DD151158A1

DD151158A1 - METHOD FOR PRODUCING INSULIN ANALOGS AND DERIVATIVES

Info

Publication number: DD151158A1
Application number: DD22148380A
Authority: DD
Inventors: Guenter Lesse; Gudrun Maetzler; Birgit Richter
Original assignee: Guenter Lesse; Gudrun Maetzler; Birgit Richter
Priority date: 1980-06-02
Filing date: 1980-06-02
Publication date: 1981-10-08

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Insulin-Analogen und -Derivaten aus den beiden Teilketten,indem diese durch bifunktionelle Klammergruppen (Typ U, V und W des Formelschemas) sterisch vororientiert und dann der eigentlichen Kombinationsreaktion zum Disulfidsystem des Insulins unterworfen werden. Auf diese Weise werden gegenueber den herkoemmlichen, sterisch ungelenkten Ketten-Kombinationsverfahren wesentlich hoehere Kombinationsausbeuten bis zu 80% erreicht. Die genannten Klammergruppen werden mittels Aktivester-Verfahren in die Aminogruppen A 1 und B 29 der beiden Teilketten eingefuehrt, wobei sich alkalisch,also unter den gaengigen Bedingungen der Kettenkombination stabile bifunktionelle Urethane bilden. Erfindungsgemaesz zeichnen sich diese durch hohe Saeurelabilitaet aus und lassen sich daher aeuszerst schonend unter Freilegung des gebildeten Insulin-Molekuels reversibel spalten.The invention describes a process for the preparation of insulin analogues and derivatives from the two partial chains by sterically preorienting them by bifunctional clamp groups (type U, V and W of the formula scheme) and then subjecting them to the actual combination reaction to the disulphide system of insulin. In this way, substantially higher combination yields of up to 80% are achieved compared to conventional, sterically uncontrolled chain combination processes. The abovementioned clasping groups are introduced by means of an active ester method into the amino groups A 1 and B 29 of the two partial chains, with alkaline, ie under the usual conditions of the chain combination, forming stable bifunctional urethanes. According to the invention these are characterized by high Saechelabilitaet and can therefore be extremely gently split to reveal the formed insulin molecule reversibly.

Description

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Titel der Erfindung:Title of the invention:

Verfahren zur Herstellung von Insulin-Analogen und -DerivatenProcess for the preparation of insulin analogues and derivatives

Anwendungsgebiet der Erfindung:Field of application of the invention:

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Insulin-Analogen und -Derivaten, indem die Insulin-A- und -B-Kette bzw. ihre Abwandlungsprodukte über die Positionen A 1 - B 29 mittels neuer bifunktioneller und reversibel entfernbarer Gruppierungen verklammert werden. Auf diese Weise v/erden die Ketten ßterisch vororientiert und lassen sich in hoher Ausbeute zu den entsprechenden-Insulinen kombinieren.The invention describes a process for the preparation of insulin analogues and derivatives by clamping the insulin A and B chains or their modification products via the positions A 1 -B 29 by means of new bifunctional and reversibly removable groups. In this way, the chains are heterogeneously preoriented and can be combined in high yield to give the corresponding insulins.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:Characteristic of the known technical solutions:

