CH651930A5 - Apparatus for analysis and sorting of particles - Google Patents
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Description
La présente invention a pour objet, d'une façon générale, un appareil d'analyse et de triage de particules et, plus particulièrement, un appareil à l'aide duquel des études peuvent être effectuées de systèmes particulaires en utilisant le principe de la détection d'impédance et les mesures optiques.
Depuis sa conception au début des années 1950, le principe du comptage et du dimensionnement des particules inventé par Wallace H. Coulter a débouché sur de nombreuses méthodes et de nombreux appareils à flux traversant pour le comptage électronique de dimensionnement et d'analyse de particules microscopiques qui sont observées en suspension dans un fluide, comme décrit et représenté dans le brevet USA de pionnier N° 2656508 de Coulter. Dans l'état de la technique, un courant électrique continu est établi entre deux récipients en suspendant des électrodes dans les corps respectifs du fluide de suspension. La seule liaison pour le fluide entre les deux récipients a lieu à travers une ouverture. De ce fait, un flux de courant et de champ électriques est établi dans cette ouverture. Cette ouverture et le champ électrique résultant dans celle-ci et autour de celle-ci constituent une zone de détection. Lorsque chaque particule passe dans la zone de détection, pendant la durée de son passage, l'impédance des contenus de la zone de détection change, ce qui module le flux de courant et le champ électrique dans la zone de détection et produit un signal qui est appliqué à un détecteur agencé de façon à répondre à ce signal.
Pour de nombreuses applications d'analyseurs automatiques de particules à flux traversant, il n'est pas possible d'utiliser seulement un petit nombre de paramètres de particules pour l'identification de chaque type de cellule présent dans une population de cellules hété-rodispersées d'un échantillon. Jusqu'à présent, de nombreux systèmes à flux de courant mesurent la fluorescence, la dispersion de lumière et le volume électronique des cellules (détection d'impédance). En outre, on a développé des analyseurs de particules à flux traversant dans lesquels les particules sont placées à l'intérieur de gouttelettes de liquide, ces gouttelettes étant triées lors des mesures décrites ci-dessus. De tels analyseurs de particules sont représentés dans le brevet USA N° 3710933 de Fulwyler et al. et dans un article intitulé «A Volume-Activated Cell Sorter», publié dans «The Journal of Histochemistry and Cytochemistry», par E. Menke et al., vol. 25, pp. 796-803,1977.
Des problèmes majeurs de construction naissent de l'utilisation à la fois des mesures optiques et des mesures d'impédance dans les analyseurs et trieurs de particules. Les analyseurs et trieurs de particules décrits ci-dessus, appartenant à l'état de la technique, effectuent des mesures électroniques de volumes de cellules avant des mesures optiques, ce qui rend nécessaire de produire une corrélation entre les deux types de mesure. Ce problème de corrélation n'a pas d'importance pour des vitesses de flux très faibles. Par contre, à des hautes vitesses de flux de particules, il est possible que les signaux détectés soient brouillés par des facteurs étrangers tels qu'agrégats de cellules qui se séparent après avoir traversé une ouverture de détection de volume de façon à se déplacer alors séparément jusqu'à la zone de détection optique, d'où la présence de particules non fluorescentes et la possibilité que deux cellules voisines échangent leur position dans le flux. En outre, cela nécessite l'utilisation de circuits spéciaux pour compenser les retards entre les signaux optiques et électroniques pour une particule donnée.
Pour les cas où le triage n'est pas nécessaire, on a développé un analyseur de particules électro-optique dans lequel les mesures sont effectuées simultanément, ce qui élimine ainsi la complexité et l'incertitude des valeurs de corrélation obtenues des mesures séquentielles. Cet analyseur électro-optique de particules est décrit dans un article intitulé «Combined Optical and Electronic Analysis of Cells with AMAC Transducers», par Thomas et al., publié dans «The Journal of Histochemistry and Cytochemistry», vol. 25, N° 7 (1977), pp. 827-835. Cet analyseur de particules à multiparamètres utilise une ouverture de détection carrée dans laquelle tous les paramètres sont mesurés simultanément. L'ouverture carrée est logée à l'intérieur d'un tube formé par l'adhérence de quatre pyramides les unes aux autres.
La présente invention se rapporte à un appareil d'analyse et de triage de particules en suspension, comprenant une unité d'écoulement de particules présentant une ouverture de détection de particules traversée par un flux de particules en suspension, ladite unité d'écoulement de particules présentant un canal amont et un canal aval, l'ouverture de détection de particules étant placée entre eux et constituant la seule liaison pour le fluide entre lesdits canaux, et des moyens de sortie situés à proximité de l'extrémité aval dudit canal aval.
