines durch eine Teilchenmeßöffnung strömenden Teilchenstromes gleichzeitig gemessen wird. Die Strömungszelle weist zwei Kanäle auf, einen stromaufwärtigen und einen stromabwärtigen, die an ihren sich gegenüberliegenden Enden Öffnungen haben und über eine Teilchenerfassungsöffnung miteinander in Fließverbindung stehen. Die Vorrichtung ist dahingehend verbessert worden, daß sie eine Düse mit Austritts öffnung am Ende des stromabwärtigen Kanals aufweist, so daß eine mit Flüssigkeit gefüllte Strömungskammer gebildet ist.

Eine Hüllflüssigkeit befindet sich am unteren Ende der Strömung s kammer und dient der Umhüllung des Teilchenstromes über

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die gesamte Länge der Strömungslcaitimer mit kleinem Durchmesser. Dadurch wird in der Strömungszelle neben den stromaufwärtigen und dem stromabwärtigen Kanal zur Beleuchtung der Teilchen und zum Auffangen des Lichtes dieser Teilchen Platz freigelassen. Aufgrund dieser Konstruktion wird der Teilchenstrotn während des Durchströmens zur Austrittsöffnung hydrodynamisch fokussiert und geht danach in einen Flüssigkeitsstrahl über. Dieser Strahl wird in herkömmlicier Weise in viele Tropfen aufgeteilt, welche anhand der vorstehend beschriebenen Signale geladen und klassiert werden.

Bisher ist die Klassierung der Tropfen niemals durch eine elektro-optische Vorrichtung durchgeführt worden, bei der der elektrische Widerstand und die optische Messung gleichzeitig erfolgen. Darüberhinaus hat man festgestellt, daß trotz des geringen Volumens der Strömungskammer die hydrodynamische Fokussierung des Teilchenstromes durch eine flüssige Umhüllung durch Einführen der Hüllflüssigkeit in den unteren Bereich der stromabwärtigen Öffnung durchgeführt werden kann und somit durch die optische Vorrichtung 'keine Störungen erfolgen.

Die Erfindung wird nachstehend anhand der in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsform näher erläutert. In den Zeichnungen zeigt:

Fig. 1 eine Teilansicht des Querschnitts und des

Blockschaltbildes der Teilchenuntersuchungsund -klassiervorrichtung nach der Erfindung und

Fig. 2 einen vergrößerten Querschnitt der Erfassungsöffnung der Strömungszelle nach Fig. 1.

Fig. 1 zeigt eine Teilch enströmungsuntersuchungs- und -klassiervorrichtung 10 mit einer Röhre 12 zum Einführen von Probenmaterial, einer Röhre 14, die koaxial um die Röhre 12 angeordnet ist, sowie einer durchsichtigen Strömungszelle 16 am Ende der Röhre 12. Die Strömungszelle 16 weist zwei sich gegenüberliegende Bohrungen bzw. Kanäle 18 und 20 und eine mikroskopische Heßöffnung 22 auf, welche einen Durchgang für

Flüssigkeit zwischen den Enden der Kanäle bildet. Die Öffnung 22 ist eine Teilchenmeßzone, welche nachstehend noch genauer beschrieben wird.

Ein Flüssigkeitsstrom einzeln suspendierter. Teilchen, die.aus einem unter Druck stehenden Reservoir 23A kommen, fließt durch die Röhre 12 hindurch. Eine salzhaltige, laminare Hüllflüssigkeit aus einem anderen unter Druck stehenden Reservoir 23B fließt durch die Röhre 14, so daß der Teilchenstrom davon umgeben ist. Mit Austritt des flüssigen Teilchenstromes aus der Röhre 12 und Eintritt in den ersten Kanal 18 verringert sich der Durchmesser des Teilchenstromes durch hydrodynamischen Druck, wenn der Strom die Geschwindigkeit der Hüllflüssigkeit erreicht.

Diese Flüssigkeit.dient ferner der Zentrierung des Teilchenstromes, so daß die Teilchen ausgerichtet durch die Öffnung strömen können. Danach treten sie in den zweiten Kanal 20 der Strömungszelle 16 ein.

Mehrere Systemteile werden von einem zylindrischen Rahmen 25 getragen. Eine Düse 24 mit Austrittsöffnung 26 ist am Ende der Strömühgszelle 16 aufgesetzt und bildet zusammen mit den zweiten Kanal 20 eine mit Flüssigkeit gefüllte Strömungskammer Eine Röhre 29 ist mit dem Rahmen 25 über eine Leitung 30 verbunden.

