DE3129404A1

DE3129404A1 - Process for preparing a B30-threonine insulin

Info

Publication number: DE3129404A1
Application number: DE19813129404
Authority: DE
Inventors: Hans-Gregor Dipl.-Chem.Dr.rer.nat. 5100 Aachen Gattner; Alfred Dipl.-Chem.Dr.rer.nat. Jonczyk
Original assignee: Deutsches Wollforschungsinstitut
Current assignee: Deutsches Wollforschungsinstitut
Priority date: 1981-07-25
Filing date: 1981-07-25
Publication date: 1983-02-10

Abstract

Process for preparing B30-threonine insulin using a threonine derivative of the formula <IMAGE> in which Thr represents the L-threonine residue, R1 denotes hydrogen or a hydroxyl protective group, and R2 is a carboxyl protective group, and an enzyme which acts specifically on the carboxyl linkages or peptide linkages of basic amino acids, in a solvent mixture consisting of water and an organic solvent, with the threonine derivative of the formula I and the enzyme being allowed to act on animal insulin at a pH of 5 to 9, the resulting B30-threonine insulin derivative being separated off, purification being carried out, if appropriate, in a manner known per se, and the carboxyl protective group and, where appropriate, the hydroxyl protective group being eliminated in a manner known per se.

Description

Verfahren zur Herstellung von einem B 30-Threonin-Process for the preparation of a B 30 threonine

Insulin Humaninsulin, das sich von Schweineinsulin nur in der Position B 30 (Threonin statt Alanin) unterscheidet, wurde bisher auf verschiedenen Wegen hergestellt. Neben den chemischen Methoden, denen Kupplungen von teilgeschütztem Des-oktapeptid(B23-30 )-insulin mit synthetischen Oktapeptiden zugrunde lagen und die keine präparativ befriedigenden Ergebnisse lieferten, haben enzymatische Arbeiten seit 1979 neue Wege gewiesen.Insulin Human insulin, which differs from porcine insulin only in the position B 30 (threonine instead of alanine) has so far been used in different ways manufactured. In addition to the chemical methods that couplings from partially protected Des-octapeptide (B23-30) insulin with synthetic octapeptides were based and which did not give satisfactory preparative results have enzymatic work since 1979 breaking new ground.

K.Inouye et al., (1979) J.Am.Chem.Soc. 101, 751-752, beschrieben 1979 die Kupplung eines synthetischen Humanoktapeptides (B23-30) an Bis(tert.butyloxyearbonyldes-oktapeptid(B23-30)-insulin mit Hilfe von Trypsin.K. Inouye et al., (1979) J. Am. Chem. Soc. 101, 751-752, described 1979 the coupling of a synthetic human octapeptide (B23-30) to bis (tert.butyloxyearbonyldes-octapeptide (B23-30) -insulin with the help of trypsin.

Bei dieser Reaktion wurde das Gleichgewicht zugunsten des Humaninsulins durch Zugabe organischer Lösungsmittel verschoben. Eine etwas einfachere und ergiebigere Methode wurde von K. Morihara et al.,(1979) Nature 280, 412-413, 1979 beschrieben, in der Des-Ala(B30)-insulin und Threonin-tert. butylester mit guten Ausbeuten tryptisch zu Humaninsulin gekuppelt wurden. Dieses beschrieben H.G.Gattner et.al.,(1980) Proc. 2. Internat. Insulin Symp., Aachen 1979 Brandenburg, D., Wollmer, A. (Ed.) Walter De Gruyter 1980, S. 117-123, zur gleichen Zeit unter Verwendung von Threoninmethylester. Es konnte gezeigt werden, daß in dem Kupplungspuffer, der Je 30% Dimethylformamid und 3096 Ethanol enthielt, eine geringe Spaltung der Arginin(B22)-Glycin(B23)-Bindung des Des-Alanin(B30)-insulins und/oder des Humaninsulin-tert.butylesters eintritt, (1980) in Peptide Chemistry 1979, Yonehara, H. (Ed.) Protein Research Foundation, Osaka, 113-118 Weiter wurde gezeigt, daß einerseits die Verwendung einer Argininschutzgruppe (DHCH-Arg(B22)-DAI) bei Trypsinkatalyse diese unerwUnschte Reaktion verhindert, andererseits mit der lysinspezifischen Achromobacter Protease der Argininschutz unnötig wird.In this reaction, the equilibrium was in favor of human insulin shifted by adding organic solvents. A somewhat simpler and more productive one Method was described by K. Morihara et al., (1979) Nature 280, 412-413, 1979, in the Des-Ala (B30) -insulin and threonine-tert. butyl ester tryptic with good yields coupled to human insulin. This is described by H.G. Gattner et al., (1980) Proc. 2. Internat. Insulin Symp., Aachen 1979 Brandenburg, D., Wollmer, A. (Ed.) Walter De Gruyter 1980, pp. 117-123, at the same time using threonine methyl ester. It could be shown that in the coupling buffer, the 30% dimethylformamide and 3096 ethanol contained slight cleavage of the arginine (B22) -glycine (B23) bond des-alanine (B30) insulin and / or human insulin tert-butyl ester occurs, (1980) in Peptide Chemistry 1979, Yonehara, H. (Ed.) Protein Research Foundation, Osaka, 113-118 It was also shown that on the one hand the use of an arginine protective group (DHCH-Arg (B22) -DAI) prevents this undesired reaction in the case of trypsin catalysis, on the other hand with the lysine-specific Achromobacter protease the arginine protection becomes unnecessary.

Daß proteolytische Enzyme als Katalysatoren bei Transferreaktionen nicht nur zur Ubertragung auf Wasser, sondern auch auf andere Acceptormoleküle fähig sind, wurde schon seit Jahrzehnten vermutet und bewiesen ,vgl. Boyer, P.D. (Ed.) (1971) The Enzymes Vol III Academic Press N.Y., S. 157-158. Mechanismen können hierbei entweder eine Acylübertragung oder einen Aminogruppentransfer enthalten. Für Trypsin kommt nur das erste Typus in Frage. Inkubiert man ein Peptid A mit einem Enzym in Gegenwart einer Aminosäure oder eines Zweiten Peptides und wird dabei ein Spaltprodukt des Peptides-A an das zweite Nucleophil gekuppelt, so spricht man von Transpeptidierung. Die bisherigen enzymati schen Humaninsulins emisynthesen gingen vom isolierten Des-Alanin-(B30)-insulin aus und sollten vom Mechanismus her als Kondensationsreaktion über einen Acyl-Enzym-Komplex beschrieben werden.That proteolytic enzymes act as catalysts in transfer reactions Not only capable of transfer to water, but also to other acceptor molecules have been suspected and proven for decades, cf. Boyer, P.D. (Ed.) (1971) The Enzymes Vol III Academic Press N.Y., pp. 157-158. Mechanisms can do this contain either an acyl transfer or an amino group transfer. For trypsin only the first type comes into question. A peptide A is incubated with an enzyme in Presence of an amino acid or a second peptide and becomes a cleavage product of the peptide-A is coupled to the second nucleophile, one speaks of transpeptidation. The previous enzymatic human insulin emisyntheses started from the isolated des-alanine (B30) insulin and should, in terms of their mechanism, be a condensation reaction via an acyl-enzyme complex to be discribed.

