NL8301045A - Deeltjesanalyse- en -sorteerinrichting. - Google Patents

Description

-1- 23075/JF/tj

I I

Korte aanduiding: Deeltjesanalyse- en -sorteerinrichting.

De uitvinding heeft betrekking op een deeltjesanalyse-inrichting voor het bestuderen van deeltjes in suspensie, welke inrichting is voorzien van j 5 een stromingscel met een deeltjesaftastopening, waardoor een stroom van deeltjes in suspensie wordt doorgelaten, welke stromingscel een bovenstrooms kanaal en een benedenstrooms kanaal heeft, waarbij de deeltjesaftastopening daartussen is gepositioneerd en de enige fluXdumverbinding tussen de kana- j len is en een uitgangsorgaan dat in de nabijheid van het benedenstroomse 10 einde van het benedenstroomse kanaal is gepositioneerd. j

De uitvinding heeft in het algemeen betrekking op een deeltjesanalyse- | en- sorteerinrichtingen en betreft in het bijzonder inrichtingen, waarin studies kunnen worden uitgevoerd met betrekking tot deeltjessystemen, waar- j bij gebruik wordt gemaakt van het impedantie-aftastprincipe en optische me- j ! 15 tingen.

Sinds de conceptie ervan in de vroege- vijftiger jaren, heeft het principe van het deeltjestellen en-sorteren, uitgevonden door Wallace H. Coulter geresulteerd in talrijke werkwijzen en doorstroominrichtingen voor het elec-tronische tellen, sorteren en analyseren van microscopische deeltjes, die 20 worden afgestast in een fluldumsuspensie, zoals getoond door het Amerikaanse basisoctrooischrift 2.656.508 ten name van Coulter. In deze inrichting j volgens de stand van de techniek wordt een electrische gelijkstroom tot j

stand gebracht tussen twee vaten door het ophangen van electroden in de res- I

pectieve lichamen van het suspensiefluldum. De enige fluXdumverbinding tus-25 sen twee lichamen is via een opening; derhalve worden een electrische stroom en een electrisoh veld tot stand gebracht in de opening. De opening en het resulterende electrische veld in en rondom de opening vormen een aftastzone.

Terwijl elk deeltje passeert door de aftastzone zal voor de duur van de doorgang de impedantie van de inhoud van de aftastzone veranderen, waardoor de 30 stroom en het electrische veld in de aftastzone worden gemoduleerd en de opwekking tot gevolg hebben van een signaal, dat wordt toegevoerd naar een detector, die op geschikte wijze is ingericht voor het reageren op dergelijke veranderingen.

Voor vele toepassingen van geautomatiseerde, doorstromings-deeltjes-ana-35 lysatoren,is het niet mogelijk alleen maar een klein aantal deeltjesbeschrij-vers te gebruiken voor identificatie van elk type cel, dat aanwezig is in een heterogedispergeerde celpopulatie van een monster. Thans meten vele stromingssystemen fluorescentie, lichtverstrooiing en electronisch ce]- 8301045 ............ -...............................-........- - -.........

-2- 23075/JF/tj volume (impedantie-aftasting), Daarnaast zijn er doorstromings-deeltjes-analysatoren ontwikkeld, waarbij de deeltjes in vloeistofdruppels’ zijn gepositioneerd en de druppels worden gesorteerd aan de hand van de hierboven beschreven metingen. Dergelijke sorterende deelt'jesanalysatoren zijn ge-5 toond in het Amerikaanse octrooischrift 3.710.933 ten name van Fulwyler et al. en in een artikel getiteld "A Volume-Activated Cell Sorter”, The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, door E. Menke et al; Vol. 25, biz. 796-803, 1977.

