DE3304785A1 - Kulturbruehe von myxococcus fulvus dsm 2549, wirkstoffextrakt, wirkstoffgemisch, wirkstoffe und herstellungsverfahren - Google Patents

Description

Anmelderin: Gesellschaft für Biotechnologische

Forschung mbH (GBF), Mascheroder Weg 1, 3000 Braunschweig-Stöckheim, BRD

Kulturbrühe von Myxococcus fulvus DSM 2549, Wirkstoffextrakt, Wirkstoffgemisch, Wirkstoffe und Herstellungsverfahren. . - .

Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Kulturbrühe von Myxococcus fulvus DSM 2549, die dadurch erhältlich ist, daß man Myxococcus fulvus DSM 2549 unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralsalze enthaltenden wässrigen Nährmedium bei 15 bis 40 C kultiviert. Vorzugsweise kultiviert man Myxococcus fulvus DSM 2549 bei 25 bis 35 und insbesondere etwa 30 ⁰C.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Wirkstoffextrakt, der dadurch erhältlich ist, daß man

(a) ggf. die Zellen von Myxococcus fulvus DSM 2549 von erfindungsgemäßer Kulturbrühe abtrennt und

(b) die Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht unbegrenzt

—2 —

mischbaren organischen Lösungsmittel oder Adsorberharzen (z.B. Amberlite wie XAD 2, XAD 4, oder ER 180) extrahiert. Vorzugsweise verwendet man für die Stufe (b) Essigsäureethylester als organisches Lösungsmittel.

Gemäß einer weiteren AusfUhrungsform betrifft die Erfindung ein Wirkstoffgemisch, das dadurch erhältlich ist, daß man

(a) einen mit Essigsäureethylester erhaltenen Wirkstoffextrakt zwischen Methanol und Hexan verteilt,

(b) die Methanolphase an vernetzten! Polysaccharid (wie Sephadex LH-20) chromatographiert und

(c) die wirkstoffhaltige Fraktion an Umkehrphasen-Kieselgel mit Methanol/Wasser/Essigsäure chromatographiert.

Ausserdem betrifft die Erfindung zwei Wirkstoffe mit den im folgenden angegebenen Eigenschaften.

Gemäß'weiteren Aus-führungsformen betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung der Kulturbrühe, des Wirkstoffextraktes und des Wirkstoffgemischs mit den vorstehend angegebenen Maßnahmen.

Die beiden Wirkstoffe lassen sich dadurch gewinnen, daß man das erfindungsgemäße Wirkstoffgemisch durch präparative Hochleistungsflüssigchromatographie an Umkehrphasen-Kieselgel ab- und auftrennt und danach die einzelnen Wirkstoffe durch Abdampfen des flüssigen Mediums gewinnt. Vorzugsweise trennt man das flüssige Medium durch Gefriertrocknen ab.

Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Daten anhand von 10 Figuren noch näher erläutert.

A. Produktionsbedingungen

A 1. Produktionsstamm: Das Bakterium Myxococcus fulvus Stamm Mx f50 = DSM 2549, Familie Myxococcaceae, Ordnung

-3-

Myxobacterales, Klasse Flexibacteriae.

A 2. Herkunft des Produktionsstamms: Isoliert im August 1977 von Kaninchenmist, gesammelt in der Umgebung von Calpe, Provinz Alicante, Spanien.

A 3. Beschreibung des Produktionsstamms: Die vegetativen Zellen sind schlanke Stäbchen, 3,5-6 ,um lang und 0,8 ,um dick, mit leicht verjüngten Enden. Auf geeigneten Nährböden, z.B. auf Wasseragar mit Ausstrichen des Bakteriums Escherichia coli, bildet der Organismus rotbraune tropfenförmige weichschleimige Fruchtkörper von rund 200 ,um Durchmesser. In diesen befinden sich kugelige, im Phasenkontrast stark lichtbrechende Myxosporen von 1,2-1,5 ,um Durchmesser. Das Bakterium be wegt sich gleitend fort. Die Kolonien oder Schwärme breiten sich deshalb allmählich über die Kulturplatte . aus. · ' ·