Aus der EP-OS 0017938 ist ein Verfahren zur Herstellung von B 30-Threonin-Insulin bekannt, gemäß dem man Des-B 30-Insulin mit einem Threoninderivat der' Formel Thr (R1) (R2) I.From EP-OS 0017938 a process for the production of B 30 threonine insulin is known, according to which Des-B 30-insulin with a threonine derivative of the 'formula Thr (R1) (R2) I.

worin Thr für den L-Threoninrest steht, R1 Wasserstoff oder eine Hydroxylschutzgruppe bedeutet und R2 eine Carboxylschutzgruppe ist, in Gegenwart eines Enzyms, das spezifisch wirkt auf die Carboxylbindungen oder Peptidbindungen von basischen Aminosäuren, umsetzt. Für dieses Verfahren ist es erforderlich, zunächst das Des-B 30-Insulin herzustellen und in möglichst reiner Form zu isolieren.where Thr is the L-threonine residue, R1 is hydrogen or a hydroxyl protecting group and R2 is a carboxyl protecting group, in the presence of an enzyme that specifically acts on the carboxyl bonds or peptide bonds of basic amino acids, implements. For this procedure it is necessary to first use the Des-B 30 insulin and isolate them in as pure a form as possible.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabenstellung zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von einem B 30-Threonin-Insulin zu finden, das in einer Stufe ausgehend von tierischem Insulin zum gewünschten B 30-Threonin-Insulin führt. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß diese Aufgabenstellung in einfacher Weise dann gelöst werden kann, wenn man ein Threoninderivat der obigen Formel I und ein Enzym, das spezifisch wirkt auf die Carboxylbindungen oder Peptidbindungen von basischen Aminosäuren, auf tierisches Insulin einwirken läßt.The present invention is based on the object To find a method for the production of a B 30 threonine insulin, which is in a Stage leads from animal insulin to the desired B 30 threonine insulin. It has surprisingly been found that this task can be achieved in a simple manner can then be solved if you have a threonine derivative of the above formula I and a Enzyme that specifically acts on the carboxyl bonds or peptide bonds of basic Amino acids, can act on animal insulin.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Herstellung von einem B 30lThreonin-Insulin unter Verwendung von einem Threoninderivat der Formel Thr (R1) (R2) I.The present invention is accordingly a method for Production of a B 30l threonine insulin using a threonine derivative of the formula Thr (R1) (R2) I.

worin Thr für den L-Threoninrest steht, R1 Wasserstoff oder eine Hydroxylschutzgruppe bedeutet und R2 eine Carboxylschutzgruppe ist, und einem spezifisch auf die Carboxylbindungen oder Peptidbindungen von basischen Aminosäuren wirkendem Enzym, in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und einem organischen Lösungsmittel, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das Threonin-Derivat der Formel I und das Enzym auf tierisches Insulin bei einem pH-Wert von 5 bis 9 einwirken läßt, das entstandene 3 30-Threonin-Insulin-Derivat abtrennt, gegebenenfalls in an sich bekannter Weise reinigt und in an sich bekannter Weise die Carboxylschutzgruppe und gegebenenfalls die Hydroxylschutzgruppe abspaltet.where Thr is the L-threonine residue, R1 is hydrogen or a hydroxyl protecting group and R2 is a carboxyl protecting group, and one specifically on the carboxyl bonds or peptide bonds of basic amino acid acting enzyme, in a mixed solvent from water and an organic solvent, which is characterized by that the threonine derivative of the formula I and the enzyme on animal Lets insulin act at a pH of 5 to 9, the resulting 3 30-threonine-insulin derivative separates, optionally purifies in a manner known per se and in a manner known per se Way, the carboxyl protecting group and optionally the hydroxyl protecting group splits off.

Als tierisches Insulin wird vorzugsweise Schweineinsulin verwendet, weil der chemische Aufbau abgesehen von der B 30-Aminosäure identisch ist mit Humane insulin. Man erhält also dann bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung aus Schweineinsulin unmittelbar ein Humaninsulinderivat, aus dem lediglich die Schutzgruppen abgespalten werden müssen, um Humaninsulin zu erhalten. Für Humaninsulin besteht naturgemäß ein großes Bedürfnis zur Behandlung von-Diabetes.Pig insulin is preferably used as animal insulin, because apart from the B 30 amino acid, the chemical structure is identical to that of humans insulin. One then obtains when the method according to the invention is carried out from porcine insulin directly a human insulin derivative, from which only the protective groups must be split off in order to obtain human insulin. For human insulin there is naturally a great need for the treatment of diabetes.

Die B 30-Threonin-Insuline, die man gemäß dem Verfahren der Erfindung aus anderen tierischen Insulinen erhält, können, wie dies im Stand der Technik bekannt ist, ebenfalls für pharmazeutische Zwecke eingesetzt werden.The B 30 threonine insulins that can be obtained according to the method of the invention obtained from other animal insulins can, as is known in the art is also used for pharmaceutical purposes.

Als Threoninderivate können gemäß der Erfindung diewenigen eingesetzt werden, die für-das oben beschriebene Verfahren der EP-OS 0017938 vorgeschlagen wurden. Geeignete Carboxyl-Schutzgruppen sind z.B.The few threonine derivatives which can be used according to the invention are proposed for the method of EP-OS 0017938 described above became. Suitable carboxyl protecting groups are e.g.

Alkylester, insbesondere der t-Butylester, Aralkylester, z.B. der Benzylester, die Amidgruppe, die substituiert sein kann, z.B. die Anilidogruppe? Salze, wie Alkalisalze usw. Grundsätzlich können die in der Peptidsynthese üblichen Schutzgruppen verwendet werden.Alkyl esters, especially the t-butyl esters, aralkyl esters, e.g. Benzyl ester, the amide group that can be substituted, e.g. the anilido group? Salts, such as alkali salts, etc. In principle, those customary in peptide synthesis can be used Protecting groups are used.

Naturgemäß dürfen nicht solche schutzgruppen eingesetzt werden, die insbesondere bei der Abspaltunglmit dem Insulin in unerwünschter Weise reagieren. Die Hydroxygruppe der Threoninderivate kann geschützt oder ungesöhützt sein. Auch hier können grundsätzlich die in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen eingesetzt werden, wie Alkylgruppen, insbesondere t-Butyl Benzyl, Acetyl.Naturally, protection groups may not be used that especially in the case of the spin-off the insulin in undesirable Respond wisely. The hydroxy group of the threonine derivatives can be protected or unprotected be. In principle, the protective groups customary in peptide chemistry can also be used here can be used, such as alkyl groups, in particular t-butyl benzyl, acetyl.