De belangrijkste ontwerpproblemen worden veroorzaakt door het ge-10 bruik van zowel optische metingen als impedantiemetingen in de sorterende deeltjesanalysatoren. De hierboven beschreven sorterende deeltjesana. -lysatoren van de stand van de techniek voeren de electronische cel-volumemetingen uit voorafgaand aan de optische metingen, waardoor hèt mogelijk wordt twee typen metingen te correleren. Dit correlatieprobleem is niet 15 beduidend bij zeer langzame deeltjesstroomsnelheden; bij hoge deeltjesstroomsnelheden echter is het mogelijk dat de gedetecteerde signalen door elkaar worden gegooid door artifacten zoals samenstellen van cellen, die uit elkaar trekken nadat deze een volumeaftastende opening zijn doorkruist, zodat deze afzonderlijk naar de optische aftastzone bewegen,de aanwezigheid van niet 20 fluoresserende deeltjes en de mogelijkheid van twee naburige cellen, die van positie wisselen in de vloeiende stroom. Daarnaast vereist dit het gebruik van speciale schakelingen voor het compenseren van de tijdsvertaging tussen het optische en electronische signaal voor een gegeven deeltje.

Wanneer het sorteren niet wordt gebruikt, is er een gecombineerde 25 electro-optische deeltjesanalysator ontwikkeld, waarin alle metingen tegelijkertijd worden uitgevoerd, waardoor de complexiteit en onzekerheid van het correleren van gegevens verkregen van sequentiële metingen wordt geëlimineerd. Deze electro-optische deeltjesanalysator is beschreven in een artikel getiteld "Combined Optical and Electronic Analysis of Cells with 30 AMAC Transducers", door Thomas et al., gepubliceerd in The Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol. 25, No. 7, (1977) biz. 827-835.

Deze multiparameter-deeltjesanalysator maakt gebruik van een rechthoekige aftastopening, waarin alle parameters tegelijkertijd worden gemeten. De rechthoekige opening is opgesloten in het inwendige van een kubus, 35 gevormd door het aan elkaar hechten van vier pyramiden.

De onderhavige uitvinding is gericht op een gecombineerde electro-optische deeltjesanalyse -en-sorteerinrichting, waarbij zowel optische als electrische impedantie-(electronisch volume) metingen tegelijkertijd worden * -3- 23075/JF/tj é uitgevoerd met betrekking tot een deeltjesstroom, die passeert door een deeltjesaftastopening. De stromingscel heeft een tweetal kanalen, een bo-venstrooms kanaal en benedenstrooms kanaal, die openingen bepalen aan tegenovergestelde einden ervan, waarbij de deeltjesaftastopening de twee 5 kanalen vloeiend verbindt.

De uitvinding voorziet in een inrichting van de in de aanhef genoemde soort, die het kenmerk heeft, dat deze verder een vloeistofinbreng-orgaan omvat, dat benedenstrooms van het benedenstroomse einde van het be-nedenstroomse kanaal is vervaardigd en gepositioneerd en werkzaam is voor 1° het inbrengen van vloeistof, die stroomt zowel in het uitgangsorgaan alsmede naar de bovenstroomse gepositioneerde deeltjesaftastopening voor het hydrodynamisch focusseren van de deeltjesstroom, terwijl deze benedenstrooms van de deeltjesaftastopening in het uitgangsorgaan stroomt.

De verbetering in de inrichting omvat het monteren van een straal-15 stuk, dat een uitgangsopening bevat aan het einde van het benedenstroomse kanaal, zodat een vloeistof gevulde stromingskamer wordt bepaald. Een man-telvloeistof wordt verschaft aan het benedeneinde van de stromingskamer teneinde te voorzien in een mantel voor de deeltjesstroom over de totale lengte van de stromingskamer met een kleine diameter, waardoor ruimte in 20 de stromingscel wordt gelaten,grenzend aan het boveneinde van het benedenstroomse kanaal voor het verlichten van de deeltjes en het verzamelen van licht daarvan. Dankzij dit ontwerp wordt de deeltjesstroom hydrodynamisch gefocusseerd wanneer deze voortgaat naar de uitgangsopening en wordt daarna een deel van een vloeistofstraal. De vloeistofstraal wordt op gebruike-25 lijke wijze opgebroken in een aantal druppeltjes, die worden geladen en gesorteerd, op basis van.de hierboven beschreven signalen.