Wie aus röntgenstrukturanalytischen Untersuchungen hervorgeht, sind von den 3 Aminogruppen des Insulins diejenigen in Position A 1 und B 29 auf einen Abstand von etwa 8 - 10 δ einander sterisch angenähert (Blundell, Dodson, Hodgkin, Mercola, Adv. Pro-, tein Chem, 2,6, 279 (1972)), was eine Überbrückung dieser Funktionen durch bifunktionelle Reagenzien geeigneter Distanzweite ermöglicht (Zahn, Meienhofer, Makromol. Chem. ,26, 153 (1958), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. ^, 613, 1521 (1973)). Werden .die beiden voneinander getrennten Teilketten des Insuline an den genannten Aminogruppen durch derartige Reagenzien verklammert, führt dies zu konformativer Vororientierung und einer in hoher Ausbeute, also unter weitgehend formelgerechter Knüpfung der 3 Disulfidbrücken verlaufenden Rückbildung des Insulins. DerAs can be seen from X-ray structural analysis, of the 3 amino groups of insulin, those in position A 1 and B 29 are sterically approximated to a distance of about 8-10 δ (Blundell, Dodson, Hodgkin, Mercola, Adv. Pro, tein Chem. Chem., 26, 153 (1958), Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem., 613., 2,6, 279 (1972)), which allows a bridging of these functions by bifunctional reagents of suitable distance (Zahn, Meienhofer, Makromol , 1521 (1973)). If the two mutually separate partial chains of the insulins at the mentioned amino groups are clamped by such reagents, this leads to conformational preorientation and a recovery of the insulin which proceeds in high yield, that is to say under largely formula-compatible formation of the 3 disulphide bridges. The

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Einsatz von Klammerreagenzien als Hilfsmittel für die Kombinat tion der beiden Insulin-»Teilketten zum Gesamtmolekül ist daher von besonderem Vorteil und den herkömmlichen Methoden der ungelenkten Kettenkombination mit Gemischen von A-. und B-Kette überlegen« Voraussetzung hierbei ist es jedoch, daß die verklammernde Gruppierung reversible Eigenschaften hat und sich möglichst schonend, d. h. unter Erhalt der gebildeten Disulfid« brücken aus dem Insulinmolekül wieder abspalten läßt.The use of brace reagents as an aid to the combination of the two insulin partial chains to the total molecule is therefore of particular advantage and the conventional methods of unguided chain combination with mixtures of A-. and B chain superior. "The condition here, however, is that the enslaving grouping has reversible properties and is as gentle as possible, i. H. while retaining the disulfide bridges formed, it is possible to split off the insulin molecule again.

In der Literatur wurde bisher eine Reihe biftinktioneller Klaramergruppen für die Aminopoßitionen A 1 - B 29 beschrieben (Übersicht Geiger, Chem« Ztg. 100, 111 (1976)), die zwar den ßterißchen Anforderungen genügen, die aber zu chemisch nicht voll befriedigenden Verklammerungseffekten führen.The literature has hitherto described a series of bidentate claramer groups for the amino episodes A1-B29 (reviewed by Geiger, Chem. Ztg. 100, 111 (1976)), which, although satisfying the demands of the art, lead to chemically unsatisfactory interlocking effects ,

• CO - CH -(CHg)_n - CH - CO - η = 2 - 4 (D• CO - CH - (CHg) _n - CH - CO - η = 2 - 4 (D.

- CO - 0 - (CH₂)₂ - SO₂ - (CHg)₂ - 0 - CO - (2)- CO - 0 - (CH ₂₎ ₂ - SO ₂ - (CHg) ₂ - 0 - CO - (2)

CH₃ CH-CH ₃ CH-

-CO-O-C- CH₂ - CH₂ - C - 0 - CO - (3)-CO-OC- CH ₂ - CH ₂ - C - 0 - CO - (3)