Der Organismus wächst gut auf Peptonagar, z.B. cy-Agar (Casitone, Difco, 0,3 %; Hefeextrakt, Difco, 0,1 %; CaCl₂.2H₂O 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2) oder auf Hefeagar, z.B. vy/2-Agar (Backhefe 0,5 %, bezogen auf Frischgewicht; CaCl₃.2H₃O 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,2). In Flüssigmedien wächst DSM 2549 in homogener Zellsuspension, sowohl in Schüttelkolben (bei etwa 160 Upm), als auch in Bioreaktoren (bis 700 1 getestet). Als Kulturmedium ist z.B. geeignet f50 Pep l.m.: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,6 %; Hefeextrakt, Difco, 0,05 %; MgSO₄^H₃O 0,2 %; CaCl₃.2H₃O 0,04 %; pH 7,2.

DSM 2549 wächst streng aerob. Alle Kulturen wurden bei 30 ⁰C gehalten. Die Generationszeit liegt um 10 Stunden ( ,u = 0,1 Stunden" ). In f50 Pep l.m. erhält man pro

-Χ-'³

Liter 4,5-5,6 g Zellmasse (Feuchtgewicht). DSM 2549 ist auf die Verwertung von Proteinen und Peptonen eingestellt und besitzt Enzyme zum Abbau anderer Mikroorganismen (Bakterien und Hefen).

DSM 2549 läßt eich konservieren: 1. Durch Einfrieren vegetativer Zellen von Platten oder Flüssigkulturen in Pepton-Lö'sung bei -80 ⁰C (mehrere Jahre lebensfähig), 2t Durch trocknen von Fruchtkörpern auf Filterpapier (mehrere Jahre bei Zimmertemperatur lebensfähig). 3. Durch Trocknen von Myxosporen in Milch, Lagerung unter · Stickstoff bei Zimmertemperatur (mehrere Jahre lebensfähig).

BAD ORlGiNAL

■ 'S».

Temei·; ·-Ja&p&r^v&r&p&Pr-H*^^ •r Sciffiffief4efflpey'a£iH^a--ffijefo^^

DSM Z^V3 A 4. Leistungen: Die zellfreien überstände von Flüssigkulturen von -Mx--fO- zeigten antibiotische Aktivität gegen gram-positive Bakterien (z.B. Staphylococcus aureus). Die im folgenden gemachten Angaben gelten jeweils für ein Gemisch

i^A (=ß

aus zwei aktiven Substanzen, die als AB-Mx f50-A}und AB-Mx f50-B)bezeichnet werden. (Myropyt-"»'* A &***.

A 5. Zugänglichkeit des Stamms: Der Produktionsstamm - ist bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen -al Pacnstm-unter Nr. DSM hinterlegt.

A 6. Produktionsbedingungen für die Antibiotika: In Schüttelkolben und Bioreaktoren kann antibiotische Aktivität, gemessen gegen Staphylococcus aureus, schon während

λ λ Au ■ u ,, u ^ u u - /o.D. (623 nm, 1 cm Liciitweg)

der logaithmisehen Wachstumsphase ab einer von etwa 0,6-0,/ nacnge-

wiesen werden. Die maximal erreichbare o.D. beträgt etwa 3. Die höchsten Aktivitäten werden während der spaten logarithmischen Wachstumsphase erreicht. Ό)φ Antibiotika befinde/, sich im Kulturüberstand. ·■ . - · "

Ein typischer Kulturverlauf unter Antibiotikabildung in Schüttelkolben ist im folgenden dargestellt: 1 1 Erlenmeyer Kolben Wurden mit je 200 ml iMedium beschickt. Das Medium enthielt Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,6 %i Hefeextrakt, Difco, 0,1 %; MgSO₄.7H₂O 0,2 %; CaCl₇.2H₂O 0,04 %; pH 7,2. Die Kolben wurden aus einer Vorkultur bis zu einer o.D. ' von

0,175 beimpft. Bei einer o.D. von .0,355 war noch kein Hemmhof zu senen. Die nächste Probe bei einer o.D. von 1,15 ergab im üblichen Plattendiffusionstest gegen Staphylococcus aureus ei nen Hemmhof durchmesser von 9 mm. In den ersten Stunden betrug die Generationszeit (gemessen als Zunahme der o.D.) etwa 10 Stunden. Danach flacht die o.D.-Kurve allmählich ab. Zwischen der 47. und 52. Stunde änderte sich die maximale o.D. von 3 nicht mehr. Die Kultursuspension zeigte dann einen pH von 7,8. Der Hemmhofdurchmesser betrug 14 mm.

