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Kulturbrühe von Myxococcus (Corallococcus) coralloides NCIB
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12063, Wirkstoffextrakt, Wirkstoffgemisch, Wirkstoffe und Herstellungsverfahren.
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Gemäß einer Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Kulturbrühe
von Myxococcus (Corallococcus) coralloides NCIB 12063, die dadurch erhältlich ist,
daß man Myxococcus (C.) coralloides NCIB 12063 unter submersen aeroben Bedingungen
in einem Kohlenstoff und Stickstoff sowie Mineralsalze enthaltenden wässrigen Nährmedium
bei 15 bis 40 0C kultiviert. Vorzugsweise kultiviert man Myxococcus (C.) coralloides
NCIB 12063 bei 25 bis 35 und insbesondere bei etwa 30 °C.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung einen
Wirkstoffextrakt, der dadurch erhältlich ist, daß man (a) ggf. die Zellen von Myxococcus
(C.) coralloides NCIB 12063 von erfindungsgemäßer Kulturbrühe ab trennt und (b)
die Kulturbrühe mit einem mit Wasser nicht unbegrenzt mischbaren organischen Lösungsmittel
extrahiert. Vorzugsweise verwendet man für die Stufe (b) Essigsäureethylester als
organisches Lösungsmittel.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Wirkstoffgemisch,
das dadurch erhältlich ist, daß man (a) einen mit Essigsäureethylester erhaltenen
Wirkstoffextrakt zwischen Methanol und Heptan verteilt, (b) die eingeengte Methanolphase
zwischen Chloroform und Wasser verteilt, (c) die organische Phase einengt und in
Dichlormethan aufnimmt und einer Säulenfiltration unterwirft und (d) das Eluat an
Kieselgel mit Dichlormethan/Heptan als Laufmittel (gepuffert) chromatographiert.
Zur Säulenfiltration kann man beispielsweise Florisil verwenden.
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Außerdem betrifft die Erfindung zwei Wirkstoffe mit den im folgenden
angegebenen Eigenschaften.
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Gemäß weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung Verfahren
zur Herstellung der Kulturbrühe, des Wirkstoffextraktes und des Wirkstoffgemischs
mit den vorstehend angegebenen Maßnahmen.
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Die beiden Wirkstoffe lassen sich dadurch gewinnen, daß man das Wirkstoffgemisch
an Umkehrphasen-Kieselgel trennt und danach die einzelnen Wirkstoffe durch Abdampfen
des flüssigen Mediums gewinnt. Vorzugsweise trennt man das flüssige Medium durch
Gefriertrocknen ab.
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Nachstehend wird die Erfindung durch experimentelle Daten anhand von
5 Figuren noch näher erläutert.
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A. Produktionsbedingungen.
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A 1. Produktionsstamm; Das Bakterium Myxococcus (Corallococcus) coralloides
Stamn Cc c127 = NCIB 12063, Familie Myxococcaceae, Ordnung Myxobacterales, Klasse
Flexibacteriae.
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A 2. Herkunft des Produktionsstamms: Isoliert im April 1980 aus einer
Bodenprobe, gesammelt in der Oase Gabel, Tunesien.
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A 3. Beschreibung des Produktionsstamms: Die vegetativen Zellen sind
schlanke Stäbchen, 3,5 - 6 pm lang und tim 0,8 tjm dick, mit leicht verjüngten Enden.
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Auf geeigneten Nährböden, z.B. auf Wasseragar mit Ausstrichen des
Bakteriums Escherichia coli, bildet der Organismus sogenannte Fruchtkörper, derbe
rötliche Rippen, oft mit kronenartigen Fortsätzen oder korallenfömigen Kämmen, etwa
30 - 50 auf 80 - 150 pm groß. In den Fruchtkörpern befinden sich kugelige, im Phasenkontrast
stark lichtbrechende Myxosporen von 1,3 - 1,5 µm Durchmesser.
