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Die Dichtegradienten-Zentrifugation stellt eine wichtige
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analytische und prparative ilethode zur Auftrennung und somit zur
Identifizierung bzw. Gewinnuna von L'inzelko:nponentc.n unter--schiedlicher Auftriebsdichte
bzw. molarer Masse bzw. Sedimentationskoeffizienten dar.
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So beruht z.B. das Prinzip der isopyknischen Dichtegradienten-Zentrifugation
darauf, daß in Gegenwart eines gelösten Stoffen hinreichend großer molarer Masse
unter der Einwirkung eines Zentrifugal feldes ein Dichtegradient ausgebildet wird.
Die maximal erzielbaren Dichteunterschiede hängen exponentiell vom Wert der molaren
Masse des gelösten Stoffes und der Zentrifugalbeschleunigung ab.
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Jedoch ist die maximal erreichbare Dichte einerseits begrenzt durch
die Löslichkeit des gelösten Stoffes am Ort der höchsten Dichte und ist andererseits
umgekehrt proportional dem Wert des partiellen spezifischen Volumens des Dichtegradientenmaterials.
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In der Praxis werden derartige Dichtegradienten entweder präformiert
oder durch Gleichgewichts-Zentrifugation in der Zentrifuge gebildet. Das zu trennende
Stoffgemisch kann entweder vor oder nach der Ausbildung des Dichtegradienten zugegeben
werden. Die Stoffe banden an den Orten die ihrer Auftriebs dichte in der Dichtegradientenkurve
entsprechen.
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Man hat bisher als Dichtegradientenmittel für wässrige Lösungen insbesondere
Cäsiumchlorid und verwandte Verbindungen sowie Sucrose und Metrizamid angewandt.
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Im Hinblick auf das geschilderte Verhältnis zwischen molarer Masse
und Steilheit des Dichtegradienten hat man versucht, Verbindungen mit möglichst
großer molarer Masse anzuwenden.
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Außerdem muß neben guter Löslichkeit der Verbindung ein großer ert
der Dichte erreichbar sein. Da die Einstellung des Sedimentationsgleichgewichtes
wesentlich von der Viskosität der
Lösung abhängt, ist es erforderlich,
daß auch bei hohen Konzentrationen des Dichtegradientenmittels eine möglichst geringe
Viskosität der Lösung vorliegt. Das Cäsiumchlorid mit einer molaren Masse von 168
g/mol erlaubt Dichten bis maximal 2,00 g/cm³ bei Raumtemperatur. In der Absicht,
die molare Masse zu erhöhen und somit steile Dichtegradienten zu erreichen, ist
das Metrizamid {2-(3-Acetamido-5-N-methylacetamido-2,4,6-tri-jodbenzamido)-2-desoxy-D-glukose}
mit einer molaren Masse von 789 g/mol entwickelt worden. Die maximale Dichte beträgt
hierbei 1,45 g/cm3. Die hohe molare Masse-wird bedingt durch den dreifach mit Jod
substituierten Phenylrest und es ist auch dieser Substituent, der dieser Verbindung
eine gewisse Instabilität verleiht. Weitere Nachteile bestehen darin, daß Metrizamidlösungen
dem bakteriellen Abbau unterworfen sind und die Hersteller davor warnen, eine Aufarbeitung
bzw. Rückgewinnung einmal benutzter Lösungen zu versuchen. Metrizamid ist außerordentlich
kostspielig (Dtl 6000.-- bis 8000.-- pro kg), so daß zahlreiche an sich wünschenswerte
Untersuchungen wegen des Kostenfaktors nicht durchgeführt werden können. Cäsiumchlorid
ist zwar wesentlich preiswerter (DM 2000.-- bis 3000.-- pro kg), bedingt aber bei
präparativen Arbeiten immer noch erhebliche Kosten.
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Der Erfindung liegt nun die Aufgabe zugrunde, ein neues Mittel für
die Dichtegradienten-Zentrifugation zu schaffen, das die Nachteile der vorbekannten
Mittel nicht besitzt und insbesondere die folgenden Eigenschaften aufweist: relativ
hohe Molmasse zusammen mit guter Löslichkeit und daraus resultierender hoher Dichte,
sowie niedrige Viskosität bei der hohen Dichte; nicht toxisch, in der Lösung neutral-und
chemisch inert ist.