Eine typische Fermentation unter Antibiotikabildung verläuft wie folgt: Der Bioreaktor (Firma Giovanola, Manthey, Schweiz, mit ü'mwurfsystern) enthielt 320 f50 Pep l.m. und wurde mit 35 1 aus einem 70 1 Vorfermenter beimpft. Die Luftzufuhr wurde auf 1800 Nl/h, die Drehzahl auf 400 Upm eingestellt. Der pO₂ er-

COPY

reichte zu Beginn der Fermentation 90-95 % Sättigung. Im Verlauf der Fermentation sank der pCL kontinuierlich ab und erreichte nach 30-33 Stunden das Minimum von etwa 40 % SauerstoffSättigung. Dieser Wert blieb etwa 3-4 Stunden lang konstant und stieg danach langsam wieder an. Die Fermentation wurde nach einer Gesamtdauer von etwa 40 Stunden während der Phase des ansteigenden p0₂ abgebrochen, indem die Zellen aus der Kulturbrühe abzentrifugiert wurden. Die End-o.D. betrug 2,5, der End-pH 7,7, der Antibiotikagehalt 10 mg/1 Kulturüberstand. ·

B. Biologische Charakterisierung dey Antibiotikfams- aus

B 1. Wirkungsspektrum: Die reine Komponente A des Antibiotikums wurde zu 2 mg/ml in Methanol gelöst. Diese Lösung wurde stufenweise verdünnt, von jeder Verdünnung wurden 5 pl auf ein Filterblättchen übertragen und die Aktivität im Plattentest anhand des Hemmhofdurchmessers bestimmt. Die Ergebnisse sfnd in Tabelle dargestellt.

Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) wurde das Antibiotikum zu . 100·ug/ml-einem geeigneten Flüssigmedium zugesetzt. Diese Ausgangs!ösung wurde dann in Zweierschritten verdünnt, die einzelnen Röhrchen wurden jeweils mit dem Testorganismus (etwa 10 Zellen/ml) beimpft und 18 Stunden bei 30°£auf einem Schütteltisch inkubiert. Als Medien wurden verwendet:

1. für Bakterien: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,5 % Proteose Pepton, Difco, 0,5 %■; Fleischextrakt, Oxoid, 0,1 %; Agar 1,5 %; pH 7,0.

2. für Hefen und Pilze: Mycophil Ägar (Phytone Pepton, BBL, 1 %; Glucose 1 %; Agar 1,6 %).

Für die Bestimmung der MHK wurden dieselben Medien ohne Agar benutzt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Ferner wurde die MHK für die Komponente des Antibiotikums in FTüssigkultüren für Staphylococcus aureus bestimmt. Sie be trug etwa 0,29 pg/ml.

B 2. Wirkungsweise des Antibiotikums/: Der Einfluß des Antibiotikums auf die DNS-, RNS- und Protein-Synthese wurde bei Staphylococcus aureus anhand des Einbaus

14
von C-markierten Vorstufen dieser Makromoleküle studiert. Durchführung des

Versuchs: Eine Übernachtkultur von Staphylococcus aureus wurde auf eine o.D. (62: nm, lern Licht von 0,1 verdünnt. Medium: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,3 Z; Hefeextrakt, Difco, 0, 05 %; MgSO₄.7H₂O 0,2 %; CaCl₂.2H₂O 0,05 %; pH 7,0. Die verdünnten Kulturen wurden bei 37°<?weiterinkubiert, bis sie eine o.D. von 0,4 erreicht hatten. Dann wurden sie erneut auf eine o.D. von 0,1 verdünnt, 10 Min. inkubiert und darauf die radioaktiven