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Das Bakterium bewegt sich gleitend fort. Die Kolonien oder Schwärme
breiten sich deshalb allmählich über die Kulturplatte aus. Der Organismus wächst
gut auf Peptonagar, z.B. cy-Agar (Casitone, Difco, 0,3 %; Hefeextrakt, Difco, 0,1
t; CaCl2.2H20 0,1 %; Agar 1,5 t; pH 7,2) oder auf Hefeagar, z.B. vy/2-Aqar (Backhefe
0,5 %, bezogen auf Frischqewicht; CaCl.2H20 0,1 t; Agar 1,5 %; pH 7,2). In Flüssigmedien
wächst NCIB 12063 in homogener Zellsuspension, sowohl in Schüttelkolben (bei etwa
160 Upm), als auch in Bioreaktoren (bis 700 l getestet). Als Kulturmedium ist z.B.
geeignet MD1 l.m.: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,3 %;
MgS04.7H20 0,2 %; CaCl2.2H20 0,05 %; 12063 wächst streng aerob. Alle Kulturen wurden
bei 30 wächst NcIB ærob. C gehalten Die Generationszeit in MD1 l.m. liegt bei etwa
14 Stunden ( = 0,07 Stunden 1).
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Die maximal erreichte optische Dichte (623 nm, 1 cm Weglänge) liegt
dabei um 1,0. NCIB 12063 ist auf die Verwertung von Proteinen und Pepton eingestellt
und besitzt Enzyme zum Abbau anderer Mikroorganismen (Bakterien und Hefen).
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Setzt man dem MD1 l.m. bestimmte Kohlenhydrate in einer Konzentration
von 0,3 % zu, so erhöht sich die optische Dichte im Vergleich zu MD1 l.m. auf etwa
das Doppelte, die Generationszeit sinkt auf etwa 9 Stunden. Geeignete Kohlenhydrate
sind: Maltotriose (Serva), Dextrin 20, Dextrin 15, Dextrin 10
(jeweils
von Serva, Heidelberg), lösliche Stärke, Maisstärke, Amylose, Amylopectin.
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Auch in den folgenden Medien wächst der Stamm unter Antibiotikabildung:
MD1-PL l.m.: gleiche Teile von MD1 l.m. und PL l.m. (PL l.m.: Probion L, Einzellerprotein
der Firma Hoechst 1 %; MgS04.7H20 0,05 %; CaCl2.2H20 0,05 %; pH 7,2).
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Oder Def l.m.: Casamino acids, Difco 0,3 %; MgS04.7H20 0,2 %; CaCl2.2H20
0,06 t; Phosphatpuffer 1 mM pH 7,2; (NH4)2S04 0,06 %; lösliche Stärke 0,3 %; Spurenelementlösung;
Vitaminlösung.
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NCIB 12063 läßt sich konservieren: 1. Durch Einfrieren vegetativer
Zellen von Platten oder Flüssigkulturen in Pepton-Lösung bei -800C(mehrere Jahre
lebensfähig). 2. Durch Trocknen.von Fruchtkörpern auf Filterpapier (mehrere Jahre
bei Zimmertemperatur lebensfähig). 3. Durch Trocknen von Fruchtkörpern in Milch,
Lagerung in zugeschmolzenen Ampullen unter Stickstoff bei Zimmertemperatur (mehrere
Jahre lebensfähig). 4. Durch Einfrieren vegetativer Zellen von Platten oder Flüssigkulturen
in Peptonlösung in flüssigem Stickstoff (mehrere Jahre lebensfähig).
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A 4. Leistungen: Die zellfreien Oberstände von Flüssigkulturen von
NCIB 12063 zeigten antibiotische Aktivität gegen gram-positive Bakterien (z.B. Staphylococcus
aureus). Die antibiotische Aktivität tritt in 2 Komponenten A und B auf. Die im
folgenden gemachten Angaben gelten jeweils für das Gemisch.
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A 5. Zugänglichkeit des Stamms: Der Produktionsstamm ist unter Nr.
NCIB 12063 hinterlegt.
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A 6. Produktionsbedingungen für die Antibiotika: In Schüttelkolben
ist die Aktivität bereits während der logarithmischen Wachstumsphase mit Hilfe des
Agardiffusionstests gegen Staphylococcus aureus nachzuweisen. Die höchste Aktivität
ist in der späten logarithmischen Wachstumsphase bis frühen stationären Phase erreicht.
Danach sinkt sie wieder ab. Nach Erreichen der stationären Phase beginnen die Zellen
bald zu lysieren. In den Kulturen steigt der pH allmählich bis 8,3.