Cet appareil est caractérisé par des moyens d'introduction de liquide agencés et situés à l'aval de l'extrémité aval dudit canal aval et servant à introduire un liquide qui s'écoule à la fois dans lesdits moyens de sortie à travers l'ouverture de détection de particules, placée en amont, pour focaliser hydrodynamiquement le flux de particules lorsqu'il s'écoule vers l'aval à partir de ladite ouverture de détection de particules par lesdits moyens de sortie.
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Il est à remarquer que, jusqu'à présent, le triage par gouttelettes n'a jamais été inclus Jans un appareil électro-optique dans lequel l'impédance électrique et les mesures optiques sont effectuées simultanément. En outre, on a trouvé que, en dépit du petit volume de la chambre d'écoulement, la focalisation hydrodynamique du flux de particules par un manchon de liquide pouvait être réalisée en introduisant le manchon de liquide dans le fond de l'orifice aval et, de ce fait, sans interférer avec l'ensemble optique.
Le dessin représente, à titre d'exemple, une forme d'exécution de l'objet de l'invention.
La fig. 1 illustre une vue partiellement en action droite et partiellement sous forme de schéma bloc d'un appareil d'analyse et de triage de particules, et la flg. 2 est une coupe agrandie de la zone d'ouverture de détection du flux de cellule de l'appareil de la flg. 1.
La flg. 1 illustre un appareil d'analyse et de triage de particules à flux traversant 10 comportant un tube d'introduction d'échantillon 12, un tube formant manchon 14 entourant, en position coaxiale, le tube 12, et une unité ou cellule d'écoulement optiquement transparente 16 placée à l'extrémité du tube 12. L'unité d'écoulement 16 comporte, ménagée dans celle-ci, une paire de perçages ou canaux opposés 18 et 20 et une ouverture de détection microscopique 22 qui forment un passage pour le fluide entre les extrémités des canaux. L'ouverture 22 définit une zone de détection de particules qui sera décrite ci-après. Un courant de liquide contenant des particules individuelles en suspension provenant d'un réservoir sous pression 23A circule dans le tube 12. Un manchon de liquide salin laminaire provenant d'un autre réservoir sous pression 23B circule dans le tube 14 de manière à entourer le flux des particules. Lorsque le flux du liquide des particules sort du tube 12 et pénètre dans le premier canal 18, les pressions hydrodynamiques réduisent le diamètre du flux de particules lorsque celui-ci atteint la vitesse du manchon liquide. Ce dernier agit également pour centrer le flux de particules de telle manière que les particules traversent l'ouverture 22. Après avoir abandonné l'ouverture 22, les particules pénètrent dans le second canal 20 de l'unité d'écoulement 16.
Différents composants du système sont supportés par un bâti cylindrique 25. Une buse 24 dans laquelle est ménagé un orifice de sortie 26 est montée à l'extrémité de l'unité d'écoulement 16 de telle manière que cette buse 24 et le second canal 20 définissent une chambre d'écoulement 28 remplie de liquide.
Un tube 29 est relié au bâti 25 par un conduit 30. Un second manchon liquide est amené par le tube 29 à une cavité pour le liquide 31 qui est en communication avec les orifices d'entrée 32 ménagés dans la paroi de l'unité d'écoulement 16. En raison de la baisse de pression associée à l'ouverture 22, il est nécessaire d'introduire le second manchon de liquide dans la chambre d'écoulement 28 pour créer un second manchon ayant des pressions hydrodynamiques suffisantes pour faire passer les particules par la chambre d'écoulement 28 et hors de l'orifice de sortie 26.