14 14

Vorstufen zugegeben (jeweils 0,1 iiCi/ml von U- C-Leucin bzw. U- C-Uracil

14
bzw. U- C-Thymidin). Nach weiteren 6 Min. wurden jeweils 3 jug Antibiotikum, reine Komponente A/ml zugegeben. Die Kontrolle erhielt eine entsprechende Menge Methanol. Sofort nach Zugabe des Antibiotikums wurde eine erste Probe entnommen. In Abständen von einigen Minuten wurden weitere Proben entnommen. Jede Probe bestand aus 0,5 ml. Sie v/urde in 2 ml kalte 3 %ige Perchlorsäure gegeben und die entstandene Fällung auf Glasfaserfiltern (Whatman GF/B) gesammelt. Die Filter wurden dann viermal mit 5 ml Perchlorsäure und zweimal mit 4 ml 95 %igem Ethanol gewaschen, getrocknet und die Radioaktivität im Szintillationszähler bestimmt.

14
Ergebnis: 1. Die DNS-Synthese (Efnbau von C-Thymidin) wird nicht beeinflußt-

2. Die Protein- und RNS-Synthese werden beide gehemmt. Nach 40 Min. erreicht der Einbau von Uracil (RNS-Synthese) in Anwesenheit des Antibiotikums nur etwa 10 % des Kontrollwertes (Abb. 2). Die Hemmung der Protein-Synthese (Einbau von C-Leucin) erfolgt langsamer, so daß nach 40 Min. prozentual erheblich mehr Radioaktivität eingebaut ist als bei der RNS-Synthese (Abb. 3). Daraus ist zu schließen, daß Myxopyroniη)unmittelbar die RNS-Synthese hemmt und die Protein-Synthese erst als Folge davon abnimmt.

Zur Bestätigung dieser Aussage wurde ein Hemmtest mit isolierter RNS-Polymerase (aus Escherichia coli· Boehringer, Mannheim) durchgeführt. Das Enzym wurde stark gehemmt. Bei einer Konzentration von 4 jug/ml des Antibiotikums war die halbmaximale Hemmung erreicht. Die Konzentrationsabhängigkeit der Hemmung ist in Abb. 4 dargestellt.

ORIGINAL INSPECTED COPY

Tabelle 1. Das Hemmspektrum von %xo pyron i η 1 {-ein

nt)-

Testorganismus

Gram-positive Bakterien

Durchmesser der Hemmzone im Plattentest bei verschiedenen Antibiotikum-Konzentrationen

jjg/Blättchen

Minimale Hemmkonzentration

jjg/ml

Mycobacterium phlei Corynebacterium medioianum Bacillus megaterium Bacillus subtil is Brevibacterium ammoniagenes Staphylococcus aureus Micrococcus luteus Arthrobacter simplex

O	O	0	0	6
O	9	13	17	50
O	10	13	17
O	0	8	9	1,0
O	0	8	10	12
11	16	19	22	6
O	0	8	10
O	9	10	12

Gram-negative Bakterien Acinetobacter calcoaceticus Agrobacterium tumefaciens Serratia marcescens Salmonella typhimurium Pseudomonas fluorescens Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Escherichia coil Mucor hiemal is

20	24	28
10	16	20
0	0	0
0 ■	0	0
0	0	0

0
0

0
0

0 0

0,8 0,8

>100

>100 >100 >100

Hefen

Candida albicans Schizosaccharomyces pombe Saccharomyces cerevisiae

0
0

0
0

0 0

>100

COPY

EXTRAKT

Der Wirkstoff-Extrakt wird erhalten durch Abtrennen der Zellen von Myxococcus der Kulturbrühe und Extraktion der letzteren mit ainem

organischen Lösungsmittel z.B. Essigester oder mit Hilfe von Adsorfaerharzen Cz.B. Araberlite wie XAD2, XÄD4 oder ER180).

ISOLIERUNG DES WIRKSTOFFGEMISCHES

Das Wirkstoffgemisch wird aus dem Extrakt der Kulturbrühe isoliert durch:

a. Verteilung zwischen Methanol und Hexan

b. Chromatographie der Methanolphase an Sephadex LH-20

c. Chromatographie der das Wirkstoffgemisch enthaltenden Fraktion an Reversed-Phase-Kieselgel mit Methanol/Wasser/Essigsäure.