CH₃ CH ₃

So gelangten beispielsweise , *-I>iamino-dicarbonsäure-Reste (Typ 1) zur Anwendung, deren Wiederabspaltung aus dem Insulin-Molekül den Edman-Abbau erfordert. Das führt jedoch zu gleichzeitigem Verlust von Phe in Position B 1. Bifunktionelle SuI--fonylethyl«oxycarbonyl«>Gruppen (Typ 2) (Obermeier, Geiger, Hoppe«Seyler*s Z. Physiol. Chem. ;?££, 1631 (1975)) sind alkalilabil und daher unter den üblichen Kombinationsbedingungen für die beiden derart verklammerten Ketten nicht voll beständig. Diese Gruppierung sowie bifunktionelle tert. Alkyl-oxycarbonyl-Gruppen (Typ 3) (BRD Offenlegungsschrift 2253327 vom 31. 10. 1974 (9* 5« 74)) lassen sich nach erfolgter Vereinigung der beiden Insulin-Teilketten zum Gesamtmolekül zwar wieder reversibel entfernen, allerdings sind dazu Bedingungen wie alkalische Hydrolyse bzw. Acidolyse erforderlich, unter denen DisulfideFor example, * -I> amino dicarboxylic acid residues (type 1) have been used, whose elimination from the insulin molecule requires Edman degradation. However, this leads to simultaneous loss of Phe in position B 1. Bifunctional sulfonylethyl "oxycarbonyl"> groups (type 2) (Obermeier, Geiger, Hoppe "Seyler Z. Physiol. Chem.; £ ££, 1631 (FIG. 1975)) are alkali-stable and therefore not fully stable under the usual combination conditions for the two such bracketed chains. This grouping as well as bifunctional tert. Although alkyloxycarbonyl groups (type 3) (Federal Republic of Germany Offenlegungsschrift 2253327 of Oct. 31, 1974 (9 * 5, 74)) can be reversibly removed again after the two insulin subchains have been combined to form the total molecule, conditions such as alkaline are used Hydrolysis or acidolysis required, among which disulfides

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austausch an den 3 Cystinbrücken nicht auszuschließen ist. Die Anwendung dieser sowie der übrigen bisher vorgeschlagenen Klammergruppen kann daher zu ausbeutemindernden, biologisch inaktiven und schwer abtrennbaren Nebenprodukten führen.Exchange at the 3 cystine bridges can not be ruled out. The use of these and the other previously proposed staple groups can therefore lead to yield-reducing, biologically inactive and difficult to separate by-products.

Ziel der Erfindung:Object of the invention:

Die Erfindung bezweckt die Verklammerung der Insulin-A-Kette an der Aminoposition 1 mit der Insulin-B-Kette an der Aminoposition 29 durch neue bifunktionelle Reagenzien, welche die beiden Aminogruppen etwa auf eine Distanzweite fixieren, wie sie den natürlichen Verhältnissen im Insulin-Molekül entspricht und die zu einer für die formelgerechte Herstellung der 3 Inaulin-Disulfidbrücken geeigneten konformativen Vororientierung führt. Weiterhin wird für die verklammernde Punktion eine derartige Struktur angestrebt, daß sie aus dem gebildeten Insulinderivat für das Disulfidsystem möglichst.schonend reversibel entfernbar ist (s. Formelschema). Auf diese Weise sollen gegenüber den herkömmlichen Verfahren zur Kombination der beiden Insulinketten verbesserte Ausbeutewerte erzielt und gleichzeitig allgemeine auf Abwandlungsprodukte übertragbare Verfahren entwickelt v/erden, welche neue Analoge und Derivate des Insulins bessererschließen.The invention aims at clamping the insulin A chain at the amino position 1 with the insulin B chain at the amino position 29 by new bifunctional reagents which fix the two amino groups at a distance, as the natural conditions in the insulin molecule which leads to a conformational preorientation suitable for the formula-compliant production of the 3 inauline disulfide bridges. Furthermore, such a structure is desired for the entrapped puncture that it is possible reversibly removable from the insulin derivative formed for the disulfide system (see formula scheme). In this way, compared with the conventional methods for combining the two insulin chains, improved yield values are to be achieved and, at the same time, general methods that can be transferred to modification products are developed, which better open up new analogs and derivatives of insulin.