Die Alkylgruppen enthalten zweckmäßig 1 bis 6, vorzugsweise 1 bis 4 Kohlenstoffatome. The alkyl groups suitably contain 1 to 6, preferably 1 to 4 carbon atoms.

Zweckmäßig wird die Hydroxyl-Schutzgruppe so ausgewählt, daß sie gleichzeitig mit der Carboxyl-Gruppe in einer hierfür geeigneten dem Fachmann bekannten chemischen Reaktion abgespalten werden kann. Suitably, the hydroxyl protecting group is selected so that it simultaneously with the carboxyl group in a suitable one known to the person skilled in the art chemical reaction can be split off.

Als Enzyme können ebenfalls die in der EP-OS 0017938 beschriebenen und eingesetzten Enzyme verwendet werden. Those described in EP-OS 0017938 can also be used as enzymes and enzymes used are used.

Bevorzugt werden Trypsin und Trypsin-ähnliche Enzyme, die dem Fachmann bekannt sind. Ein weiteres geeignetes Enzym ist Protease 1, hergestellt von Achromobacter Lyticus M 497-1. Dies ist ebenfalls ein Trypsin-ähnliches Enzym. Trypsin and trypsin-like enzymes, which are known to the person skilled in the art, are preferred are known. Another suitable enzyme is Protease 1 manufactured by Achromobacter Lyticus M 497-1. This is also a trypsin-like enzyme.

Bevorzugt wird das Verfahren gemäß der Erfindung bei einem pH-Wert von 5.5 bis 8.8 durchgeführt. Der pH-Wert wird zweckmäßig durch Verwendung von Puffer Systemen eingestellt. The method according to the invention is preferred at pH carried out from 5.5 to 8.8. The pH is made convenient by using buffer Systems discontinued.

Wenn man beispielsweise einen Phosphat-Puffer, zweckmäßig einen 1-molaren Puffer, einsetzt, liegt der optimale pH-Wert im Bereich von etwa 6 bis 8.8. For example, if you have a phosphate buffer, it is advisable to use a 1 molar Buffer, the optimal pH is in the range of about 6 to 8.8.

Wenn man einen Trishydroymethyl)aminomethan-Puffer einsetzt, zweckmäßig in einer in 0.05 bis 0.5 molarer Konzentration, liegt der pH-Wert zweckmäßig bei etwa 5.5 bis 8.5. If you use a trishydroymethyl) aminomethane buffer, expedient in a concentration of 0.05 to 0.5 molar, the pH is expediently around approximately 5.5 to 8.5.

Das Verhältnis zwischen Wasser und organischem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel beträgt zweckmäßig 20 bis 80 Vol.% Wasser auf 80 bis 20 Vol.% organisches Lösungsmittel. Besonders gute Ergebnisse werden er halten bei Verwendung von Dimethylformamid (DMF) und/oder Dimethylsulfoxid (DMSO). In diesem Fall beträgt das Verhältnis zu Wasser zweckmäßig 25 bis 60, vorzugsweise 30 bis 40 Vol.% Wasser zu 75 bis 40, vorzugsweise 70 bis 60 Vol.% DMF und/oder DMSO.The ratio between water and organic water miscible The solvent is expediently 20 to 80% by volume of water to 80 to 20% by volume of organic Solvent. Particularly good results will be obtained when using dimethylformamide (DMF) and / or dimethyl sulfoxide (DMSO). In this case the ratio is to Water expediently 25 to 60, preferably 30 to 40% by volume of water at 75 to 40%, preferably 70 to 60% by volume DMF and / or DMSO.

Beispiele fUr andere Lösungsmittel sind Hexamethylphosphorsäuretriamid (HMPT), aliphatische Alkohole und Polyalkohole, insbesondere Diole und Triole mit etwa 2 bis 6, vorzugsweise 2 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Glycol, Glycerin, 1,4-Butandiol.Examples of other solvents are hexamethylphosphoric triamide (HMPT), aliphatic alcohols and polyalcohols, especially diols and triols with about 2 to 6, preferably 2 to 4 carbon atoms, such as glycol, glycerol, 1,4-butanediol.

Beispiele für andere zu verwendende Puffersysteme sind Borat, Carbonat, Acetat, Citrat, Succinaty p-Toluolsulfonat-Puffer.Examples of other buffer systems to be used are borate, carbonate, Acetate, citrate, succinate p-toluenesulfonate buffer.

Da das Threoninderivat der Formel I sehr viel leichter zugänglich und deshalb billiger ist als das tierische Insulin, wird es zur Erzielung einer hohen Ausbeute in Uberschuß eingesetzt. Zweckmäßig werden etwa 5 bis 300 Mol Threoninderivat auf 1 Mol tierisches Insulin eingesetzt. Vorzugsweise wird mindestens die 10fach Menge Threoninderivat und höchstens die 250fach Menge Threoninderivat bezogen auf das Insulin verwendet.Since the threonine derivative of the formula I is much more accessible and therefore cheaper than animal insulin, it will help achieve one high yield used in excess. Approximately 5 to 300 moles of threonine derivative are expedient used on 1 mole of animal insulin. Preferably at least 10 times Amount of threonine derivative and a maximum of 250 times the amount of threonine derivative based on who used insulin.

Die Temperatur der Behandlung liegt , wie dies auf diesem technischen Gebiet allgemein bekannt ist, im Bereich von etwa 0 bis 500C, wobei Temperaturen im Bereich von 15 bis 400C bevorzugt sind.The temperature of the treatment is as technical as this on this The area commonly known is in the range of about 0 to 500C, with temperatures in the range from 15 to 40 ° C. are preferred.

Die Behandlung des tierischen Insulins mit dem Threoninderivat der Formel 1 und dem Enzym wird solange durchgeführt, bis eine ausreichende, möglichst optimale Menge B 301Threonin-lnsulin-Derivat unter den jeweils angewandten speziellen Bedingungen gebildet wurde. Die Menge des gebildeten B 30-Threonin-Insulin-Derivats kann in Testversuchen vor der Durchführung größerer.Ansätze jeweils ermittelt werden.The treatment of animal insulin with the threonine derivative of Formula 1 and the enzyme is carried out until sufficient, if possible optimal amount of B 301 threonine insulin derivative among the particular applied Conditions was formed. The amount of B 30 threonine insulin derivative formed can be determined in test trials before larger approaches are carried out.