Eine zweite Hüllflüssigkeit wird über die Röhre 29 in einen Hohlraum 31 geleitet, in den Flüssigkeit über drei Einlaßöffnungen 32 in der Wand der Strömungszelle 16 eingelassen wird. Aufgrund des Druckabfalls über der Öffnung 22 muß die zweite Hüllflüssigkeit in die Strömungskammer 28 eingeführt werden, so daß eine zweite Umhüllung mit ausreichendem hydrodynamischem Druck zur Weiterleitung der Teilchen durch die Strömungskammer 28 und aus der Austrittsöffnung 26 vorhanden ist.

Im Gegensatz zu den Konstruktionen nach dem Stand der Technik wird die zweite Ilüllflüssip;kei.t in den unteren Bereich der . Strömungskamner 28 eLn^eLassen, was für die optische Beleuch-

tung und den Lichtauffang vorteilhaft ist. Dies wird nachstehend noch genauer beschrieben.

Genauer gesagt: Die Hüllflüssigkeit tritt in den zweiten Kanal 20 über eine Vielzahl von Einlaßöffnungen 32 ein, welche in beträchtlichem Abstand unterhalb und stromabwärts zur Meßöffnung 22 angeordnet sind. Ferner wird die zweite Flüssigkeit in unkonzentrischer Weise bzgl. des aus der Öffnung 22 austretenden Teilchenstromes eingelassen und in den relativ kleinen Innenraum des zweiten Kanals 20 eingespritzt. Trotz der geringen Aufnahmefähigkeit des Kanals 20 und der unkonzentrischen Einführung der zweiten Hüllflüssigkeit in den unteren Bereich des Kanals 20 hat man festgestellt, daß ein Teil dieser zweiten Flüssigkeit ansteigt, um so den aus der Meßöffnung 22 austretenden Teilchenstrom zu erfassen, während ein Teil der zweiten Hüllflüssigkeit sofort zur Austrittsöffnung 26 und allen dazwischen liegenden Stellen wandert.

Auf diese Weise ist eine gute, hydrodynamische Fokussierung des Teilchenstromes durch die S'trömungskammer 28 möglich, wodurch der Austritt des Stromes durch die Austrittsöffnung ermöglicht "wird.

Bei der ausgewählten Ausführungsform sind drei Einlaßöffnungen 32 dargestellt. Die Anzahl der Öffnungen 32 hängt jedoch einzig und allein von der Wahl der Konstruktion ab, wobei eine Öffnung durchaus ausreichend wäre. Es ist jedoch angenehmer, mehr als eine Öffnung zur Verfugung zu haben, was von ihrem Durchmesser abhängt, damit die Strömun gskammer 28 gereinigt und gespült werden kann.

Die schematisch in Blockform dargestellten Systemteile sind normalerweise Teil bekannter Teilchenuntersuchungs- und -klassiervorrichtungen und werden bisweilen als cytoraetrische Durchflußklassiersysteme bezeichnet. Es sind nur die Teile der Vorrichtung 10 dargestellt, welche für die Erläuterung der Arbeitsweise der Erfindung notwendig sind-

t. In herkömmlicher Weise werden Schwingungen an den aus der ^qPY

Austrittsöffnung 26 austretenden Flüssigkeitsstrom 34 über eine Schwingungsvorrichtung 36 angelegt.' Die Schwingungsvorrichtung 36 kann einen piezoelektrischen Kristall auf v/eisen. Die Strömungszelle 16 ist dem piezoelektrischen Kristall zugeordnet und wird von diesem getragen, welcher die Ströraungszelle 16 mit hoher Frequenz in Schwingung versetzt. Die genaue Frequenz, mit der die Zelle 16 schwingt, hängt von dem gewählten Durchmesser der Austrittsöffnung 26 ab. Die Schwingungen üben kleine Störungen, gewöhnlich in Form von Wellen, auf die Oberfläche des Strahles 34- aus, werden aufgrund bekannter Effekte der Oberflächenspannung größer und schnüren schließlich den Strahl an einem Zerfallpunkt 38 ein, so daß genau bemessene Tropfen entstehen können. Der Durchmesser der Austrittsöffnung 26, die Geschwindigkeit des Strahles 34- und die "Verdünnung der Teilchensuspension ist jeweils vorbestimmt, so daß sich normalerweise nicht mehr als eine Zelle in einem Tropfen 40 befindet.

