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Kanalzähler zur Zählung und Größenbestimmung von in
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einem Elektrolyten suspendierten Teilchen Die Erfindung betrifft einen
Kanal.ähler zur Zählung und Größenbestimmung von in einem Elektrolyten suspendierten
Teilchen, mit einer ersten Elektrode, einer kleinen Durchtrittsöffnung und einer
zweiten Elektrode, wobei die Suspension durch die Durch -trittsöffnung strömt, und
die erste Elektrode in Strömungsrichtung vor der Durchtrittsöffnung, die zweite
Elektrode hinter der Durchtrittsöffnung angeordnet ist, und die während des Durch
-tritts eines Teilchens erfolgende Widerstandsänderung zwischen den Elektroden registriert
und ausgewertet wird.
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Eine derartige Vorrichtung findet i.sbescundere in der Zytologie beim
Zählen und bei der Größenbestimmung von Zellen, z.B. Blutzellen etc. oder bei der
Untersuchung von in einem Elektrolyten suspendierten Mikroorganismen Verwendung.
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Ein derartiger Zähler ist unter dem Name "Coulter counter" bekannt,
vergleiche z.B. die Veröffentlichung sizing particles with a Coulter counter" von
J. Hurley, Biophys. J. 1970, von.10, S. 74 bis 79, oder den Aufsatz "Effects of
external electrical fields on cell membranes" von U. Zimmermann e.a., in Bioelectrochemistry
and bioenergetics, Band 3, S. 58 bis 83 (1976). Die Wirkungsweise des bekannten
Zählers beruht darauf, daß die zu untersuchenden Teilchen eine gegenüber dem Elektrolyten
unterschiedliche spezifische Leitfähigkeit besitzen und daher beim Durchtritt durch
die sehr kleine Durchtrittsöffnung einen Strom-oder Spannungsimpuls an den stromaufwärts
und stromabwarts von der Durchtrittsöffnung angeordneten Elektroden erzeugen. Bei
einer ersten Ausführungsform des bekannten Zählers strömt die die Teilchen enthaltende
Suspension von einer ersten relativ großen Kammer durch die sehr kleine Durchtrittsöffnung
in eine zweite, relativ große Kammer, wobei während des Durchtritts eines Teilchens
durch die Durch-trittsöffnung an den in der ersten bzw. zweiten Kammer angeordneten
ersten bzw. zweiten Elektrode ein Strom- und/oder Spannungsimpuls auftritt, der
anschliessend verstärkt wird und weiteren elektrischen Einrichtungen, z.P, dekadischen
Zählern oder Vielkanalanalysatoren zur weiteren Untersuchung zugeführt wird.
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Bei einer weiteren Ausführungsform des bekannten Zählers, vergleiche
insbesondere die gen tinte Veröffentlichung von U. Zimmermann e.a., tritt die die
Teilchen enthaltende Suspension durch eine Kapillare in die erste, mit Elektrolytflüssigkeit
gefüllte Kammer ein und wird durch eine unmittelbar vor der tirchtrittsöffnung liegende
Düse durch die Durchtrittsöffnung in die zweite Kammer geschickt. Die auf diese
Weise hydrodynamisch fokussierte Suspension strömt dabei durch das Zentrum der Durchtrittsöffnung,
wo das elektrische Feld homogener ist als an den
Rändern der Durchtrittsöffnung,
so daß die Impulsgröße bei dieser Ausführungsform der Teilchengröße genauer entspricht.
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Nachteilig ist bei dem Zähler bekannter Art, daß sich die einzelnen
Teilchen nach dem Durchtritt durch die Durchtrittsöffnung im wesentlichen in einer
relativ großen Kammer verlieren. Eine weitere Untersuchung eines einzelnen Teilchens,
dessen Größe zuvor beim Durchtritt durch die Durchtrittsöffnung festgestellt wurde,
ist daher nicht möglich.
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Aufgabe der Erfindung ist es daher, einen Zähler zur Zählung und Größenbestimmung
von in einem Elektrolyten suspendierten Teilchen anzugeben, bei dem die einzelnen
Teilchen nach dem Durchtritt durch die Durchtrittsöffnung für weitere Untersuchungen
an dem betreffenden einzelnen Teilchen zur Verfügung stehen und sich nicht unmittelbar
nach der Duihtrittsöffnung mit einer großen Menge von Teilchen vermengen.