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Es wurde nun in überraschender eise gefunden, daß diese Aufgabe gelöst
werden kann durch das Anwenden von Alkali- und Lrdalkalimetawolframaten, wie z.B.
Na6(H2W12040) und
Mg3(H2W12040), und zwar gegebenenfalls unter Zusatz
eines niedermolekularen Elektrolyten wie Natriumchlorid bzw.
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Magnesiumchlorid (ternäre Dichtegradienten-Zentrifugation).
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So besitzen Natrium- und Magnesiummetawolframate hohe Löslichkeit
in Wasser. Im Falle des Natriummetawolframates führt ein Massenanteil von etwa 80%
zu einer Dichte von 3,12 g/cm3.
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Die relativ geringe Viskosität der Alkali- und Erdalkalimetawolframate
führt zu einer schnellen Einstellung des Sedimentationsgleichgewichtes. Die Alkali-
und Erdalkalimetawolframate sind die einzig stabilen Polywolframate, die gleichzeitig
in Lösung monomolekular vorliegen, -wobei die Lösungen neutral reagieren und in
einem pH-Bereich von 2 bis 10 aprotisch sind. Metawolframate sind auch in weiteren
hydrophilen Lösnngsmitteln, wie Methanol, löslich.
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Metawolframat-Lösungen neigen zu Übersättigungen, wobei im Falle des
Natrium- und Magnesiummetawolframates bei hoher Rotorfrequenz gearbeitet werden
kann, ohne daß ein Auskristallisieren zu befürchten ist. Metawolframat-Lösungen
sind auch thermisch stabil und autoklavierbar.
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Die Herstellung von Metawolframaten erfolgt in denkbar einfacher gleise
durch Umsetzung- von Wolframtrioxid mit Alkali-bzw. Erdalkalihydroxid. Zur Herstellung
von z.B. Natriummetawolframat legt man eine konzentrierte Natriumhydroxidlösung
vor und setzt derselben unter Rühren eine wässrige Wolframtrioxidsuspension zu.
Nachdem die Suspension einige Stunden 1 Rückfluß gekocht ist, wird filtriert, eingeengt
und auskristallisiert; gegebenenfalls empfiehlt es sich, ein weiteres Umkristallisieren
vorzunehmen, um so einen extrem hohen Reinheitsgrad zu erzielen. Die Alkali- und
Erdalkalimetawolfratnate sind bei Raumtemperatur unbegrenzt haltbar.
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Aufgrund des durch die crfindungsgemäße Anwendung von z.B.
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Natriummetawolframat-Lösungen erzielten steilen Dichtegradienten ist
es möglich, Trennungen bzw. Messungen hochmolekularer Verbindungen, wie Sedipur
(Copolymerisate auf der Grundlage
von Arylamid und Natriumacrylat),
DNS (aus der Thymusdrüse vom Kalb), Immungammaglobulinö(IgG vom Kaninchen), Murein
(Zellmembran von Staphylococcus aureus) usw. mit mittleren Rotorfrequenzen entsprechend
mittleren Zentrifugalbeschleunigungen von 80 000 g durchzuführen.
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Vergleichende Untersuchungen mit Cäsiumchlorid sowie Alkali-und Erdalkalimetawolframat-Lösungen
haben gezeigt, daß Sedipur in einem erheblichenUmfang Cäsium-Ionen bindet, während
Metawolframationen von dieser Substanz praktisch nicht adsorbiert werden. Desgleichen
zeigen Schlierenaufnahmen von Sedipur enthaltenden Lösungen, die sich im Sedimentationsgleichgewicht
befinden, ausgesprochen scharf ausgebildete Peaks in Natriummetawolframat-Lösung,
während dieselben in Cäsiumchlorid-Lösung verschwommen sind. Vermittels der erfindungsgemäßen
Anwendung von Metawolframaten ist es möglich, auch Substanzen mit sehr kleinen Auftriebsdichten
zu untersuchen wobei man durch Anwendung von z.B. Methanol als Lösungsmittel auch
Dichtewerte bis herunter zu 0,8 g/cm³ erreichen kann.