Darlegung des Wesens der Erfindung:Explanation of the essence of the invention:

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, verbesserte Methoden gegenüber den bisher bekannten statistischen oder sterische Orientierungseffekte verwendenden Verfahren für die Kombination von Insulin-Α- und -B-Kette zu entwickeln. Gleichzeitig sollen auf diese Weise auch Analoge und Derivate der beiden Teilketten einem zweckmäßigeren Kombinationsverfahren zu den entsprechenden Insulinen zugänglich gemacht und so neue Wege für die Gewinnung von Insulin-Abwandlungsprodukten erschlossen werden. Darüber hinaus werden von den hierbei intermediär gewonnenen Insulin-Verklaminerungs produkt en neue biologische Eigenschaften er-»The problem of the invention is to develop improved methods for the combination of insulin Α and B chain with respect to previously known statistical or steric orientation effects. At the same time, analogues and derivatives of the two partial chains are to be made accessible in this way to a more convenient combination method to the corresponding insulins, thus opening up new ways of obtaining insulin modification products. In addition, the intermediately obtained insulin-lysing products will produce new biological properties. "

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wartet. 'waiting. '

In der vorliegenden Erfindung werden 3 neue bifunktionelle Klammerreagenzien vom Typ HpO-X-OIIp (-X- = Typ U-Y/ des Formelschemas, ΟΪΤρ = Nitrophenoxy«») beschrieben, welche sich spezifisch in Aminofunktionen einführen lassen, die die eingangs erwähnten stereochemischen Bedingungen erfüllen, indem sie Dißtanzweiten zwischen 2 Aminogruppen in einem Intervall von 5 bis 18 % erfassen und die zu Verklammerungsprodukten vom bifunktionellen Urethantyp führen.In the present invention 3 new bifunctional stapling reagents of the type HpO-X-OIIp (-X- = type UY / of the formula scheme, ΟΪΤρ = nitrophenoxy ") are described, which can be introduced specifically into amino functions that meet the stereochemical conditions mentioned above by detecting density scores between 2 amino groups at an interval of 5 to 18 % and resulting in bifunctional urethane type compounding products.

HpOHHpOH

Die so gebildeten Urethane sind im Gegensatz zu den von der oben erwähnten Klammergruppierung (2) abgeleiteten bifunktio«* nellen Sulfonylethyl°»urethanen unter den alkalischen Kombina« tionsbedingungen für die A- und B-Kette weitgehend stabil, so daß der Verklammerung3effekt und die sterische Vororientierung von A- und B-Kette weitgehend gewährleistet ist.The urethanes thus formed, in contrast to the bifunctional sulfonylethyl urethanes derived from the above-mentioned parent grouping (2), are largely stable under the alkaline combination conditions for the A and B chains, so that the interlocking effect and the steric conformation Preorientation of A and B chain is largely ensured.

Auch lassen sie sich nach erfolgter Kombination der Ketten zum Insulin auf Grund ihrer besonderen Struktur durch Protonenkatalyee um ein Vielfaches schneller und dabei für die gebil« deten Cystin-Brücken wesentlich schonender spalten, als die bei den bisher bekannten, von Typ (3) abgeleiteten Verklamraerungsprodukten des bifunktionellen tert. Alkyl-Urethantypes der Fall ist, Die Anwendung der 3 hier neu beschriebenen Klara« merreagenzien NpO-X-OlIp sowie der entsprechenden bifunktionellen Gruppen U, V und W (X = Typ U, V und W des Formelschemas) als verklammerndes Prinzip erweisen sich daher als ein besonders geeignetes reversibles Hilfsmittel zur Kombination der Insulin«A- und -B-Kette. Die Klammerreagenzien selbst sind bequem aus den zugrunde liegenden 2-wertigen Alkoholen durch Umsatz mit Chlorameisensäure-nitrophenylester zugänglich.Moreover, due to their special structure, they can be split much more quickly by proton catalysis after the chains have been combined into insulin, and they can be cleaved much more gently for the cystine bridges formed than in the previously known lattice-removal products derived from type (3) of the bifunctional tert. The use of the three novel reagent reagents NpO-X-OlIp and the corresponding bifunctional groups U, V and W (X = types U, V and W of the formula scheme) is therefore an interlocking principle as a particularly suitable reversible adjuvant for combining the insulin A and B chains. The staple reagents themselves are conveniently accessible from the underlying 2-valent alcohols by reaction with nitrophenyl chloroformate.