Tot nu toe is druppeltjes sorteren nooit vervat geweest in een electro-optische inrichting, waarin electrische impedantie-en optische metingen tegelijkertijd worden uitgevoerd. Bovendien is gevonden dat ondanks 30 het kleine volume van de stromingskamer, hydronamisch focusseren van de deeltjesstroom door een vloeistoftaantel tot stand kon worden gebracht door het inbrengen van de mantelvloeistof in de bodem van de benedenstroomse opening en daardoor geen bezwaar te zijn voor de optische inrichting.

Slechts bij wijze van voorbeeld zullen nu illustratieve uitvoerings-35 vormen van de uitvinding worden beschreven onder verwijzing naar de bij- 8301045 -4- 23075/JF/tj behorende tekening, waarin: fig. 1 gedeeltelijk een dwarsdoorsnede-aanzicht en gedeeltelijk een blokschema toont van een deeltjesanalyse- en-sorteerinrichting volgens de uitvinding; en 5 fig. 2 een dwarsdoorsnede-aanzicht van het gebied van de aftast- opening van de stromingscel van fig. 1 op vergrote schaal is.

Fig. 1 toont een doorstromings-, deeltjesanalyse- en -sorteerin-richting 10 met een monsterinbrengbuis 12, een mantelbuis 14, die coaxiaal met betrekking tot de buis 12 en deze omgevend is gepositioneerd en een 10 optisch doorzichtige doorstromingscel 16, gepositioneerd aan het einde van de buis 12. De stromingscel 16 heeft daarin gevormd een tweetal tegenover elkaar liggende boringen of kanalen 18 en 20 en een microscopische aftast-opening 22, die een fluldumdoorlaat vormt tussen de einden van de kanalen.

De opening 22 bepaalt een deeltjesaftastzone, die hierna zal worden be-15 schreven. Een vloeistofstroom van afzonderlijk gesuspendeerde deeltjes, die afkomstig zijn van een onder druk gebracht reservoir 23A, beweegt zich voort door de buis 12. Een zoute laminaire vloeistofmantel, die afkomstig is van een ander onder druk gebrachte reservoir 23B, schrijdt voor door de buis 14, teneinde de deeltjesstroom te omgeven. Wanneer de vloeistofdeel-20 tjesstroom uit de buis 12 komt en het eerste kanaal 18 binnentreedt, vermindert de hydrodynamische druk de diameter van de deeltjesstroom naarmate de stroom de snelheid van de vloeistofmantel verkrijgt. De vloeistofmantel werkt eveneens voor het centreren van de deeltjesstroom, zodat de deeltjes door de opening 22 passeren. Na de opening 22 verlaten te hebben, treden 25 de deeltjes het tweede kanaal 20 van de stromingscel 16 binnen.

Verschillende inrichtingscomponenten worden ondersteund door een cilindrisch gestel 25. Een straalstuk 24 met een uitgangsopening 26 daarin gevormd,is gemonteerd aan het einde van de stromingscel 16, zodat het straalstuk 24 en het tweede kanaal 20 een vloeistof gevulde stromingskamer 28 be-30 palen. Een buis 29 is gekoppeld met het gestel 25 door een leidingbevesti-ging 30. Een tweede mantelvloeistof wordt gevoed via de buis 29 naar een vloeistofholte 31, die in fluidumverbinding staat met drie inlaatopeningen 32, die zijn gevormd in de wand van de stromingscel 16. Vanwege de drukval, die is geassocieerd met de opening 22 is het noodzakelijk de tweede mantel-35 .vloeistof in te brengen in de stromingskamer 28, teneinde een tweede mantel tot stand te brengen met voldoende hydrodynamische druk om de deeltjes te laten passeren door de stromingskamer 28 en uit de uitgangsopening 26.

