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Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung
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der Wissenschaften e.V.
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Bunsenstraße 10 3400 Göttingen Einrichtung zur zeitlich hoch aufgelösten
Messung der zeitlichen Verteilung von Photonen-Impulsen Die vorliegende Erfindung
betrifft eine Einrichtung gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1. Insbesondere
betrifft die Erfindung eine Einrichtung zur Photonenzählung, z.B. bei der Erfassung
von Phosphoreszenzabklingkurven von farbstoffmarkierten Proteinen und dgl.
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Es sind Photonenzählsysteme,die mit einem Zeit-Amplituden-Konverter
und einem Vielkanalanalysator mit Impulshöhenanalysation arbeiten, bekannt, siehe
z.B. Yguerabide, Methods in Enzymology XXVI, Seite 498; Mende, M.L., J. Phys.
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E: Sci.Instrum. Band 14, 1981 S. 909 ff. Diese bekannten Systeme arbeiten
im allgemeinen mit der Zählung einzelner Photonen, d.h. daß für jeden Anregungsimpuls,
der die zu messende Photonenemission auslöst, genau ein einzelnes Photon erfaßt
wird. Dies führt insbesondere bei schwachen Emissionen zu sehr langen Akkumulationszeiten,
die in der Größenordnung von mehreren Stunden bis Tagen liegen können.
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Man hat zwar versucht, dieses Problem durch hohe Wiederholungsfrequenzen
des Anregungsimpulses zu lösen. Jedoch selbst bei Anregungsfrequenzen von mehreren
10 KHz liegen die Akkumulationszeiten immer noch in der Größenordnung von Stunden.
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Der vorliegenden Erfindung liegt dementsprechend die Aufgabe zugrunde,
eine Einrichtung der obengenannten Art anzugeben, welche trotz hoher Zeitauflösung
mit kurzen Akkumulations- oder Sammelzeiten auskommt.
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Diese Aufyabe wird bei einer Einrichtung der eingangs genannten Art
erfindungsgemäß durch die im Patentanspruch 1 angegebenen Maßnahmen gelöst.
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Weiterbildungen und vorteilhafte Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen
Einrichtung sind Gegenstand von Unteransprüchen.
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Mit der vorliegenden Einrichtung ist es möglich, sämtliche Impulse
jeder Impulsfolge mit hoher Zeitauflösung zu erfassen, so daß sich kurze Sammel
- oder Mittelungszeiten ergeben. Es ist insbesondere bei der Phosphoreszenzanalyse
möglich, pro Anregungsimpuls sämtliche Photonenereignisse einer Emission mit hoher
Zeitauflösung und kurzen Sammelzeiten zu erfassen. Dies ist von besonderem Vorteil,
wenn Emissionen von biologischen Proben untersucht werden. Diese lassen hohe Anregungsimpulsfolgefrequenzen
in der Anregung und/oder lange Sammelzeiten nicht zu, ohne daß man Gefahr läuft,
die Probe zu überlasten und irreversible Schäden in ihr zu verursachen, die zu einer
Verfälschung der Meßergebnisse führen können.
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Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung unter Bezugnahme
auf die Zeichnung näher erläutert.
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Es zeigen: Fig. 1 eine schematische Übersichtsdarstellung einer Einrichtung
gemäß einer Ausführungsform der Erfindung;
Fig. 2 ein Blockschaltbild
wesentlicher Teile der Einrichtung gemäß Fig. 1; Fig. 3 eine mit der Einrichtung
gemäß Fig. 1 und 2 gemessene Phosphoreszenz-Abklingkurve.
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Ein vorteilhaftes und hauptsächliches Anwendungsgebiet der vorliegenden
Erfindung ist die Erfassung der zeitlichen Verteilung von Photonenimpulsen, wie
sie z.B. bei der Messung von Phosphoreszenzabklingkurven von farbstoffmarkierten
Proteinen in Modellmembranen auftreten. Die Erfindung wird daher im folgenden am
Beispiel eines Photonenzählsystems erläutert.