Auf diese Weise erhält man das zu etwa 90% reine Wirkstoffgemisch!, das ,· zwei Komponenten A und B enthält (HPLC-Oiagramm s. Abb. /). Das Mengenverhältnis der beiden Komponenten variiert von Ansatz zu Ansatz.

Auf Kieselgeldünnschichtplatten können die beiden Wirkstoffe durch Anfärbung mit Joddampf oder Besprühen mit Anisaldehyd-Sprühreagenz (Gelb- bis Blaugraufärbung je nach Konzentration, Temperatur und .Einwirkungsdauer) sichtbar gemacht werden.

Durch präparat!ve HPLC an Reversed-Phase-Kieselgel können die beiden Wirkstoff komponenten getrennt und völlig rein erhalten werden.

CHARAKTERISIERUNG DES WIRKSTOFFES A ·

1. Chromatographisches Verhalten auf KieseTgelplatten:

Laufmittel system . Rf-Wert

0.8

0.9 0.4 0.4

0.2

S"

2. Retentionszeit in der HPLC auf Kieselgel RP-IS (s. Abb. -/): 3.36 min

3. (Massenspektrum:

m/e 417, 374, 342, 255, 233, 219, 175, 149 _c

Elementarzusammensetzung (Hochauflösung): C_o^n^yl0_q

CH9Cl2/Me0H	95:5
EE
Toluol/Aceton	30:20
CH?C12/iPr0H	98:2
Hex/Ac/AcOH	80:20

4. UV-Spektrum:

Lösungsmittel Methanol, X max = 295 nm ( £ = 20 624), 213 nm ( ε = 34 772) (s. Abb//).

5. IR-Spektrum: (s. Abb.^

6. ^-NMR-Spektrum: (s. Abb. ^)

7. ¹³C-NMR-Spektrum:

(X/ppm): 11.8(q), 14.0(q), 17.2(q), 18.4(q), 22.0(t), 28.5(t), 35.8(t), 39.0(d), 43.8(t), 52.6(q), 102,4(s), 102.7(d), 110.8(d), 122.3(d), 125.9(d), '135.4(-S), 137.8(d), 150.5(s), 156.8(s), 165.3(s), 172.5(s), 176.5(s), 199.6(s

8. Drehwert:

[oc]_D = -65.8 Grad, Lösungsmittel Methanol

CHARAKTERISIERUNG DES WIRKSTOFFES B: ■

1. Chromatographisches Verhalten auf Kieselgelplatten: s. Wirkstoff A

2. Retentionszeit in der HPLC auf RP-18 (s. Abb f): 5.72 min

3. Massenspektrum:

m/e 431, 400, 374, 342,-299, 255, 233, 219, 175, Elementarzusammensetzung (Hochauflösung): 024H^₃NOg

4. UV-Spektrum: . ' . .

Lösungsmittel Methanol, 71 _m'_ax ='297 ('£= 20 S13), 213 (£= 28942)

5. IR-Spektrum: (s. Abb: ³J)

6. VNMR-Spektrum: (s. Abb^)

7. ¹³C-NMR-Spektrum: ' ■ ·

(i/ppm, Multiplizität, Lösungsmittel Methanol) 12.4(q), 14.3(q), 17.3(q), 18.2(q)i 23.3(t), 28.4(t), 31.0(t), 35.6(t), 39.0(d), 41.5(t), 52.6(q), 100.8(d), 101.7(s), 110.4(d), 121.8(d), 125.9(d), 134.7(s), 136.8(d), 150.7(s)₅ 156.4(s), 174.4(s), 175.9(s), 199.3(s).