Man entnimmt dem Ansatz 10F1 verdünnt mit 20 Sl Puffer und spritzt diese Lösung bei- der Hochdruckflüssigkeitschromatographie ein und trägt auf dem Celluloseacetat-Streifen zur Elektrophorese auf. Die Auswertung erfolgt in an sich bekannter Weise:Integration der Peakflächen bzw. Anfärbung der Proteinzonen.The mixture is taken from 10F1 diluted with 20 μl of buffer and injected this solution enters both high pressure liquid chromatography and carries on the Cellulose acetate strips for electrophoresis. The evaluation takes place in itself known way: integration of the peak areas or staining of the protein zones.

Die Kombination der Verfahrensparameter, insbesondere Puffersystem, pH-Wert, Art des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels und dessen Menge kann durch Testversuche ermittelt werden. Es wird hierzu auch auf die nachfolgenden Beispiele und Kurven verwiesen.The combination of the process parameters, in particular the buffer system, pH value, type of water-miscible organic solvent and its amount can be determined through test trials. This is also referred to in the following Examples and curves referenced.

Durch solche Testversuche kann auch die optimale Behandlungszeit ermittelt werden, die für die jeweiligen Systeme zu optimalen Ausbeuten an B 30-Threonin-Insulin-Derivat führen. In der Regel muß die Behandlung mindestens etwa 2 Stunden, zweckmäßig mindestens etwa 4 Stunden durchgeführt werden. Die obere Grenze liegt in der Regel bei 24 Stunden. Danach wird im allgemeinen keine Erhöhung der Ausbeute erzielt, Wie aus den nachfolgenden Beispielen ersicht- lich ist, kann aber unter Anwendung bestimmter pH-Werte, Puffersysteme und Lösungsmittel eine kürzere Reäktionszeit besonders zweckmäßig sein.Such test attempts can also determine the optimal treatment time that for the respective systems to optimal yields of B 30-threonine-insulin derivative to lead. As a rule, the treatment must be at least about 2 hours, expediently at least be carried out for about 4 hours. The upper limit is usually 24 hours. Thereafter, there is generally no increase in the yield, As from the following Examples Lich is, but can with the application of certain For pH values, buffer systems and solvents, a shorter reaction time is particularly useful be.

Gemäß dem Verfahren der Erfindung wird also überratschend in guter Ausbeute zunächst das B 30-Threonin-Insulin-Derivat erhalten, wobei der Begriff "Derivat" so zu verstehen ist, daß dieses Produkt noch die Schutzgruppen enthält an der Carboxylgruppe und gegebenenfalls Hydroxylgruppe entsprechend dem als Ausgangsprodukt eingesetzten. Threoninderivat der Formel I. Das B 30-Threonin-Insulin-Derivat kann aus dem Reaktionsgemisch durch übliche Trennungsmethoden in gereinigter Form gewonnen werden, wie Ionenaustausch-Chromatographie oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie.Thus, according to the method of the invention, surprisingly good Yield first the B 30-threonine-insulin derivative obtained, with the term "Derivative" is to be understood as meaning that this product still contains the protective groups on the carboxyl group and optionally hydroxyl group in accordance with the starting product used. Threonine derivative of the formula I. The B 30 threonine insulin derivative can obtained from the reaction mixture in purified form by customary separation methods such as ion exchange chromatography or high pressure liquid chromatography.

Aus diesen so in gereinigter Form gewonnenen B 30-Threonin-Insulin-Derivat , das im wesentlichen identisch ist-mit dem gemäß der EP-OS 0017938 zunächst erhaltenen B 30-Threonin-Insulin-Derivat, wird in an sich bekannter Weise die Schutzgruppe an der Carboxylgruppe und gegebenenfalls auch an der Hydroxylgruppe, sofern eine vorhanden ist, abgespalten. Die Verfahren zur Abspaltung solcher Schutzgruppen sind dem Proteinchemiker allgemein bekannt. From this B 30 threonine insulin derivative obtained in this way in purified form which is essentially identical to that initially obtained according to EP-OS 0017938 B 30-threonine-insulin derivative, becomes the protective group in a manner known per se on the carboxyl group and optionally also on the hydroxyl group, if one is present, split off. The procedures for removing such protecting groups are well known to protein chemists.

Nach Abspaltung der Schutzgruppe (n) fällt das B 30-Threonin-Insulin in relativ reiner Form an , und kann in bekannter Weise aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, z.B. durch Gelchromatographie.After splitting off the protective group (s), the B 30 threonine insulin falls in relatively pure form, and can be extracted from the reaction mixture in a known manner isolated, e.g., by gel chromatography.

Der L-Threonin-tert.butylester kann zweckmäßig und in besonders vorteilhafter Form wie folgt hergestellt werden: Man läßt 100 g Threonin in 1 1 EssigsSure-tert.butylester mit 2.1 ÄqUivalenten 70% Perchlorsäure 6 Tage lang bei Raumtemperatur reagieren, extrahiert Thr(But)-OBut und Thr -OBut mit 0.01 M Salzsäure, stellt die wäßrige Lösung auf pH 9 um, sättigt mit Kochsalz und extrahiert die beiden Threoninderivate wiederum mit Ether. Die etherische Lösung wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Filtrat am Wasserstrahlvakuum eingeengt. Man erhält 60 bis 85 g eines hellgelben Öls, das in 180 ml Hexan aufgenommen wird. Durch mehrmaliges Ausschütteln mit je 30 ml Wasser, Sättigen der wäßrigen Extrakte mit Natriumchlorid und wiederholtes Extrahieren mit Ether erhält man den Threonin-tert.butylester in 34 bis 41% d.Th. (50 bis 60 g) Ausbeute.The L-threonine tert-butyl ester can be useful and particularly advantageous Shape can be made as follows: 100 g of threonine are left in 1 1 acetic acid tert-butyl ester with 2.1 equivalents of 70% perchloric acid for 6 days react at room temperature, extracts Thr (But) -OBut and Thr -OBut with 0.01 M. Hydrochloric acid, adjusts the aqueous solution to pH 9, saturated with sodium chloride and extracted the two threonine derivatives in turn with ether. The ethereal solution is made with magnesium sulfate dried and the filtrate concentrated in a water jet vacuum. 60 to 85 are obtained g of a light yellow oil which is taken up in 180 ml of hexane. By repeated Shake out with 30 ml of water each time, saturate the aqueous extracts with sodium chloride and repeated extraction with ether gives the threonine tert-butyl ester in 34 to 41% of the total (50 to 60 g) yield.

Zu den nachfolgenden Beispielen ist noch folgendes zu bemerken: Aminosäureanalysen wurden nach 24-stUndiger Hydrolyse mit 6 N Salzsäure und Phenol bei 1000C auf einem Analysator von Biotronic nach dem Einsäulenverfahren, vgl. Spackman, D.H., Stein, W.H., Moore, S. (1958) Anal.Chem. 30, 1190-1206, ausgeführt und so zugleich der Proteingehalt der Proben bestimmt.The following should also be noted in relation to the following examples: Amino acid analyzes were hydrolysed for 24 hours with 6N hydrochloric acid and phenol at 1000C on a Analyzer from Biotronic using the one-column method, see Spackman, D.H., Stein, W.H., Moore, S. (1958) Anal. Chem. 30, 1190-1206, and so at the same time the Protein content of the samples determined.