In tegenstelling tot andere ontwerpen volgens de stand van de

---- . - I

. Λ -5- 23075/JF/tj techniek wordt de tweede vloeistofmantel ingebracht aan het benedengedeelte van de stromingskamer 28, hetgeen resulteert in de voordelen met betrekking tot optische verlichting en verzameling, die hierna zullen worden beschreven. In het bijzonder treedt de mantelvloeistof het tweede ka-5 naai 20 binnen door middel van het aantal inlaatopeningen 32, die zijn gepositioneerd op plaatsen die een aanzienlijke afstand beneden en bene- i denstrooms van de aftastopening 22 zijn gepositioneerd. Bovendien wordt j de tweede mantelvloeistof op een niet-concentrische manier met betrekking j tot de deeltjesstroom,die de aftastopening 22 verlaat,ingebracht en wordt 10 in een relatief klein inwendig volume van het tweede kanaal 20 geïnjecteerd. Ondanks het geringe volume van het tweede kanaal 20 en de niet-concentrische inbreng van de tweede vloeistoftaantel aan de bodem van het i tweede kanaal 20 is gebleken dat een gedeelte van de tweede mantelvloeistof Mde heuvel 0?" loopt, teneinde de deeltjesstroom, die de aftastope-15 ning 22 verlaat te vangen, terwijl een gedeelte van de tweede mantelvloeistof onmiddellijk naar de uitgangsopening 26 en alle punten daartussen j gaat. Op deze wijze wordt er een goede hydrodynamische focussering van de deeltjesstroom door de stromingskamer 28 tot stand gebracht, waardoor j de stroom de uitgangsopening 26 kan verlaten. In de voorkeursuitvoerings- j 20 vorm zijn drie inlaatopeningen 32 getoond. Het dient echter te worden begrepen dat het aantal openingen 32 louter een kwestie van ontwerpkeuze is en men zal inzien dat ofschoon afhankelijk van de diameter ervan het gemakkelijk is meer dan een opening te hebben, teneinde reinigen en doorspoelen van de stromingskamer 28 mogelijk te maken.

i 25 De inrichtingscomponenten, die schematisch in blokvorm zijn ge toond, zijn die welke normaal bestaan in een gebruikelijke deeltjesanalyse-en-sorteerinrichting,waarnaar soms wordt verwezen als een stromingscytorae-trische sorteerinrichting. Alleen die componenten van de deeltjesanalyse-én-sorteerinrichting 10 zijn getoond, die noodzakelijk zijn voor toelich-30 ten van de werking van de onderhavige uitvinding.

Op een gebruikelijke wijze wordt trillingsenergie overgebracht op j de vloeistofstraal 34, die treedt uit de uitgangsopening 26 door een tril- j lingsorgaan 36. Als één mogelijkheid kan het trillingsorgaan 36 een piëzo-electrisch kristal omvatten.De stromingscel is gemonteerd aan en wordt ge-35 dragen door een piëzo-electrisch kristal, dat de stromingscel 16 doet trillen met een hoge frequentie. De exacte frequentie waarop de cel 16 trilt is afhankelijk van de gekozen diameter van de uitgangsopening 26. Deze trillingen veroorzaken kleine verstoringen, gebruikelijk golvingen, op 8301045 ♦ -6- 23075/JF/tj het oppervlak van de straal 34 die aangroeien, vanwege het bekende opper-vlaktespanningseffect en knijpen eventueel de straal af op het afbreek-punt 38 in goed gedefinieerde druppeltjes 40. De diameter van de uitgangs-opening 26, de snelheid van de vloeistofstraal 34 en de verdunning van de 5 deeltjessuspensie worden alle vooraf bepaald, zodat er normaal nooit meer dan een cel in een gegeven druppeltje 40 aanwezig is.

Door middel van een gebruikelijke sorteerinrichting 60 worden de gekozen druppeltjes 40 geladen door bijvoorbeeld een laadkraag met daaraan een spanning toegevoerd; Andere druppeltjes worden niet geladen. De sor-10 teerinrichting 60 is eveneens voorzien van een tweetal afbuigplaten, waartussen een electrisch potentiaalverschil wordt aangelegd. Terwijl de druppeltjes de platen passeren, worden de geladen druppeltjes afgebogen in het electrische veld, waardoor de geladen druppeltjes kunnen worden gescheiden van de niet-geladen druppeltjes. De beslissing en gegeven druppeltje te 15 laden is gebaseerd op de hiervoor beschreven optische en impedantieme-tingen van de deeltjes, die zijn vervat in dat druppeltje. De hierboven gegeven beschrijving van het druppeltjes vormen en druppeltjes sorteren wordt slechts kort gegeven, aangezien dit gedeelte van de inrichting 10 bekend in de techniek is.

