DE3232685A1

DE3232685A1 - Verfahren zur horizontalen ein- und zweidimensionalen elektrophorese in duennen bzw. ultraduennen gelschichten

Info

Publication number: DE3232685A1
Application number: DE19823232685
Authority: DE
Inventors: Reiner Dr. 8050 Freising Westermeier
Original assignee: Individual
Current assignee: WESTERMEIER, REINER, DR., 8039 PUCHHEIM, DE
Priority date: 1982-09-02
Filing date: 1982-09-02
Publication date: 1984-03-15
Also published as: DE3232685C2

Description

Die vòrlieaende Erfindung betrifft ein Verfahren zur
eindimensionalen und zweidimensionalen Elektrophoretischen Auftrennunq von Anionen und Kationen, insbesondere Proteinen, Enzymen und Peptiden in einer dünnen bzw. ultradünnen Gelschicht (aus z.B. Polyacrylamid oder Avarose) in einem horizontalen System.
Bei der Elektrophorese muß zu Beginn eine Konzentrierunq des zu trennenden Protein- bzw, Peptidgemisches erfolgen, um eine optimale Auflösung und Bandenschärfe der getrennten Fraktionen zu erzielen.
Es ist beispielsweise bekannt, zur Konzentrierung der proteine das Prinzin der Diskelektronhorese anzuwenden (Ornstein,L.: Ann.N.Y.Acad.Sci. 121, 321-349 (1964); Davis,B.J.: Ann.N.Y.Acad.Sci. 121, 404-427 (1964)). Es ist weiterhin bekannt, daß bei der horizontal durchgefahrten Elektrophorese in dünnen bzw. ultradünnen Polyacrylamidgelen der Konzentrierunqseffekt auf einfachere Weise erzielt werden kann, indem in ein kontinuierliches Gel bei der Findimensional-Elektrophorese die Proben in kleine Gelwannen einpipettiert werden, bei der Zweidimensional-Elektrophorese die Gelstreifen mit den in der ersten Dimension nach einem unterschiedlichen Trennkriterium getrennten proben in Gelwannen geeigneter Größe eingelegt werden. Die Tiefe dieser Gelwannen darf nicht durch die gesamte Gelschicht gehen, da Löcher im Gel die Trennung stark stören bzw. unmöglich machen würden. Diese Gelwannen können deshalb nicht nachträglich in das polymerisierte Gel eingebracht werden; sie müssen mittels einer Schablone bereits einpolymerisiert sein. Da zur Eindimensional-Eiektrophorese für die einzelnen flüssigen Proben eine Anzahl kleiner Gelwannen, für die Zweidimensional-Elektrophorese jedoch zur Aufnahme der Gelstreifen große Gelwannen benötigt werden, müssen für verschiedenartige Trennprobleme unterschiedliche Arten von Gelformen hergestellt und die Elektrophorese in der jeweils geeigneten Gelmatrix durchgeführt werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Vielzahl der Gelformen für die verschiedenen Anwendungsbereiche zu vermindern und ein Verfahren zur wahlweisen bzw.
gleichzeitigen ein- und zweidimensionalen elektrophoretischen Trennung von Anionen und Kationen, insbesondere Proteinen, Enzymen und peptiden in einer dünnen bzw.
ultradünnen Gelmatrix (aus z.B. nolyacrylamid oder Aqarose) im Horizontalsystem zu schaffen.
Diese Aufgabe wird erfindungsmäßi# dadurch gelöst, daß die Elektrophorese in einer Gelmatrix durchgeführt wird, die so aestaltet ist, daß sie sowohl für eindimensionale als auch zweidimensionale Trennunqen verwendet werden kann.
Eine solche universal einsetzbare Gelmatrix wird in der Form polymerisiert, daß sie eine Kette kleiner Gelwannen und eine große ununterbrochene Gelwanne jeweils über die gesamte Geibreite enthalt, wobei die beiden Wannentypen in Richtung des elektrischen Feldes (Trennrichtung) nebeneinander angeordnet sind. Das Gel kann dabei homogen oder diskontinuierlich polymerisiert sein oder einen Polyacrylamid-Gradienten enthalten, Puffer und/oder Antikörper und/oder Detergentien (z.B. Natriumdodecylsulfat, Lithiumdodecylsulfat) enthalten oder nicht enthalten, auf eine Trägerfolle aufpolymerisiert sein oder nicht aufpolymerisiert sein.
Die mit der erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesoNdere darin, daß in einer vielseitig anwendbaren Gelmatrix wahlweise ein- oder zweidimensionale elektrophoretische Trennverfahren oder beide zugleich durch fahrt werden können. Weiterhin erlaubt es dieses Verfahren, daß in einer solchen Gelmatrix unter optimaler Dlatzausnutzuna eine variable Anzahl an Gelstreifen, deren Länge ebenso variabel sein können, elektrophoretische Trennungen in der zweiten Dimension durchzuführen, da die daffir vorgesehene Gelwanne über die gesamte Gelbreite nicht unterbrochen ist. Vergleichende Untersuchunqen haben gezeigt, daß die Trennergebnisse nicht dadurch beeinflußt werden, daß die Fraktionen durch den Boden der Gelwanne wandern messen. Da die Gelwannen in diesem Horizontalsystem nicht an den Geländern sondern im Inneren der Trenngelfläche angeordnet sind, werden bei Elektrophoresen unter nichtdenaturierenden Bedinaunven Anionen und Kationen in der Gelmatrix gleichzeitig aufgetrennt. Eine solche Gelmatrix ist auch insofern vielseitig einsetzbar, als sie über eine an die positionen der kleinen Gelwannen angepaßte multinle Spritze, u.a. auch in einem automatisierten Verfahren, mit den Proben beschickt werden kann. Da das Verfahren auch in ultradiinnen Gelschichten ((0,5mm)) durchgeführt werden kann, ergeben sich zusätzlich Vorteile hinsichtlich erhöhter Auflösung und stark verkürzter Trenn- undVisualisierungszeiten.
Bin Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens ist schematisch in einer Zeichnung (Fig.1) dargestellt. Fig. 1 zeigt im Grundriß eine öalichkeit einer Form eines solchen Geles. In diesemBeispiel ist die breitere, ununterbrochene Gelwanne (a) (ffir die Gelstreifen der Zweidimensional- Trennungen) auf der Seite der Trennrichtung neben der Kette der Gelwannen (h) (für die flüssigen proben der Eindimensional-Trennunqen) angeordnet. In diesem Fall müssen bei der Eindimensional-Eiektrophorese die Anionen durch den Boden der Gelwanne (a) wandern. Die Positionen + und - zeigen für dieses Beispiel die Elektrodenanordnung an.
Zur Veranschaulichung zeigt Fig. 2 die Photoqraphie eines mit der oben beschriebenen Vorrichtung erzielten Trennersebnisses. Es handelt sich in diesem Fall um eine Natriumdodecylsulfat (SDS)-Elektrophorese verschiedener flroteingemische (eindimensionale Trennungen) und zweier unterschiedlich langer Gelstreifen, die mit isoelektrischer Fokussierung separierte Proteine enthielten (zweidimensionale Trennungen). Das kontinuierlich aufgebaute Gel enthielt in diesem Beispiel einen nolyacrylamid-Gradienten von 10-20 %, war 250 mm breit, 120 mm lang, 0,360 mm dick, und war auf eine nolyesterfolie aufpolymerisiert. Die Tiefe der Gelwannen betrug 0,1 mm.
Die Trennung wurde bei max. 1000 V, max. 35 W, max. 70 mA innerhalb von 90 Minuten durchgeführt. Der Zeitaufwand für die Visualisierung der Proteine betrug 120 Minuten.