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Die in Fig. 1 dargestellte Meßanordnung enthält einen Laser 10, der
mit einer Folgefrequenz von 50 Hz kurze Strahlungsimpulse liefert, die in eine zu
untersuchende Probe 12 eingestrahlt werden. Die Auslösung der Strahlungsimpulse
des Lasers erfolgt durch eine externe Auslöseimpulsquelle 14. Die durch einen Laserstrahlungsimpuls
in der Probe 12 ausgelöste Phosphoreszenz wird durch einen Photo-Sekundärelektronenvervielfacher
(SEV)16 erfaßt, an dessen Ausgang Impulse auftreten, die jeweils im wesentlichen
einem vom SEV erfaßten Photon entsprechen. Die Impulse werden durch einen Verstärker
18 verstärkt.und dann einem Diskriminator 20 zugeführt, der im wesentlichen eine
Schwellenwertstufe darstellt und Rauschstörungen, deren Amplitude unterhalb eines
Schwellenwertes liegen, unterdrückt. Die von Rauschstörungen kleiner Amplitude befreiten
Impulse werden vom Ausgang des Diskriminators 20 einem schnellen digitalen Zwischenspeicher
zugeführt, der den hauptsächlichen Gegenstand der vorliegenden Erfindung darstellen
und anhand der Figuren 2 und 3 noch näher erläutert werden wird. Auf den Zwischenspeicher
22 folgt ein Vielkanalanalysator 24 konventioneller Bauart, in den eine größere
Anzahl
der jeweils im Zwischenspeicher 22 mit hoher zeitlicher Auflösung gespeichertzen
Impuls folgen übertragen und dadurch integriert oder gemittelt wird. Die im Vielkanalanalysator
24 akkumulierte mittlere zeitliche Verteilung der Impulse in der Impulsfolge kann
dann in üblicher Weise mittels einer Kathodenstrahlröhre dargestellt und/oder durch
ein Registriergerät aufgezeichnet werden.
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Fig. 2 ist ein Blockschaltbild einer bevorzugten Ausführungsform des
Zwischenspeichers 22.
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Der Zwischenspeicher enthält im wesentlichen eine Zeitbasis 30, einen
Adressenzähler 32, eine wahlfrei adressierbare Speichereinheit (RAM) 34, die mehrere
Speicherchips enthalten kann, ein Adressenregister 36 sowie eine Steuerschaltung
zur Steuerung der Betriebsart des Zwischenspeichers. Die Steuerschaltung enthält
im wesentlichen einen Betriebsartumschalter 38 und eine Umschaltlogik 40.
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Der Betriebsartumschalter hat drei mit der Zeitbasis gekoppelte Takteingänge.
Am ersten Takteingang liegt eine Impulsfolge mit veränderbarer Frequenz von maximal
10 MHz; am zweiten Takteinang liegt eine Impulsfolge mit einer Frequenz von 200
kHz und am dritten Takteingang liegt eine Impulsfolge mit einer Frequenz von 10
MHz. Der Betriebsartumschalter hat ferner zwei Steuereingänge El und E2, von denen
der erste mit der Auslöseimpulsquelle 14 und der zweite mit einem Überlaufausgang
des Adressenzählers 32 gekoppelt ist. Weiterhin hat der Betriebsartumschalter 38
einen Taktausgang TA, der mit einem Takteingang des Adressenzählers 32 ge-
koppelt
ist, und einen Steuerimpulsausgang SA, welcher mit einem Steuereingang der Umschaltlogik
40 und einem Dateneingang der Speichereinheit 34 gekoppelt ist.
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Die Speichereinheit enthält bei dem vorliegenden Ausführungsbeispiel
4096 Speicherplätze für jeweils ein Bit und kannmehrere Speicherbausteine (chips)
enthalten. Die Speichereinheit 34 hat einen mit einem Ausgang des Adressenzählers
gekoppelten Adresseneingang, einen mit dem Ausgang der Umschaltlogik gekoppelten
Adressenfreigabe-Eingang sowie einen mit einem Dateneingang DE des Adressenregisters
36 sowie einem Eingang einer Verzögerungsschaltung 42 gekoppelten Datenausgang DA.
Die Ausgänge des Adressenregisters 36 und der Verzögerungsschaltung 42 sind mit
einem Adresseneingang bzw. einem Dateneingang des Vielkanalanalysators 24 gekoppelt.
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Die beschriebene Schaltungsanordnung arbeitet folgendermaßen: Zu Beginn
einer Messung arbeitet die Einrichtung im Betriebszustand "Bereitschaft". Die Speichereinheit
34 und das Adressenregister 36 sind gelöscht, der Adressenzähler steht auf seiner
Anfangsstellung, der Betriebsartumschalter stellt keine Verbindung zwischen der
Zeitbasis 30 und dem Adressenzähler 32 her, so daß letzterer nicht getaktet wird,
und die Umschaltlogik 40 unterbricht die Verbindung zum Freigabeeingang WE, Wenn
der Auslöseimpulsgenerator 14 einen Auslöseimpuls an den Laser 10 und den Eingang
El des Betriebsartumschalters 38 liefert, wird die Einrichtung in den Betriebszustand
"Speichern" umgeschaltet. In diesem Betriebszustand schaltet der Betriebsartumschalter
die eingestellte, maximal 10 MHz betragende Taktfrequenz von der Zeitbasis 30 zum
Takteingang des Adressenzählers 32 durch, so daß dieser mit maximal 10 MHz getaktet
wird. Gleichzeitig liefert der
Betriebsartumschalter am Steuerausgang
SA ein Ausgangssignal, das die Umschaltlogik 40 veranlaßt, die Verbindung zwischen
dem Ausgang des Impulsdiskriminators 20 und dem Freigabeeingang WE der Speichereinheit
34 durchzuschalten.
