FR2543298A1 - Dispositif d'analyse et de triage de particules - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN DISPOSITIF DE TRIAGE DE PARTICULES POUR DES MESURES DE PARTICULES DANS UN COURANT. SELON L'INVENTION, IL COMPREND UNE CELLULE D'ECOULEMENT 16 AYANT DEUX CANAUX 18, 20 QUI SONT CONNECTES PAR UNE OUVERTURE INTERPOSEE 22 DE DETECTION DES PARTICULES, PAR OU PASSE LA PARTICULE, UNE TUBULURE 24 MONTEE PRES DE L'EXTREMITE EN AVAL DU CANAL EN AVAL, ET UN MOYEN 30, 31, 32 POUR INTRODUIRE UN LIQUIDE FORMANT GAINE A L'EXTREMITE EN AVAL DU CANAL EN AVAL POUR GAINER ET HYDRODYNAMIQUEMENT FOCALISER LE COURANT DES PARTICULES TANDIS QU'IL PASSE A TRAVERS LE CANAL EN AVAL EN PROVENANT DE L'OUVERTURE DE DETECTION VERS LA TUBULURE. L'INVENTION S'APPLIQUE NOTAMMENT A L'ANALYSE ET AU TRIAGE DES PARTICULES.
Description
La présente invention se rapporte généralement à un dispositif d'analyse
et de triage de particules, et elle concerne plus particulièrement des dispositifs ou des études peuvent être faites, concernant des systèmes particulaires, en utilisant le principe de
détection d'impédance et des mesures optiques.
Depuis sa conception dans les années 1950, le principe ducomptage et du dimensionnement des particules inventé par Wallace H Coulter a eu pour résultat de nombreuses méthodes et dispositifs à débit continu pour le oomptage électronique, le dimensionnement et l'analyse de particules microscopiques, qui sont explorées dans une suspension fluide, comme le montre le brevet US NI 2656508 au nom de Coulter Dans cet agencement selon l'art antérieur, un écoulement de courant électrique continu est établi entre deux récipients en suspendant des électrodes dans les corps respectifs du fluide de suspension La seule cannexion de fluide entre les deux corps se fait par un orifice; par conséquent, un écoulement de courant électrique et un champ s'établissent dans l'orifice L'orifice et le champ électrique résultant dans et autour de lui constituent une zone de détection Tandis que chaque particule traverse la
zone de détection, pendant la durée du passage, l'im-
pédance du contenu de la zone de détection change, modulant ainsi l'écoulement de courant et le champ électrique dans la-zone de détection, et provoquant la
production d'un signal à appliquer à un détecteur avan-
tageusement agencé pour répondre à ce changement.
Pour de nombreusesapplications d'analyseurs automa-
tisés d e particules à débit continu, il n'est pas possible de n'utiliser qu'un petit nombre de descripteurs de particules pour l'identification de chaque type de cellule présente dans une population de cellules hétérodispersées d'un échantillon Actuellement, de nombreux systèmes d'écoulement mesurent la fluorescence, la dispersion de la lumière et le volume d'une cellule électronique (détection d'impédance) De plus, des analyseurs de particules à débit continu se sont développés, o les particules sont placées à l'intérieur de gou Ielette de liquide et les goutelettes sont triées lors desmesuresci-dessus décrites De tels analyseurs triant les particules sont indiqués dans le brevet US NO 3 710933 au nom de Fulwyler et autres, et dans un article intitulé "A Volume-Activated Cell Sorter", The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, de E.
Menke et autres, volume 25, pp 796-803, 1977.
Des problèmes majeurs de conception sont posés par l'utilisation des mesures optiques et des mesures
d'impédance dans les analyseurs triant les particules.