20 In de stromingscel 16 wordt de deeltjessuspensie op een gebruikelij ke wijze verlicht, terwijl de deeltjessuspensie passeert door de aftast-opening 22,door een lichtbundel, waarin wordt voorzien door een verlich-tingsbron 42, bijvoorbeeld een laser. De responsie van het deeltje in de monstersuspensie op de verlichting, kenmerkend lichtverstrooiing,fluor-25 escentie of absorbtie, wordt gedetecteerd door een optische detectorin-richting 44. Zoals bekend in de techniek zijn er talrijke verlichtings-en lichtverzamelingsinrichtingen, die kunnen worden gebruikt met de stromingscel 16.Door het in hoofdzaak positioneren van de inlaatopening 32 benedenstrooms van de opening 22 volgens de onderhavige uitvinding zijn de 30 openingen 32 echter niet bezwarend voor de lichtverlichting en-verzame-ling; zodat grote ruimtehoeken van lichtverlichting en-verzameling mogelijk zijn.

De aftastopening 22 dient niet alleen als een optische aftastzone zoals hierboven beschreven maar dient eveneens als een electronische vo-35 lume-aftastzone, volgens het principe van Wallace Coulter, zoals hierbeneden zal worden beschreven. In het inwendige van de mantelbuis 14 wordt bij voorkeur een bovenstroomse electrode 26 gemonteerd. Een benedenstroom-se electrode 48 wordt bij voorkeur gemonteerd in een kamer op afstand 50, 8301045 t -7- 23075/JF/tj die in fluldumverbinding staat met de stromingskamer 28 door middel van een buis 29. Een laagfrequente stroom-,inclusief gelijkstroom, of hoogfrequente stroombron ,52 of beide is zijn electrisch gekoppeld met de electrodes 46 en 48 door middel van electrische geleiders respectievelijk 54 5 en 56. Terwijl de deeltjes door de opening 22 passeren, moduleren deze deeltjes de stroom zo dat deze deeltjes pulsen opwekken, die worden gedetecteerd door conventionele detectorschakeling 58. Een illustratieve stroombron 52 en detectieschakeling 58 zijn getoond in de Amerikaanse oc-trooischriften 3.710.933, 3.502.974 en 3.502.973.

10 kanalen 18 en 20 hebben bij voorkeur, maar niet noodzakelijk, een cirkelvormige dwarsdoorsnede van 0,05 inch met de totale lengte van j de stromingscel 16 0,25 inch zijnd.De stromingscel 16 is gevormd uit een monolithisch stuk kwarts, waardoor de stromingscel 16 klein kan zijn.

Des te kleiner de grootte van de stromingscel 16, des te beter de opti-15 sche karakteristieken hiervan, aangezien de stromingscel een puntbron voor de optische signalen benadert. De dwarsdoorsnede van de deeltjesaf-tastopening 22 benadert bij voorkeur een rechthoek. Zoals te zien in de verdere vergroting van fig. 2 zijn de einden van de kanalen 18 en 20 gevormd met bolle oppervlakken 62 en 64, die elk zijn onderbroken door de 20 opening 22. Door het aanbrengen van de ronde einden voor de boringen, j hoeft de opening 22 niet nauwkeurig te zijn geplaatst. De buitenoppervlakken zijn vlak en parallel aan de wanden van de opening 22. Kenmerkend heeft de opening 22 wanden met lengten van 50 tot 100 micrometer. Bij voorkeur liggen de opening 22, de uitgangsopening 26 en de kanalen 18 en 25 20 coaxiaal in lijn. De boven beschreven afmetingen en configuraties be schreven in deze alinea zijn louter illustratief en kunnen andere vormen en grootten aannemen.