Contrairement aux dispositions connues, le second manchon décrit est introduit à la partie inférieure de la chambre d'écoulement 28, ce qui est avantageux en ce qui concerne l'illumination optique et la connexion qui sera décrite ci-après. Plus spécifiquement, le manchon liquide entre dans le second canal 20 par une pluralité d'orifices d'entrée 22 placés en des endroits considérablement au-dessous et en aval de l'ouverture de détection 22. De plus, le second manchon liquide est introduit d'une façon non concentrique par rapport au flux de particules sortant de l'ouverture de détection 22 et est injecté dans un volume intérieur relativement petit du second canal 20. En dépit du petit volume du second canal 20 et de l'introduction non concentrique du second manchon liquide, au bout du second canal 20, il a été trouvé qu'une partie du second manchon liquide circule en remontant pour capturer le courant de particules sortant de l'ouverture de détection 22 alors qu'une partie du second manchon liquide va immédiatement à l'orifice de sortie 26 et à tout point situé entre eux. De cette manière, une bonne focalisation hydrodynamique du courant de particules dans la chambre d'écoulement 28 est obtenue, permettant ainsi au courant de sortir par l'orifice de sortie 26. Dans la forme d'exécution préférée, trois orifices d'entrée 32 sont prévus. Cependant, il est entendu que le nombre des orifices 32 est une simple question de choix et qu'un seul suffira, suivant son diamètre, alors qu'il est plus commode d'en avoir plusieurs pour permettre le nettoyage et le rinçage de la chambre d'écoulement 28.
Les composants du système représentés schématiquement sous forme de blocs sont ceux qui existent normalement dans les systèmes d'analyse et de triage de particules usuels désignés parfois comme étant des systèmes de triage à flux cytométrique. Seuls les composants des analyseurs et trieurs de particules 10 ont été représentés qui sont nécessaires à la compréhension du fonctionnement de la présente disposition.
D'une façon usuelle, de l'énergie vibratoire est appliquée au jet de liquide 34 sortant de l'orifice de sortie 26 par des moyens vibratoires 36. Une possibilité consiste à réaliser les moyens vibratoires 36 au moyen d'un cristal piézo-électrique. L'unité d'écoulement 16 est montée et est supportée par un cristal piézo-électrique qui la fait vibrer à haute fréquence. La fréquence exacte à laquelle l'unité 16 vibre dépend du diamètre choisi de l'orifice de sortie 26. Ces vibrations produisent de légères perturbations, normalement des ondulations, à la surface du jet 34, qui grandissent en raison des effets de tension de surface bien connus et, éventuellement, brisent le jet, en un point de rupture 38, en des gouttelettes 40 bien définies. Le diamètre de l'orifice de sortie 26, la vitesse du jet de liquide 34 et la dilution de la suspension de particules sont prédéterminés de telle manière qu'il n'y ait normalement pas plus d'une cellule dans une gouttelette donnée 40.
Au moyen d'un agencement de triage usuel 60, les gouttelettes sélectionnées 40 sont chargées par exemple, par un collier de charge ayant une tension qui y est appliquée. D'autres gouttelettes ne sont pas chargées. L'agencement de triage 60 comporte également une paire de plaques déflectrices ayant une différence de potentiel électrique appliqué entre elles. Lorsque les gouttelettes passent entre les plaques, les gouttelettes chargées sont déviées dans le champ électrique, ce qui permet aux gouttelettes chargées d'être séparées des gouttelettes non chargées. La décision de charger une gouttelette donnée est fondée sur les mesures optiques et d'impédance décrites précédemment pour la particule contenue dans cette gouttelette. La description qui précède de la formation des gouttelettes et du triage des gouttelettes est donnée brièvement, puisque cette partie de l'appareil 10 est connue en soi.
Dans l'unité d'écoulement 16, la suspension de particules est illuminée de façon usuelle, alors qu'elle passe par l'ouverture de détection 22, par un faisceau lumineux produit par une source lumineuse 42, par exemple un faisceau laser. La réponse de la particule dans la suspension d'échantillon à l'illumination est typiquement une réflexion de lumière, une fluorescence ou une absorption et est détectée par un système de détection optique 44. Comme cela est bien connu dans ce domaine, il y a de nombreux dispositifs d'illumination et de collection de lumière qui peuvent être utilisés avec l'unité d'écoulement 16. Cependant, en plaçant l'orifice d'entrée 32 sensiblement en aval de l'ouverture 22, les orifices 32 n'interfèrent pas avec la lumière d'illumination et de collection. De ce fait, des angles solides plus grands d'illumination et de collection de lumière sont possibles.
L'ouverture de détection 22 sert non seulement comme zone de détection optique, comme décrit ci-dessus, mais également comme zone de détection de volume électronique, selon le principe de Wallace Coulter, comme cela sera décrit ci-après. Une électrode amont 46 est de préférence montée à l'intérieur du manchon 14. Une électrode aval 48 est de préférence montée dans une chambre éloignée 50 qui est en communication avec la chambre d'écoulement 28 par le tube 29. Un courant à basse fréquence, à savoir un courant continu, ou une source de courant à haute fréquence 52, ou tous les deux,
sont électriquement reliés aux électrodes 46 et 48 au moyen de conducteurs électriques 54 et 56, respectivement. Lorsque des particules traversent l'ouverture 22, elles modulent le courant électrique de fa5
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çon à produire des impulsions de particules détectées par une circuitene de détection usuelle 58. La source de courant 52 et la circuitene de détection 58 sont représentées dans les brevets USA N°s 3710933, 3502974 et 3502973.