Les analyseurs triant les particules ci-dessus décrits de l'art antérieuraccomjieait des mesures électroniques du volume des cellules avant les mesures optiques, ce qui rend nécessaire la mise en corrélation des deux types de mesure Ce problème de corrélation n'est pas important à des débits très faibles des particules, cependant, à des débi tsélevés des particules, il est possible que les signaux détectés soient brouillés par des objets tels que des agrégats de cellules qui se séparent après avoir traversé un orifice de détection du volume, afin de passer séparément vers la zone de
détection optique, la présence de particules non fluo-
rescentes, et la possibilité que deux cellules voisines
changent de position dans le courant en écoulement.
De plus, cela nécessite l'utilisation d'un circuit spécial pour compenser le retard dessignaux optique
et électronique pour une particule donnée.
Lorsque le triage n'est pas utilisé, on a developpé un analyseur électrooptique combiné de particules, o toutes les mesures sont faites simultanément, éliminant ainsi la complexité et l'incertitude de la mise en corrélation des données obtenues de mesures séquentiel Cet analyseur électro-optique de particules est décrit dans un article intitulé "Combined Optical and Electronic Analysis of Cells with AMAC Trantsducers", par Thomas et autres, publié dans The Journal of Histochemistry and
Cytochemistry, volume 25, No 7 ( 1977)epes 827-835.
Cet analyseur de particules à multiparamètres utilise un orifice de détection carré o tous les paramètres sont mesurés simultanément L'orifice carré est enfermé à l'intérieur d'un cube formé par addhérence de quatre pyramides ensemble La présente invention est dirigée vers un dispositif électro-optique -combiné d'analyse et de triage de particules, o des mesures optiques et d'impédance
électrique (volume électronique) sont effectués simulta-
nément sur un courant de particules passant par une
ouverture de détection de particules La cellule d'écou-
lement a deux canaux,un canal amont et un cana Il aval, définissant des ouvertures à ses extrémités supérieures, l'ouverture de détection des particules connectant de façon fluide les deux canaux L'amélioration du dispositif consiste à monter une tubulure, contenant un orifice de sortie, à l'extrémité du canal aval afin de définir une chambre d'écoulement remplie de liquide Un liquide formant gaine est prévu à ltextrémité inférieur de la chambre d'écoulement pour former une gaine pour le courant de particules sur toute la longueur de la chambre d'écoulement de petit diametre, afin de laisser ainsi de la place dans la cellule d'écoulement, à proximité de l'extrémité supérieim du canal en aval, pour l'éclairement des particules et pour en recueillir la lumière En vertu de cette conception, les particules sont hydrodynamiquement focalisées alors qu'elles passent vers l'orifice de sortie et ensuite font partie d'un jet
de liquide Le jet de liquide, d'une façon convention-
nelle,est rompu en un certain nombre de gouttelettes, qui sont chargées et triées, en se basant sur les
signaux ci-dessus décrits.
Jusqu'à maintenant, le triage des gouttelettes n'a jamais été incorporé dans un dispositif électro-optique ou des mesures d'impédance électrique et optiques sont faites simultanément Par ailleurs, les demandeurs ont
trouvé que malgré le petit volume de la chambre d'écoule-
ment, urefocalisation hydrodynamique du courant de parti-
cules par gaine liquide pouvait être accomplie en intro-
duisant le liquide de la gaine au fond de l'orifice en
aval pour ainsi ne pas interférer avec l'ensemble optique.
L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci
apparaltront plus clairement au cours de la description
explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement a titre d'exemple illustrant un mode de réalisation de l'invention, et dans lesquels: la figure 1 montre une vue en coupe transversale
partielle et un schéma-bloc partiel d'un dispositif d'a 8 a-
lyse et de triage de particules selon l'invention; et la figure 2 est une rue en coupe transversale agrandie de la région de l'ouverture de détection de la
cellule d'écoulement de la figure 1.
La figure 1 montre un dispositif 10 d'analyse et de triage de particules à débit continu, ayant un tube 12 d'introduction de l'échantillon, un tube formant gaine 14 placé en relation coaxial et entourant le tube 12, et une cellule d'écoulement optiquement transparente 16 qui est placée à l'extrémité du tube 12 Dans la cellule d'écoulement 16 sont formés deux alésages ou canaux
opposés 18 et 20 et une ouverture microscopique de détec-
tion 22, qui forme un passage de fluide entre les extrémités des canaux L'ouverture 22 définit une zone
de détection de particules que l'on décrira ci-après.