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Zur Lösung dieser Aufgabe ist ein Zähler zur Zählung und Grössenbestimmung
von in einem Elektrolyten suspendierten Teilchen vorgesehen, der eine erste Elektrode,
eine kleine Durchtrittsöffnung und eine zweite Elektrode enthält, wobei die Suspension
durch die Durchtrittsöffnung strömt und die erste Elektrode in Strömungsrichtung
vor der Durchtrittsöffnung, die zweite Elektrode hinter der Durchtrittsöffnung angeordnet
ist, und wobei die während des Durchtritts eines Teilchens erfolgende Widerstandsänderung
zwischen den Elektroden registriert und ausgewertet wird. Dieser Zähler ist erfindungsgemäß
dadurch gekennzeichnet, daß die Durchtrittsöffnung in dem Strompfad der Suspension
zwischen einen Eingangkanal und einen Ausgangkanal für die Suspension angeordnet
ist, und daß die Elektroden auBerhalb des Strompfads der Suspension angeordnet sind.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beginnt der
Eingangkanal an seiner Einströmseite in einem ersten, mit Suspension gefüllten Gefäß,
in dem die erste Elektrode
angeordnet ist. In Strömungsrichtung
unmittelbar hinter der Durchtrittsöffnung ist mindestens ein Seitenkanal vorgesehen,
der von dem Ausgangkanal zu einem zweiten Gefäß abzweigt, das Elektrolytflüssigkei:
enthält, in die die zweite Elektrode eingetaucht ist. Dabei sind der Eingangkanal
und der Seitenkanal bevorzugt möglichst kurz und besitzen einen gegenüber der Durchtrittsöffnung
relativ großen Querscti1itt, damit der zwischen den Elektroden messbare Widerstandswert
im wesentlichen durch die Abmessungen der Durchtrittsöffnung bestimmt wird. Die
durch die Durchtrittsöffnung hindurchtretenden Teilchen erzeugen dann größere relative
Änderungen im Widerstand, d.h. größere elektrische Impulse, so daß der Zähler eine
höhere Empfindlich..eit besitzt.
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Die Vorteile der Erfindung liegen insbesondere darin, daß die Teilchen
(Zellen) sich nach dem Durchströmen der Durchtrittsöffnung in einem dünnen Ausgangkanal
weiter bewegen, dessen Querschnitt etwa die Größenordnung der Durchtrittsöffnung
besitzt. Die Teilchen stehen daher in der Reihenfolge, in der sie die Durchtrittsöffnung
durchlaufen, am Ende des Ausgangkanals zur weiteren Untersuchung der einzelnen Teilchen
zur Verfügung.
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Der erfindungsgemäße Zähler, auch Kanalzähler genannt, kann daher
als integraler Bestandteil weiterer Meßeinrichtungen ausgebildet werden, wodurch
diese weiteren Meßeinrichtungen, z.B.
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ein aus der DT-PS 1919 628 bekanntes Durchfluß-Photometer als weiteren
Meßwert die Größe der Teilchen (Zellen) gleichzeitig mit der Messung der anderen
Meßwerte, z.B. der Nukleinsäuren und/oder der Proteine, liefern. Außerdem kann z.B.
am stromabseitigen Ende des Ausgangkanals ein Sortierer angeschlossen werden, der
die Teilchen entsprechend ihrer Größe sortiert.
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Ein weiterer Vorteil liegt darin, daß die erste und die zweite Elektrode
außerhalb des unmittelbaren Strömungspfades der Suspension innerhalb der Gefäße
am Ende der Eingang- bzw. Seitenkanäle angeordnet sind, wodurch das durch Elektrolyse
des Elektrolyten an der Elektrodenoberfläche erzeugte Gas relativ frei entweichen
kann, ohne daß aufstepnde Gasblasen die strömende
Suspension und
damit den Widerstand zwischen den Elektroden merklich beeinflussen. D darüberhirlaus
große Elektrodenflächen einsetzbar sind, lässt sich der Rauschpegel auf einen vernachlässigbaren
Wert reduzieren.