Gelchromatographien und Ionenaustauschchromatographien wurden bei 280 nm bzw. 254 nm registriert.Gel chromatographies and ion exchange chromatographies were performed at 280 nm and 254 nm respectively.

Die Hochdruckflüssigkeitschromatographie erfolgte auf den, Säulen Nucleosil C 18 ( 5/um, 4 x 300 mm) von Macherey, Nagel und Co. analytisch und auf RP 18 (10/um 1.6 x 25 cm) von Knauer präparativ. Die Apparatur bestand aus einem Zweipumpenstand mit Steuereinheit von Spectraphysics, Darmstadt, einer septum- freien Rheodyne Probenaufgabe (Probenschleife 20/ul analytisch, 500/ul präparativ), dem Durchflußphotometer LC 55 Perkin Elmer, dem Integrator System I von Spectraphysics und einem Linienschreiber von Linseis.The high pressure liquid chromatography was carried out on the columns Nucleosil C 18 (5 / um, 4 x 300 mm) from Macherey, Nagel and Co. analytically and on RP 18 (10 / um 1.6 x 25 cm) from Knauer preparative. The apparatus consisted of one Two-pump stand with control unit from Spectraphysics, Darmstadt, a septum free Rheodyne sample application (sample loop 20 / ul analytical, 500 / ul preparative), the Flow photometer LC 55 Perkin Elmer, the Integrator System I from Spectraphysics and a line recorder from Linseis.

Die präparative HPLC wurde mit W-Einheit und Fraktionssammler, wie es bei der Gelchromatographie beschrieben ist, ausgeführt.The preparative HPLC was carried out with a W-unit and fraction collector, such as it is described in the context of gel chromatography.

Folgendes Elutionssystem erwies sich für die analytische HPLC als geeignet: 5gmM n-Butansulfonsäure-Natriumsalz- 50-mM Natriumsulfat- 5. mM Dinatriumhydrogenphosphat- o-.?hosphorsäure-pH 3.0-2Bg (vol) Acetonitril.(5), präparativ wurde das Elutionssystem : 0.04 M Ammoniumacetat-Essigsäure-pH 4.0 mit einem Gradienten von 20% bis 24% 2-Propanol benutzt.The following elution system was found to be suitable for the analytical HPLC suitable: 5gmM n-butanesulfonic acid sodium salt- 50-mM sodium sulfate- 5. mM disodium hydrogen phosphate- o-.?hosphoric acid pH 3.0-2Bg (vol) acetonitrile. (5), the elution system was preparative : 0.04 M ammonium acetate-acetic acid-pH 4.0 with a gradient from 20% to 24% 2-propanol used.

Die analytischen Daten der Transpeptidierungs reaktionen wurden mit Hilfe der Hochdruckflüssigkeitschromatographie bestimmt. Aus den Reaktionsansätzen wurden 10/ul-Proben mit 20µl Puffer verdünnt und .tibg eine 20/ul-Probenschleife aufgegeben.The analytical data of the transpeptidation reactions were with Determined using high pressure liquid chromatography. From the reaction batches 10 / ul samples were diluted with 20 ul buffer and .tibg a 20 / ul sample loop given up.

pH-Werte wurden mit einer kombinierten Mikroelektrode in der Mischung bestimmt. Die Elektrode war mit wäßrigen Puffern gewicht.pH values were measured with a combined microelectrode in the mixture certainly. The electrode was weighted with aqueous buffers.

Elektrophoresen wurden in Kammern von Serva auf Celluloseacetatstreifen (180 x 25 mm) von Schleicher und Schall, Dassel, bei 200 V während 3 Stunden ausgeführt (pH 2.2, 4.8, 8.6 (16). Das Anfärben erfolgte in 0.2%iger Lösung von Ponceau s in 3% Trichloressigsäure.Electrophoreses were performed in Serva chambers on cellulose acetate strips (180 x 25 mm) by Schleicher and Schall, Dassel, carried out at 200 V for 3 hours (pH 2.2, 4.8, 8.6 (16). The staining took place in 0.2% solution of Ponceau s in 3% trichloroacetic acid.

Folgende Abkurzungen werden verwendet: HPCL High performance liquid chromatography DOPI Des-oktapeptid (B23 -B30)-insulin Ins-OBut Threonin-tert. butylester (330 )-insulin DEAE DiethylaminoethyL Tris Tris(hydroximethyl )aminomethan TPCK L-( 1 -p-Tosylamino-2-phenylethyl)-chlor methylketon DMF N. N-Dimethylformamid Vol Volumen Beispiel 1: 200 mg= 5/umöl Schweineinsulin und 200 mg - 1.14 mmol Threthin-tert.butylester werden in 600µl DMF und 400/ul 0.25 M Tris/HCl bei pH 5.5-5.8 mit 10 mg Trypsin in 40 µl 10-4 M HCl versetzt. Nach 20 Stunden Reaktion bei Raumtemperatur wird das Volumen mit 50%ier Essig-säure verdoppelt (resultierender pH 2-3).The following abbreviations are used: HPCL High performance liquid chromatography DOPI Des-octapeptide (B23 -B30) -insulin Ins-OBut Threonine-tert. butyl ester (330) -insulin DEAE Diethylaminoethyl Tris Tris (hydroximethyl) aminomethane TPCK L- (1-p-tosylamino-2-phenylethyl) chloro methyl ketone DMF N. N-dimethylformamide vol Volume example 1: 200 mg = 5 / um oil pork insulin and 200 mg - 1.14 mmol of threthine tert-butyl ester are in 600 μl DMF and 400 / μl 0.25 M Tris / HCl at pH 5.5-5.8 with 10 mg trypsin added in 40 μl of 10-4 M HCl. After 20 hours of reaction at room temperature, the Volume doubled with 50% acetic acid (resulting pH 2-3).