HO ——— OH + 2 Cl-CO-OlTp ——- NpQ-COO >— OCO-ONpHO --- OH + 2 Cl-CO-OlTp --- NpQ-COO> - OCO-ONp

β ITpO -X- ONpβ ITpO -X- ONp

Als typisches Beispiel für die Wirksamkeit dieser Klammerrea«As a typical example of the effectiveness of this Klammerrea «

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genzien zur Kombination von A- und B-Kette sei die Anwendung von 1,4-Bis-ClTitrophenoxy-carbonyloxy-isopropyl-)benzol (NpO-X-OTTp, X = Typ TJ des Formelschemas) beschrieben.For the combination of A and B chains, the use of 1,4-bis-ClTitrophenoxy-carbonyloxy-isopropyl) benzene (NpO-X-OTTp, X = type TJ of the formula scheme) is described.

Rinderinsulin wird mit dem Klammerreagenz im Molverhältnis 1 : 1,1 in Gegenwart von IT-Iüethylmorpholin und unter Verwendung von DMSO als lösungsmittel umgesetzt und das Reaktionsprodukt durch Säulenchromatographie an Sephadex G 50 gereinigt. Man erhält hierbei ein Gemisch aus AI-B 29- und A 1 - B 1-verklammerten sowoe monofunktioneil substituierten Insulinen, aus welchem sich das A 1 - B 29-Derivat säulenchromatographisch an CM-Cellulose bequem isolieren läßt ♦ Seine Struktur wird neben den üblichen analytischen Daten durch die Tatsache bewiesen, daß bei der Endgruppenbestimmung nach der Dansylmethode kein GIy A 1, sondern lediglich endständiges Phenylalanin aus der Position B 1 auftritt und daß unter den Spaltprodukten des tryptischen Abbaues kein Alanin aus der Position B 30 nachweisbar, die -Aminogruppe des nachbarständigen Lysins B 29 also besetzt ist.Bovine insulin is reacted with the stapling reagent in the molar ratio 1: 1.1 in the presence of IT-ethylmorpholine and using DMSO as solvent and the reaction product is purified by column chromatography on Sephadex G 50. This gives a mixture of AI-B 29- and A 1 -B 1 -klammed and mono-functionally monosubstituted monosubstituted insulins, from which the A 1 - B 29 derivative can be easily isolated by column chromatography on CM cellulose ♦ Its structure is in addition to the usual proved analytical data by the fact that in the end group determination by the Dansylmethode no GIy A 1, but only terminal phenylalanine from the position B 1 occurs and that among the cleavage products of the tryptic degradation no alanine from the position B 30 detectable, the -Aminogruppe of Neighboring lysine B 29 is thus occupied.

Spaltet man entsprechend dem Formelschema die Disulfidbrücken dieses Ä 1 - B 29-Insulin-Derivates durch oxydative Sulfitoly-8c, gelangt man zu einem A 1 - B 29-Hexa-S-Sulfonat. Dieses kann auch durch direkte Verklammerung der Einzelketten, also von Insulin-A-Ketten-Tetra-S-Sulfonat mit Insulin-B-Ketten-Di-S-SuIfonat durch Reagenz UpO-X-OlIp (X = Typ U, V, W) und anschließende säulenchromatographische Aufreinigung gewonnen v/erden, in abgewandelter Form auch unter Verwendung von derivatißiertem A- bzw. B-Ketten-S-Sulfonat. Ein solches A 1 B 29-Verklammerungsprodukt der S-SuIfonate beider Einzelketten läßt sich mit Tributylphosphin bei pH 10,6 unter Verdünnungsbedingungen in bis zu 80-prozentiger Ausbeute zum authentischen A 1 - B 29-Insulin mit korrekter Anordnung der Disulfidbrücken rückwerwandeln. Mittels 83-prozentiger Essigsäure/ Ameisensäure/Wasser (7:1:2) wird hieraus die Klammerfunktion quantitativ entfernt und biologisch voll aktives Insulin gewonnen .If, according to the formula scheme, the disulphide bridges of this Ä 1 - B 29 insulin derivative are cleaved by oxidative sulphitoly-8c, an A 1 -B 29-hexa-S-sulphonate is obtained. This can also be achieved by direct clamping of the single chains, ie insulin A-chain tetra-S-sulfonate with insulin B-chain di-S-sulfonate by reagent UpO-X-OlIp (X = type U, V, W ) and subsequent purification by column chromatography, in a modified form also using derivatized A or B chain S-sulfonate. Such an A 1 B 29 -clamping product of the S-sulfonates of both single chains can be converted back to the authentic A 1 - B 29 -insulin with correct arrangement of the disulfide bridges with tributylphosphine at pH 10.6 under dilution conditions in up to 80% yield. By means of 83% acetic acid / formic acid / water (7: 1: 2), the stapling function is quantitatively removed from this and biologically active insulin is recovered.