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Typische Fermentationen im Bioreaktor verlaufen wie folgt: 1. Bioreaktor
mit 70 1 Inhalt der Firma Giovanola, Manthey, Schweiz, mit Umwurfsystem. Medium:
Pepton aus Casein, tryptisch verdaut 0,3 %; MgS04.7H20 0,2 %; CaCl2.2H20 0,05 «;
Hefeextrakt, Difco 0,05 %; DH 7,0.
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Der Bioreaktor wird mit 5,4 1 Vorkultur aus Schüttelkolben (15 x
360 ml in 11 Erlenmeyer Kolben) beimpft. Die Luftzufuhr wird auf 400 Nl/h, die Drehzahl
auf 420 Upm eingestellt. Der p02 sinkt im Verlauf der Fermentation ab und erreicht
nach etwa 18 Stunden ungefähr 30 % Sättigung.
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Danach beginnt er langsam zu steigen. Nach weiteren 3 Stunden wird
die Fermentation abgebrochen. Die Bakterien werden aus dem Medium auszentrifugiert.
Die Bakterienmasse beträgt dann 2,3 - 2,8 g Naßgewicht/l. Der nichtrequlierte pH
erreicht einen Wert von 7,8 - 8,0. Der Kulturüberstand gibt im Agardiffusionstest
gegen
innen Hemmhof von etwa 13 mm Durchmesser.
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2. Bioreaktor mit 320 1 Inhalt der Firma Giovanola, Manthey, Schweiz,
mit Umwurfsystem. Medium: Pepton aus Casein, tryptisch verdaut 0,3 %; Maisstärke
0,2 t; MgS04.7H20 0,2 ; CaCl2.2H20 0,05 %; pH 7,0. Der Bioreaktor wird mit 70 1
aus einem Vorfermenter beimpft. Die Luftzufuhr wird auf 1000 Nl/h, die Drehzahl
auf 300 Upm eingestellt. Kurz nach dem Oberimpfen sinkt der p02 auf etwa 60 % Sättigung
ab. Durch Erhöhung der Drehzahl auf 450 Upm erreicht man etwa 70 % Sättigung. Der
Biore - tor wird dann unter konstanten Außenbedingungen betrieben, wobei der p02
im Verlauf von 12 Stunden auf ungefähr 40 % Sättigung abfällt. Dieser Wert bleibt
über rund 11 Stunden konstant. Danach wird die Fermentation abgebrochen.
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Die Bakterienmasse beträgt etwa 4 g Naßgewicht/l, der nichtregulierte
pH erreicht einen Wert von 7.4. der Kulturüberstand eraibt im Aaardiffusionstest
gegen Staph
Hemmhof von ungefähr 15 mm, der Antibiotikagehalt im Oberstand beträgt 1,7 mg/l.
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B. Biologische Charakterisierung der Antibiotika aus NCIB 12063 B
1. Wirkungsspektrum: Die Komponenten A und B des Antibiotikums werden getrennt und
in reiner Form in Methanol gelöst. Die gelösten Antibiotika werden zu
0,5
und 5 pg auf Filterblättchen aufgetragen. Die Aktivität wird im Plattentest anhand
des Hemmhofdurchmessers bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle dargestellt.
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Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK) wurden die beiden
Antibiotika in unterschiedlichen Konzentrationen in Röhrchen gegeben, die mit einem
geeigneten Testmedium beschickt waren und mit etwa 105 Zellen/ml des Testorganismus
beimpft wurden. Die Kulturen wurden 18 Stunden bei 30auf einem Schütteltisch inkubiert.
Die Ergebnisse sind aus Tabelle 2 zu ersehen.
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Als Medien wurden verwendet: 1. Für Bakterien: Pepton aus Casein,
tryptisch verdaut, Merck (Darmstadt) 0,5 %; Proteose Pepton, Difco 0,5 %; Fleischextrakt,
Oxoid 0,1 %; pH 7,0.
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Bei Verwendung für den Plattentest wurde außerdem 1,5 % Agar zugesetzt.
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1. Für Hefen und Pilze: Mycophil Agar (Phytone Pepton, BBL 1 %; Glucose
1 %; bei Verwendung für den Plattentest außerdem 1,6 % Agar).
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B 2. Wirkunasweise der Antibiotika: In Geaenwart der Antibiotika wird
der Einbau von 14C-markierten Vorstufen in Proteine und RNS bei
blockiert. Im Test mit isolierter RNS-Polymerase aus Escherichia coli in vitro wird
die Enzymaktivität durch die Antibiotika gehemmt. Es dürfte sich infolgedessen um
Hemmstoffe der RNS-Polymerase handeln.