Bei der folgenden Gelfiltration an Sephadex G 50 f (2.7 x 95 cm) in 10%iger Essigsäure werden nacheinander Trypsin, Insulin(derivate) und niedrigmoiekulare Substanzen eluiert. Nach Gefriertrocknung der Insulinfraktion erhält man 170 - 180 mg eines Gemisches, das 50 - 60 % umaninsulin-tert.-butylester enthält.During the following gel filtration on Sephadex G 50 f (2.7 x 95 cm) in 10% acetic acid are successively trypsin, insulin (derivatives) and low molecular weight Substances eluted. After freeze-drying the insulin fraction, 170-180 are obtained mg of a mixture containing 50-60% umaninsulin tert-butyl ester.

beispiel 2: 200 mg = 35µmol Schweineinsulin und 200 mg = 1.14 mmol Threonin-tert.butylester werden in 2m1 eines Gemisches aus 40 Vol.5' 0.25 M Tris/HCl und 60 Vol.5' DMF bei pH 6.6 mit 20 mg Trypsin 4 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Verdoppelung des Volumens mit 50%iger Essigsäure wird wie in Beispiel 1 angegeben aufgearbeitet. Nach der Gelfiltration enthält die Insulinfraktion (180 mg) etwa 55% Humaninsulin.tert.butylester.Example 2: 200 mg = 35 µmol porcine insulin and 200 mg = 1.14 mmol Threonine tert-butyl ester are added in 2 ml of a mixture of 40 vol. 5 '0.25 M Tris / HCl and 60 vol. 5 'DMF at pH 6.6 with 20 mg trypsin for 4 hours at room temperature incubated. After doubling the volume with 50% acetic acid, as in example 1 indicated worked up. Contains after gel filtration the Insulin fraction (180 mg) approximately 55% human insulin, tert, butyl ester.

Beispiel 3: 100 mg = 17.5µm Schweineinsulin und 100 mg = 570/umol Tbreonin-tert.butylester werden in 600µl DMF und 400 µl 1.0 M Natriumdihydrogenphosphat mit 10 M Natriumhydroxid bei pH 7.7 gelöst und-mit 10 mg Trypsin 24 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Verdoppelung des Volumens mit 50%iger Essigsäure wird ie in Beispiel 1 angegeben aufgearbeitet. Nach der Gelfiltration enthält die Insulinfraktion (80 - 90 mg) etwa 55% Humaninsulin-tert. butylester.Example 3: 100 mg = 17.5 µm porcine insulin and 100 mg = 570 / µmol Tbreonine tert-butyl ester is dissolved in 600 μl DMF and 400 μl 1.0 M sodium dihydrogen phosphate dissolved with 10 M sodium hydroxide at pH 7.7 and -with 10 mg trypsin for 24 hours incubated at room temperature. After doubling the volume with 50% acetic acid ie indicated in Example 1 worked up. After the gel filtration, the Insulin fraction (80 - 90 mg) about 55% human insulin tert. butyl ester.

Beispiel 4: Reinigung von Humaninsulin-tert.butylester durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie 100 mg einer Insulin-tert.butylester enthaltenden Fraktion, die durch Gelfiltration an Sephadex G 50 erhalten wurde, wurden durch Chromatographie an RP 18 (Knauer, 10 um, 1.6 x 25 cm) in 0.04 M Ammoniumacetat/ Essigsäure-pH 4.0 mit einem 2-Propanol-gradienten gereinigt (Fig.1). Fraktion I enthielt Insulin, Des-Ala (B30)-insulin und eventuell Des oktapeptid(B23-30)-insulin, Fraktion II ergab nach Einengen am Wasserstrahlvakuum bei 35 0C, Verdünnen mit Wasser und Gefriertrocknene 30 mg = 30 % d.Th. Humaninsulin-tert.Example 4: Purification of human insulin tert-butyl ester by high pressure liquid chromatography 100 mg of a fraction containing insulin tert-butyl ester, which was obtained by gel filtration on Sephadex G 50 were obtained by chromatography on RP 18 (Knauer, 10 µm, 1.6 x 25 cm) in 0.04 M ammonium acetate / acetic acid pH 4.0 with a 2-propanol gradient cleaned (Fig. 1). Fraction I contained insulin, Des-Ala (B30) -insulin and possibly The octapeptide (B23-30) insulin, fraction II was obtained after concentration in a water jet vacuum at 35 ° C., dilute with water and freeze-dry 30 mg = 30% of theory Human insulin tert.

butylester.butyl ester.

Fig. 1 ist das Diagramm für die HPLC-Trennung eines tryptischen Transpeptidierungsgemisches (100 mg/500µl) an RP 18 (Knauer 10/um, 1.6 x 25 ¢m) bei 230C in 0.04 M Amminoacetat/Esssigsäure-pH 4.0-20 (von) 2-Propanol, nach 15 min mit linearem Gradienten von 205' bis 24 % (Vol) 2-Propanol in 5 min, Elution bei 96 atm mit 6 ml/min Fraktion I Insulin, Des-Ala(B3O)-Insulin, Des- oktapeptid (B23-30)-insulin Fraktion II =Humaninsulin-tert.butylester.Fig. 1 is the diagram for the HPLC separation of a tryptic transpeptidation mixture (100 mg / 500 μl) of RP 18 (Knauer 10 μm, 1.6 × 25 μm) at 230 ° C. in 0.04 M aminoacetate / acetic acid pH 4.0-20 (from) 2-propanol, after 15 min with a linear gradient of 205 'to 24% (vol) 2-propanol in 5 min, elution at 96 atm with 6 ml / min fraction I insulin, des-Ala (B3O) -insulin, des-octapeptide (B23-30) -insulin fraction II = human insulin tert-butyl ester.

Beispiel 5: Reinigung von Humaninsulin-tert.butylester durch Ionenaustauschchromatographie 80 mg einer Insulin-tert.butylester enthaltenden Fraktion, die durch Gelfiltration an Sephadex G 50 erhalten wurde, konnten durch Chromatographie an Sephadex DEAE-A 25 (1.6 x 16 cm) in 0.03 M Tris/HCl-0.05 % EDTA-50 5' (Vol) 2-Propanol-pH 8.2 mit einem Salzgradienten von 2 x 300 ml/ 0.0 M'-0.2 M Natriumchlorid gereinigt werden (Fig. 2). Nach Einengen der Fraktionen am Wasserstrahlvakuum bei 350C auf 5 - 10 ml, Entsalzen an Sephadex G 25 f in 0.05 M Ammoniumhydrogencarbonat und Gefriertrocknen , erhält man 32 mg = 40 % Humaninsulin-tert.butylester (Fig. 2, Fraktion I) Fig. 2 ist das Diagramm für die Ionenaustauschchromatographie von 80 mg einer Humaninsulin-tert.butylester enthaltenden Fraktion an Sephadex DEAE-A 25 (1.6 x 16 cm) in 0.03 M Tris/HCl - 50 % (Vol) 2-Propanol-0.05 % EDTA-pH 8.2 mit einem Salzgradienten von 2 x 300 ml/ 0.0 - 0.2 M NaCl, 11 ml pro Fraktion, 40 ml/h Fraktion I 3 Humaninsulin-tert.butylester Fraktion II = Insulin, Des-Alanin-(B30)-insulin.Example 5: Purification of human insulin tert-butyl ester by ion exchange chromatography 80 mg of a fraction containing insulin tert-butyl ester, which was obtained by gel filtration on Sephadex G 50 could be obtained by chromatography on Sephadex DEAE-A 25 (1.6 x 16 cm) in 0.03 M Tris / HCl-0.05% EDTA-50 5 '(vol) 2-propanol-pH 8.2 with a salt gradient of 2 x 300 ml / 0.0 M'-0.2 M sodium chloride (Fig. 2). After concentrating the fractions in a water jet vacuum at 350C to 5-10 ml, desalting on Sephadex G 25 f in 0.05 M ammonium hydrogen carbonate and freeze drying , 32 mg = 40% human insulin tert-butyl ester are obtained (Fig. 2, fraction I) 2 is the diagram for the ion exchange chromatography of 80 mg of a human insulin tert-butyl ester containing fraction of Sephadex DEAE-A 25 (1.6 x 16 cm) in 0.03 M Tris / HCl - 50 % (Vol) 2-propanol-0.05% EDTA-pH 8.2 with a salt gradient of 2 x 300 ml / 0.0 - 0.2 M NaCl, 11 ml per fraction, 40 ml / h fraction I 3 human insulin tert-butyl ester Fraction II = insulin, des-alanine (B30) insulin.