De préférence, mais pas nécessairement, les canaux 18 et 20 ont une section droite circulaire de 1,25 mm alors que la longueur hors tout de l'unité d'écoulement 16 est de 6,25 mm. L'unité d'écoulement 16 est formée d'une pièce de quartz monolithique qui permet à ladite unité 16 d'être petite. Plus la dimension de l'unité d'écoulement 16 est petite, meilleures sont les caractéristiques optiques en ce sens que l'unité d'écoulement s'approche alors d'une source ponctuelle pour les signaux optiques. La section droite de l'ouverture de détection de particules 22 sera de préférence sensiblement un carré.
Comme visible dans l'agrandissement de la fig. 2, les extrémités des canaux 18 et 20 présentent des surfaces sphériques 62 et 64 qui sont chacune interrompues par l'ouverture 22. En prévoyant des extrémités arrondies pour les perçages, l'ouverture 22 n'a pas à être localisée 5 avec précision. Les surfaces extérieures sont plates et parallèles aux parois de l'ouverture 22. Typiquement, l'ouverture 22 a des parois dont la longueur sera de 50 à 100 [im. De préférence, l'ouverture 22, l'orifice de sortie 26 et les canaux 18 et 20 seront en alignement coaxial. Les dimensions décrites ci-dessus et les configurations décri-10 tes dans ce paragraphe sont uniquement illustratives et peuvent être différentes.
Bien que l'appareil soit utilisé principalement pour l'étude de cellules, il pourra être applicable à d'autres genres de particules.
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1 feuille dessin
Claims (6)
1. Appareil d'analyse et de triage de particules pour l'étude de particules en suspension, comprenant une unité (16) d'écoulement de particules présentant une ouverture de détection de particules (22) traversée par un flux de particules en suspension, ladite unité d'écoulement de particules présentant un canal amont (18) et un canal aval (20), l'ouverture de détection de particules (22) étant placée entre eux et constituant la seule liaison pour le fluide entre lesdits canaux, et des moyens de sortie (24, 26) situés à proximité de l'extrémité aval dudit canal aval, caractérisé par des moyens d'introduction de liquide (32) agencés et situés à l'aval de l'extrémité aval dudit canal aval (20) et servant à introduire un liquide qui s'écoule à la fois dans lesdits moyens de sortie (24, 26) à travers l'ouverture de détection de particules (22), placée en amont, pour focaliser hydrodynamique-ment le flux de particules lorsqu'il s'écoule vers l'aval à partir de ladite ouverture de détection de particules par lesdits moyens de sortie.
2. Appareil d'analyse de particules suivant la revendication 1, caractérisé par le fait que lesdits moyens d'introduction de liquide (31, 32) sont disposés et agencés par rapport au flux de particules de manière à introduire le liquide de façon non concentrée.
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REVENDICATIONS
3. Appareil d'analyse de particules suivant l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que lesdits moyens d'introduction (30, 31, 32) sont agencés par rapport au flux de particules de telle manière que le liquide pénètre dans ladite unité d'écoulement de cellules à approximativement angle droit par rapport au flux des particules.
4. Appareil d'analyse de particules suivant l'une des revendications 1 à 3, comprenant en outre des moyens d'illumination (42) produisant une radiation illuminant les particules dans ladite ouverture de détection (22), caractérisé par le fait que lesdits moyens d'illumination et leur radiation sont orientés et situés à distance desdits moyens d'introduction du liquide (32).
5. Appareil d'analyse de particules suivant l'une des revendications l à 4, caractérisé par le fait que lesdits moyens d'introduction de liquide (32) sont situés à proximité desdits moyens de sortie (26), ces derniers comprenant une buse (24) ayant un orifice de sortie (26) pour pulvériser le flux de particules sous la forme d'un jet de liquide (34).
6. Appareil d'analyse de particules suivant la revendication 5, caractérisé par des moyens de perturbation (36) perturbant périodiquement le jet de liquide (34) pour le rompre en gouttelettes contenant les particules, des moyens de triage (60) desdites gouttelettes étant commandés par des signaux produits lorsque des particules traversent ladite ouverture de détection de particules (22).
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