Tabelle 1 Testorganismus
Wirkungsspektrum von Komponente A Komponente B Hemmhofdurchm. bei Hemmhofdurchm.
bei 0,5 g 5 ;ig 0,5 pg 5 ig je Blättchen je Blättchen mm mm Gram-positive Bakterien
Arthrobacter simplex 7 12 0 8 Arthrobacter rubellus 0 13 0 12 Micrococcus lysodeikticus
20 30 15 26 Micrococcus luteus 9 16 0 13 Nocardia corallina 7 12 0 12 Nocardia flava
12 24 10 20 Corynebacterium mediolanum 15 30 12 26 Bacillus subtilis 0 10 0 8 Bacillus
thuringiensis 9 15 8 14 Bacillus polymyxa 18 28 16 23 Bacillus megaterium 19 26
16 22 Staphylococcus aureus 17 22 14 20 Brevibacterium ammoniagenes 0 11 0 10 Gram-negative
Bakterien Pseudomonas aeruginosa 0 0 0 0 Pseudomonas acidovorans 0 7 0 7 Rhizobium
meliloti 19 28 14 25 Agrobacterium tumefaciens 13 22 10 19 Serratia marcescens 0
0 0 0 Aerobacter aerogenes 9 15 8 14 Escherichia coli 0 0 0 0 Salmonella thyphimurium
0 0 0 0 Proteus mirabilis 0 0 0 0 Proteus morganii 0 0 0 0 Klebsiella spec. 0 0
0 0 Hefen und Hyphenpilze Saccharomyces cerevisiae 0 0 0 0 Schizosaccharomyces pombe
0 0 0 0 Candida albicans 0 0 0 0 Pichia membranaefaciens 0 0 0 0 Mucor hiemalis
0 O 0 0
Tabelle 2 Minimale Hemmkonzentrationen (MHK) in Flüssigkulturen
Testorganismus Komp. A Komp. 3 MHK in ,ug/ml Staphylococcus aureus 0,195 0,39 Bacillus
subtilis 6,25 12,5 Escherichia coli 125 >125 Pseudomonas aeruginosa 125 >
125 Saccharomyces cerevisiae >125 >125
Isolierung der Corallopyronine
A und 13 Der eingeengte Essigsäureethylesterextrakt eines 250 1 Fermenters (ca.
34 g) wird in je 600 ml Methanol und Heptan verteilt. Die Methanolphase wird noch
zweimal mit ca. 250 ml Heptan ausgeschüttelt. Die eingedampfte Methanol phase (8.3
g) wird in je 500 ml Chloroform und Wasser verteilt. In der organischen Phase verbleiben
6.8 g Rohmaterial, das zur Säulenfiltration in 30 ml'Dichlormethan gelöst und auf
240 g Florisil gegeben wird. Die Säule wird mit je 2,5 1 Dichlormethan und Dichlormethan
mit 1% Essigsäure gespült. Mit 51 Essigsäure in Dichlormethan werden 1.85 g Rohantibiotike
eluiert, die anschließend in drei Chromatographieläufen an Kieselgel (Lobar-Fertigsäulen
(Merck) Si 60, Größe C, Laufmittel Dichlormethan/Heptan/Pufferlösung 55:43:2, Pufferlösung
aus Methanol/ Ameisensäure 1:2 mit Triethylamin auf pH 7 eingestellt, Fluß 14 ml/min,
Detektion: UV-Absorption bei 295 nm) zu 660 mg Antibiotikumkomplex gereinigt werden.
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Die Komponenten werden durch RP-Chromatographie (Lobar-Fertigsäulen
(Merck) RP-8, Größe C, Laufmittel Methanol/Puffer 65:35, Pufferlösung aus 1% Ameisensäure
in Wasser mit Triethylamin auf pH 7 eingestellt, Fluß 9 ml/min) zu 460 mg Corallopyronin
A (1.3 %) und 40 mg Corallopyronin B (0.1 t) getrennt.
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Corallopyronin A HPLC: Retentionszeit 4.11 min (s. Abb. 1) Säule Hibar-Fertigsäule
(Merck) LiChrosorb RP-18 (7 C ), mit Vorsäule, Laufmittel Methanol-Puffer 70:30,
(Puffer aus 1% Ameisensäure in Wasser mit Triethylamin auf pH 7 eingestellt), Fluß
= 1.5 ml/min, Detektion UV-Absorption bei 295 nm.