^r COPY

8. Drehwert:

= -74.9 Grad, Lösungsmittel Methanol

BEISPIEL /

Die Aufarbeitung wird am Beispiel eines 320 1 Fermenters erläutert: Die Zellen wurden vom Nährmedium abfiltriert und dieses im Gegenstrom mit Essigester extrahiert. Der Extrakt wurde i. V. eingedampft,-»** MeOH/H^O 98:2 gelöst und mit Hexan extrahiert. Die MeOH-Phase enthielt nach dem Abdampfen des Lösungsmittels 8 g Rohgemisch. Dieses wurde an einer Sephadex LH-20-Säule mit Methanol als Eluens chromatographiert, wobei 4 g biologisch aktives Material erhalten wurde. Dieses Material wurde an einer präparativen RP-8-Säule mit Me0H/H₂0/Eisessig 80:20:4 chromatographiert, wobei 2.5 g ca. 90%iges Wirkstoffgemisch erhalten wurde, das etwa gleiche Mengen der Komponenten A und B enthielt. Zur chemischen und spektroskopischen Charakterisierung und zur Bestimmung der biologischen Daten wurde das Gemisch durch präparative HPLC an 16 mm-RP-18-Säulen mit Me0H/H₂0/Essigsäure 80:20:4 als Eluens aufgetrennt.

BEISPIEL 2 " ·

Der Oberstand eines 320 1 Fermenters wurde durch eine Chromatographiesäule mit 8 1 Amberlite XAD 4 gepumpt, wobei das Antibiotikum quantitativ gebunden wurde. Die Elution erfolgte mit Methanol/Wasser Gemischen (von 1:1 bis reinem Methanol). Antibiotika-haltige Fraktionen wurden im Vakuum eingedampft und das erhaltene Rohgemisch (6 g), wie bei Beispiel 1 beschrieben, durch Chromatographie an LH-20 und RP-8 gereinigt.

EE

IPr OH

Hex

Ac

AcOH

HPLC

cpm

/Ug/ml = mcg/ml cy-Agar
vy/2-Agar
f50 Pep 1 m -Phytone Pepton, BBL

Sephadex LH-20

Kieselgel RP-18 RP- 8

Casitone (Difco) Mycophil Agar, BBL Amberlite XAD 2 Amberlite XAD 4 Amberlite ER 180 Essigsäureethylester

i-Propanol

Hexan

Aceton

Essigsäure

Hochleistüngsflüssigchromatographie

/U Curie

Counts per minute (d.h. Zählerereignisse pro min)

Laborabkürzungen für bestimmte im Text im einzelnen beschriebene Medien, d.h. Eigennamen; 1 m steht für liquid medium _= Flüssigmedium

Beeton, Dickinson and Company, Cockeysville_t Maryland, USA

Firmenangaben beiliegend

Claims (13)

PATENTANSPRÜCHE

1. Kulturbrühe von Myxococcus fulvus DSM 2549, erhältlich durch Kultivieren von Myxococcus fulvus DSM 2549 unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralsalze enthaltenden wässrigen Nährmedium bei 15 bis 40 ⁰C.

2. Kulturbrühe nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sie durch Kultivieren von Myxococcus fulvus DSM 2549 bei 25 bis 35, insbesondere etwa 30
hältlich ist.

C er-

3. Verfahren zur Herstellung einer Kulturbrühe nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß man
Myxococcus fulvus DSM 2549 unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralsalze enthaltenden wässrigen Nährmedium bei 15 bis 40 ⁰C kultiviert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man bei 25 bis 35 und insbesondere etwa 30 ⁰C kultiviert.

-2-

5. Wirkstoffextrakt, dadurch erhältlich, daß man

(a) ggf. die Zellen von Myxococcus fulvus DSM 2549 von gemäß Anspruch 3 oder 4 erhaltener Kulturbrühe abtrennt und

(b) die Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht unbegrenzt mischbaren organischen Lösungsmittel oder Adsorberharzen (z.B. Amberlite wie XAD 2, XAD 4 oder ER 180) extrahiert.

6. Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffextraktes gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß man

(a) ggf. die Zellen von Myxococcus fulvus DSM 2549 von gemäß Anspruch 3 oder 4 erhaltener Kulturbrühe abtrennt und

(b) die Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht unbegrenzt mischbaren organischen Lösungsmittel oder Adsorberharzen (z.B. Amberlite wie XAD 2, XAD 4 oder ER 180) extrahiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeich net, daß man für die Stufe (b) Essigsäureethylester als organisches .Lösungsmittel verwendet..- " .