Durch eine herkömmliche Klassiervorrichtung 60 werden die ausgewählten Tropfen 40 z.B. durch einen unter Spannung stehenden Ladering geladen. Andere Tropfen werden nicht geladen. Die Klassiervorrichtung 60 umfaßt ferner zwei Ablenkplatten, zwischen denen ein elektrischer Potentialunterschied besteht. Wenn die Tropfen zwischen den Platten hindurchströmen, werden die geladenen Tropfen im elektrischen Feld abgelenkt, wodurch die Trennung der geladenen von den ungeladenen Tropfen erfolgt. Die Entscheidung, einen Tropfen zu laden, "basiert auf den vorstehend beschriebenen optischen Messungen und den Im pedanzmessungen für die Teilchen innerhalb des Tropfens. Vorstehende Beschreibung der Tropfenbildung und -klassierung ist kurz, da dieser Teil der Vorrichtung 10 zum Stand der Technik gehört.

In der Strömungszelle 16 wird die Teilchensuspension in herkömmlicher Weise mittels eines von einer Leuchtquelle 42 komv.enden Lichtstrahles, z.B. Laserstrahles, beleuchtet, während sie durch die fTeßöffnung 22. strömt. Die Reaktion des Teilchens in der Probensuspension auf diese Beleuchtung wird durch eine optische Anzeige 44 in der Regel als Streulicht, Fluoreszenz, oder Absorption dargestellt. " _BAD ORIGINAL ^C0PY

Wie allgemein bekannt, können bei der StrÖmungszelle 16 mehrere Beleuchtungs- und Lichtauf fangvori'ichtunpjen angewendet werden. Durch Anordnung der E'iinlaßöffining 52 .im wesentlichen stromabwärts der erfindungsgemäßen Öffnung 22 behindern die Öffnungen 32 jedoch nicht die Beleuchtung und den Lichtauffang; vielmehr sind größere Raumwinkel von Beleuchtung und Lichtauffang möglich.

Die Gießöffnung 22 dient nicht nur als optische Meßzone, wie vorstehend beschrieben, sondern dient nach dem Prinzip von Coulter auch als elektronische Meßzone für das Volumen. Eine stromaufwärts angeordnete Elektrode 46 ist vorzugsweise im Inneren der Röhre 14 angeordnet. Eine stromabwartige Elektrode 48 ist vorzugsweise in einer entfernten Kammer 50 angeordnet, welche über die Röhre 29 in Fließverbindung mit der Strömungskammer 28 steht.

Ein Niederfrequenzstrom mit Gleichstromanteil bzw. eine Hochfrequenzquelle 52, bzw. beide zusammen, werden über elektrische Leitungen 54 und 56 den Elektroden 46 und 48 zugeleitet. Wenn die Teilchen durch die Öffnung 22 hindurchtreten, modulieren sie den elektrischen Strom, so daß Teilchenimpulse erzeugt werden, die durch die herkömmliche Detektorschaltung 58 erfaßt werden. Die dargestellte Stromquelle 52 und die Schaltung 58 sind in den US-Patenten 3,710,933; 3,502,974 und 3,502,973 dargestellt.

Vorzugs-, jedoch nicht zwingenderweise haben die Kanäle 18 und 20 einen runden Querschnitt von 0,15 cm (0,06 Inch), wobei die Gesamtlänge der Strömungszelle 16 0,63 cm (0,25 Inch) beträgt. Die Strömungszelle 16 ist aus einem monolithischen Quartzstück hergestellt worden und ist daher sehr klein. Je kleiner die Zelle 16 ist, um so besser sind ihre optischen Charakteristika, da sie sich einer Punktquelle für die optischen Signale nähert.

Der Querschnitt der Teilchenerfassungsöffnung 22 ist vorzugsweise in etwa quadratisch. Wie der weiteren Vergrößerung nach Fig. 2 zu entnehmen ist, sind die Enden der Kanäle 18 und 20

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mit kugelförmigen Flächen 62 und 64 ausgebildet, welche jeweils durch die Öffnung 22 unterbrochen werden. Da die Bohrungen abgerundete Ecken haben, ist eine präzise Anordnung
der Öffnung nicht notwendig. Die Außenflächen sind flach und liegen parallel zu den Wänden der Öffnung 22. Die Wände der Öffnung 22 sind gewöhnlich 50 bis 100/U lang.