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Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die zweite einem
oder mehreren Elektrode in menrere Tellelettroden untertev><r,ale ln/weI-aljen
in Elektrolytflilssigkeit getaucht sind, wobei ein oder mehrere .3eitenkanäle vorgesehen
sind, die von den die Teilelektroden enthaltenden Gefäßen ausgehen und unmittelbar
hinter der Durchtrittsöffnung wn den Ausgangkanal münden und dem Ausgangkanal Elektrolytflü:3sigkeit
laminar zuführen.
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Um den erfindungsgemäßen Kanalzähler mit einer hydrodynamischen Fokussierulsg
zu versehen, die von U. Zirnmermann et al. in der genannten Veröffentlichung für
den bekannten Coulte-Zähler vorgeschlagen wurde, verläuft der Eingangskanal der
Suspension koaxial innerhalb eines von Elektrolytflüssigkeit durchströmten Hüllkanals
und endet in geringem Abstand von der Durchtrittsöffnung in Form einer Düse, die
einen fokussierten Suspensionsstrahl durch die Durchtrittsöffnung abgibt. Bei dieser
Ausführungsform ist die erste Elektrode in einem weiteren, mit Elektrolytflüssigkeit
ingefüllten Gefäß angeordnet, in welches das stromaufwärtige Ende des Hüllkanals
eingetaucht ist.
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Eine derartige Ausführungsform besitzt den Vorteidaß dufgrund de1vor
mehreren Seiten, z.B. von zwei gegenüberliegenden Seiten erfolgendenEinströmung
des Elektrolyten die Suspension und damit die Teilchen (Zellen) in die Mitte des
Ausgangkanals strömt. Die hydrodynamische Fokussierung der Suspension bewirkt ebenfalls
eine genauere Ausrichtung der Teilchenbahn im Zentrum der Durchtrittsöffnung, wodurch
die Teilchen längs des relativ homogenen elektrischen Feldes in der Mitte der Durchtrittsöffnung
transportiert werden. Die an den Elektroden erzeugte Impulsgröße entspricht daher
der Teilchengröße besser als das bei nichtzfokussierten Ausführungsformen der Fall
ist.
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Der Eingangkanal verengt sich bevorzugt vor der Durchtritts -öffnung
trichterförmig. Ebenfalls sind die Seitenkanäle an
ihrer Mündung
bevorzugt trichterförmig verengt, um an der Durchtrittsöffnung günste hydrodynamische
Verhältnisse zu schaffen.
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Der Querschnitt des Ausgangkanals ist bevorzugt kleiner oder gleich
(200x200) 2* Die Durchtritt:iöffnung ist bevorzugt kleiner als der Querschnitt d-,
Ausgangkanals. Der Ausgangkanal kann in mehrere Zweigkanäle verzweigt werden, sofern
dies für die nachgeschalteten Meßeinrichtungen erforderlich ist.
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Das aus Eingangkanal, Ausgangkanal, Seitenkanal und/oder Hüllkanal
bestehende Kanalsystem ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform einstückig
in nichtleitendem Material oder in mit nichtleitendem Material beschichtptem Metall
ausgebildet.
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Als Elektroden werden bevorzugt Platinelektroden verwendet, deren
Fläche in der Größenordnung von etwa 1 cm2 liegt, lim die bei der Elektrolyse an
den Elektrod.en durch Gasbildung hervorgerufene Fluktuation im Zählerstrom klein
zu halten. Außerdem soll der Zählerstrorn in der Größeriordnung von 0,1 bis einige
Milliampere liegen, da ansonsten die Auswirkung des Polarisations -potentials an
der Grenzfläche zwischen Elektrode und Elektrolyt den effektiven elektrischen Widerstand
zwischen den Elektroden stark erhöht, wodurch die relative Widerstandsänderung e
im Durchtritt eines Teilchens durch die Durchtrittsöffnung stark verringert wird,
der Zähler also unempfindlich wird.
