DE2314964C3 - Verfahren zum Bestimmen von normalen und pathologischen Plasma-Lipoprotein-Mustern in menschlichen Körperflüssigkeiten - Google Patents

Verfahren zum Bestimmen von normalen und pathologischen Plasma-Lipoprotein-Mustern in menschlichen Körperflüssigkeiten

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Description

platte, verwendet, in dem die Entwicklerlösung oder Teile davon bereits enthalten sind.
Zur Bestimmung des anormalen Lipoproteins vom Typ III wird zweckmäßig ebenfalls ein Entwickler verwendet, der Heparin und Magnesium-Ionen und NaCl enthält.
Wenn selektiv das Lipoprotein des Typs III einerseits und die Lipoproteine VLDL, LDL und HDL andererseits bestimmt werden sollen, wird der Träger nacheinander mit verschiedenen Entwicklerlösungen behandelt, von denen die eine Heparin und Magnesium-Ionen und die andere Dextransulfat und Kalzium-Ionen enthält.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die Reagentien zu seiner Durchführung sind in den folgenden Beispielen näher erläutert, wobei die Fig. la bis Id Darstellungen von erfindungsgemäb erhaltenen Plasma-Lipoprotein-Mustern veranschaulichen.
Beispiel 1
Zur Bestimmung der Lipoproteinbanden im menschlichen Serum wurde die Elektrophorese in einem Agarose-Wanderungsmedium, wie von R. P. Noble, I. Lipid Res. 9, 693 (1968) beschrieben, durchgeführt. Es wurde ein Veronalpuffer mit einem pH-Wert von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 verwendet. Nach einstündiger Dauer der Elektrophorese wurde die Schablone dem Apparat entnommen und in ein Entwicklungsbad gegeben, das aus O,55ft/o Dextransulfat 2000 und 2,2°/0iger wäßriger Kalzium-Chloridlösung bestand. Der Träger wurde 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur im Bad belassen. In dieser Zeit kam es zu einer kompletten Präzipitation der folgenden Lipoproteinbanden:
Chylomikronen
/^-Lipoproteine
Prä-/?-Lipoproteine
a-Lipoproteine,
die in F i g. la der Reihe nach mit 1, 2, 3 und 4 bezeichnet sind.
Beispiel 2
In gleicher Weise wie in Beispiel 1 wurde zur Bestimmung der Hyperlipoproteinämie Typ III menschliches Serum auf einer Agarschablone in einem Veronalpuffer mit einem pH-Wert von 8,6 und einer Ionenstärke von 0,05 der Elektrophorese unterworfen. Nach einstündiger Dauer der Elektrophorese wurde die Schablone entnommen und in ein Entwicklungsbad gegeben, welches aus 0,25% Heparin und Ü,95%igem Magnesiumchlorid in 0,95%iger wäßriger NaCl-Lösung bestand und 20 min im Bad belassen. Die Präzipitation des für Typ IH charakteristischen Felds VLDL war deutlich erkennbar und ist in F i g. Ib mit 5 bezeichnet. Das Feld reicht von der /ϊ-Position 2 bis zur Prä-/?-Position 3.
B e i s ρ i e 1 3
Zur Bestimmung von LP-X-Lipoprotein wurden vier Proben von menschlichem Serum in vier Löcher eines mit einer Agarplatte beschichteten Objektträgers eingebracht und der Objektträger mittels Filterpapier mit einer Veronalpuffer-Lösung verbunden, die einen pH-Wert von 8,6 und eine Ionenstärke von 0,05 aufwies. Die so vorbereiteten Proben wurden der Elektrophorese unterworfen. Nach halbstündiger Dauer der Elektrophorese wurde der Objektträger entnommen und in ein Entwicklungsbad gegeben, welches aus 0,25% Heparin und 0,95%igem Magnesiumchlorid in 0,9%iger wäßriger NaCl-Lösung bestand und 10 min im Bad belassen. Zwei Proben, die in F i g. lc mit JV bezeichnet sind, waren negativ, bei den beiden übrigen mit P bezeichneten positiven Proben war die LP-X-Bande deutlich erkennbar und mit 6 bezeichnet.