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Das Signal am Steuerausgang SA erzeugt außerdem am Dateneingang der
Speichereinheit 34 ein Signal des Logikwertes 1. Wenn also am Freigabeingang WE
ein Photonenimpuls vom Ausgang des Diskriminators 20 auftritt, wird in der gerade
angewählten Adresse ein Bit gespeichert.
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Enthält die Speichereinheit 34 mehrere Speicherbausteine, so erfolgt
die Wahl der verschiedenen Bausteine jeweils zweckmäßigerweise durch die Adressen
vom Adressenzähler über einen Binärdecodierer.
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Wenn der Adressenzähler seinen Adressenvorrat durchlaufen er hat,
liefert/einen Überlaufimpuls an den Eingang E2 des Betriebsartumschalters. Dies
bringt die Einrichtung in den Betriebszustand "Lesen". Der Betriebsartumschalter
führt dem Takteingang des Adressenzählers nun die 200-KHZ-Impulsfolge von der Zeitbasis
30 zu, so daß die Adressen nun mit einer für die Adressierung des Vielkanalanalysators
24 geeigneten Taktfrequenz (z.B.maximal 250 kHz) fortgeschaltet werden. Die Adressen
steuern das Lesen der Plätze der Speichereinheit 34 und werden außerdem jeweils
im Adressenregister 36 zwischengespeichert. Immer wenn aus einem Speicherplatz der
Speichereinheit eine gespeicherte 1 ausgelesen wird, wird die im Adressenregister
36 gespeicherte Adresse an den Adresseniengang des Vielkanalanalysators weitergegeben.
Die herausgelesene "1" gelangt außerdem mit einer Verzögerung von ca 100 Nanosekunden
in der Verzögerungsschaltung 32 zum Dateneingang des Vielkanalanalysators 24 und
bewirkt dort die Inkrementierung des Inhaltes des durch die Adresse im Adressenregister
36 angewählten Kanales um 1.
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Nachdem der Adressenvorrat im Betriebszustand "Lesen" durchlaufen
worden ist, tritt wieder ein Überlaufimpuls am Eingang E2 des Betriebsartumschalters
auf, der die Einrichtung in die Betriebsart "Löschen" schaltet, in der alle Komponenten
wieder in den Ausgangszustand zurückyebracht werden. Im Betriebszustand "Löschen"
wird dem Takteingang des Adressenzählers eine Taktimpulsfolge von 10 MHz zugeführt.
Außerdem wird dem Freigabeeingang WE der Speichereinheit 34 uber die entsprechend
umgeschaltete Umschaltlogik 40 eine Impulsfolge von ca 33 MHz von der Zeitbasis
oder, wie dargestellt, von einem eigenen Löschoszillator 44 zugeführt. Der Dateneingang
SA liegt dabei an einem dem Binärwert null entsprechenden Signal.
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Nach dem erneuten Durchlaufen des Adressenvorrates ist der Speicher
gelöscht. Der nach Durchlaufen des Adressenvorrates entstehende Überlaufimpuls des
Adressenzählers schaltet die Einrichtung wieder in die Betriebsart "Bereitschaft"
zurück.
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In Fig. 3 ist eine mit der beschriebenen Einrichtung gemessene Phosphoreszenz-Abklingkurve
dargestellt. Die Auslöseimpulsquelle 40 lieferte Auslöseimpulse mit einer Wiederholungsfrequenz
von 50 Hz. Die Taktfrequenz für die Speicherung der Photonenimpulse betrug 10 MHz,
was einer Zeitauflösung von 100 Nanosekunden pro Kanal entspricht. Die Speichereinheit
34 hatte 4096 Speicherplätze.
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Der Schreibzyklus dauerte etwa 200 Mikrosekunden, der Lesezyklus etwa
10 Millisekunden, der Löschzyklus ca 200 Mikrosekunden.
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Der Vielkanalanalysator 24 hatte 2048 Kanäle. Die Akkumulationszeit
bei der Messung der Kurve gemäß Fig. 3 betrug 5 Minuten. Die maximale Impulszahl
pro Zeitkanal betrug 18077 Impulse.
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Bei der beschriebenen Einrichtung konnte die Speicherplatz-Fortschaltzeit
während des Speicherzyklus
des Speichers 34 zwischen 100 Nanosekunden
und 90 Mikrosekunden geändert werden, um die Dauer des Speicherzyklus der Dauer
des zu analysierenden Ereignisses anpassen zu können.
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Die beschriebene Einrichtung ermöglicht es also, sämtliche Photonen,
die vom SEV 16 während eines Abklingvorganges der Phosphoreszenz-Emission erfaßt
werden, mit einer Zeitauflösung zu registrieren, die bis zu 40 mal größer ist als
die des Vielkanalanalysators. allein. Hieraus resultiert eine kurze Akkumulationszeit
trotz hoher zeitlicher Auflösung.
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