Die Al - B 29-Insulinderivate vom Typ U, V und W des Formelschemas zeigten gegenüber natürlichem Insulin modifizierte, interessante biologische und biochemische Eigenschaften.The Al-B 29 insulin derivatives of type U, V and W of the formula scheme showed modified biological and biochemical properties that are modified compared to natural insulin.

Ausführungsbeispiele: 'Exemplary embodiments:

Beispiel 1: Darstellung der KlammerreagenzienExample 1: Preparation of the Clamp Reagents

a. 1 _t4-BiS-(Nitrophenoxy-carbonyloxy-isopropyl-)benzol (NpO-X-ONp; X = Typ U)a. 1 _t 4-BiS- (nitrophenoxy-carbonyloxy-isopropyl) -benzene (NpO-X-ONp; X = type U)

2,5 mMol 1,4~Bis«(Hydroxy-isopropyl-)benzol (Schmp. HO ⁰C) werden in 2,5 ml CH₂Cl₂ und 0,3 ml Pyridin bei - .5 °C innerhalb von 30 min mit 5 mMol Chlorameisensäure-p-nitrophenylester (Schmp. 81 - 82 ⁰C) versetzt. Nach 8 Std. Rühren bei 20 ⁰C v/ird das Reaktionsgemisch auf wenig Eis gegossen, mit 2,5 ml Di-* chlormethan verdünnt, die organische Phase abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über NapSO. getrocknet und das Lösungsmittel bei 30 ⁰C im Vakuum entfernt. Nach Umkristallisieren aus Essigester:2.5 mmol of 1,4-bis (hydroxy-isopropyl) benzene (mp HO ⁰ C) are dissolved in 2.5 ml of CH ₂ Cl ₂ and 0.3 ml of pyridine at -5 ° C. within 30 min with 5 mmol of p-nitrophenyl chloroformate (mp 81 - 82 ⁰ C). After stirring for 8 hours at 20 ^° C., the reaction mixture is poured onto a small amount of ice, diluted with 2.5 ml of dichloromethane, the organic phase is separated off, washed with water, and over Na 2 SO 4. dried and the solvent removed at 30 ⁰ C in vacuo. After recrystallization from ethyl acetate:

Schmp. 94 - 96 ⁰C; Ber.: C 59,73, H 4,58, N 5,30 %; Gef.: C 59,54, H 4,67, N 5,01 %. Mp 94-96 ⁰ C. Calc .: C, 59.73, H, 4.58; N, 5.30 %; Found: C 59.54, H 4.67, N 5.01 %.