Beispiel 4
Menschliches Vollplasma wurde einer Polyacrylamid-Elektrophorese entsprechend der Methode von B. J. Davis, Ann. N. Y. Acad. Sei. 121, 404 (1964) unterworfen, wobei ein Tris-GIyzin-Puffer [Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Puffer] mit einem pH-Wert von 8,8 und einer Acrylamidmonomer-Konzentration von 3,5/7% verwendet wurde. Nach Eintritt des gewünschten Auftrennungseffekts nach zweistündiger Elektrophorese wurde das Glasröhrchen dem Apparat entnommen, das Polyacrylamid-Gel entnommen und mit einer Entwicklungslösung der folgenden Zusammensetzung behandelt: 0,55% Dextransulfat 2000 und 2,2%ige wäßrige Kalziumchloridlösung.
Die folgenden Lipoproteinbanden wurden damit sichtbar gemacht und identifiziert:
Prä-/?-Lipoproteine
/^-Lipoproteine
a-Lipoproteine,
die in F i g. Id mit 3, 2 und 4 bezeichnet sind.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (9)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Bestimmen von normalen und pathologischen Plasma-Lipoprotein-Mustern in menschlichen Körperflüssigkeiten durch elektrophoretische Auftrennung der Lipoproteine in einem Trägermedium, wie einem Gel, oder auf Folien, dadurch gekennzeichnet, daß nach Eintritt des gewünschten elekcrophoretisehen Anftrennungseffekts der Träger mit einer Entwicklerlösung behandelt wird, die eine oder mehrere der folgenden Substanzen enthält: Heparin, Dextransulfat, Natriumlaurylsulfat, Natriumphosphowolframsäure, Natriumoleat, Natriumsalze von Gallensäuren, zweckmäßig in An-. Wesenheit von zweiwertigen Kationen, wie Magnesium und Kalzium, wobei schwerlösliche Komplexsalze mit den Lipoproteinen gebildet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des LP-X-Lipoproteins ein Entwickler verwendet wird, der Heparin und Magnesium-Ionen und gegebenenfalls NaCl enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des Lipoproteins des Typs III ein Entwickler verwendet wird, der Heparin und Magnesium-Ionen und gegebenenfalls NaCl enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur selektiven Bestimmung des Lipoproteins des Typs III einerseits und der Lipoproteine VLDL, LDL und HDL andererseits der Träger nacheinander mit verschiedenen Entwicklerlösungen behandelt wird, von denen die eine Heparin und Magnesium-Ionen und die andere Dextransulfat und Kalzium-Ionen enthält
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß zur Bestimmung des Lipoproteins LP-X ein Träger, z. B. eine Gelplatte, verwendet wird, in dem die Entwicklerlösung oder Teile davon bereits enthalten ist.
6. Reagens zur Entwicklung von Plasma-Lipoproteinmustern auf Elektropherogrammen, dadurch gekennzeichnet, daß es eine oder mehrere der folgenden Substanzen Heparin, Dextransulfat, Natriumlaurylsulfat, Natriumphosphowolframsäure, Natriumoleat, Natriumsalze von GaI-lensäuren sowie zweiwertige Kationen wie Kalzium oder Magnesium enthält.
7. Reagens zur Entwicklung einer LP-X-Fraktion auf Elektropherugrammen, dadurch gekennzeichnet, daß es Heparin und Magnesium-Ionen und gegebenenfalls NaCl enthält.
8. Reagens zur Entwicklung der Fraktionen eines Lipoproteins des Typs III auf Elektropherogrammen, dadurch gekennzeichnet, daß es Heparin und Magnesium-Ionen und gegebenenfalls NaCl enthält.