Beispiel 6: Deblockierung Nach Behandlung von 9.5 mg gereinigtem Humaninsulintert.butylester mit 10/ul Anisol und 400/ul Trifluoressigsäure bei Raumtemperatur in 1 Stunde fällt man mit Ether, zentrifugiert ab, entsalzt an Sephadex G 25 f in 10 proz. Essigsäure und gefriertrocknet. Man erhält 6.8 mg = 72% Humaninsulin.Example 6: Deblocking After treatment of 9.5 mg of purified human insulin tert-butyl ester with 10 / µl anisole and 400 / µl trifluoroacetic acid at room temperature in 1 hour one with ether, centrifuged off, desalted on Sephadex G 25 f in 10 percent. acetic acid and freeze-dried. 6.8 mg = 72% human insulin are obtained.

Die biologische Aktivität wurde durch Tritiumeinbau aus Glucose in toluolloslichem Fett in isolierten Fettzellen der Ratte nach Moody, A.J., Stan, M.A., Stan, M., Gliemann, J. (1974) Horm Metab. Res. 6, 12-16, bestimmt.The biological activity was determined by incorporating tritium from glucose into Toluene-soluble fat in isolated rat fat cells according to Moody, A.J., Stan, M.A., Stan, M., Gliemann, J. (1974) Horm Metab. Res. 6, 12-16, determined.

Beispiel 7: Einfluß der DMF-Konzentration In Fig. 3 ist der Einfluß der DMF-Konzentration auf die tryptische Transpeptidierung bei 230C von 18.5 mg = 3.2jumol Insulin/ 20 mg = 114/umol Thr-OBut in 225/ul 0.25 M Tris/HCl-DMF-pH 6.7, E/s =1/10 bei pH 6.7 gezeigt. o= 385', = 47%, D = 575', # = 6746, X = 805" (Vol) DMF. Es ist erkennbar, daß die Bildung von Desoktapeptid(323-30)-insulin erst bei mehr als 70% DMF verhindert wird, daß aber dabei der Humaninsulinester nur noch zu weniger als 5 % gebildet wird. Oberhalb 80% DMF erfolgt weder ein Angriff des Trypsins auf die Arginin(B22)-Bindung, noch erhält man ein Transpeptidierungsprodukt. Der optimale Bereich für die Transpeptidierung in Lysin(329) ist unter diesen Bedinungen bei 60 - 70 % DMF zu finden.Example 7: Influence of DMF Concentration In Fig. 3 is the influence the DMF concentration on tryptic transpeptidation at 230C of 18.5 mg = 3.2jumol insulin / 20 mg = 114 / umol Thr-OBut in 225 / ul 0.25 M Tris / HCl-DMF-pH 6.7, E / s = 1/10 shown at pH 6.7. o = 385 ', = 47%, D = 575', # = 6746, X = 805 "(Vol) DMF. It can be seen that the formation of desoctapeptide (323-30) -insulin only occurs with more than 70% DMF is prevented, but only the human insulin ester less than 5% is formed. Above 80% DMF, the Trypsins on the arginine (B22) binding, nor is a transpeptidation product obtained. The optimal range for transpeptidation into lysine (329) is under these conditions found at 60-70% DMF.

Beispiel 8: Einfluß des pH-Wertes Fig. 4 zeigt die pH Abhängigkeit der tryptischen Transpeptidierung bei 230C von 25 mg - 4.6 µmol Insulin/ 25 mg = 140/umol Thr-OBut in 250/ul 0.25 N Tris/HCl-60% (Vol) DMF, E/S =1/10. Im überprüften Bereich pH 4.7 bis 9.2 ist das Optimum für die kinetische Bildung des Humaninsulinesters um pH 6.6 zu erkennen, bei pH 4.7 erfolgt keine Reaktion. Die Bildung von Des- oktapeptid(B23-30)-insulin erfolgt oberhalb pH 6.6 nach 4 Stunden, nach 19 Stunden ist auch bei pH 5.8 eine Spur von diesem Derivat sichtbar.Example 8: Influence of the pH value Fig. 4 shows the pH dependency tryptic transpeptidation at 230C from 25 mg - 4.6 µmol insulin / 25 mg = 140 / µmol Thr-OBut in 250 / µL 0.25 N Tris / HCl-60% (Vol) DMF, E / S = 1/10. Im verified Range pH 4.7 to 9.2 is the optimum for the kinetic formation of the human insulin ester to detect pH 6.6, at pH 4.7 there is no reaction. The formation of desoctapeptide (B23-30) insulin takes place above pH 6.6 after 4 hours, after 19 hours there is also at pH 5.8 Trace of this derivative visible.

Da bei kleineren pH-Werten als 6 die tryptische Spaltung des Insulins (Esters) in Position B22-23 anscheinend gehindert ist, ist bei pH 5.8 ein zweites Optimum für die Bildung des Humaninsulinesters zu erkennen. Er entsteht zwar langsam, ist aber nach 19 h zu etwa 60% vorhanden. Der zeitliche Verlauf der Transpeptidierung ist in Fig. 5 noch einmal verdeutlicht. Sie zeigt die Zeit- und pH-Abhängigkeit der tryptischen Transpeptidierung bei 230 C von 25 mg = 4.61umol Insulin/ 25 mg = 140/umol Thr-OBut in 250/ul 0.25 M Tris/HCl - 60 % (Vol) DMF, E/S - 1/10.Since the tryptic cleavage of the insulin occurs at pH values below 6 (Esters) is apparently hindered in position B22-23, a second one is at pH 5.8 To recognize optimum for the formation of the human insulin ester. It arises slowly but is present to about 60% after 7 pm. The time course of transpeptidation is illustrated again in FIG. 5. It shows the time and pH dependencies tryptic transpeptidation at 230 C of 25 mg = 4.61umol insulin / 25 mg = 140 / µmol Thr-OBut in 250 / µl 0.25 M Tris / HCl - 60% (vol) DMF, E / S - 1/10.