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Untörsuchungen haben gezeigt, das unterschiedliche Proteine su unterschiedlichen
Auftriebsdichten fUhren, was wohl darauf zurückzuführen ist, daß diese Verbindungsgruppe
abhängig von ihrem Ladungszustand Metawolframationen verschieden stark bindet. Somit
kann die Dichtegradienten-Zentrifugation von Proteinen unter erfindungsgemäßer Anwendung
von Metawolframat-Lösungen als präparatives Trennverfahren eingesetzt werden.
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Die Auftriebsdichten von Nukleinsäuren in wässrigen Natriummetawolframat-Lösungen
sind wesentlich kleiner als in Cäsiumchlorid-Lösungen. Hieraus ergibt sich, daß
Nukleinsäuren keine Metawolframationen binden. Aufgrund der hohen Molmasse der Metawolframate
könen Untersuchungen von Nukleinsäuren bei niedrigen Rotorfrequenzen von z.B. 20
000 min-1 durchgeführt werden hierdurch kann nun in wässriger Lösung die Interferenzoptik
der analytischen Ultrasentrituge eingesetzt werden.
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Der F'rfindungsgegeIlstand wird nachfolgend vergleichend mit dem Stand
der Technik erläutert.
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Beispiel 1 Bildung der Dichtegradienten einer wässrigen Natriummetawolframat-Lösung
und einer wässrigen Cäsiumchlorid-Lösung (binäres System) Aufgrund der wesentlich
höheren molaren Masse von z.B. Natriummetawolframat (2986,16 g/mol) sedimentiert
diese Substanz unter sonst gleichen Bedingungen wesentlich stärker. Es bildet sich
somit bei der erfindungsgemäß angewandten Verbindung ein wesentlich steilerer Dichtegradient
aus. Die diesbezüglichen Ergebnisse sind in der Abbildung 1 wiedergegeben, die auf
der Ordinate die Dichte und auf der Abszisse die Fraktionszahl wiedergibt.
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Beispiel 2 Bildung des Dichtegradienten einer wässrigen Natriumchloridhaltigen
Natriummetavsolframat-Lösung (ternäres System).
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Elektrolyte in reinem Wasser als Lösungsmittel sedimentieren aufgrund
ihrer Dissoziation wesentlich geringer als Nichtelektrolyte gleicher molarer Masse.
Der Zusatz eines oder mehrerer Frendelektrolyte bewirkt, sofern der Fremdelektrolyt
eine kleine Molmasse aufweist, näherungsweise ein Sedimentationsverhalten des Elektrolyten
wie dasjenige eines Nlchtelektrolyten gleicher molarer Masse. Dieser Effekt steigt
mit. zunehmender Ladungszahl des schweren Ions des Elektrolyten an. Aufgrund der
hohen Ladungszahl des Metawolframatanions hat somit ein NaCl-Zusatz einen großen
Einfluß auf das Sedimentationsverhalten der erfindungsgemäß angewandten Verbindung.
Die Abbildung 2 zeigt die erhaltenen Werte.
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Beispiel 3 Dichtegradienten-Zentrifugation von Sedipur in wässriger
Natriummetawolframat-Lösung im Vergleich zu einer wässriqen Cäsiumchlorid-Lösung.
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Sedipur ist ein wasserlösliches Copolymerisat aus Acrylamid und Natriumacrylat
und weist eine Molmassenverteilung von 5 x 105 bis 3 x 106 g/mol auf.
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In einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten wird eine relativhohe Auftriebsdichte
von 1,41 g/cm³ erhalten, wobei von einem Anfangsmassenanteil an Cäsiumchlorid von
39% ausgegangen und mit einer Rotorfrequenz von 56.000 min gearbeitet-wird.