Ofschoon de inrichting primair wordt gebruikt voor het bestuderen van cellen is deze gelijkelijk toepasbaar op andere soorten deeltjes.

30 Ofschoon bepaalde uitvoeringsvormen van de uitvinding zijn getoond en beschreven hierin, is het daardoor geen bedoeling de uitvinding tot de details van dergelijke uitvoeringsvormen te beperken. In tegendeel, de bedoeling is alle modificaties, alternatieven, uitvoeringsvormen,gebruiken en equivalenten van de onderhavige uitvinding te laten vallen binnen de geest 35 en strekking van de uitvinding, beschrijving en de aangehechte conclusies.

8301045

Claims (6)

1. Deeltjesanalyse-inrichting voor het bestuderen van deeltjes in suspensie, welke inrichting is voorzien van een stromingsoel met een 5 deeltjesaftastopening, waardoor een stroom van deeltjes in suspensie wordt doorgelaten, welke stromingsoel een bovenstrooms kanaal en een benedenstrooms kanaal heeft, waarbij de deeltjesaftastopening daartussen is gepositioneerd en de enige fluldumverbinding tussen de kanalen is en een uit-gangsorgaan dat in de nabijheid van het benedenstroomse einde van het be-10 nedenstroomse kanaal is gepositioneerd, met het kenmerk, dat deze verder een vloeistofinbrengorgaan (32) omvat, dat benedenstrooms van het benedenstroomse einde van het benedenstroomse kanaal (20) is vervaardigd en gepositioneerd en werkzaam is voor het inbrengen van vloeistof (23B), die stroomt zowel in het uitgangsorgaan (24, 26), alsmede naar de bovenstroomse geposi- . 15 tioneerde deeltjesaftastopening (22) voor het hydrodynamisch focusseren van de deeltjesstroom, terwijl deze benedenstrooms van de deeltjesaftastopening in het uitgangsorgaan stroomt.

„ 2. Deeltjesanalyse-inrichting volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het vloeistofinbrengorgaan zodanig is vervaardigd (31, 32) en ingericht 20 met betrekking tot de deeltjesstroom, dat de vloeistof op een niet-concen-trische wijze wordt ingebracht.

3. Deeltjesanalyse-inrichting volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het vloeistofinbrengorgaan zodanig is vervaardigd (30, 31, 32) en ingericht met betrekking tot de deeltjesstroom, dat de vloeistof de stro-25 mingscel nagenoeg loodrecht met betrekking tot de deeltjesstroom binnentreedt.

4. Deeltjesanalyse-inrichting volgens een van de conclusies 1, 2 of 3 en verder omvattende een verlichtingsorgaan voor het verschaffen van straling voor het verlichten van deeltjes in de deeltjesaftastopening, met het 30 kenmerk, dat het verlichtingsorgaan (42) en de straling ervan in hoofdzaak op afstand van het vloeistofinbrengorgaan (32) zijn georiënteerd en gepositioneerd.

5. Deeltjesanalyse-inrichting volgens een van de conclusies 1 tot en met 4, met het kenmerk, dat het vloeistofinbrengorgaan (32) in de nabij- 35 heid van het uitgangsorgaan (26) is aangebracht en het uitgangsorgaan is voorzien van een straalstuk (24) met een uitgangsopening (26) voor het tot een straal vormen van de deeltjesstroom als een vloeistofstraal (34) van het straalstuk. 8301045 -9- 23075/JF/tj

6. Deeltjesanalyse-inrichting volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat deze is voorzien van een verstoringsorgaan (36) voor het periodiek verstoren van de vloeistofstraal (34) voor het opwekken van druppeltjes, die de deeltjes bevatten en een sorteerorgaan (60) voor het sorteren van de 5 druppeltjes, welk sorteerorgaan wordt gestuurd door signalen, die worden opgewekt wanneer de deeltjes passeren door de deeltjesaftastopening (22). EINDHOVEN, maart 1983. | ' i 8301045