BeisPiel 9: Abhängigkeit der Transpeptidierung in Phosphatpuffern vom pH-Wert Fig. 6 zeigt die Zeit-und pH-Abhängigkeit der tryptischen Transpeptidierung von 25 mg = 4.6/umol Insulin / 25 mg = 140/umol Thr-OBut in 250/ul 1 M Natriumphosphat - 60% (Vol) DMF bei 23°C E/S = 1/10.EXAMPLE 9: Dependence of transpeptidation in phosphate buffers on the pH value FIG. 6 shows the time and pH dependence of tryptic transpeptidation of 25 mg = 4.6 / µmol insulin / 25 mg = 140 / µmol Thr-OBut in 250 / µl 1 M sodium phosphate - 60% (Vol) DMF at 23 ° C E / S = 1/10.

Nur bei dem hohen pH-Wert 8.5 wird nach mehr als 4 Stunden der Humaninsulin-tert.butylester wieder abgebaut, bei kleinen pH-Werten ist auch-nach 70 Stunden kein Des- - oktapeptid(323-30 )-insulin elektrophoretisch nachweisbar. Das pH-Optimum hat sich nach 7.7 verschoben. Der Insulinester ist nach 23 Stunden zu etwa 55% entstanden.Only at the high pH value of 8.5 does the human insulin tert-butyl ester become after more than 4 hours degraded again, at low pH values there is no des- - octapeptide even after 70 hours (323-30 ) -insulin detectable electrophoretically. The pH optimum has shifted to 7.7. About 55% of the insulin ester has formed after 23 hours.

Beispiel 10: Abhängigkeit der Transpeptidierung in Phosphatpuffern von der Threonin-tert.butylester-Konzentration Daß für die Transpeptidierung die Threonin-tert.butylester-Konzentration nicht beliebig erhöhbar ist,um das Gleichgewicht zu verschieben, macht Fig. 7 deutlich.Example 10: Dependence of transpeptidation in phosphate buffers of the threonine tert-butyl ester concentration that is responsible for transpeptidation Threonine tert-butyl ester concentration cannot be increased to the equilibrium 7 makes it clear.

In Fig. 7 ist die tryptische Transpeptidierung von 25 mg = 4.6/mol Insulin bei 230C mit Thr-OBut <0.17 - 1.4 mmol) in 2501ul 1 M Natriumphosphat- 60« (Vol) DMF-pH 6.8, EIS = 1/10 dargestellt. Im Bereich zwischen 130 und 300 Äquivalenten des Threoninesters ist die enzymatische Reaktion anscheinend gehemmt.In FIG. 7, the tryptic transpeptidation of 25 mg = 4.6 / mol Insulin at 230C with Thr-OBut <0.17 - 1.4 mmol) in 2501ul 1 M sodium phosphate 60 «(vol) DMF-pH 6.8, EIS = 1/10 shown. In the range between 130 and 300 equivalents of the threonine ester, the enzymatic reaction is apparently inhibited.

Bei 130 Äquivalenten entsteht der Humaninsulinester zu etwa 7096 d.Th.With 130 equivalents, about 7096 of the human insulin ester is formed.

Das erhaltene Humaninsulin wurde wie folgt charakterisiert: Die Celluloseacetatelektrophoresen bei pH 2.2, 4.8.The human insulin obtained was characterized as follows: The cellulose acetate electrophoresis at pH 2.2, 4.8.

und 8.6 waren einheitlich und die elektrophoretische Beweglichkeit war gleich der des Schweineinsulins; Das Produkt wurde durch Aminosäureanalyse charakterisiert. Die Aminosäureanalyse entsprach den erwarteten Werten (in Klammern).and 8.6 were uniform and the electrophoretic mobility was equal to that of pork insulin; The product was determined by amino acid analysis characterized. The amino acid analysis corresponded to the expected values (in brackets).

Asp. 3.13 (3) Thr 2.90 (3) Ser 2.81 (3) Glu 7.00 (7) Gly 4.55 (4) Ala 1.18 (1) Cis21.79 (3) Val 2.79 (4) Ile 1.21 (2) Leu 5.79 (6) Tyr 3.87 (4) Phe 2.88 (3) Lys 1.11 (1) His 1.96 (2) Arg 1.00 (1) Im Fettzellentest nach Moody, A.J., Stan, M.A., Stan, M., Gliemann, J. (1974) Horm Meta. Res. 6, 12-16, konnte eine biologische Aktivität dieses Insulins von 95 5%, bezogen auf Schweineinsulin, festgestellt werden.Asp. 3.13 (3) Thr 2.90 (3) Ser 2.81 (3) Glu 7.00 (7) Gly 4.55 (4) Ala 1.18 (1) Cis21.79 (3) Val 2.79 (4) Ile 1.21 (2) Leu 5.79 (6) Tyr 3.87 (4) Phe 2.88 (3) Lys 1.11 (1) His 1.96 (2) Arg 1.00 (1) In the fat cell test according to Moody, A.J., Stan, M.A., Stan, M., Gliemann, J. (1974) Horm Meta. Res. 6, 12-16, could be a biological activity of this insulin of 95 5%, based on porcine insulin, was found will.

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Claims

Claims: Xß process for the production of B 30 threonine insulin using a threonine derivative of the formula Thr (R1) (R2) I.

wherein Thr stands for the L-threonine residue, R1 is hydrogen or a Means hydroxyl protecting group and R2 is a carboxyl protecting group, and one specifically acting on the carboxyl bonds or peptide bonds of basic amino acids Enzyme, in a solvent mixture of water and an organic solvent, d u r c h e k e n n n z e i c h n e t that one is the threonine derivative of the formula I and allows the enzyme to act on animal insulin at a pH of 5 to 9, separates the resulting B 30 threonine insulin derivative, possibly in itself known way and cleans the Carboxylschut7.gruppe in a manner known per se and optionally splitting off the hydroxyl protective group.

2.) The method according to claim 1, characterized in that the animal Insulin is porcine insulin.

3.) Method according to claim 1 or 2, characterized in that treatment at a pH Performs a value from 5.5 to 8.8.

4.) The method according to one or more of claims 1 to 3, characterized characterized in that the solvent used is a mixture of 20 to 80% by volume of water and correspondingly 80 to 20% by volume of organic solvent used.

5.) The method according to one or more of claims 1 to 4, characterized characterized in that the organic solvent is dimethylformamide and / or dimethyl sulfoxide is.

6.) Method according to claim 5, characterized in that the solvent mixture from 25 to 60% by volume of water and correspondingly 75 to 40% by volume of dimethylformamide and / or Is dimethyl sulfoxide.

7.) The method according to one or more of claims 1 to 6, characterized characterized in that the solution medium mixture contains a phosphate buffer and one Has a pH of 6 to 8.8.

8.) The method according to one or more of claims 1 to 6, characterized characterized in that the solvent mixture is a tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer and has a pH of 5.5 to 8.5.