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Erfindungsgemäß lässt sich der Zähler in der Zytometrie in einem Strömungs-Photometer
einsetzen, das z.B. aus der DT-PS 1919 628 bekannt ist. Bei dieser Verwendungsart
soll die optische Achse des Mikroskops des Strömungs-Photometers durch die Durchtrittsöffnung
und senkrecht zur Achse der Eingang- und Ausgangkanäle verlaufen. Das Kanalsystem
wird mit einem Mikroskop-Deckglas bedeckt, und die Appertur des Okulars soll so
weit geschlossen sein, daß das Mikroskop lediglich einen sehr kleinen Teil der Durchtrittsöffnung
sieht. Auf diese Weise lassen sich fluorometrische Messungen der verschiedenen Nukleinsäuren
und/oder Proteine mit
der Größenbestimmung der Zellen und/oder
mit der Triggerung von elektronischen Einrichtungen zur Rauschunterdrückung kombinieren.
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Ferner lässt sich der erfindungsgemäße Zähler mit geeigneten Sortierern
verbinden, die di3 Teilchen (Zellen) entsprechend ihrer Größe sortieren und daher
eine Größenverteilung messen.
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Im folgenden werden Ausführungsbeispiele der Erfindung an Hand der
Zeichnung näher erläutert.
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In den Figuren zeigen Fig. 1 eine schematische Darstellung einer ersten
Ausführungsform des erfindungsgemäßen Zählers; Fig. 2 eine weitere AusfUhrungsforq
des erfindungsgemäßen Zählers mit hydrodynamischer Fokussierung; und Fig. 3 den
zwischen erster und zweiter Elektrode gemessenen Zählerwiderstand als Funktion des
Zählerstroms.
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In Figur 1 ist eine erste, asymmetrische Ausführungsform des erfindungßgemäßen
Zählers dargestellt. Ein erstes Gefäß 7 enthält eine Suspension 9 aus einem ELektrolyten
und suspendierten Teilchen. Die Suspension 9 strömt durch den Eingangkanal 3, der
in die Suspension 9 eingetaucht ist und sich am stromabseitigen Ende trichterförmig
in eine Durchtrittsöffnung 1 verJüngt. An die Durchtrittsöffnung 1 schliesst sich
der relativ-enge Ausgangkanal 2 an, durch den die Suspension zur weiteren Untersuchung
weiteren Meßeinricatungen ziiführbar ist. In Strömungsrichtung unmittelbar hinter
der Durc rittsöffnung mündet ein Seitenkanal 4 trichterförmig veb engt in den Ausgangkanal
2. Der Seitenkanal 4 befindet sich mit dem nom Ausgangkanal 2 abgewandten Ende in
einer reinen ElektrolytflUssigkeit 10, die sich in einem zweiten Gefäß 8 befindet.
In vorgogebenem Abstand vor dem
Eingangkanal 3 liegt im ersten
Gefäß 7 eine erste Platinelektrode 5, während sich eine zweite Platinelektrode 6
in vorgegebenem Abstand vor dem dem Ausgangkanal abgewandten Ende des Seitenkanals
4 befindet. Die Suspension 9 strömt durch den aus Eingangkanal3, Durchtrittsöffnung
1 und Ausgangkanal 2 gebildeten Strompfad, dem ein bestimmtes Druckgefälle von außen
zur Verwirklichung der Strömung eingeprägt wird. Vom zweiten Gefäß 8 strömt durch
den Seitenkanal 4 unmittelbar hinter der Durchtrittsöffnung 1 reine Elektrolytflüssigkeit
in den Ausgangkanal 2. Eingangkanal 3 und Seitenkanal 4 besitzen gegenüber der Durchtrittsöffnung
1 und dem Ausgangkanal 2 einen relativ großen Querschnitt. Die Fläche der Durchtrittsöffnung
und ebenso die Fläche des Querschnitts des Ausgangkanals liegt etwa in der Größenordnung
von 1002. Die Fläche der als Platinelektroden ausgebildeten Elektroden 5 und 6 liegt
in der Grössenordnung von 1cm2 . Strömt ein in der Suspension 9 enthaltenes Teilchen
durch die Durchtrittsöffnung 1, so veränder sich bei dem Durchtritt dieses Teilchens
aufgrund des unterschiedlichen spezifischen Widerstands des Teilchens der zwischen
den Elektroden 5 und 6 gemessene Widerstand Rc. Diese Widerstandsänderung wird als
Strom- und/oder Spannungsimpuls zwischen den Elektroden 5 und b registriert und
in gewünschter Weise weiter verarbeitet, wobei aus der Größe des Impulses auf die
Teilchengröße geschlossen werden kann.