9. Reagens zur Entwicklung der Fraktionen der Lipoproteine VLDL und HDL auf Elektropherogrammen, dadurch gekennzeichnet, daß es Dextransulfat und Kalziumionen enthält.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Bestimmen von normalen und pathologischen Plasma-Lipoprotein-Mustern in menschlichen Körperflüssigkeiten durch elektrophoretische Auftrennung der Lipoproteine in einem Trägermedium, wie einem Gel, oder auf Folien.
Di« Analyse der Serum-Plasma-Lipoproteine ist eine Voraussetzung für die exakte Diagnose der verschiedenen Formen von Hyperlipoproteinämie, und es besteht seit langem der Wunsch nach einer zuverlässigen, leicht durchführbaren Technik für die Identifizierung der normalen und abnormalen Lipoproteinfraktionen. Es sind Bestimmungsmethoden bekannt, die auf der Elektrophorese menschlicher Körperflüssigkeiten beruhen. Hierbei werden die Lipoproteine aus menschlichem Serum od. dgl. in einem festen Wanderungsmedium, vorwiegend einem Gel, der Einwirkung eines elektrischen Felds ausgesetzt, wobei durch Wanderung der Lipoproteine ein Auftrennungseffekt bewirkt wird. Die Lipoproteinbanden werden nach der bekannten Arbeitsweise durch Färben mit Lipid-Farbstoffen oder durch immunologische Fällungen, z. B. mit Antiserum, sichtbar gemacht. Vielfach ist in Kombination damit eine Ultrazenirifugation erforderlich; die bekannten Methoden haben den Nachteil, daß sie sehr arbeitsaufwendig und apparativ so teuer sind, daß eine komplette Lipoproteinanalytik nur in Speziallaboratorien vorgenommen werden kann.
Es ist auch bekannt, ^-Lipoproteine durch Heparin bzw. Heparinoide in Gegenwart zweiwertiger Kationen zu fällen und durch Trübungsmessung zu bestimmen. Nachteilig bei diesem Verfahren ist es, daß die Teilchengröße von verschiedenen unbeeinflußbaren Faktoren abhängig ist und die Bestimmung äußerst ungenau ist. Eine selektive Bestimmung sämtlicher Piasma-Lipoprotein-Fraktionen ist auf diese Weise nicht möglich.
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, ein Verfahren zu schaffen, daß diese Nachteile vermeidet, in jedem Laboratorium durchführbar ist und genaue, verläßliche Resultate gewährleistet. Insbesondere soll eine selektive Erfassung der einzelnen Lipoproteine in der Körperflüssigkeit ermöglicht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren, das ausgeht von der elektrophoretischen Auftrennung der Lipoproteine in einem Trägermedium, wie einem Gel, oder auf Folien, ist dadurch gekennzeichnet, daß nach Eintritt des gewünschten elektrophoretischen Auftrennungseffekts der Träger mit einer Entwicklerlösung behandelt wird, die eine oder mehrere der folgenden Substanzen enthält: Heparin, Dextransulfat, Natriumlaurylsulfat, Natriumphosphowolframsäure, Natriumoleat, Natriumsalze von Gallensäuren, zweckmäßig in Anwesenheit von zweiwertigen Kationen, wie Magnesium und Kalzium, wobei schwerlösliche Komplexsalze mit den Lipoproteinen gebildet werden.
Die Zusammensetzung der Entwicklerlösung bzw. die Art der zu verwendenden Substanzen richtet sich nach den zu bestimmenden Lipoproteinen:
Zur- Bestimmung des anormalen LP-X-Lipoproteins wird zweckmäßig ein Entwickler verwendet, der Heparin und Magnesium-Ionen und gegebenenfalls NaCl enthält.
Nach einer modifizierten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zur Bestimmung des LP-X-Lipoproteins ein Träger, z. B. eine Gel-
DE2314964A 1973-02-12 1973-03-26 Verfahren zum Bestimmen von normalen und pathologischen Plasma-Lipoprotein-Mustern in menschlichen Körperflüssigkeiten Expired DE2314964C3 (de)

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