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In einem Natriummetawolframat-Dichtegradienten ergibt sich eine Auftriebsdichte
von 1,00 g/cm3 bei einer Rotorfrequenz von 56.000 min , wobei lediglich ein Natriummetawolframat-Massenanteil
von 0,25% benötigt wird. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind in der nachfolgenden
Tabelle I zusammengefaßt: Tabelle I Sedipur in Natrium- Sedipur in Cäsiummetawolframat-Lösung
chlorid-Lösung -1 Rotorfrequenz: 56.000 min 1 56.000 min Massen %: 0,25 39 Temperatur:
25 OC 25 °C Auftriebsdichte: 1,00 g/cm3 1,41 g/cm3 Rotortyp: SW 65 SW 65
Beispiel
4 Vergleich des Sedimentationsverhaltens einer DNS in einem Cäsiumchlorid- und einem
Natriummetawolframat-Dichtegradienten.
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Gemäß Literaturangaben wird in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten
für DNS eine Auftriebsdichte von etwa 1,7 g/cm3 (Rotorfrequenz etwa 50.000 min 1)
gemessen, wobei der Massenanteil von Cäsiumchlorid bei 56% liegt.
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Im Natriummetawolframat-Dichtegradienten wird eine Auftriebsdichte
von 1,046 g/cm³ bei Rotorfrequenzen von nur 20.000 bis 26.000 minze festgestellt,
wobei sich der Massenanteil von Natriummetawolframat auf lediglich 58 beläuft.
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Die Ergebnisse sind in derfolgenden Tabelle II zusammengefaßt.
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Tabelle II DNS (Phagen) in Cäsiurn- DNS (Kalbsthymus) in chlorid-Lösung
Natriummetawolframat-Lösung Rotorfrequenz: 51.000 min-1 20.000 bis 28.000 min-1
Massen t: 56% 5% 3 Auftriebsdichte: 1,699 g/cm@ 1,046 g/cm Temperatur: 25 °C 25
°C Einsatz der Interferenzoptik: nicht möglich möglich Rotortyp: SW 65 SW 65 Die
Abbildung 3 ordnet die maximal erreichbaren Dichten den tiassenanteilen zum einen
der Verbindungen nach dem Stand der Techni]t, und zum anderen der erfindungsgemäß
in Anwendung kommenden Verbindung zu. Hieraus ist eindrucksvoll die erfindungsgemäß
erzielte maximale Dichtezunahme ersichtlich. Die Abbildung 4 gibt ebenfalls vergleichend
zu dem Stand der Technik eine Gegenüberstellung der bei der erfindungsgemäßen Anwendung
erzielten günstigen Viskositätswerte aufgetragen gegen den Gehalt des Dichtegradientenrnittels
wieder.
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Beispiel 5 Vergleich des Sedimentationsverhaltens von einem Immungammaglobulin
(IgG), sowie der Proteinhülle des Poliovirus in einem Cäsiumchlorid- und Natriummetawolframat-Dichtegradienten.
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Untersuchungen von einem Immungammaglobulin (Kaninchen) sowie der
Proteinhülle (Kapsid) des Poliovirus in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten ergeben
Auftriebsdichten von 1,30 g/cm³ bzw.
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1,29 g/cm3.
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Eine Trennung dieses Proteins bzw. Proteinkomplexes ist aufgrund der
fast gleichen partiellen spezifischen Volumina, deren reziproke Größen die Auftriebsdichten
ergeben, in einen Cäsiumchlorid-Dichtegradienten nicht möglich.
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Bei Verwendung eines Natriummetawolframat-Dichtegradienten zeigt sich
hingegen, daß IgG und Viruskapsid völlig unterschiedliche Auftriebsdichten ergeben,
und somit prdparativ zu trennen sind.
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Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle III zusammengestellt.
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Tabelle III Auftriebsdichte in Auftriebsdichte in Na6(H2W12O40) CsCl
IgG: 1,14 g/cm 1,30 g/cm³ Virusprotein: 1,97 g/cm3 1,29 g/cm³ Rotorfrequenz: 30.000
min-1 56.000 min-1/40.000 min Temperatur: 7°C 7°C Das erfindungsgemäße Mittel kann
ganz allgemein bei allen ein schlägigen Verfahrcn Anwendung finden, also für jede
modifizicrte Form der Dichtegradienten-Zentrifugation.