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[α]D20 t95,80 (c=3.S in Chloroform).
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D UV (Ethanol): ax (IgE) 296 (4.28), 213 nm (4.54); (Ethanol+Salzsäure):
max (1g#) = 307 (4.24), 218 (sh), 209 nm (4.40).
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IR (CHC13) siehe Abb. 2 1H-NMR (400 MHz, Eo41 -Methanol, innerer Standard
MethanolS= 3.35) siehe Abb. 3 13C-NMR (100 MHz, D4 -Methanol, innerer Standard Methanol
S= 49.0): # = 199.4 (s), 176.0(s), 173.3(s), 164.7(s), 156.8(s), 150.2(s), 138.6(s),
137.4(d), 135.4 (s), 130.9(d), 126.5(d), 126.1(d), 126.0(d), 122.3(d), 110.7(d),
102.3(s), 101.9 (d), 69.6(d), 52.6(q)S 39.1(d), 37.9(t), 35.8(t), 34.3(t), 31.4(t),
28.5(t), 18.4 (q), 18.0(q), 17.7(q), 17.4(4), 12.0(q).
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MS (70 eV, Direkteinlaß 1700C, Hauptfragmente über m/e 100): m/e (rel.
Intensität) = 527(12), 509(5), 495(2.5), 491(1.2), 485(3.6), 483(6), 472(16), 465(3),
452(4), 440(5), 434(4), 428(5), 408(22), 390(13), 388(7), 366(15), 353(16), 334(7),
330(11), 313(5), 255(29), 229(35), 215(82), 205(14), 199(13), 186(22), 179(31),
175(92), 161(38), 121(100).
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C30H41NO7 8er. 527.2883 Gef. 527.2887 (MS) 8er. C 68.29 H 7.83 N 2.65
0 21.22 Gef. C 67.46 H 7.83 N 2.67 0 21.9 Corallopyronin B HPLC: Retentionszeit
=5.48 min (s. Abb. 1) Bestimmung wie bei Corallopyronin A [α]D20 = -51.50
(c = 0.6 in Chloroform).
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UV (Ethanol):# # max (1g#) = 295 (4.23), 212 nm (4.56); (Ethanol+Salzsäure)
Stmax (lg E) = 307 (4.19), 218 (sh), 212 nm (4.40).
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IR (Chloroform) s. Abb. 4 1H-NMR (400 MHz ED-Methanol, innerer Standard
Methanol # =3.35) s. Abb. 5 13C-NMR (100 MHz [D4] -Methanol, innerer Standard Methanol
S=49.0) = 199.0(s), 174.8(s), 174.1(s), 164.2(s), 157.8(s), 150.6(s), 138.6(s),
137.5(d), 135.2(s), 133.4(d), 128.7(d), 126.5(d), 126.0(d), 122.2(d), 110.6(d),
102.2(s), 100.8(d), 69.6(d), 52.1(q), 39.2(d), 38.0(t), 35.7(t), 34.3(t), 31.4(t),
28.5(t), 26.5(t), 18.4(q), 17.7(q), 17.4(q), 14.3(q), 12.0(q).
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MS (70 eV, Direkteinlaß 1450C, Hauptfragmente über m/e 100): m/e (rel.
Intensität) = 541(28), 523(11), 505(4), 497(9), 485(7), 472(27), 466(8), 454(4),
448(7), 422(24), 404(16), 388(11), 374(10), 366(22), 353(19), 334(14), 330(19),
323(9), 294(8), 281(7), 271(12), 268(1), 262(9), 255(29), 229(24), 215(72), 207(13),
205 (13), 200(20), 193(20), 175(100), 135(57), 121(18), 105(28).
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l.m. liquid medium = Flüssiamedium PL l.m. Probion L = Einzellerprotein
von ttoechst
| Dextrin 10 Prospekt anliegend |
| 15 |
| 20 |
| cy-Agar |
| vy/2-Agar |
| Casitone, Difco |
| Mycophil Agar |
| Phytone Pepton, BBL |
| Florisil |
| RP- 8 |
| RP-18 |
| Hibar-Fertigsäule |
HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie