DE3104949C2

DE3104949C2 - Process for the preparation of threonine → B → 0 → esters of human insulin, accordingly prepared threonine → B → → 3 → → 0 → esters of human insulin as well as processes for the preparation of such threonine using human insulin. B → → 3 → → 0 → esters of human insulin

Info

Publication number: DE3104949C2
Application number: DE3104949A
Authority: DE
Inventors: Jan 2730 Herlev Markussen
Original assignee: Novo Industri AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1980-02-11
Filing date: 1981-02-11
Publication date: 1984-04-26
Also published as: IT1195038B; IT8119620A0; CA1162868A; DK147109C; FI77876B; PT72485A; SE427025B; ZA81898B; DK147109B; NL8100624A; DK147437A; SE451143B; DK147437C; GR73844B; NO156247B; NO810443L; AR231277A1; FI77876C; BE887480A; NL178797B

Abstract

Insulin und Insulin-ähnliche Verbindungen bestimmter Spezies können in Gegenwart eines L-Threonin-Esters, Wassers, eines Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels und Trypsin in einen Threonin ↑B ↑3 ↑0-Ester menschlichen Insulins transplitidiert werden, in welchem die Schutzgruppe(n) unter Bildung von menschlichem Insulin abgespalten werden kann (können).Insulin and insulin-like compounds of certain species can be transplitidated into a threonine ↑ B ↑ 3 ↑ 0 ester of human insulin in the presence of an L-threonine ester, water, a water-miscible organic solvent and trypsin, in which the protective group (s) can be split off with the formation of human insulin.

Description

2525th

40 daüurch gekennzeichnet, daß man dieses mit einer organischen Säure, bevorzugt Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Buttersäure, durchführt. 40 characterized in that this is carried out with an organic acid, preferably formic acid, acetic acid, propionic acid and butyric acid.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge Säure in der Reaktionsmischung zwischen 0,5 und 5 Äquivalente pro Äquivalent des L-Threonin-Esters beträgt 12. The method according to any one of claims 2 to 11, characterized in that the amount of acid in the reaction mixture is between 0.5 and 5 equivalents per equivalent of the L-threonine ester

13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin und der Insulinverbindung in der Reaktionsmischung obei aalb von 1:200 liegt.13. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the weight ratio between trypsin and the insulin compound in the reaction mixture above aalb of 1: 200 lies.

14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart von Calciumionen durchführt. 14. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the reaction performs in the presence of calcium ions.

15. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in einem Puffersystem durchführt.15. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the Implementation in a buffer system.

16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den L-Threonin-Ester als Acetat, Propionat, Butyrat oder als Halogenwasserstoffsalz zugibt.16. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the L-threonine ester as acetate, propionate, butyrate or as a hydrogen halide salt.

17. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß R⁴ eine niedrige Alkyl-, substituierte Benzyl- oder Diphenylmethylgruppe oder eine Gruppe der allgemeinen Formel17. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that R ^{4 is} a lower alkyl, substituted benzyl or diphenylmethyl group or a group of the general formula

-CH₂CH₂SO₂R⁶ -CH ₂ CH ₂ SO ₂ R ⁶

ist, wobei R⁶ eine niedrige Alkyl-Gruppe bedeutet.where R ^{6 is} a lower alkyl group.

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß R⁴ Methyl, Ethyl, tert.-Butyl, p-Methoxybenzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl oder eine Gruppe der allgemeinen Formel18. The method according to claim 17, characterized in that R ^{4 is} methyl, ethyl, tert-butyl, p-methoxybenzyl, 2,4,6-trimethylbenzyl or a group of the general formula

-CH₂CH₂SO₂R⁶ -CH ₂ CH ₂ SO ₂ R ⁶

ist, wobei R⁶ Methyl, Ethyl, Propyl oder η-Butyl ist.where R ^{6 is} methyl, ethyl, propyl or η-butyl.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 5-7 oder 9-18, dadurch gekennzeichnet, daß man Schweineinsulin mit L-Threonin-methylester oder -tert.-butylester in wäßrigem Ν,Ν-Dimethyl-formamid oder Ν,Ν-Dimethylacetamid bei etwa 37°C umsetzt, wobei der Wassergehalt in der Reaktionsmischung zwischen 41 und 43%, das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin und dem Schweineinsulin etwa 1:8 und das Mol-Verhältnis zwischen dem L-Threonin-Ester und dem Schweineinsulin etwa 120:1 betragen und man zwischen 1,2 und 1,5 Äquivalente Essigsäure pro Äquivalent L-Threonin-Ester zugibt.19. The method according to any one of claims 5-7 or 9-18, characterized in that pig insulin with L-threonine methyl ester or tert-butyl ester in aqueous Ν, Ν-dimethylformamide or Ν, Ν-Dimethylacetamide converts at about 37 ° C, the water content in the reaction mixture between 41 and 43%, the weight ratio between trypsin and porcine insulin about 1: 8 and the molar ratio between the L-threonine ester and the porcine insulin are about 120: 1 and adding between 1.2 and 1.5 equivalents of acetic acid per equivalent of L-threonine ester.

20. Threonin⁸³⁰-Ester des Humaninsulins bzw. eines Salzes oder Komplexes desselben, hergestellt durch ein Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche.20. Threonine ⁸³⁰ ester of human insulin or a salt or complex thereof, prepared by a method according to one of the preceding claims.

21. Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin oder eines Salzes oder Komplexes desselben unter Verwendung der Threonin⁸³⁰-Ester des Humaninsulins bzw. eines Salzes oder Komplexes desselben nach Anspruch 20.21. A process for the preparation of human insulin or a salt or complex thereof using the threonine ⁸³⁰ esters of human insulin or a salt or complex thereof according to claim 20.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Threonin^B30-Estern des Humaninsulins oder einesThe invention relates to a process for the production of threonine ^B30 esters of human insulin or one

Salzes odor Komplexes desselben aus einem L-Threonin-Ester der allgemeinen Formel IISalt or complex of the same from an L-threonine ester of the general formula II

Thr(R⁵)-OR⁴ Thr (R ⁵ ) -OR ⁴

(H)(H)

in der R⁴ eine Carboxyl-Schutzgruppe und R⁵ Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe bedeuten, und einer Insulinverbindung, welche die im Humaninsulin vorliegenden Aminosäure-Sequenzen Al bis A21 und Bl bis B29 enthält, in Gegenwart einer Protease, demgemäß hergestellte Threonin^B30-Ester des Humaninsulins sowie ein Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin unter Verwendung derartiger Threonin^B30-Ester des Humaninsulins nach dem Oberbegriff der Patentansprüche 1, 20 bzw. 21. Insbesondere betrifft die Erfindung die Umwandlung von Insulin und insulinähnlichen Verbindungen der in Anspruch 1 genannten Sequenzen in Humaninsulin.in which R ^{4 is} a carboxyl protective group and R ^{5 is} hydrogen or a hydroxyl protective group, and an insulin compound which contains the amino acid sequences A1 to A21 and B1 to B29 present in human insulin, in the presence of a protease, threonine ^B30 prepared accordingly - Esters of human insulin and a process for the production of human insulin using such threonine ^B30 esters of human insulin according to the preamble of claims 1, 20 and 21. In particular, the invention relates to the conversion of insulin and insulin-like compounds of the sequences mentioned in claim 1 into human insulin .

Bei der Behandlung von Diabetes mellitus werden Insulinverbindungen, hergestellt aus Schweine- oder Rinderinsulin, allgemein verwandt. Schweine-, Rinder-und Humaninsuline zeigen geringfügige Unterschiede in ihrer Aminosäurezusammensetzung, wobei der Unterschied zwischen Human- und Schweineinsulin sich insofern auf eine einzige Aminosäure beschränkt, als die B30-Aminosäure des Humaninsulins Threonin ist, während die von Schweineinsulin Alanin ist. Es kann daher immerhin eingewendet werden, daß die ideale Insulinpräparation für die Behandlung von Menschen ein Insulin mit exakt der gleichen chemischen Struktur wie der von Humaninsulin ist.The treatment of diabetes mellitus uses insulin compounds, made from pork or beef insulin, commonly related. Pig, cattle and Human insulins show slight differences in their amino acid composition, with the difference being between human and porcine insulin is limited to a single amino acid, as the B30 amino acid of human insulin is threonine while that of porcine insulin is alanine. It can therefore after all, it may be argued that the ideal insulin preparation for the treatment of humans is an insulin with exactly the same chemical structure as that of human insulin.

Für die Herstellung von menschlichem, natürlichen Insulin steht die notwendige Menge menschlicher Pankreas-Drüsen nicht zur Verfugung.The necessary amount of human insulin is available for the production of human, natural insulin Pancreatic glands not available.

Synthetisches Humaninsulin ist sehr teuer in kleinem Maßstab hergestellt worden, siehe HeIv. Chim. Acta, 57, 1974, 2617, und 60, 1977, 27. Halbsynthetisches Humaninsulin ist aus Schweineinsulin über zeitaufwendige Reaktionswege, wie in Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie, 357, 1976, 759 und Nature 280, 1979, 412, beschrieben, hergestellt worden.Synthetic human insulin has been produced very expensively on a small scale, see HeIv. Chim. Acta, 57, 1974, 2617, and 60, 1977, 27. Semi-synthetic human insulin is over time consuming from porcine insulin Reaction pathways, as in Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie, 357, 1976, 759 and Nature 280, 1979, 412.

Die US-PS 32 76 961 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von halbsynthetischem Humaninsulin. Nichtsdestoweniger ist die Ausbeute an Humaninsulin schlecht, da das Verfahren in Wasser durchgeführt wird und unter Bedingungen, unter denen Trypsin eine Spaltung der Arg^B22-Gly^B23-Bindung bewirkt, siehe Journal of Biological Chemistry, 236, 1961, 743.The US-PS 32 76 961 relates to a process for the production of semi-synthetic human insulin. Nevertheless, since the process is carried out in water and under conditions in which trypsin causes cleavage of the Arg ^B22 -Gly ^B23 bond, the yield of human insulin is poor, see Journal of Biological Chemistry, 236, 1961, 743.

Ein bekanntes halbsynthetisches Verfahren zur Herstellung von Humaninsulin weist folgende drei Schritte auf: Zuerst wird Schweineinsulin in Schweine-des-(Ala^B30)-Insulin mittels Behandlung mit Carboxypeptidase A, siehe Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie, 359, 1978, 799, umgewandelt. Im zweiten Schritt wird Schweirie-des-(Ala^B30)-Insulin einer Trypsin-katalysierten Kopplung mit Thr-OBu¹ unterworfen, wodurch der Thr^Bj0-tert.-Butylester des Humaninsuüns gebildet wird. Schließlich wi, d dieser Ester mit Trifluoressigsäure behandelt, um Humaninsulin zu liefern, siehe Nature 280,1979,412. Der erste Schritt liefert eine teilweise Abspaltung von Asn^A21, wodurch des-(Ala^B3",Asn^A21)-Insulin geliefert wird. Dieser Abkömmling führt nach den beiden anschließenden Reaktionen zu einer Verunreinigung von des-(Asn^A21)-Insu-Hn in dem hergestellten halbsynthetischen Humaninsulin, die nicht ieicht mit dem bekannten Präparationsverfahren entfernt werden kann. Des-(Asn^A2')-Insulin besitzt niedrige biologische Aktivität (etwa 5%), sieheA known semisynthetic process for the production of human insulin has the following three steps: First, porcine insulin is converted into porcine des (Ala ^B30 ) insulin by treatment with carboxypeptidase A, see Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie, 359, 1978, 799 . In the second step, Schweirie-des- (Ala ^B30 ) -insulin is subjected to a trypsin-catalyzed coupling with Thr-OBu ¹ , whereby the Thr ^Bj0 -tert-butyl ester of human insulin is formed. Finally, this ester is treated with trifluoroacetic acid to provide human insulin, see Nature 280,1979,412. The first step results in a partial cleavage of Asn ^A21 , whereby des- (Ala ^B3 ", Asn ^A21 ) -insulin is supplied. This derivative leads to a contamination of des- (Asn ^A21 ) -Insu-Hn in after the two subsequent reactions the semisynthetic human insulin produced, which cannot easily be removed with the known preparation process. Des- (Asn ^A2 ') -insulin has low biological activity (approx. 5%), see

American Journal of Medicine 40, S. 750.American Journal of Medicine 40, p. 750.

Bisher war es auch nicht möglich, ausgehend von anderen Substanzen, welche die Aminosäuresequenz in Al bis A21 und Bl bis B29 des Humaninsulins enthielten, außer Schweineinsulin, Humaninsulin unter Verwendung eines L-Threonin-Esters in Gegenwart einer Protease herzustellen. Dies schränkte den Kreis einzusetzender Insulinverbindungen erheblich ein.So far it was also not possible, starting from other substances which contained the amino acid sequence in A1 to A21 and B1 to B29 of human insulin, other than porcine insulin, human insulin using an L-threonine ester in the presence of a To produce protease. This significantly restricted the range of insulin compounds to be used.

Die Aufgabe der Erfindung besteht also darin, ein Verfahren zu liefern, mit welchem in industriellem Maßstab Humaninsulin hergestellt werden kann, wobei Nicht-Humaninsulin in Humaninsulin umgewandelt werden soll. Weiterhin soll ein Verfahren geliefert werden, welches Schweineinsulin und in diesem enthaltene bestimmte Verunreinigungen in Humaninsulin über einen Threonin^{8 30}-Ester des Humaninsulins umwandelt. The object of the invention is therefore to provide a process with which human insulin can be produced on an industrial scale, with the aim of converting non-human insulin into human insulin. Furthermore, a method is to be provided which converts pig insulin and certain impurities contained in it into human insulin via a threonine ^{8 30} ester of human insulin.

Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Herstellung von Threonin^B3°-Estern des Humaninsulins der eingangs genannten Art gelöst, welches gekennzeichnet ist durch die im Kennzeichen des Patentanspruches 1 aufgeführten Merkmale. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche. This object is achieved by a method for producing threonine ^B3 ° esters of human insulin of the type mentioned at the beginning, which is characterized by the features listed in the characterizing part of claim 1. Preferred embodiments of the invention are the subject of the subclaims.

Das Verfahren nach der Erfindung besitzt also folgende Vorteile gegenüber dem Stand der Technik:The method according to the invention therefore has the following advantages over the prior art:

a) Die ^nzymatische Hydrolyse zur Abspaltung von Ala^B3°, beispielsweise mit Carboxypeptidase A, wird ausgelassen.a) The enzymatic hydrolysis for splitting off Ala ^B3 °, for example with carboxypeptidase A, is omitted.

b) Die Isolierung einer Zwischenverbindung, wie beispielsweise Schweine-des-(Ala^B30)-Insulin, ist unnötig. b) Isolation of an intermediate such as porcine des (Ala ^B30 ) insulin is unnecessary.

c) Verunreinigungen mit des-(Asn^A2')-Insulin-Derivaten werden vermieden.c) Contamination with des- (Asn ^A2 ') -insulin derivatives are avoided.

d) Proinsulin und andere insulinähnliche Verunreinigungen, die im Rohinsulin anwesend sind, werden durch das erfindungsgemäße Verfahren über den Threonin^B30-Ester des Humaninsulins in Humaninsulin umgewandelt, wodurch die Ausbeute erhöht wird.d) Proinsulin and other insulin-like impurities that are present in crude ^{insulin are converted into human insulin by the method according to the invention via the threonine B30} ester of human insulin, whereby the yield is increased.

e) Antigenartige insulinähnliche Verbindungen, siehe GB-PS 12 85 023, werden in Humaninsulin umgewandelt.e) Antigen-like insulin-like compounds, see GB-PS 12 85 023, are in human insulin converted.

Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Ansprüchen und aus der nachfolgenden Beschreibung, in der Ausführungsbeispiele erläutert sind.Further features and advantages of the invention emerge from the claims and from the following Description in which exemplary embodiments are explained.

Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß die an di e Carbonylgruppe von Lys^{B 29} gebundene Aminosäure oder Peptidkette in der Insulinverbindung mit einem Threonin-Ester ausgetauscht werden kann. Dieser Austausch kann als Transpeptidierung bezeichnet werden.The invention is based on the knowledge that the ^{amino acid or peptide chain bound to the carbonyl group of Lys B 29} in the insulin compound can be exchanged for a threonine ester. This exchange can be referred to as transpeptidation.

Der hierin verwandte Terminus »Insulinverbindungen« umschließt Insuline und insulinähnliche Verbindungen, welche die menschliche des-(Thr^B30)-lnsulineinheit enthalten, wobei die B30-Aminosäure des Insulins Alanin (in Insulin von beispielsweise Schwein, Hund und Finn- und Spermwal) oder Serin ist, wie beim Kaninchen. Der Terminus »insulinähnliche Verbindungen«, wie er hierin gebraucht wird, schließt Proinsulin, das sich von irgendeiner oben genannter Spezies und Primaten ableitet, gemeinsam mit Intermediärprodukten von der Umwandlung von Proinsulin in Insulin, ein. Als Beispiel derartiger Intermediärprodukte können gespaltenes Proinsulin, Desdipeptid-Proinsuline, Desnonapeptid-Proinsulin und Üiarginin-Insuline genanntThe term "insulin compounds" used herein includes insulins and insulin-like compounds which ^{contain the human des- (Thr B30} ) -insulin unit, the B30 amino acid of insulin being alanine (in insulin from, for example, pigs, dogs and fin and sperm whales) or serine is like the rabbit. The term "insulin-like compounds" as used herein includes proinsulin derived from any of the above-mentioned species and primates, along with intermediates from the conversion of proinsulin to insulin. Split proinsulin, desdipeptide proinsulins, desnonapeptide proinsulin and iarginine insulins may be mentioned as examples of such intermediate products

werden, siehe auch R. Chance »In Proceedings of the Seventh Congress of IDF, Buenos Aires 1970, 292 bis 305, Herausgeber: R- R- Rodrigues & J. V.-Owen, Excerpta Medica, Amsterdam.see also R. Chance "In Proceedings of the Seventh Congress of IDF, Buenos Aires 1970, 292 bis 305, editors: R- R- Rodrigues & J. V.-Owen, Excerpta Medica, Amsterdam.

Obwohl Trypsin wegen seiner prote olytischen Eigenschaften am bekanntesten ist, ist auch bekannt, daß Trypsin dazu befähigt ist, das Koppeln von des-(Ala^B30)-Insulin und einem Threonin-tert.-butyl-Ester zu katalysieren, siehe Nature 280,1979,412. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Trypsin zur Katplyse der UmseUung eingesetzt.Although trypsin is best known for its proteolytic properties, it is also known that trypsin is able ^{to catalyze the coupling of des- (Ala B30} ) -insulin and a threonine tert-butyl ester, see Nature 280, 1979 , 412. In the method according to the invention, the trypsin is used to catalyze the circulation.

Die Umsetzung kann durch Auflösen von 1. der Insulinverbindung, 2. einem L-Threonin-Ester und 3. Trypsin in einer Mischung von Wasser und mindestens einem wassermischbaren organischen Lösungsmittel, wunschweise in Gegenwart einer Säure, durchgeführt werden.The reaction can be accomplished by dissolving 1. the insulin compound, 2. an L-threonine ester and 3. trypsin in a mixture of water and at least one water-miscible organic solvent, if desired in the presence of an acid.

Bevorzugte wassermischbare organische Lösungsmittel sind polare Lösungsmittel. Als spezifische Beispiele derartiger Lösungsmittel können Methanol, Ethanol, 2-PropanoI, 1,2-Ethandiol, Aceton. Dioxan, Tetrahydrofuran, Ν,Ν-Dimethylformamid, Formamid, N₁N-Dimethylacetamid, N-Methylpyrrolidon, Hexamethylphosphortriamid und Acetonitril genannt werden.Preferred water-miscible organic solvents are polar solvents. As specific examples of such solvents, methanol, ethanol, 2-propanol, 1,2-ethanediol, acetone can be used. Dioxane, tetrahydrofuran, Ν, Ν-dimethylformamide, formamide, N ₁ N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, hexamethylphosphoric triamide and acetonitrile can be mentioned.

In Abhängigkeit davon, welches wassermischbare organische Lösungsmittel verwendet wird, von der ausgewählten Reaktionstemperatur und davon, ob eine Säure in der Reaktionsmischung anwesend ist, sollte der Wassergehalt in der Reaktionsmischung bevorzugt weniger als etwa 40 Vol.-% und mehr als etwa 10 Vol.-% betragen. Ein Vorteil der Verminderung der Wassermenge in der Reaktionsmischung besteht darin, daß aufgrund dessen die Bildung von Nebenprodukten vermindert wird. Durch Erhöhen der Säuremenge in der Reaktionsmischung ist es auf ähnliche Art und Weise möglich, die Nebenproduktbildung herabzusetzen. Die Erhöhung der Ausbeute ist positiv mit einem hohen Prozentsatz organischen Lösungsmittel korreliert.Depending on which water-miscible organic solvent is used, on the selected one The reaction temperature and whether an acid is present in the reaction mixture should be the water content in the reaction mixture are preferably less than about 40% by volume and more than about 10% by volume. An advantage of reducing the amount of water in the reaction mixture is that due to the formation of by-products is reduced. By increasing the amount of acid in the reaction mixture, it is possible in a similar manner to do the Reduce by-product formation. The increase in the yield is positive with a high percentage organic solvents.

Die Trypsinart ist nicht wesentlich für die Ausführung der Erfindung. Trypsin ist ein gut charakterisiertes, kommerziell in hoher Reinheit erhältliches Enzym, nämlich von Schweinen und Rindern. Weiterhin kann Trypsin mikrowellen Ursprungs verwandt werden. Die Trypsinform, beispielsweise kristallines Trypsin (lösliche Form), immobilisiertes Trypsin oder sogar Trypsinderivate (so lange die Trypsinaktivität erhalten bleibt), ist nicht kritisch für die Durchführung der Erfindung. Der Terminus Trypsin, wie er hierin verwandt wird, soll Trypsine aus allen Quellen und alle Formen von Trypsin umschließen, welche transpeptidierende Aktivität besitzen. Eingeschlossen ist ferner Achromobacter lyticus-Protease, siehe Agiic. Biol. Chem. 42, Seite 1443.The type of trypsin is not essential to the practice of the invention. Trypsin is a well characterized, Enzyme commercially available in high purity, namely from pigs and cattle. Furthermore can Trypsin of microwave origin can be used. The trypsin form, for example crystalline trypsin (soluble Form), immobilized trypsin or even trypsin derivatives (as long as the trypsin activity is maintained remains) is not critical to the practice of the invention. The term trypsin as used herein is intended to include trypsins from all sources and all forms of trypsin which are transpeptidic Have activity. Achromobacter lyticus protease is also included, see Agiic. Biol. Chem. 42, Page 1443.

Als Beispiele aktiver Trypsinderivate können acetyliertes Trypsin, succinyliertes Trypsin, mit Glutaraldehyd behandeltes Trypsin und immobilisierte Trypsin-Derivate genannt werden.As examples of active trypsin derivatives, acetylated Trypsin, succinylated trypsin, with glutaraldehyde treated trypsin and immobilized trypsin derivatives are mentioned.

Wenn ein immobilisiertes Trypsin eingesetzt wird, wird es im Medium suspendiert.If an immobilized trypsin is used, it will be suspended in the medium.

Organische oder anorganische Säuren wie Salzsäure, Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure und Butyrsäure oder Basen wie Pyridin, TRIS (Tris-hydroxymethylaminomethan), N-Methylmorpholin und N-Ethylmorpholin können dazugegeben werden, um ein geeignetes Puffersystem zustandezubringen. Organische Säuren werden bevorzugt eingesetzt. Die Reaktion kann jedoch auch ohne derartige Zusätze durchgeführt werden. Die Menge zugesetzter Säure ist üblicherweise geringer als 10 Äquivalente pro Äquivalent L-Threonin-Ester. Bevorzugt beträgt die Säuremenge zwischen 0,5 und 5 Äquivalent L-Threonin-Ester. Ionen, welche Trypsin stabilisieren, wie Calciumionen, können zugegeben werden.Organic or inorganic acids such as hydrochloric acid, formic acid, acetic acid, propionic acid and butyric acid or bases such as pyridine, TRIS (tris-hydroxymethylaminomethane), N-methylmorpholine and N-ethylmorpholine can be added to create a suitable buffer system. Organic Acids are preferred. However, the reaction can also be carried out without such additives. The amount of acid added is usually less than 10 equivalents per equivalent of L-threonine ester. The amount of acid is preferably between 0.5 and 5 equivalents of L-threonine ester. Ions, which Trypsin stabilize, like calcium ions, can be added will.

Das Verfahren kann in einem Temperatur-Bereich von +50⁰C bis zum Erstarrungspunkt der Reaktionsmischung durchgeführt werden. Enzymatische Reaktionen mit Trypsin werden üblicherweise bei etwa 37°CThe method of the reaction mixture can be carried out in a temperature range of +50 ⁰ C to the freezing point. Enzymatic reactions with trypsin are usually carried out at around 37 ° C

κι durchgeführt, um eine genügende Reaktionsgeschwindigkeit zu gewährleisten. Nichtsdestoweniger ist es vorteilhaft, um Inaktivierung des Trypsins zu vermeiden, das Verfahren nach der Erfindung bei einer Temperatur unterhalb der Umgebungstemperatur durchzuführen.κι carried out to a sufficient reaction speed to ensure. Nonetheless, to avoid inactivating trypsin, it is beneficial to to carry out the method according to the invention at a temperature below ambient temperature.

ι -, In praxi werden Reaktionstemperaturen oberhalb von etwa 0⁰C bevorzugt.In practice, reaction ^{temperatures above about 0 °} C. are preferred.

Die Reaktionszeit beträgt üblicherweise zwischen einigen Stunden und mehreren Tagen, abhängig von der Reaktionstemperatur, von der Menge zugegebenen Trypsins und von anderen Reaktionsbedingungen.The reaction time is usually between a few hours and several days, depending on the Reaction temperature, the amount of trypsin added and other reaction conditions.

Das Gewichtsverhältnis zwischen Trypsin und der Insulinverbindung in der Reaktionsmischung ist üblicherweise oberhalb von etwa 1:200, bevorzugt oberhalb etwa 1:50, und unterhalb etwa 1:1.The weight ratio between trypsin and the insulin compound in the reaction mixture is usually above about 1: 200, preferably above about 1:50, and below about 1: 1.

2-, Die für die Durchführung der Erfindung vorgesehenen L-Threonin-Ester können durch die allgemeine Formel2-, Those intended for carrying out the invention L-threonine esters can be given by the general formula

Thr(R⁵) —OR⁴ Thr (R ⁵ ) -OR ⁴

(H)(H)

beschrieben werden, wobei R⁴ eine Carboxyl-Schutzgruppe und R⁵ Wasserstoff oder eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist.where R ^{4 is} a carboxyl protecting group and R ^{5 is} hydrogen or a hydroxyl protecting group.

Die Threonin^{8 30}-Ester menschlichen Insulins, die bei dem Verfahren entstehen, können durch die allgemeine FormelThe threonine ^{8 30} -ester human insulins that are produced in the process can be given by the general formula

(Thr(R⁵)-OR⁴)^B30-h-ln(Thr (R ⁵ ) -OR ⁴ ) ^B30 -h-ln

(III)(III)

wobei h-In die menschliche des-(Thr^B30)-Insulineinheit repräsentiert, und R⁴ und R^s die gleichen Reste wie weiter oben definiert sind, beschrieben werden. Verwendbare L-Threonin-Ester der Formel II sind solche, in denen R⁴ eine O.rboxyl-Schutzgruppe ist, die vom Threonin⁸³⁰-Ester des Humaninsulins (Formel III) unter Bedingungen, welche keine wesentliche irreversible Umwandlung im Insulinmolekül hervorrufen, abgespalten werden kann. Als Beispiele derartigerwhere h-In represents the human des- (Thr ^B30 ) -insulin moiety, and R ⁴ and R ^{s are} the same residues as defined above. L-threonine esters of the formula II which can be used are those in which R ^{4 is} an orboxyl protective group ^{which are cleaved from the threonine 830} ester of human insulin (formula III) under conditions which do not cause any significant irreversible conversion in the insulin molecule can. As examples of such

5(i Carboxyl-Schutzgruppen können niedere Alkylgruppen, beispielsweise Methyl, Ethyl und tert.-Butyl, substituiertes Benzyl, wie p-Methoxybenzyl, 2,4,6-Trimethylbenzyl und Diphenylmethyl, genannt werden, sowie Gruppen der allgemeinen Formel5 (i Carboxyl protective groups can be lower alkyl groups, for example methyl, ethyl and tert-butyl, substituted benzyl, such as p-methoxybenzyl, 2,4,6-trimethylbenzyl and diphenylmethyl, as well as groups of the general formula

-CH₂CH₂SO₂R⁶ -CH ₂ CH ₂ SO ₂ R ⁶

wobei R⁶ einen niederen Alkylrest wie Methyl, Ethyl, Propyl und η-Butyl bedeutet. Geeignete Hydro-where R ^{6 is} a lower alkyl radical such as methyl, ethyl, propyl and η-butyl. Suitable hydro

w) xyl-Schutzgruppen R⁵ sind solche, die von dem Threonin⁸³⁰-Ester des Humaninsulins (Formel III) unter Bedingungen abgespalten werden können, die keine wesentlichen irreversiblen Umwandlungen im Insulinmolekül hervorrufen. Als Beispiel einer derarti-w) xyl protective groups R ⁵ are those which ^{can be cleaved from the threonine 830} ester of human insulin (formula III) under conditions which do not cause any significant irreversible conversions in the insulin molecule. As an example of such a

h, gen Gruppe R⁵ kann tert.-Butyl genannt werden.h, the group R ⁵ can be mentioned tert-butyl.

Niedrige Alkylgruppen enthalten weniger als 7 Kohlenstoffatome, bevorzugt weniger als 5 Kohlenstoffatome. Lower alkyl groups contain fewer than 7 carbon atoms, preferably fewer than 5 carbon atoms.

Weitere Schutzgruppen, die üblicherweise eingesetzt werden, sind von Wünsch in Methoden der organischen Chemie (Houben —Weyl), Band XV/1, Herausgeber Eugen Müller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, beschrieben worden.Further protective groups which are customarily used are from Wünsch in organic methods Chemie (Houben-Weyl), Volume XV / 1, editor Eugen Müller, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, described been.

Einige L-Threonin-Ester (Formel II) sind bekannte Verbindungen und die restlichen L-Threonin-Ester (Formel II) können analog der Herstellung bekannter Verbindungen hergestellt werden.Some L-threonine esters (Formula II) are known compounds and the remaining L-threonine esters (Formula II) can be prepared analogously to the preparation of known compounds.

Die L-Threonin-Ester der Formel II können freie Basen oder Salze geeigneter organischer oder anorganischer Säuren derselben sein, bevorzugt Acetate, Propionate, Butyrate und Salze von Halogenwasserstoffen wie Hydrochloride.The L-threonine esters of the formula II can contain free bases or salts of suitable organic or inorganic compounds Acids thereof, preferably acetates, propionates, butyrates and salts of hydrogen halides like hydrochloride.

Es ist wünschenswert, die Reaktanden, nämlich die Insulinverbindung und den L-Threonin-Ester (Formel II), in hohen Konzentrationen einzusetzen. Bevorzugt wird ein Molverhältnis oberhalb etwa 5:1 zwischen dem L-Threonin-Ester und der Insulinverbindung eingesetzt.It is desirable to use the reactants, namely the insulin compound and the L-threonine ester (formula II), to be used in high concentrations. Preferred is a molar ratio above about 5: 1 between the L-threonine ester and the insulin compound are used.

Es ist wünschenswert, daß die Konzentration an L-Threonin-Ester (Formel II) in der Reaktionsmischung oberhalb von 0,1 Molar liegt.It is desirable that the concentration of L-threonine ester (Formula II) in the reaction mixture is above 0.1 molar.

Humaninsulin kann aus Threonin^B30-Estern von Humaninsulin (Formel III) durch Abspaltung der Schutzgruppe R⁴ und irgendeiner Schutzgruppe R⁵ durch bekannte Verfahren oder per se bekannte Methoden erhalten werden. Im Falle, daß R⁴ Methyl, Ethyl oder eine GruppeHuman insulin can be obtained from threonine ^B30 esters of human insulin (formula III) by splitting off the protective group R ⁴ and any protective group R ⁵ by known processes or methods known per se. In the event that R ^{4 is} methyl, ethyl or a group

-CH₂CH₂SO₂R⁶ -CH ₂ CH ₂ SO ₂ R ⁶

ist, wobei R⁶ wie oben beschrieben definiert ist, kann die Schutzgruppe unter leicht basischen Bedingungen im wäßrigen Medium abgespalten werden, bevorzugt bei einem pH-Wert von etwa 8 bis 12, beispielsweise bei etwa 9,5. Als Base können Ammoniak, Triethylamin oder Alkalimetallhydroxide verwendet werden, wie Natriumhydroxid. Falls R⁴ tert.-Butyl, substituiertes Benzyl wie p-Methoxybenzyl oder 2,4,6-Trimethylbenzyl oder Diphenylmethyl ist, kann die besagte Gruppe durch Acidolyse entfernt werden, bevorzugt mit Trifluoressigsäure. Die Trifluoressigsäure kann wasserfrei sein oder etwas Wasser enthalten oder mit einem organischen Lösungsmittel wie Dichlormethan verdünnt sein. Falls R⁵ tert.-Butyl ist, kann die Gruppe durch Acidolyse wie oben beschrieben, abgespalten werden.where R ⁶ is defined as described above, the protective group can be split off under slightly basic conditions in an aqueous medium, preferably at a pH of about 8 to 12, for example about 9.5. Ammonia, triethylamine or alkali metal hydroxides, such as sodium hydroxide, can be used as the base. If R ^{4 is} tert-butyl, substituted benzyl such as p-methoxybenzyl or 2,4,6-trimethylbenzyl or diphenylmethyl, said group can be removed by acidolysis, preferably with trifluoroacetic acid. The trifluoroacetic acid can be anhydrous or contain some water, or it can be diluted with an organic solvent such as dichloromethane. If R ^{5 is} tert-butyl, the group can be split off by acidolysis as described above.

Bevorzugte Threonin^{8 30}-Ester des Humaninsulins der Formel III sind Verbindungen, in denen R⁵ Wasserstoff ist; diese werden aus den L-Threonin-Estern der Formel II hergestellt, in denen R⁵ Wasserstoff ist.Preferred threonine ^{8 30} esters of human insulin of the formula III are compounds in which R ^{5 is} hydrogen; these are produced from the L-threonine esters of the formula II, in which R ^{5 is} hydrogen.

Die Umsetzung der Insulinverbindungen im Threonin^{8 30}-Ester des Humaninsulins kann detaillierter auf Basis folgender Formel, die einigen Insulinverbindungen gegeben wird, beschrieben werden:The conversion of the insulin compounds in the threonine ^{8 30} ester of human insulin can be described in more detail on the basis of the following formula, which is given to some insulin compounds:

R¹ R ¹

-(I-j-A-j-21) (1-I- B -J-- 29)— R² - (IjAj-21) (1-I- B -J-- 29) - R ²

wobeiwhereby

—(l-j-A-j-21)
(1 -L-B -L-29)—- (ljAj-21)
(1 -LB -L-29) -

die menschliche des-(Threonin^B30)-Insulineinheit ist, wobei Gly^A1 mit dem als R¹ bezeichneten Substituenten verbunden ist und Lys^B29 mit dem Substituenten, der als R² bezeichnet ist, verbunden ist, und worin für Schweinediarginin-Insulin R¹ Wasserstoff und R² -AIa-Arg-Arg ist, für Schweineproinsulin X Arg und R³ zusammen mit R² -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-GIu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lysist, wobei das terminale Alanyl mit Lys^B29 verbunden ist, für Hundeproinsulin X Arg oder Lys und R³ is the human des (threonine ^B30 ) insulin moiety where Gly ^{A1 is} linked to the substituent labeled ^{R 1} ^{and Lys B29 is} linked to the substituent ^{labeled R 2} and wherein for porcine diiarginine insulin R ^{1 is} hydrogen and R ^{2 is} -AIa-Arg-Arg, for porcine proinsulin X Arg and R ³ together with R ² -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu -Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu-Ala-Leu-GIu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lysist, with the terminal alanyl connected to Lys ^B29 , for Canine proinsulin X Arg or Lys and R ³

ίο zusammen mit R² -Ala-Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ala-Leu-GIn-Lysist, wobei das terminale Alanyl mit Lys⁸²⁹ verbunden ist, für gespaltenes Schweineproinsulin X Arg, R³ Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys- und R² -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu ist, für Desdipeptid-(Lys⁶²-Arg⁶³)-Proinsulin vom Schwein R' Wasserstoff und R² -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-GIy-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala- Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln ist, für menschliches Proinsulin X Arg und R³ zusammen mit R² -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-GIn- Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GIn-Lys- ist, wobei das terminale Threonyl mit Lys⁸²⁹ verbunden ist, und für Affenproinsulin X Arg oder Lys und R³ zusammen mit R² -Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly- Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lysist, wobei das terminale Threonyl mit Lys⁸²⁹ verbunden ist; für die Fälle, wo X und R³ angegeben sind, ist R¹ in Formel I durch die Gruppe der allgemeinen Formel R³ — X—substituiert.ίο together with R ² -Ala-Arg-Arg-Asp-Val-Glu-Leu-Ala-Gly-Ala-Pro-Gly-Glu-Gly-Gly-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu- Gly-Ala-Leu-GIn-Lysist, with the terminal alanyl connected to Lys ⁸²⁹ , for split porcine ^{proinsulin X Arg, R 3} Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln-Lys- and R ² -Ala- Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala-Leu is, for Desdipeptide- (Lys ⁶² -Arg ⁶³ ) -Proinsulin from pork R 'hydrogen and R ² -Ala-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asn-Pro-Gln-Ala-Gly-Ala-Val-Glu-Leu- GIy-Gly-Gly-Leu-Gly-Gly-Leu-Gln-Ala- Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Pro-Pro-Gln is, for human proinsulin X Arg and R ³ together with R ² -Thr- Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-GIn- Pro- Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-GIn-Lys- is where the terminal threonyl is connected to Lys ⁸²⁹ , and for monkey proinsulin X is Arg or Lys and R ³ together with R ² -Thr-Arg-Arg -Glu-Ala-Glu-Asp-Pro-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-G ly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lysist with the terminal threonyl connected to Lys ⁸²⁹ ; for the cases where X and R ³ are indicated, R ¹ in formula I is substituted by the group of the general formula R ³ - X -.

Die Umsetzung nach dieser Erfindung wandelt dementsprechend jegliche der oben genannten Insulinverbindungen in Threonin^B30-Ester des Humaninsulins (Formel III) um, welche sodann zur Bildung von Humaninsulin entblockiert werden.The reaction according to this invention accordingly converts any of the above-mentioned insulin compounds into threonine ^B30 esters of human insulin (Formula III), which are then unblocked to form human insulin.

Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß die in rohem Insulin vorhandenen insulinähnlichen Verbindungen, die in einigen handelsüblichen Insulinpräparationen gegenwärtig sind und durch die Formel I gedeckt werden, durch die erfindungsgemäße VerfahrenAnother advantage of the invention is that those present in raw insulin are insulin-like Compounds present in some commercial insulin preparations and represented by Formula I. are covered by the method according to the invention

in Threonin^{8 30}-Ester des Humaninsulins umgewandelt werden, welche sodann zur Bildung von Humaninsulin entblockiert werden können.be converted into threonine ^{8 30} esters of human insulin, which can then be unblocked to form human insulin.

Bei all den durch die Formel I abgedeckten Verunreinigungen wird der mit R³ — X— bezeichnete R¹-Substituent mit Wasserstoff ausgetauscht.In all of the impurities covered by the formula I ^{, the R 1} ^{substituent denoted by R 3} - X - is exchanged for hydrogen.

Ein bevorzugtes Ausführungsbeispiel der Erfindung umfaßt das Keagiereniassen von rohem Schweineinsulin, welches insulinähnliche Verbindungen enthält, oder eines Salzes oder eines Komplexes desselben mit einem L-Threonin-Ester (Formel II) oder einem Salz desselben unter oben genannten Bedingungen, wonach die Schutzgruppe R⁴ und irgendeine Schutzgruppe R⁵ abgespalten werden. Durch dieses Verfahren wird das Schweineinsulin zusammen mit insulinähnlichen Verbindungen in demselben in Humaninsulin umgewandelt. A preferred embodiment of the invention comprises the keagieren of crude porcine insulin, which contains insulin-like compounds, or a salt or a complex thereof with an L-threonine ester (formula II) or a salt thereof under the conditions mentioned above, after which the protective group R ⁴ and any protecting group R ^{5 can be} split off. This process converts porcine insulin, along with insulin-like compounds therein, to human insulin.

Als Beispiel eines Komplexes oder eines Salzes einer Insulinverbindung (Formel I) kann ein Zinkkomplex oder ein Zinksalz genannt werden.As an example of a complex or a salt of an insulin compound (formula I), a zinc complex or a zinc salt can be called.

Wenn die Reaktionsbedingungen entsprechend den obigen Erklärungen ausgewählt und die in den darauffolgenden Beispielen erzielten Resultate in Betracht gezogen werden, ist es möglich, eine Ausbeute vonWhen the reaction conditions are selected in accordance with the above explanations and those in the subsequent ones Examples of the results obtained are taken into account, it is possible to obtain a yield of

mehr als 60% Threonin^B30-Ester des Humaninsulins zu erzielen, ja sogar eine solche, die höher als 80% und unter besonders bevorzugten Bedingungen eine von mehr als 90% ist.to achieve more than 60% threonine ^B30 ester of human insulin, even one that is higher than 80% and, under particularly preferred conditions, one of more than 90%.

Ein bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des Humaninsulins ist das folgende:A preferred method of making the human insulin is as follows:

1. Das Ausgangsmaterial für die Umsetzung ist rohes Schweineinsulin, beispielsweise kristallines Insulin, das durch Verwendung eines Citratpuffers, siehe US-PS 26 26 228, hergestellt wurde.1. The starting material for the implementation is raw pig insulin, for example crystalline insulin, which was prepared using a citrate buffer, see US Pat. No. 2,626,228.

2. Falls nach der Umsetzung noch etwas Trypsin-Aktivität übrigbleibt, wird diese bevorzugt unter Bedingungen, unter denen Trypsin nicht aktiv ist, beispielsweise in saurem Medium mit einem pH-Wert unterhalb von 3, entfernt. Trypsin kann durch Trennverfahren nach dem Molekulargewicht, beispielsweise durch Gelfiltration auf Sephadex® G-50 oder Bio-gel^e P-30 in 1 M Essigsäure, siehe Nature 280, 412, entfernt werden.2. If some trypsin activity still remains after the reaction, this is preferably removed under conditions under which trypsin is not active, for example in an acidic medium with a pH below 3. Trypsin can be removed by separation processes according to the molecular weight, for example by gel filtration on Sephadex® G-50 or Bio-gel ^e P-30 in 1 M acetic acid, see Nature 280, 412.

3. Andere Verunreinigungen, wie beispielsweise nicht reagiertes Schweineinsulin, können durch Anionen- oder Kationenaustaiischchromatographie, siehe Beispiele 1 und 2, entfernt werden.3. Other contaminants, such as unreacted porcine insulin, can get through Anion or cation exchange chromatography, see Examples 1 and 2, can be removed.

4. Anschließend wird der Threonin^B30-Ester des Humaninsulins entblockiert und das Humaninsulin in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Kristallisation, isoliert.4. The threonine ^B30 ester of the human insulin is then unblocked and the human insulin is isolated in a manner known per se, for example by crystallization.

Durch dieses Verfahren kann Insulin einer akzeptablen pharmazeutischen Reinheit erhalten und, falls gewünscht, weiterer Reinigung unterworfen werden.Through this procedure, insulin can be an acceptable one obtained pharmaceutical purity and, if desired, subjected to further purification.

Weiterhin werden nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Threonin^B30-Ester des Humaninsulins erhalten, in welchen sich die Estergruppe von tert.-Butyl und Methyl unterscheidet. ^{Furthermore, threonine B30} esters of human insulin in which the ester group differs from tert-butyl and methyl are obtained by the process according to the invention.

Die hier verwandten Abkürzungen entsprechen den von der IUPAC-IUB Commission in Biochemical Nomenclature, 1974, empfohlenen Regeln, siehe Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland, 1975.The abbreviations used here correspond to those of the IUPAC-IUB Commission in Biochemical Nomenclature, 1974, recommended rules, see Collected Tentative Rules & Recommendations of the Commission on Biochemical Nomenclature IUPAC-IUB, 2nd ed., Maryland, 1975.

Analytische UntersuchungenAnalytical studies

Die Umwandlung von Schweineinsulin und Schweineproinsulin in Humaninsulinester kann durch DISC PAGE-Elektrophorese in 7,5% Polyacrylamidgel in einem Puffer, bestehend aus 0,375 M Tris, 0,06 M HCl und 8 M Harnstoff demonstriert werden. Der pH-Wert des Puffers beträgt 8,7. Ester der Formel III wandern mit 75 % der Geschwindigkeit von Schweineinsulin. Schweineproinsuiin wandert mit 55 % der Geschwindigkeit von Schweineinsulin und wird durch den erfindungsgemäßen Prozeß in das gleiche Produkt umgewandelt. Identifizierung der Umwandlungsprodukte als Verbindungen der Formel III erfolgt aufgrund folgender Kriterien:The conversion of porcine insulin and porcine proinsulin to human insulin esters can be achieved by DISC PAGE electrophoresis in 7.5% polyacrylamide gel in a buffer consisting of 0.375 M Tris, 0.06 M HCl and 8 M urea can be demonstrated. The pH of the buffer is 8.7. Esters of the formula III migrate with them 75% the speed of porcine insulin. Porcine protein migrates at 55% the speed of Porcine insulin and is converted into the same product by the process of the invention. identification the conversion products as compounds of the formula III are based on the following criteria:

a) die elektrophoretische Migration der Humaninsulinester der Formel III, bezogen auf Schweineinsulin, entspricht dem Verlust einer negativen Ladung. a) the electrophoretic migration of human insulin esters of formula III, based on porcine insulin, corresponds to the loss of a negative charge.

b) Die Aminosäurezusammensetzung der angefärbten Proteinbänder im Gel, die die Verbindungen der Formel III repräsentieren, ist identisch mit derjenigen des Humaninsulins, nämlich 3 M Threonin und 1 M Alanin pro Mol Insulin, und die Zusammensetzung des Schweineinsulins beträgt 2 M Threonin und 2 M Alanin pro Mol Insulin. Die Technik der Aminosäureanalyse von Proteinbändern in Polyaoiylamidgelen ist in Eur. J. Biochem. 25, 147, beschrieben.b) The amino acid composition of the stained protein bands in the gel that make up the compounds of formula III are identical to that of human insulin, namely 3 M threonine and 1M alanine per mole of insulin, and the composition of porcine insulin is 2M Threonine and 2 M alanine per mole of insulin. The technique of amino acid analysis of protein bands in polyaoylamide gels is in Eur. J. Biochem. 25, 147.

c) Der Beweis, daß das eingebaute Threonin als C-ter-ϊ minale Aminosäure in der B-Kette gebunden wird, wird durch oxidative Sulfitolyse der Schwefelbrükken des Insulins in 6 M Guanidiniumhydrochlorid, gefolgt durch Abtrennen der A- und B-Ketten durch Ionenaustauschchromatographie an SP Se-c) The proof that the built-in threonine as C-ter-ϊ The minimal amino acid bound in the B chain is formed by oxidative sulfitolysis of the sulfur bridges of the insulin in 6 M guanidinium hydrochloride, followed by severing the A and B chains by ion exchange chromatography on SP Se-

lü phadex, geführt. Die Verdauung des B-Ketten-S-Sulfonats mit Carboxypeptidase A setzt lediglich die C-terminale Aminosäure frei. Diese Technik ist von Markussen in Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, 12-14 July, 1978 (Herausgeber: Baba, Kaneko & Yaniahara) Ißt. Congress Series No. 468, Excernta Medica, Amsterdam — Oxford beschrieben. Die Analyse wird durchgeführt, nachdem die Estergruppe von den Verbindungen der Formel IH abge-lü phadex, led. Digestion of the B-chain S-sulfonate with carboxypeptidase A only releases the C-terminal amino acid. This technique is von Markussen in Proceedings of the Symposium on Proinsulin, Insulin and C-peptide, Tokushima, July 12-14, 1978 (Editors: Baba, Kaneko & Yaniahara) Eats. Congress Series No. 468, Excernta Medica, Amsterdam - Oxford. The analysis is carried out after the ester group from the compounds of the formula IH

-Ό spalten worden ist.-Ό has been split.

Diese drei Analysen zeigen eindeutig, daß Umwandlung in Humaninsulin stattgefunden hat. Die Umwandlung von Schweineinsulin und Schwei-These three analyzes clearly show that conversion to human insulin has occurred. The conversion of pig insulin and sweat

2> neproinsulin in Humaninsulin kann quantitativ durch HPLC (Hochdruckflüssigkeitschromatographie) in Umkehrphase verfolgt werden. Eine 4 X 300 mm μ Bondapak C_lg-Säule (Waters Ass.) wurde eingesetzt und die Elution mit einem 0,2 M Ammoniumsulphat (mit2> neproinsulin in human insulin can be followed quantitatively by HPLC (high pressure liquid chromatography) in reverse phase. A 4 X 300 mm μ Bondapak C _lg column (Waters Ass.) Was used and the elution with a 0.2 M ammonium sulphate (with

w Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 3,5 eingestellt) und 26 bis 50 Vol.-% Acetonitril aufweisenden Puffer durchgeführt. Die optimale Acetonitrilkonzentration hängt davon ab, welchen Ester der Formel III man vom Schweineinsulin abzutrennen wünscht. Im Falle, daß R⁴ Methyl und R⁵ Wasserstoff ist, wird die Auftrennung in 26 Vol.-% Acetonitril erreicht. Schweineinsulin und (Thr-OMe)^B30-h-In (Me ist Methyl) sind nach 4,5 bzw. 5,9 Säulenvolumen eluiert, als gut aufgetrennte, symmetrische Peaks. Vor dem Auftragen auf der HPLC-Säule wurden die Proteine in der Reaktionsmischung durch Zugabe von 10 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Das Ausgefällte wurde durch Zentrifugation isoliert, vakuumgetrocknet und in 0,02 M Schwefelsäure gelöst. Das Verfahren zur Herstellung der Humaninsulin- w sulfuric acid adjusted to a pH of 3.5) and carried out a buffer containing 26 to 50% by volume of acetonitrile. The optimal acetonitrile concentration depends on which ester of the formula III one wishes to separate from the porcine insulin. In the event that R ^{4 is} methyl and R ^{5 is} hydrogen, separation in 26% by volume of acetonitrile is achieved. Porcine insulin and (Thr-OMe) ^B30 -h-In (Me is methyl) eluted as well-separated, symmetrical peaks after 4.5 and 5.9 column volumes, respectively. Before application to the HPLC column, the proteins in the reaction mixture were precipitated by adding 10 parts by volume of acetone. The precipitate was isolated by centrifugation, vacuum dried and dissolved in 0.02 M sulfuric acid. The process for making the human insulin

4"i ester und des Humaninsulins wird durch folgende Beispiele genauer erläutert.4 "i ester and human insulin is illustrated by the following examples explained in more detail.

example 1

200 mg rohes Schweineinsulin, einmal kristallisiert,200 mg raw pork insulin, once crystallized,

so wurden in 1,8 ml 3,33 M Essigsäure gelöst. 2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe (Me ist Methyl) in Ν,Ν-Dirnethylacetamid und 20 mg Trypsin, gelöst in 0,2 ml Wasser, wurden zugegeben. Nach 18-stündigem Stehenlassen bei 37°C wurden die Proteine durch Zugabe von 40 ml Aceton ausgefällt, und das Ausgefällte durch Zentrifugieren isoliert. Der Überstand wurde verworfen. Analyse des Ausgefällten durch HPLC unter Verwendung von 26% Acetonitril (siehe »Analytische Untersuchungen«) zeigt eine 60%ige Umwandlung desso were dissolved in 1.8 ml of 3.33 M acetic acid. 2 ml of a 2 M solution of Thr-OMe (Me is methyl) in Ν, Ν-dirnethylacetamide and 20 mg of trypsin dissolved in 0.2 ml of water were added. After standing for 18 hours at 37 ° C., the proteins were precipitated by adding 40 ml of acetone, and the precipitated through Centrifugation isolated. The supernatant was discarded. Analysis of the precipitate by HPLC using of 26% acetonitrile (see "Analytical Investigations") shows a 60% conversion of the

Schweineinsulins in (Thr-OMe)^B30-h-In. Das Ausgefällte wurde in 8 ml frisch entionisierter 8 M Harnstofflösung gelöst, der pH-Wert auf 8,0 mit 1M Ammoniaklösung eingestellt, und die Lösung auf eine 2,5 x 25 cm Säule, gepackt mit QAE A-25 Sephadex®, mit einemPig insulin in (Thr-OMe) ^B30- h-In. The precipitate was dissolved in 8 ml of freshly deionized 8 M urea solution, the pH was adjusted to 8.0 with 1M ammonia solution, and the solution was applied to a 2.5 x 25 cm column packed with QAE A-25 Sephadex® with a

t>5 0,1 M Ammoniumchloridpuffer equilibriert, welcher 60 Vol.-% Ethanol enthielt, und dessen pH-Wert mit Ammoniak auf 8,0 eingestellt worden war, aufgetragen. Die Elution wurde mit dem gleichen Puffer durchge-t> 5 0.1 M ammonium chloride buffer equilibrated, which Containing 60% by volume of ethanol, and the pH of which had been adjusted to 8.0 with ammonia, was applied. The elution was carried out with the same buffer

fiihrt, und Fraktionen von 15 ml gesammelt. (Thr-OMe)^B30-h-In wurde in den Fraktionen 26 bis 46 gefunden, nicht reagiertes Schweineinsulin in den Fraktionen 90 bis 120. Die Fraktionen Nr. 26 bis 46 wurden vereinigt, das Ethanol im Vakuum verdampft, und (Thr-OMe)^B30-h-In in einem Citratpuffer, wie durch Schlichtkrüll et al., Handbuch der inneren Medizin 7/2 A, 96, Springer-Verlag Berlin, 1975 beschrieben, kristallisiert. Die Ausbeute betrug 95 mg Kristalle mit der gleichen rhombischen Gestalt wie auf die gleiche Art und Weise kristallisiertes Schweineinsulin. Die Aminosäurezusammensetzung wurde als identisch mit derjenigen von Humaninsulin befunden. Weitere analytische Untersuchungen, die in dem oberen Abschnitt »Analytische Untersuchungen« beschrieben sind, zeigten, daß das entstandene Produkt (Thr-OMe)^B30-h-In war.leads, and fractions of 15 ml collected. (Thr-OMe) ^B30- h-In was found in fractions 26 to 46, unreacted porcine insulin in fractions 90 to 120. Fractions No. 26 to 46 were pooled, the ethanol evaporated in vacuo, and (Thr-OMe ) ^B30- h-In in a citrate buffer, as described by Schlichtkrüll et al., Handbuch der Innere Medizin 7/2 A, 96, Springer-Verlag Berlin, 1975, crystallized. The yield was 95 mg of crystals having the same rhombic shape as porcine insulin crystallized in the same manner. The amino acid composition was found to be identical to that of human insulin. Further analytical investigations, which are described in the "Analytical investigations" section above, showed that the product formed (Thr-OMe) was ^B30- h-In.

Example 2

100 mg Schweineinsulin, welche den Reinheitsanforderungen der GB-PS 12 85 023 genügten, wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst und anschließend 1 ml einer 2 M Lösung Threonin-Methylester in N,N-DimethylformamidundnmgmitTPCKOTosylphenylalaninchloromethylketon) behandeltes Trypsin, gelöst in 0,1 ml Wasser, zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37°C wurde die Reaktion durch Zugabe von 4 ml 1 M Phosphorsäure beendet. Das erhaltene (Thr-OMe)^B30-h-In wurde von dem nicht reagierten Schweineinsulin durch Ionenaustauschchromatographie auf einer 2,5 X 25 cm Säule mit SP-Sephadex® mittels eines Elutionsmittels, welches 0,09 M Natriumchlorid und 0,02 M Natriumdihydrogenphosphat (pH-Wert des Puffers: 5,5) in 60% Ethanol aufwies, abgetrennt. Fraktionen enthaltend (Thr-OMe)^B30-h-In wurden vereinigt, das Ethanol im Vakuum entfernt und das Produkt wie in Beispiel 1 kristallisiert. Die Ausbeute betrug 50 mg (Thr-OMe)^B30-h-In.100 mg of pig insulin, which met the purity requirements of GB-PS 12 85 023, were dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and then 1 ml of a 2 M solution of threonine methyl ester in N, N-dimethylformamide and trypsin treated with TPCKOTosylphenylalanine chloromethyl ketone) in 0.1 ml of water was added. After an incubation time of 24 hours at 37 ° C., the reaction was terminated by adding 4 ml of 1 M phosphoric acid. The (Thr-OMe) ^B30- h-In obtained was purified from the unreacted porcine insulin by ion exchange chromatography on a 2.5 x 25 cm column with SP-Sephadex® using an eluent containing 0.09 M sodium chloride and 0.02 M sodium dihydrogen phosphate (pH of the buffer: 5.5) in 60% ethanol, separated off. Fractions containing (Thr-OMe) ^B30- h-In were combined, the ethanol was removed in vacuo and the product was crystallized as in Example 1. The yield was 50 mg (Thr-OMe) ^B30- h-In.

Example 3

100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst, in (Thr-OMe)^B30-h-ln umgewandelt und wie für Schweineinsulin in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt. Die Umwandlung von Proinsulin in (Thr-OMe)³³⁰-h-In wurde mittels HPLC-Analyse des Aceton-Niederschlags zu 73% bestimmt. Die Ausbeute an kristallinem (Thr-OMe)^B30-h-In betrug 54 mg.100 mg of porcine proinsulin were dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid, converted into (Thr-OMe) ^B30- h-ln and purified as described in Example 1 for porcine insulin. The conversion of proinsulin into (Thr-OMe) ³³⁰ -h-In was determined to be 73% by means of HPLC analysis of the acetone precipitate. The yield of crystalline (Thr-OMe) ^B30- h-In was 54 mg.

Example 4

100 mg Schweineinsulin werden in 0,9 ml 2,77 M Essigsäure in Wasser gelöst und analog dem in Beispie! 2 beschriebenen Verfahren zur Reaktion gebracht. Nach Beendigung de_;· Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese zeigt eine Umwandlung von 70% in (Thr-OMe)^B30-h-In.100 mg pork insulin are dissolved in 0.9 ml 2.77 M acetic acid in water and analogous to that in Example! 2 method described brought to reaction. After finishing de _; · In the reaction, the proteins were precipitated by adding 10 parts by volume of acetone. Analysis by DISC PAGE electrophoresis shows a conversion of 70% to (Thr-OMe) ^B30 -h-In.

Example 5

100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst und 1 ml 2 M Thr-OMe-Lösung in N-Methylpyrrolidon zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen durchgeführt und die Umwandlung in (Thr-OMe)^B30-h-In war 20%.100 mg of porcine insulin were dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and 1 ml of 2 M Thr-OMe solution in N-methylpyrrolidone was added. The reaction was carried out analogously to that described in Example 4 and the conversion to (Thr-OMe) ^B30- h-In was 20%.

Example 6

100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 2,77 M Essigsäure in Wasser gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in HMPA (Hexamethylphosphortriamid) zugegeben. Die Reaktion wurde analog derjenigen in Beispiel 4 beschriebenen durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)^B30-h-In betrug 80%.100 mg of porcine insulin were dissolved in 0.9 ml of 2.77 M acetic acid in water and 1 ml of a 2 M Thr-OMe solution in HMPA (hexamethylphosphoric triamide) was added. The reaction was carried out analogously to that described in Example 4. The conversion to (Thr-OMe) ^B30- h-In was 80%.

Example 7

100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in Ν,Ν-Dimethylacetamid zugegeben. Die Reaktion wurde analog derjenigen in Beispiel 4 beschriebenen durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)^B30-h-In betrug 80%.100 mg of porcine insulin were dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and 1 ml of a 2 M Thr-OMe solution in Ν, Ν-dimethylacetamide was added. The reaction was carried out analogously to that described in Example 4. The conversion to (Thr-OMe) ^B30- h-In was 80%.

Example 8

100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung100 mg of porcine insulin was dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and 1 ml of a 2 M Thr-OMe solution

!5 in Ν,Ν-Dimethylacetamid zugegeben. Anschließend wurde Trypsin mit 200 U Aktivität (gemessen gegen das Substrat BAEE), immobilisiert an 1 g Glasperlen, zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden bei 37°C wurde das an das Glas gebundene Trypsin durch Filtration abgetrennt. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Vol.-Teilen Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese zeigte eine Umwandlung in (Thr-OMe)^B30-h-In von 40%.! 5 in Ν, Ν-dimethylacetamide added. Trypsin with 200 U activity (measured against the substrate BAEE), immobilized on 1 g of glass beads, was then added. After an incubation time of 24 hours at 37 ° C., the trypsin bound to the glass was separated off by filtration. After the reaction had ended, the proteins were precipitated by adding 10 parts by volume of acetone. Analysis by DISC PAGE electrophoresis showed a conversion to (Thr-OMe) ^B30- h-In of 40%.

Example 9

100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 rnl 3,33 M Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in Ν,Ν-Dimethylacetamid zugegeben. Anschließend wurde Trypsin entsprechend einer Aktivität von 300 U (die Aktivität wurde gegen das Substrat BAEE gemessen) immobilisiert an 200 mg CNBr-aktiviertem Sephadex® G-150, zugegeben. Nach einer Inkubation von 24 Stunden bei 37°C wurde das an Sephadex® gebundene Trypsin durch Filtration abgetrennt. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von 10 Volumen-Teilen Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese zeigte eine Umwandlung in (Thr-OMe)^B50-h-In von 70%.100 mg of porcine insulin were dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and 1 ml of a 2 M Thr-OMe solution in Ν, Ν-dimethylacetamide was added. Then trypsin corresponding to an activity of 300 U (the activity was measured against the substrate BAEE) immobilized on 200 mg CNBr-activated Sephadex® G-150 was added. After incubation for 24 hours at 37 ° C., the trypsin bound to Sephadex® was separated off by filtration. After the reaction had ended, the proteins were precipitated by adding 10 parts by volume of acetone. Analysis by DISC PAGE electrophoresis showed a conversion to (Thr-OMe) ^B50 -h-In of 70%.

Example 10

Das in Beispiel 7 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, mit der Voraussetzung, daß der eingesetzte Ester eine 2 M Lösung von Thr-OBu¹ (Bu¹ ist tert.-Butyl) in Ν,Ν-Dimethylacetamid war. Die Umwandlung in (ΉΐΓ-ΟΒυ¹)⁸³⁰^-^ betrug 80%.The procedure described in Example 7 was repeated with the proviso that the ester used was a 2 M solution of Thr-OBu ¹ (Bu ¹ is tert-butyl) in Ν, Ν-dimethylacetamide. The conversion to (ΉΐΓ-ΟΒυ ¹ ) ⁸³⁰ ^ - ^ was 80%.

Example 11

Das in Beispiel 8 beschriebene Beispiel wurde wiederholt, wobei der eingesetzte Ester eine 2 M Lösung von Thr-OBu¹ in Ν,Ν-Diroethylac.etamid war. Die Umwandlung in (Thr-OBu¹)⁸³⁰-h-In betrug 30%.The example described in Example 8 was repeated, the ester used being a 2 M solution of Thr-OBu ¹ in Ν, Ν-Diroethylac.etamide. The conversion to (Thr-OBu ¹ ) ⁸³⁰ -h-In was 30%.

Example 12

Das in Beispiel 9 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei der eingesetzte Ester eine 2 M Lösung von Thr-OBu¹ in Ν,Ν-Dimethylacetamid war. Die Umwandlung in (ΤηΓ-ΟΒυ¹)⁸³⁰-!!-^! betrug 70%.The process described in Example 9 was repeated, the ester used being a 2 M solution of Thr-OBu ¹ in Ν, Ν-dimethylacetamide. The conversion to (ΤηΓ-ΟΒυ ¹ ) ⁸³⁰ - !! - ^! was 70%.

Example 13

100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst und 1 ml 2 M Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen Weise durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)^B30-h-In betrug 80%.100 mg of porcine proinsulin were dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and 1 ml of 2 M Thr-OMe in Ν, Ν-dimethylacetamide was added. The reaction was carried out analogously to the manner described in Example 4. The conversion to (Thr-OMe) ^B30- h-In was 80%.

Beispiel 14
100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 MExample 14
100 mg of porcine proinsulin was added to 0.9 ml of 3.33 M

Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N.N-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde mit immobilisiertem Trypsin analog dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren behandelt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)^ll3"-h-In betrug 40%.Dissolved acetic acid and added 1 ml of a 2 M solution of Thr-OMe in NN-dimethylacetamide. The mixture was treated with immobilized trypsin analogously to the method described in Example 8. The conversion to (Thr-OMe) ¹¹³ "-h-In was 40%.

Example 15

100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N,N-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde analog dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren mit immobilisiertem Trypsin behandelt. Die Umwandlung in (Thr-OMe)^B3"-h-In betrug 70%.100 mg of porcine proinsulin was dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and 1 ml of a 2 M solution of Thr-OMe in N, N-dimethylacetamide was added. The mixture was treated with immobilized trypsin analogously to the method described in Example 9. The conversion to (Thr-OMe) ^B3 "-h-In was 70%.

Example 16

100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OBu'-Lösung in Ν,Ν-Dimethylacetamid zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OBu')^B3u-h-In betrug 80%.100 mg of porcine proinsulin were dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and 1 ml of a 2 M Thr-OBu 'solution in Ν, Ν-dimethylacetamide was added. The reaction was carried out analogously to that described in Example 4. The conversion to (Thr-OBu ') ^B3u-h -In was 80%.

Example 17

100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OBu'-Lösung in Ν,Ν-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde mit an Glasperlen immobilisiertem Trypsin analog dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren durchgeführt. Die Umwandlung in (Thr-OBu')^B:'"-h-in betrug 40%.100 mg of porcine proinsulin were dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and 1 ml of a 2 M Thr-OBu 'solution in Ν, Ν-dimethylacetamide was added. Mixing was carried out using trypsin immobilized on glass beads in a similar manner to the method described in Example 8. The conversion to (Thr-OBu ') ^B: '"-h-in was 40%.

Example 18

100 mg Schweineproinsulin wurden in 0,9 ml 3,33 M Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Thr-OBu'-Lösung in Ν,Ν-Dimethylacetamid zugegeben. Die Mischung wurde mit Trypsin, immobilisiert an CNBr-aktiviertem Sephadex G-150, behandelt, analog dem in Beispiel 9 beschriebenen Prozeß. Die Umwandlune in (Thr-OBu')^B3°-h-In betrug 70%.100 mg of porcine proinsulin were dissolved in 0.9 ml of 3.33 M acetic acid and 1 ml of a 2 M Thr-OBu 'solution in Ν, Ν-dimethylacetamide was added. The mixture was treated with trypsin immobilized on CNBr-activated Sephadex G-150, analogously to the process described in Example 9. The conversion to (Thr-OBu ') ^B3 ° -h-In was 70%.

Example 19

100 mg Schwcincir.suün wurden in 0,5 m! 6 M Essigsäure gelöst und mit 1 ml 1 M Lösung von Thr-OTmb (Tmb ist 2,4,6-Trimethylbenzyl) in Ν,Ν-Dimethylacetamid versetzt. Weiterhin wurden 0,5 ml N.N-Dimethyiacetamidund5 mg TPCK-behandeltes Trypsin in 0,1 ml Wasser zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde bei 32°C 44 Stunden stehengelassen. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die Proteine durch Zugabe von iO Volumenteilen Aceton ausgefällt. Analyse durch DISC PAGE-Elektrophorese zeigte eine Umwandlung in (Thr-OTmb)^B30-h-In von 50%.100 mg Schwcincir.suün were in 0.5 m! 6 M acetic acid dissolved and mixed with 1 ml 1 M solution of Thr-OTmb (Tmb is 2,4,6-trimethylbenzyl) in Ν, Ν-dimethylacetamide. Furthermore, 0.5 ml of NN-dimethyl acetamide and 5 mg of TPCK-treated trypsin in 0.1 ml of water were added. The reaction mixture was allowed to stand at 32 ° C. for 44 hours. After completion of the reaction, the proteins were precipitated by adding 10 parts by volume of acetone. Analysis by DISC PAGE electrophoresis showed a conversion to (Thr-OTmb) ^B30 -h-In of 50%.

Example 20

100 mg SchweineinsuHn wurden in 0,9 ml 3 M Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Dioxan zugegeben. Die Reaktion wurde analog derjenigen in Beispiel 4 beschriebenen Weise durchgeführt; die Umwandlung in (Thr-OMe)^B30-h-In betrug 10%.100 mg of pig insect were dissolved in 0.9 ml of 3 M acetic acid and 1 ml of a 2 M solution of Thr-OMe in dioxane was added. The reaction was carried out analogously to that described in Example 4; the conversion to (Thr-OMe) ^B30- h-In was 10%.

Example 21

100 mg Schweineinsulin wurden in 0,9 ml 3 IvI Essigsäure gelöst und 1 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Acetonitril zugegeben. Die Reaktion wurde analog der in Beispiel 4 beschriebenen Art und Weise durchgeführt, und die Umwandlung in (Thr-OMe)^B3n-h-In betrue 10%.100 mg of porcine insulin were dissolved in 0.9 ml of 3 IvI acetic acid and 1 ml of a 2 M solution of Thr-OMe in acetonitrile was added. The reaction was carried out analogously to the manner described in Example 4, and the conversion to (Thr-OMe) ^B3n -h-In was 10%.

Example 22

250 mg kristalline (Thr-OMe)"^3lJ-h-In wurden in 25 ml Wasser dispergiert und durch Zugabe von 1 N Natrium-250 mg of crystalline (Thr-OMe) " ^3lJ -h-In were dispersed in 25 ml of water and by adding 1N sodium

ί hydroxidlösung bis zu einem pH-Wert von 10,0, gelöst. Der pH-Wert wurde konstant für 24 Stunden bei 25°C auf 10.0 gehalten. Das gebildete Humaninsulin wurde durch Zugabc von 2 g Natriumchlorid, 350 mg Natriumacetattrihydrat und 2.5 mg Zinkaeetatdihydrat, gefolgtί hydroxide solution up to a pH value of 10.0, dissolved. The pH was kept constant at 10.0 for 24 hours at 25 ° C. The human insulin formed was by adding 2 g of sodium chloride, 350 mg of sodium acetate trihydrate and 2.5 mg zinc acetate dihydrate followed

Ii durch Zugabe von 1 N Salzsaure zum Erhalt eines pH-Wertes von 5.52 kristallisiert. Nach 24-stündigem Stehenlassen bei 4°C wurden die rhor.boedrischen Kristalle durch Zentrifugieren isoliert, mit 3 ml Wasser gewaschen, nochmals durch Zentrifugation isoliert undIi by adding 1N hydrochloric acid to obtain a pH value crystallized from 5.52. After standing at 4 ° C for 24 hours, the rhorohedral crystals became isolated by centrifugation, washed with 3 ml of water, isolated again by centrifugation and

π vakuumgetrocknet. Ausbeute: 220 mg Humaninsulin.π vacuum dried. Yield: 220 mg human insulin.

Example 23

100 mg (Thr-OTmb)"³" wurden in 1 ml eiskalter Trifluoressigsäure gelöst und die Lösung 2 Stunden bei 0⁰C100 mg (Thr-OTmb) ^"3" were dissolved in 1 ml of ice cold trifluoroacetic acid and the solution for 2 hours at 0 C ⁰

:» stehengelassen. Das gebildete Humaninsulin wurde durch Zugabe von 10 ml Tetrahydrofuran und 0.97 ml 1,03 M Salzsäure in Tetrahydrofuran ausgefällt. Der gebildete Niederschlag wurde durch Zentrifugation isoliert, mit 10 ml Tetrahydrofuran gewaschen, durch Zen-:" ditched. The human insulin formed was precipitated by adding 10 ml of tetrahydrofuran and 0.97 ml of 1.03 M hydrochloric acid in tetrahydrofuran. The educated Precipitate was isolated by centrifugation, washed with 10 ml of tetrahydrofuran, by centrifugation

2^r> trifugaiion abgetrennt und vakuumgetrocknet. Der Niederschlag wurde in 10 ml Wasser gelöst und der pH-Wert der Lösung mittels 1 N Natriumhydroxidlösung auf 2.5 eingestellt. Das Humaninsulin wurde durch Zugabe von 1,5 g Natriumchlorid ausgefällt und durch 2 ^r > trifugaiion separated and vacuum dried. The precipitate was dissolved in 10 ml of water and the pH of the solution was adjusted to 2.5 using 1N sodium hydroxide solution. The human insulin was precipitated by the addition of 1.5 g of sodium chloride and washed through

j» Zentrifugation isoliert. Der Niederschlag wurde in 10 ml Wasser gelöst und das Humaninsulin durch Zugabe von U.8 g Natriumchlorid. 3,7 mg Zinkacetatdihydrat und 0.14 g Natriumacetattrihydrat, gefolgt durch die Zugabe von 1 N Natriumhydroxidlösung zum Erhaltj »centrifugation isolated. The precipitate was in 10 ml of water and the human insulin by adding U.8 g of sodium chloride. 3.7 mg zinc acetate dihydrate and 0.14 g of sodium acetate trihydrate, followed by the addition of 1N sodium hydroxide solution to obtain

i> eines pH-Wertes von 5.52. ausgefällt. Nach Stehenlassen bei 4⁰C tür 24 Stunden wurde der Niederschlag durch Zentrifugation isoliert, mit 0.9 ml Wasser gewaschen, nochmals durch Zentrifugation isoliert und vakuumgetrocknet. Ausbeute: 90 mg Humaninsulin.i> a pH value of 5.52. failed. After standing at 4 ⁰ C door 24 hours, the precipitate was isolated by centrifugation, washed with 0.9 ml of water, again isolated by centrifugation and vacuum dried. Yield: 90 mg human insulin.

Example 24

100 ην*! Schv.cineinsuün wurden in 0 *■· ml 10 M Essigsäure gelöst und 1.3 ml einer 1.54 M Lösung von Thr-OMc in Ν,Ν-Dimethylacetamid zugegeben. Die100 ην *! Schv.cineinsuün were in 0 * ■ · ml of 10 M acetic acid dissolved and 1.3 ml of a 1.54 M solution of Thr-OMc in Ν, Ν-dimethylacetamide added. the

■r> Mischung wurde auf i2°C abgekühlt. 10 mg Trypsin, gelöst in 0.2 ml 0.05 M Calciumacetat-Lösung, wurden zugegeben. Nach Stehenlassen von 48 Stunden bei 12⁰C wurden die Proteine durch Zugabe von 20 ml Aceton ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins inThe mixture was cooled to 12 ° C. 10 mg trypsin, dissolved in 0.2 ml 0.05 M calcium acetate solution, were added. After leaving to stand for 48 hours at 12 ^° C., the proteins were precipitated by adding 20 ml of acetone. The conversion of the pig insulin into

V) (Thr-OMe)^B-"-h-ln betrug 97*%. wie durch HPLC festgestellt wurde. V) (Thr-OMe) ^B - "- h-ln * was 97% as was determined by HPLC..

Example 25

20 mg Schweineinsulin wurden in einer Mischung von 0,08 ml 1OM Essigsäure und 0,14 ml Wasser gelöst. 0.2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben und die Mischung auf -10⁰C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumaceiat-Lösung wurden zugegeben. oo Nach 72 Stunden Stehenlassen bei -10⁰C wurden die Proteine durch Zugabe von 5 ml Aceton ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)^B30-hin betrug 64%, wie durch HPLC nachgewiesen wurde.20 mg of porcine insulin was dissolved in a mixture of 0.08 ml of 10M acetic acid and 0.14 ml of water. 0.2 ml of a 2 M solution of Thr-OMe in Ν, Ν-dimethylacetamide was added and the mixture cooled to -10 ⁰ C. 2 mg of trypsin dissolved in 0.025 ml of 0.05 M calcium aceiate solution were added. oo After 72 hours, allowing to stand at -10 ⁰ C the proteins were precipitated by the addition of 5 ml of acetone. The conversion of the porcine insulin to (Thr-OMe) ^B30 -hin was 64% as confirmed by HPLC.

Example 26

20 mg Schweineinsuiin wurden in 0.1 ml Wasser gegeben. Zugabe von 0.6 mi einer 2 M Lösung von Thr-OMe in N.N-Dimethvlacetamid veranlaßten das Insu-20 mg of pig insulin was added to 0.1 ml of water. Addition of 0.6 ml of a 2 M solution of Thr-OMe in N.N-Dimethvlacetamid caused the Insu-

lin, sich zu lösen. Die Mischung v/urde auf 7°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumacotats, wurden zugegeben. Nach 24 Stunden bei 7°C wurden die Proi eine durch Zugabe von 5 ml Aceton ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)^B30-h-In betrug 62%, wie durch HPLC nachgewiesen werden konnte.lin to loosen up. The mixture was cooled to 7 ° C. 2 mg of trypsin dissolved in 0.025 ml of 0.05 M calcium acotate was added. After 24 hours at 7 ° C., the samples were precipitated by adding 5 ml of acetone. The conversion of the porcine insulin to (Thr-OMe) ^B30- h-In was 62% as confirmed by HPLC.

Example 27

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,135 ml einer 4,45 M Propionsäure gelöst. 0,24 ml einer 1,67 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetat-Lösung wurden zugegeben und die Mischung bei 37°C 24 Stunden gehalten. Die Proteine wurden durch Zugabe von 10 Volumenteilen 2-Propanol ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)^B30-h-In betrug, wie durch HPLC nachgewiesen werden konnte, 75%.20 mg of porcine insulin was dissolved in 0.135 ml of 4.45 M propionic acid. 0.24 ml of a 1.67 M solution of Thr-OMe in Ν, Ν-dimethylacetamide were added. 2 mg of trypsin dissolved in 0.025 ml of a 0.05 M calcium acetate solution were added and the mixture was kept at 37 ° C. for 24 hours. The proteins were precipitated by adding 10 parts by volume of 2-propanol. The conversion of the porcine insulin to (Thr-OMe) ^B30- h-In was 75% as could be demonstrated by HPLC.

Example 28

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml Wasser dispergiert. 0,4 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben, gefolgt durch 0,04 m! 10 N Salzsäure, welches das Insulin veranlaßte, sich zu lösen. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M Lösung von Calciumacetat, wurden zugegeben und die M ischung bei 37°C 4 Stunden gehalten. Analyse durch HPLC zeigte eine 46%ige Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)-h-In.20 mg of porcine insulin was dispersed in 0.1 ml of water. 0.4 ml of a 2 M solution of Thr-OMe in Ν, Ν-dimethylacetamide were added, followed by 0.04 m! 10 N hydrochloric acid, which caused the insulin to to loosen up. 2 mg of trypsin dissolved in 0.025 ml of a 0.05 M solution of calcium acetate was added and the mixture was kept at 37 ° C for 4 hours. Analysis by HPLC showed 46% conversion of the Pig insulin in (Thr-OMe) -h-In.

Example 29

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,175 ml 0,57 M Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 0,025 ml einer 0,05 M Lösung von Calciumacetat. 10 mg einer Rohpräparation von Achromobacter lyticus-Protease wurden zugegeben und die Mischung 22 Stunden bei 37°C gehalten. Die Proteine wurden durch Zugabe von 10 Volumenteilen Aceton ausgefällt. Die Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)^B30-h-In betrug 12%, wie durch HPLC nachgewiesen werden konnte.20 mg of porcine insulin was dissolved in 0.175 ml of 0.57 M acetic acid. 0.2 ml of a 2 M solution of Thr-OMe in Ν, Ν-dimethylacetamide was added, followed by the addition of 0.025 ml of a 0.05 M solution of calcium acetate. 10 mg of a crude preparation of Achromobacter lyticus protease were added and the mixture was kept at 37 ° C. for 22 hours. The proteins were precipitated by adding 10 parts by volume of acetone. The conversion of the porcine insulin to (Thr-OMe) ^B30- h-In was 12% as confirmed by HPLC.

Example 30

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 0,5 M Essigsäure gelöst. Zugabe von 0,2 ml einer 0,1 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid löste das Insulin. Die Mischung wurde auf 12°C abgekühlt und 2 mg Tryp sin in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetatlösung zugegeben. Nach 24 Stunden bei 12⁰C Stehenlassen zeigte die HPLC-Analyse eine 42%ige Umwandlung des Schweineinsulins in (Thr-OMe)^B30-h-In.20 mg of porcine insulin was dissolved in 0.1 ml of 0.5 M acetic acid. Addition of 0.2 ml of a 0.1 M solution of Thr-OMe in Ν, Ν-dimethylacetamide dissolved the insulin. The mixture was cooled to 12 ° C. and 2 mg Tryp sin in 0.025 ml 0.05 M calcium acetate solution was added. After 24 hours at 12 ⁰ C standing, the HPLC analysis showed 42% conversion of porcine insulin in (Thr-OMe) ^B30-h-In.

Example 31

2 mg Kanincheninsulin wurden in 0,135 ml 4,45 M Essigsäure gelöst. 0,24 ml einer 1,67 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 1.25 mg Trypsin in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetat-Lösung. Die Mischung wurde bei 37°C 4 Stunden gehalten. HPLC-Analyse zeigte eine 88%ige Umwandlung des Kanincheninsulins in (Thr-OMe)'^i:"'-h-In. Kanincheninsulin wird vor dem Schweineinsulin aus der HPLC-Säule eluiert, wobei das Verhältnis zwischen den Elutionsvolumina des Kanincheninsulins zu (Thr-OMe)^B30-h-ln 0,72 beträgt.2 mg of rabbit insulin was dissolved in 0.135 ml of 4.45 M acetic acid. 0.24 ml of a 1.67 M solution of Thr-OMe in Ν, Ν-dimethylacetamide were added, followed by the addition of 1.25 mg of trypsin in 0.025 ml of 0.05 M calcium acetate solution. The mixture was held at 37 ° C for 4 hours. HPLC analysis showed an 88% conversion of the rabbit insulin to (Thr-OMe) ' ^i: "' -h-In. Rabbit insulin is eluted from the HPLC column before the porcine insulin, the ratio between the elution volumes of the rabbit insulin being (Thr -OMe) ^B30 -h-In is 0.72.

Example 32

2 mg Schweinediarginininsulin (Arg^B31-Arg^B32-In sulin) wurden in 0,135 ml 4,45 M Essigsäure gelöst 0,24 ml einer 1,67 M Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Di methylacetamid wurden zugegeben, gefolgt durch die Zugabe von 1,25 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetat-Lösung. Die Mischung wurde 4 Stunden bei 37°C gehalten. Analyse durch HPLC zeigte eine ι« 91%ige Umwandlung des Diarginininsulins in (Thr-OMe)^B30-h-In. Diarginininsulin wird vor Schweineinsulin aus der HPLC-Säule eluiert, wobei das Verhältnis zwischen den Elutionsvolumina von Diarginininsulin zu (Thr-OMe)^B3ö-h-In 0,50 beträgt.2 mg of pig ^{diarginine insulin (Arg B31} -Arg ^B32 -In sulin) were dissolved in 0.135 ml of 4.45 M acetic acid. 0.24 ml of a 1.67 M solution of Thr-OMe in Ν, Ν-dimethyl acetamide were added, followed by the Add 1.25 mg trypsin in 0.025 ml of a 0.05 M calcium acetate solution. The mixture was held at 37 ° C for 4 hours. Analysis by HPLC showed a ι «91% conversion of the diarginine insulin into (Thr-OMe) ^B30- h-In. Diarginine insulin is eluted from the HPLC column before porcine insulin, the ratio between the elution volumes of diarginine insulin to (Thr-OMe) ^B3ö -h-In being 0.50.

Example 33

2 mg von Schweine-Zwischenprodukten (nämlich eine Mischung von Desdipeptid(Lys⁶²-Arg⁶³)-Proinsu lin und Desdipeptid(Arg³¹-Arg³²)-Proinsu)in) wurden 2" analog der in Beispiel 32 beschriebenen Reaktion rea gieren gelassen. Analyse durch HPLC zeigte eine 88%ige Ausbeute an (Thr-OMe)^B3o-h-In.2 mg of pig intermediates (namely a mixture of desdipeptide (Lys ⁶² -Arg ⁶³ ) -proinsulin and desdipeptide (Arg ³¹ -Arg ³² ) -proinsu) in) were allowed to react 2 ″ analogously to the reaction described in example 32. Analysis by HPLC showed an 88% yield of (Thr-OMe) ^B3o-h -In.

Example 34

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 2 M Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 VI Lösung von Thr-OMe in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben und die Mischung auf -18°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetat-Lösung, wurden zugegeben und die Mischung 120 Stunden bei -18°C gehalten. HPLC-Analyse zeigte, daß die Umwandlung in (Thr-OMe)^B30-h-In 83% betrug.20 mg of porcine insulin was dissolved in 0.1 ml of 2 M acetic acid. 0.2 ml of a 2 VI solution of Thr-OMe in Ν, Ν-dimethylacetamide were added and the mixture was cooled to -18 ° C. 2 mg of trypsin, dissolved in 0.025 ml of 0.05 M calcium acetate solution, were added and the mixture was kept at -18 ° C. for 120 hours. HPLC analysis showed that the conversion to (Thr-OMe) ^B30 -h-In was 83%.

Example 35

y> Das in Beispiel 34 beschriebene Verfahren wurde unter der Maßnahme wiederholt, daß die Reaktion bei 50⁰C in 4 Stunden durchgeführt wurde. HPLC-Analyse zeigte, daß die Umwandlung in (Thr-OMe)^B3n-h-In 23% betrug. y> The process described in Example 34 was repeated with the provision that the reaction was ^{carried out at 50 °} C. in 4 hours. HPLC analysis showed that the conversion to (Thr-OMe) ^B3n -h-In was 23%.

Example 36

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 3 M Essigsäure gelöst. 0,3 ml einer 0,33 M Lösung von Thr 0(CHj)₂-SO₂-CH₃-CH₃COOH (Threonin-2-(methylsul20 mg of porcine insulin was dissolved in 0.1 ml of 3 M acetic acid. 0.3 ml of a 0.33 M solution of Thr 0 (CHj) ₂ -SO ₂ -CH ₃ -CH ₃ COOH (threonine-2- (methylsul

■*"> fonyl)ethylester, Hydroacetat) in Ν,Ν-Dimethylacet amid wurden zugegeben. Die Mischung wurde auf 12°C abgekühlt und 2 mg Trypsin in 0,025 m! einer 0,05 M Calciumacetat-Lösung zugegeben. HPLC zeigte nach 24 Stunden bei 12°C eine 77%ige Umwandlung in (Thr-O(CHj)₂-SO₂-CH₃)^B30-h-In. Das Produkt eluiert unge fähr an der gleichen Stelle wie (Thr-OMe)^B30-h-In.Fonyl) ethyl ester, hydroacetate) in Ν, Ν-dimethylacetamide were added. The mixture was cooled to 12 ° C. and 2 mg of trypsin in 0.025 M! Of a 0.05 M calcium acetate solution 77% conversion to (Thr-O (CHj) ₂ -SO ₂ -CH ₃ ) ^B30 -h-In at 12 ° C. The product elutes at about the same point as (Thr-OMe) ^B30 -h -In.

Example 37

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 10 M Essig· säure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OEt (Et ist Ethyl) in Ν,Ν-Dimethylacetamid wurden zugegeben und die Mischung auf 12°C abgekühlt. 2 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 M Lösung von Calciumacetat wurden zugegeben. HPLC zeigte nach 24 Stunden bei 12°C eine 75%ige Umwandlung in (Thr-OEt)^B30-h-In. Da! Produkt eluierte in einer Position kurz nach der vor (Thr-OMe)'^no-h-ln.20 mg of porcine insulin were dissolved in 0.1 ml of 10 M acetic acid. 0.2 ml of a 2 M solution of Thr-OEt (Et is ethyl) in Ν, Ν-dimethylacetamide were added and the mixture was cooled to 12 ° C. 2 mg of trypsin in 0.025 ml of a 0.05 M solution of calcium acetate was added. HPLC showed a 75% conversion to (Thr-OEt) ^B30 -h-In after 24 hours at 12 ° C. There! Product eluted in a position shortly after the before (Thr-OMe) ' ^no -h-ln.

Example 38

h5 20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 6 M Essig säure gelöst 0,3 ml einer 0.67 M Lösung von (ThT(Bu¹)-OBu¹ (Bu¹ ist tertiäres Butyl) in N.N-Dimethylacetamic wurde zugegeben. Die Mischung wurde auf 12°C abgeh5 20 mg of pig insulin were dissolved in 0.1 ml of 6 M acetic acid, 0.3 ml of a 0.67 M solution of (ThT (Bu ¹ ) -OBu ¹ (Bu ¹ is tertiary butyl) in NN-dimethylacetamic was added. The mixture was added down to 12 ° C

kühlt und 2 mg Trypsin in 0,025 ml einer 0,05 M CaI-ciumacetat-Lösung zugegeben. Nach 24 Stunden bei 12^DC betrug die Umwandlung in (ThrCBu'J-OBu¹)⁸³⁰^- In 77%. Das Produkt wurde aus der KPLC-Säule durch Anwendung eines Acetrviitril-Gradienten von 27% bis auf 40% eluiert.cools and 2 mg of trypsin in 0.025 ml of a 0.05 M calcium acetate solution are added. After 24 hours at 12 ^D C the conversion to (ThrCBu'J-OBu ¹ ) was ⁸³⁰ ^ - In 77%. The product was eluted from the KPLC column using an acetronitrile gradient from 27% to 40%.

Example 39

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4 M Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 1,5 M Lösung von Thr-OMe, in Tetrahydrofuran, wurden zugegeben und die Mischung auf 12°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calciumacetat, wurden zugegeben. Nach 4 Stunden bei 12°C zeigte die Analyse durch HPLC eine Umwandlung von 75% in (Thr-OMe)^B30-h-In.20 mg of porcine insulin was dissolved in 0.1 ml of 4 M acetic acid. 0.2 ml of a 1.5 M solution of Thr-OMe, in tetrahydrofuran, was added and the mixture was cooled to 12 ° C. 2 mg of trypsin dissolved in 0.025 ml of 0.05 M calcium acetate was added. After 4 hours at 12 ° C, analysis by HPLC showed a 75% conversion to (Thr-OMe) ^B30 -h-In.

Example 40

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4 M Essigsäure gelöst. 0,8 ml einer 2 M Thr-OMe-Lösung in 1,2-Ethandiol wurden zugegeben und die Mischung auf 12°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M Calciumacetüt-Lösung wurden zugegeben. Nach *t Stunden Stehenlassen bei 12°C zeigte die HPLC-Analyse eine Umwandlung von 48% in (Thr-OMe)^{8 30}-h-In. 20 mg of porcine insulin was dissolved in 0.1 ml of 4 M acetic acid. 0.8 ml of a 2 M Thr-OMe solution in 1,2-ethanediol was added and the mixture was cooled to 12 ° C. 2 mg of trypsin dissolved in 0.025 ml of a 0.05 M calcium acetate solution was added. After standing at 12 ° C. for * t hours, the HPLC analysis showed a conversion of 48% into (Thr-OMe) ^{8 30} -h-In.

Example 41

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4 M Essigsäure gelöst. 0,2 mi einer 2 M Thr-OMe-Lösung in Ethanol wurden zugegeben und die Mischung auf 12°C abgekühit. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml 0,05 M Calcium-K) acetat-Lösung, wurden zugegeben und die Reaktion 4 Stunden lang bei 12°C durchgeführt. Analyse durch HPLC zeigte eine 46%ige Umwandlung iu (JhT-OMe)^B30-h-ln. 20 mg of porcine insulin was dissolved in 0.1 ml of 4 M acetic acid. 0.2 ml of a 2 M Thr-OMe solution in ethanol were added and the mixture was cooled to 12 ° C. 2 mg of trypsin dissolved in 0.025 ml of 0.05 M calcium K) acetate solution were added and the reaction was carried out at 12 ° C. for 4 hours. Analysis by HPLC showed 46% conversion iu (JhT- OMe) ^B30 -h-In.

,. Beispiel 42,. Example 42

20 mg Schweineinsulin wurden in 0,1 ml 4 M Essigsäure gelöst. 0,2 ml einer 2 M Lösung von Thr-OMe in Aceton wurden zugegeben und die Mischung auf 12°C abgekühlt. 2 mg Trypsin, gelöst in 0,025 ml einer 0,05 M -ο Caiciumacetat-Lösung wurden zugegeben. Nach 4 Stunden bei 12°C zeigte die HPLC-Analyse eine Umwandlung von 48% in (Thr-OMe)^B30-h-In.20 mg of porcine insulin was dissolved in 0.1 ml of 4 M acetic acid. 0.2 ml of a 2 M solution of Thr-OMe in acetone was added and the mixture was cooled to 12 ° C. 2 mg of trypsin, dissolved in 0.025 ml of a 0.05 M -ο calcium acetate solution, were added. After 4 hours at 12 ° C, HPLC analysis showed a conversion of 48% to (Thr-OMe) ^B30 -h-In.

Claims

1. Process for the preparation of threonine ^{8 30} esters of human irisulin or a salt or complex thereof from an L-threonine ester of the general formula II

Thr (R ⁵ ) -OR ⁴

(H)

1010

in which R ^{4 is} a carboxyl protecting group and R is hydrogen or a hydroxyl protecting group, and an insulin compound which contains the amino acid sequences A1 to A21 and B1 to B29 present in human insulin, in the presence of a protease, characterized by conversion of the insulin compound or a salt or a complex thereof with the threonine ester or a salt thereof in a mixture of a water-miscible organic solvent and water, the water content in the reaction mixture being less than 50% by volume, in the presence of trypsin, modified trypsin or Achromobacter lyticus protease at a reaction temperature between 50 ⁰ C and the Erstarrungspankt the reaction mixture.

2. The method according to claim 1, characterized in that this is done in the presence of an acid performs.

3. The method according to claim 1, characterized in that the concentration of the L-threonine ester in the reaction mixture is above 0.1 M and that the reaction mixture is from 0 to 10 equivalents one acid per equivalent of the L-threonine ester.

4. The method according to claim 1 or 3, characterized in that this is done with pork, Canine, fin whale, sperm whale and rabbit insulin, porcine diarginine insulin, split Porcine proinsulin, porcine desdipeptide proinsulin, porcine, canine, monkey and human proinsulin and their mixtures.

5. The method according to any one of claims 1 to 4, characterized in that the insulin compound comes from pigs.

6. The method according to claim 5, characterized in that that you are actually using raw insulin.

7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that this is carried out at a reaction temperature below 37 ° C, preferably below ambient temperature, and above 0 ⁰ C through.

8. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the water content in the reaction mixture is between 40 and 10% by volume.

9. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that the molar ratio between the L-threonine ester and the insulin compound is above 5: 1.

10. The method according to any one of the preceding claims, characterized in that this is done in aqueous methanol, ethanol, 2-propanol, 1,2-ethanediol, Acetone, dioxane, tetrahydrofuran, formamide, Ν, Ν-dimethylformamide, Ν, Ν-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, hexamethylphosphoric triamide or acetonitrile.

11. The method according to any one of claims 2 to 10,

1515th