Un courant liquide de particules individuellement en suspension, provenant d'un réservoir sous pression 23 A, passe par le tube 12 Une gaine deliquide laminaire salin, provenant d'un autre réservoir sous pression 23 B, passe
par le tube 14 afin d'entourer le courant de particules.
Tandis que le courant liquide des particules sort du tube 12 et entre dans le premier canal 18, les pressions hydrodynamiques réduisent le diamètre du courant de particules tandis que le courant obtient la vitesse de la gaine liquide La gaine liquide sert également à centrer le courant des particules de façon que les particules passent par l'orifice 22 Après avoir quitté l'orifice 22, les particules entrent dans le second canal
20, de la cellule d'écoulement 16.
Divers composants du système sont supportés par un cadre cylindrique 25 Une tubulure 24, o est formé un orifice de sortie 26, est montée à l'extrémité de la cellule dtécoulement 16, donc la tubulure 24 et le second canal 20 définissent une chambre dîécoulement 28 remplie de liquide Un tube 29 est couplé au cadre 25 par un raccord Un second liquide formant gaine est amené par le tube 29 à une cavité de liquide 31, qui est en communication de fluide avec trois orifices d'entrée 32 qui sont formés dans la paroi de la cellule d'écoulement 16 Du fait de la chute de pression associée à l'ouverture 22, il est nécessaire d'introduire le second liquide formant gaine dans la chambre d'écoulement 28 pour créer une seconde gaine ayant des pressions hydrodynamiques suffisantes pour faire passer les particules à travers la chambre
d'écoulement 28 pour sortir par l'orifice de sortie 26.
Contrairement aux conceptions selon l'art antérieur, la seconde gaine de liquide est introduite à la partie inférieure de la chambre d'écoulement 28, avec pour résultat des avantages de l'éclairement optique et du
rassemblement ou récupération, que l'on décrira ci-après.
Plus particulièrement, le liquide de la gaine entre dans le second canal 20 par les orifices d'entrée 32 qui
se trouvent en des emplacements à une distance considéra-
ble au dessous et en aval de l'ouverture de détection 22.
Par ailleurs, le second liquide formnmt gaine est introduit d'une façon non concentrique par rapport au courant des particules qui sort de l'ouverture de détection 22 et il est injecté dans un volume intérieur relativement petit du second canal 20 Malgré le petit volume du second canal et l'introduction non concentrique de la seconde gaine de liquide au fond du second canal 20, on a trouvé qu'une partie du second liquide formant gaine se déplaçait "en remontant" pour capturer le courant des particules sortant de l'ouverture de détection 22, tandis qu'une partie du second liquide formant gaine passe immédiatement
vers l'orifice de sortie 26 et tous les points intermé-
diaires De cette façon, une bonne focalisation hydro-
dynamique du courant des particules à travers la chambre d'écoulement 26 est accomplie, permettant ainsi au courant de sortir de l'orifice de sortie 26 Dans le mode de réalisation préféré, trois orifices d'entrée sont représentés Cependant, on comprendra que le nombre
d'orifices 32 est une simple question de choix de concep-
tion, et qu'un seul suffit bien que, selon le diamètre, il sera pratique d'en avoir plus d'un, afin de permettre
un nettoyage et un rinçage de la chambre d'écoulement 28.
Les composants du système qui sont montrés schémati-
quement en blocs sont ceux qui existent normalement dans les systèmesconventionnels d'analyse et de triage de particules, quelquefois appelés systèmes de triage cytométrique à écoulement Seuls les composants de l'analyseur et trieur de particules 10 ont été illustrés quisont nécessaires pour expliquer le fonctionnement de
la présente invention.