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In Figur 2 ist eine weitere Ausführungsform der Erfindung dargestellt,
die symmetrisch angeordnete Seitenkanäle 4', 4" und eine hydrodynamische Fokussierung
enthält. Bei dieser Ausführungsform ist die zweite Elektrode in mehrere Teilelektroden
6', 6" unterteilt, die in Gefäßen 8', 8" in Elektrolytflüssigkeit 10 getaucht sind.
Der Elektrolyt 10, lO"wird durch mehrere Seitenkanäle 4', 4'', die von den die Teilelektroden
6', 6" enthaltenden Gefäße 8', 8" ausgehen und unmittelbar hinter der Durchtrittsöffnung
1 in den Ausgangskanal münden, in den Ausgangkanal 2, bevorzugt symmetrisch am Umfang
des Ausgangkanals 2 verteilt, eingeführt. Der Eingangkanal 3 tritt in gewissem Abstand
vor der Durchtrittsöffnung 1 durch einen Hüllkanal 12
seitlich
hindurch und wird anschliessend koaxial in den von Elektrolytflüssigkeit durchströmten
Hüllkanal 12 bis kurz vor die Durchtrittsöffnung 1 geführt. Durch eine Düse an dem
der Durchtrittsöffnung 1 benachbarten Ende des Eingdngkanals 3 strömt die Suspension
in einem fokussiertem Strahl mittig in die Durchtrittsöffnung 1 ein. Di erste Elektrode
5 befindet sich in einem weiteren, mit reinem Elektrolyt gefüllten Gefäß 13, in
welches das stromaufwärtige Ende des Füllkanls 12 eingetaucht ist. Durch die hydrodynamische
Fokussierung des Suspensionsstrahles und durch die symmetrische Einströmung von
Elektrolytflüssigkeit unmittelbar hinter der Durchtrittsöffnung 1 wird bewirkt,
daß die zu messenden Teilchen im wesentlichen im Zentrum, d.h. im Bereich des relativ
homogenen elektrischen Feldes durch die Durchtrittsöffnung 1 hindurchtreten, so
daß die zwischen der ersten Elektrode 5 und dem gemeinsamen An -schlußpunkt der
zweiten Teilelektrode 6', 6" gemessenen Strom-und/oder Spannungsimpulse der Jeweiligen
Größe des durchtretenden Teilchens genauer entsprechen.
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In Fig. 2 können die Gefäße 8',8" die Teilelektroden 6',6" und die
Seitenkanäle 4',4" durch ein Gefäß 8 und/oder eine Elektrode 6 und/oder einen Seitenkanal
ersetzt werden, der dem Ausgangskanal den Elektrolyten laminar zuführt.
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In Figur 3 ist der Verlauf des zwischen der ersten und der zweiten
Elektrode 5, 6 gemessenen Widerstands Rc als Funktion des Zählerstroms 1c dargestellt,
wobei die Gesamtfläche einer Elektrode zwischen 2cm und 3cm2 lag. Aus dem bei kleinen
Stromwerten stark ansteigenden Widerstantlsverlauf lässt sich der Einfluß des Polarisationspotentials
an der Zwischenschicht zwischen Elektrode und Elektrolyt erkennen. Durch diese starke
Erhöhung des effektiven elektrischen Widerstands zwischen den Elektroden bei relativ
kleinen sählerströmen wird die relative Widerstandsänderung, die beim Durchtritt
der Teilchen durch die Durch -trittsöffnung 1 hervorgerufen wird, relativ klein,
der Zähler wird bei einem derartigen Arbeitspunkt daher relativ unempfindlich. Um
den Zähler bei möglichst großer Empfindlichkeit zu betreiben, ist daher bei einer
Elektrodenfläche von etwa 1 cm2 ein Zählerstrom in der Größenordnung zwischen 0,1
und einigen Milliempere erforderlich.