8. Wirkstoffgemisch, dadurch erhältlich, daß man

(a) einen gemäß Anspruch 7 erhaltenen Wirkstoffextrakt zwischen Methanol und Hexan verteilt,

(b) die Methanolphase an vernetzten! Polysaccharid (wie Sephadex LH-20) chromatographiert und

(c) die wirkstoffhaltige Fraktion an Umkehrphasen-Kieselgel mit Methanol/Wasser/Essigsäure chromatographiert.

9. Verfahren zur Herstellung eines Wirkstoffgemischs gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß man

(a) einen gemäß Anspruch 7 gewonnenen Wirkstoffextrakt zwischen Methanol und Hexan verteilt,

(b) die Methanolphase an vernetztem Polysaccharid (wie Sephadex LH-20) chromatographiert und

-3-

(c) die wirkstoffhaltige Fraktion an Umkehrphasen-Kieselgel mit Methanol/Wasser/Essigsäure chromatographiert.

10. Wirkstoff, gekennzeichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Chromatographisches Verhalten auf Kieselgelplatten Laufmittelsystem Rf-Wert CH₂Cl₂/Me0H (95:5) 0,8 Essigsäureethylester 0,9 Toluol/Aceton (80:20) 0,4 CH₂Cl₂/i-Propanol (98:2) 0,4 Hexan/Aceton/Essigsäure (80:20:4) 0,2

(b) Massenspektrum

rn/e- 417, 374, 342, 255", 233, 219., 175,·.149 Element arzüsammensetzung (Hochauflösung): C„_H„.,N0,-

do öl b

(c) UV-Spektrum (Lösungsmittel Methanol)

lambda max 295 nm (epsilon = 20-624), 213 nm (epsilon = 34 772)

13
(d) C-NMR-Spektrum (Lösungsmittel Methanol; delta/ppm)

, 14,0(q), 17,2(q), 18,4(q), 22,0(t), 28,5(t), 35,8(t), 39,O(d), 43,8(t), 52,6(q), 102,4(s), 102,7(d), 110,8(d), 122,3(d), 125,9(d), 135,4(s), 137,8(d), 150,5(s), 156,8(s), 165,3(s), 172,5(s), 176,5(s)» 199,6(s)

(e) Drehwert (Lösungsmittel Methanol) alpha _D = -65,8 Grad

—4—

11. Wirkstoff, gekennze ichnet durch folgende Eigenschaften:

(a) Chromatographisches Verhalten auf Kieselgelplatten Laufmittelsystem Rf-Wert CH₂Cl₂/MeOH (95^:5) 0,8 Essigsäureethylester 0,9

Toluol/Aceton (80:20) 0,4

CH₂Cl₂/i-Propanol (98:2) 0,4

Hexan/Aceton/Essigsäure (80:20:4) 0,2

(b) Massenspektrum

m/e 431, 400, 374, 342, 299, 255, 233, 219, 175, 149 Elementarzusammensetzung (Hochauflösung): C₂₄H₃₃NO-

(c). UV-Spektrum (Lösungsmittel Methanol)

lambda max =297 (epsilon =20 613), 213 (epsilon = 28 942)

(d) C-NMR-Spektrum (Lösungsmittel Methanol; delta/ppm)

12,4(q), 14,3(q), 17,3(q), 18,2(q), 23,3(t), 28,4(t), 31,0(t), 35,6(t), 39,0(d), 41,5(t), 52,6(q), 100,8(d), 101,7(s), 110,4(d), 121,8(d), 125,9(d), 134,7(s), 136,8(d), 150,7(s), 156,4(s), 174,4(s), 175,9(s), 199,3(s).

(e) Drehwert (Lösungsmittel Methanol) alpha _ß = -74,9 Grad

12ο Verfahren zur Herstellung der Wirkstoffe gemäß den Ansprüchen 11 bis 12, dadurch gekennzeichnet , daß man das Wirkstoffgemisch gemäß Anspruch 8 durch präparative Hochleistungsflüssigchromatographie an Umkehrphasen-Kieselgel ab- und auftrennt und danach die einzelnen Wirkstoffe durch Abdampfen des flüssigen Mediums gewinnt.

-5-

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß man die Wirkstoffe durch Gefriertrocknen gewinnt.