D'une façon conventionnelle, une énergie vibratoire est appliquée au jet 34 de liquide, qui sort de l'orifice de sortie 26 par un moyen vibratoire 36 Selon une posibilité, le moyen vibratoire 36 peut comprendre un cristal piézoélectrique La cellule d'écoulement 16 est montée sur le cristal piézoélectrique par lequel elle est supportéeeti fait vibrer la cellule d'écoulement 16 à une haute fréquence La fréquence exacte à laquelle la cellule 16 vibre dépend du diamètre choisi de l'orifice de sortie 26 Ces vibrations impartissent de petites perturbations, normalement des ondulations, à la surface du jet 34 qui croiss Ent,par les effets bien connus de tension de surface, et éventuellement séparent le jet Ln le pinçant en un point de détachement 38, en gouttelettes bien définies 40 Le diamètre de l'orifice de sortie 26, la vitesse du jet de liquide 34 et la dilution de la suspension des particules sont tous prédéterminés de façon que normalement il n'y ait pas plus d'une cellule
dans une gouttelette donnée 40.
Par un agencement conventionnel de triage 60, les gouttelettes choisies sont chargées, par exemple,
par un collier de charge auquel est appliquée une tension.
D'autres gouttelettes ne sont pas chargées L'agencement de triage 60 comprend également deux plaques déflectrices entre lesquelles est appliqué une différence de potentiel électrique Tandis que les gouttelettes passent entre les plaques, les gouttelettes sont déviées dans le champ électrique, permettant ainsi aux gouttelettes chargées d 'être 86 P Mxéesdes gouttelettes non chargées La décision de charger une gouttelette donnée est basée sur les mesures précédemmentdécrites optiques et d'impédance pour la
particule contenue dans cette gouttelette La description
ci-dessus de l'a formation d'une gouttelette et du triage des gouttelettes n'est donnée que rapidement,
car cette partie du dispositif 10 est bien connue.
Dans la cellule d'écoulement 16, la suspension des particules est éclairée d-'une façon conventionnelle, tout en passant à travers l'ouverture de détection 22, par un faisceau lumineux produit par une source d'éclairement 42, par exemple un laser La réponse de la particule dans la suspension de l'échantillon, à l'éclairement, typiquement une dispersion de lumière, une fluorescence ou une absorbance, est détectée par un système de détection optique 44 Comme on le sait bien, il y a de nombreux agencements d'éclairement et collecteurs de lumière qui peuvent être utilisés avec la cellule d'écoulement 16 Cependant, en plaçant l'orifice d'entrée
32 sensiblement en aval de l'ouverture 22 selon l'inven-
tion, les orifices 32 n'interfèrent pas avec l'éclaire-
ment et le rassemblement de la lumière; par conséquent, de plus grands angles solides d'éclairement de la lumière
et de rassemblement sont possibles.
L'ouverture de détection 22 sert non seulement de zone de détection optique comme on l'a décrit ci-dessus, mais sert également de zone de détection de volume électronique selon le principe de Wallace Coulter, comme on le décrira ci-après Une électrode 46 en amont et de préférence montée à l'intérieur du tube formant gaine 14 Une électrode 48 en aval est de préférence montée dans une chambre éloignée 50, qui est en communication de fluide avec la chambre d'écoulement 28 par le tube 29 Une source de courant à basse fréquence, comprenant le courant continu ou de courant à haute fréquence 52, ou bien les deux, est électriquement couplée auxr électrodes 46 et 48 par des conducteurs électriques 54 et 56 respectivement Tandis que les particules passent par l'ouverture 22, elles modulent le courant électrique afin de produire des impulsions de particule qui sont
détectées par un circuit détecteur conventionnel 58.
Un exemple d'une source de courant 52 et d'un circuit de détection 58 sont montrés dans lesbrevets US 3 710 933,
3 502 974 et 3 502 973.