Claims

Patentansprüche Verfahren zu eindimensionalen und zweidimensionalen elektrophoretischen Auftrennunq von Anionen und Kationen, insbesondere Proteinen, Enzymen und peptiden in einer dünnen bzw. ultradünnen Gelmatrix (aus z.B. Polyacrylamid oder Aqarose) in einem horizontalen System, d a d u r c h q e k e n n z e i c h n e t , daß dlv Elektrophorese in einer Gelmatrix durchgeführt wird, die so nestalteF ist, daß sie wahlweise für eindimensionale und für zweidimensionale Trennungen bzw. für beide zugleich verwendet werden kann.
2.Gelmatrix zur Durchführunq des Verfahrens nach Anspruch 1 d a d u r c h q e k e n n z e i c h n e t , daß sie in der Form polymerisiert wird, daß sie a) eine Kette kleiner Gelwannen und b) eine große ununterbrochene Gelwanne jeweils über die gesamte Geibreite enthilt, wobei c) die beiden Wannentypen in Pdchtung des elektrischen Feldes (Trennrichtung) nebeneinander angeordnet sind und d) einenGelboden besitzen.
3.Eine vorteilhafte Ausbildunq des Verfahrens nach Anspruch 1 ergibt sich dadurch, daß in der Gelmatrix nach Anspruch 2 Anionen und Kationen zugleich aufgetrennt werden können, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e't , daß die Gelwannen im Inneren der Trennfläche angeordnet sind.
4.Eine vorteilhafte Ausbildung des Verfahrens nach Anspruch 1 ergibt sich dadurch , daß in einer Gelmatrix nach Ansprüchen 2 und 3 sehr hochauflösende und schnelle Trennungen durchgeführt werden können und die Visualisierunqszeit stark reduziert wird d a d u r c h q e k e n n z e i c h n e t , daß die Gelmatrix ultradünn (#O,5 mm) ist.
5.Gießschablone zur Herstellung der Gelmatrix nach Ansprüchen 2, 3, 4 zur Durchführung des Verfahrens nach-Ansruch 1 d a d u r c h q e k e n n z e i c h n e t , daß die Schablone so gestaltet ist, daß in der Gelmatrix nach Ansprüchen 2, 3, 4 bei der Polymerisation bzw.

Erstarrung Gelwannen in der unter Ansprüchen 2 und 3 beschriebenen Anordnung entstehen.
6.Der Probenauftrag kann in einer Gelmatrix nach Ansprüchen 2, 3, 4 u.a. in einem mechanisierten bzw.

automatisierten Verfahren erfolaen, d a d u r c h q e k e n n z e i c h n e t , daß zur Proben auftragung ein multiples Spritzensystem verwendet wird, wobei die Positionen der Füllkammern und Kanülen bzw. Spritzen den Positionen der Gelwannen angepaßt sind.