Vorzugsweise sind die Öffnung 22, die Austrittsöffnung 26
und die Kanäle 18 und 20 koaxial ausgerichtet. Vorstehend
beschriebene Dimensionen und Anordnungen sind rein darstellen! und können jeweils auch andere Formen und Größen aufweisen.

Obwohl die Vorrichtung primär für die Untersuchung von Zellen verwendet wird, kann sie in gleicher V/eise auch für andere
Teilchen benutzt werden.

Patentanwälte

Dipl.-fng. E/Eder

Dlpl.-Ing. K.^hieschlo

8 München 40, dÄfatrr.Co 34

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Claims (6)

1. Patentanwälte

   Dipl.-Ing. E. Eder

   Dipl.-Ing. K. Schieschke

   8 München 40, Elisobcthstraße 34

   COULTER CORPOMTIOIf
   Hialeah, Florida
   U.S.A.

   Teilchenuntersuchungs- und -klassiervorrichtung

   Patentansprüche

   eilchenuntersuchungsvorrichtung zur Untersuchung von in einer Flüssigkeit suspendierter Teilchen, mit einer Strömungszelle mit Teilchenerfassungsöffnung, durch welche ein •Teilchenstrom hindurchströmt, wobei die Strömungszelle einen stromaufwärtigen und einen stromabwärtigen Kanal aufweist, zwischen denen die Teilchenerfassungsöffnung angeordnet ist und so die einzige Fließverbindung zwischen den Kanälen herstellt, sowie mit Austritts öffnungen, die nahe dem stromabwärtigen Ende des stromabwärtigen Kanals angeordnet sind, gekennzeichnet durch eine am stromabwärtigen Ende des stromabwärtigen Kanals (20) angeordnete Vorrichtung (32) zum Einführen von Flüssigkeit (23B), welche sowohl in die Austrittsvorrichtung (24, 26) als auch in Richtung der stromaufwärts angeordneten Teilchenerfassungsöffnung (22) zur hydrodynamischen Fokussierung des Teilchenstromes beim Stromabwärtsfließen von der Teilchenerfassungsöffnung in die Austrittsöffnungen fließt.

   COPY /2

   ■ - - ² --■- — ' * 331 055 r
2. 2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (31, 32) zum. Einführen von Flüssigkeit bzgl. des Teilchenstromes so angeordnet ist, daß die Flüssigkeit in unkonzentrischer Weise eingeführt werden kann.
3. 3· Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (30, 31, 32) zum Einführen von Flüssigkeit bzgl. des Teilchenstromes so angeordnet ist, daß die Flüssigkeit ungefähr rechtwinklig zum Teilchenstrom in die Strömungszelle (16) eintritt.
4. 4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche 1,2 oder 3, mit einer Beleuchtungsvorrichtung zur Erzeugung von Strahlen zur Beleuchtung von Teilchen in der Teilchenerfassungsöffnung, dadurch gekennzeichnet, daß die Beleuchtungsvorrichtung (42) und deren Strahlung im wesentlichen entfernt von der Vorrichtung (32) zum Einführen von Flüssigkeit ausgerichtet und angeordnet ist.
5. 5· Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorrichtung (32) zum Einführen von Flüssigkeit nahe der Austrittsvorrichtung (26) angeordnet ist, welche eine Düse (24) mit einer AustrittsÖffnung (26) für das Ausstoßen des Teilchenstromes als Flüssigkeits- ; strahl (34) aufweist.
6. 6. Vorrichtung nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch eine Störungsvorrichtung (36) für die periodische Störung des Flüssigkeitsstrahles (34) zur Erzeugung von Teilchen enthaltenden Tropfen (40) und durch eine Klassiervorrichtung (60) zum Klassieren der Tropfen, wobei diese Vorrichtung (60) über Signale gesteuert wird, welche während des Durchlaufes der Teilchen durch die ErfassungsÖffnung (22) er-

   zeugt werden. Patentanwälte ^AD ORIGiNAl

   Dipl.-Ing. E. Eder ___QV

   Dipl.-Ing. K.^chieochke ^C0PY

   8 München 40, ^abethstraGe

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