De préférence, mais pas nécessairement, les canaux 18 et 20 ont une coupe transversale circulaire de 1,27 mm avec la longueur totale de la cellule d'écoulement 16 de 6,35 mm La cellule d'écoulement 16 est formée d'un morceau monolithique de quartz, ce qui permet à la cellule d'écoulement 16 d'être assez petite D'autant plus petite est la dimension de la cellule d'écoulement 16, dlautant meilleure sont les caractéristiques, parce que la cellule d'écoulement s'approche d'une source ponctuelle pour les signaux optiques La coupe transversalec l'overture 22 de détection de particule s'approche de préférence d'un carré Comme on le peut le voir dans l'agrandissement de la figure 2, les extrémités des canaux 18 et 20 présentent des surfaces sphériques 62 et 64, chacune étant interrompue par 1 touverture 22 En prévoyant des extrémités arrondies pour les trous, l'ouverture 22 n'a pas à être localiséeavec précision Les surfaces extérieures sont plates et parallèles aux parois de l'ouverture 22 Typiquement, l'ouverture 22 a des parois ayant des longueurs de 50 à 100 p De préférence, l'ouverture 22, l'orifice de sortie 26 et les canaux 18 et 20 sont coaxialement alignés Les dimensions et configurations ci- dessus décrites dans ce paragraphe sont simplement données à titre d'exemple et peuvent
prendre d'autresformesat dimensions.
Bien que le dispositif soit utilisé principalement pour l'étude des cellules, il sapplique également à
d'autres sortes de particules.
Claims (5)
1 Dispositif d'analyse de particules pour étudier des particules en suspension, ledit dispositif comprenant une cellule d'écoulement ayant une ouverture de détection des particules, par laquelle passe un courant de particules en suspension, ladite cellule d'écoulement ayant un canal en amont et un canal en aval, ladite ouverture de détection desparticules étant placée entre eux et étant la seule connexion de fluide entre lesdits canaux, et un moyen de sortie placé proche de l'extrémité en aval dudit canal en aval, caractérisé par unmoyen d'introduction de liquide ( 32) construit et placé en aval de l'extrémité enaval du canal en aval ( 20) et fonctionnant pour introduire du liquide ( 23 B) qui s'écoule à la fois dans ledit moyen de sortie ( 24, 26) ainsi que vers l'ouverture ( 22) de détection de particules qui est placée en amont, pour focaliser hydrodynamiquement le courant des particules tandis qu'il s'écoule versle
bas à partir de ladite ouverture de détection des parti-
cules vers ledit moyen de sortie.
2 Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que le moyen précité d'introduction du liquide ( 31, 32) est construit et agencé par rapport au courant des particules afin d'introduire le liquide d'une façon
non concentrique.
3 Dispositif selon 1 tune quelconque dezimv 3 sicioris 1 au 2, caractérisé en ce que le moyen d'introduction du liquide ( 30, 31, 32) est construit et agencé par rapport au courant des particules de façon que-le liquide entre dans la cellule d'écoulement précitée à peu près à angle
droit avec le courant des particules.
4 Dispositif selon l'une quelconque des revendications
précédentes, du type comprenant de plus: un moyen d'é-
clairement pour produire un rayonnement pour éclairer les particules dans ladite ouverture de détection des particules, caractérisé en ce que ledit moyen d'éclairement ( 42) et son rayonnement sont orientés et placés sensiblement
éloignés dudit moyen d'introduction du liquide ( 32).
Dispositif selon l'une quelconque des revendica- tions précédentes, caractérisé en ce que le moyen précité d'introduction du liquide ( 32) est placé proche du moyen de sortie ( 26) précité et ledit moyen de sortie comprend une tubulure ( 24)ayant un orifice de sortie ( 26) pour éjecter le courant des particules sous forme
d'un jet liquide ( 34), de ladite tubulure.
6 Dispositif selon la revendication 5, caractérisé par un moyen de perturbation ( 36) pour perturber périodiquement le jet liquide ( 34) afin de produire des gouttelettes contenant des particules et un moyen de triage ( 60) pour trier lesdites gouttelettes, ledit moyen de triage étant contr 8 le par des signaux produits lorsque les particules traversent ladite ouverture de
détection des particules ( 22).
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