* *

b» 1,2~Bis-/o«(Nitrophenoxy-carbonyloxy-ethyl(1)-)phenoxy-/b »1,2-Bis- / o (nitrophenoxy-carbonyloxy-ethyl (1) -) phenoxy- /

ethan . (NpO-X-ONp; X = Typ V)ethane. (NpO-X-ONp; X = Type V)

2,8InIIiOl 1,2-Bis-(o-Hydroxyethyl(1)-phenoxy-)ethan (Schisp. 109 «110 ⁰C); Ber. C 71,50, H 7,30; Gef. C 71,56, H 7,60 % (dargestellt durch lieerwein-Ponndorf-Reduktion aus T,2-Bis-(o-Acetyl-phenoxy-»)ethan) v/erden in 6 ml absol. Dioxan " gelöst, mit 0,75 ml N~Methylmorpholon versetzt und. bei 0 ⁰C die Lösung von 6 mMol Chlorameisensäure-p-nitrophenylester in 3 ml Dioxan tropfenweise hinzugefügt, 2 Stunden bei 20 ⁰C Rühren gelassen, vom ausgefallenen Niederschlag abgesaugt, im Vakuum bei 30 ⁰C eingedampft und aus Essigester/Petroläther kristallisiert. Schmp. 138 - 139 ⁰C; Ber. C 60,74, K 4,48, N 4,48;.Gef· C 60,71, H 4,69, N 4,49 %. 2,8InIIiOl 1,2-bis (o-hydroxyethyl (1) phenoxy) ethane (Schisp 109 "110 ⁰ C.); Ber. C 71.50, H 7.30; Gef. C 71.56, H 7.60 % (represented by eurewein-Ponndorf reduction from T, 2-bis- (o-acetyl-phenoxy-) ethane) in 6 ml absolute. Dioxane, "with 0.75 ml of N ~ Methylmorpholon added and. At 0 ⁰ C, the solution of 6 mmol of chloroformic acid p-nitrophenyl ester in 3 ml dioxane was added dropwise, left for 2 hours at 20 ⁰ C with stirring, filtered off with suction from the precipitate, evaporated in vacuo at 30 ⁰ C and crystallized from Essigester / petroleum ether, mp 138-139 ⁰ C;... Ber C 60.74, K 4.48, N 4.48; .Gef · C 60.71, H 4, 69, N 4.49 %.

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c. 1,2-Bis-/p«(Hitrophenoxy-carbonyloxy«»ethyl(1 )-)phenoxy-/ ethan (ITpO-X-OlTp; X = Typ W)c. 1,2-bis- / p- (-hitrophenoxy-carbonyloxy-) ethyl (1) -phenoxy- / ethane (ITpO-X-OlTp; X = type W)

Die Verbindung wird analog wie unter b. beschrieben, durch Meerwein-Ponndorf-Reduktion von 1,2-Bi3-(p-Acetyl-phenoxy-)ethan zum 1,2-Bis-(p-Hydroxyethyl(1)-phenoxy-)ethan (Schmp. 147 - 149 °C; Ber. C 71,50, H 7,30; Gef. C 71,27, H 7,19 %) und dessen Umsetzung mit Chlorameisensäure-p-nitrophenylester erhalten. Zers.Punkt 232 - 235 ⁰C; Ber. C 60,74, H 4,48;^; II 4,48; Gef. C 60,45, H 4,60, H 4,25 %. The compound is analogous as under b. Meerwein-Ponndorf reduction of 1,2-Bi3- (p-acetylphenoxy) ethane to 1,2-bis (p-hydroxyethyl (1) -phenoxy) ethane (mp 147-149 ° C, C 71.50, H 7.30, C 71.27, H 7.19 ) and its reaction with p-nitrophenyl chloroformate. Breakpoint 232 - 235 ⁰ C; Ber. C, 60.74, H, 4.48; ^; II 4,48; Gef. C 60.45, H 4.60, H 4.25 %.

Beispiel 2: Anwendung von Klammerreagenz ITpO-U-OTTpExample 2: Use of Clip Reagent ITpO-U-OTTp

47 /uMol Insulin und 500 ,uMol IT-Methylmorpholin werden in 200 ml DLTSO gelöst und die Lösung von 50 /UMol Klammerreagens NpO-U-OlTp in 36 ml DMSO innerhalb von 2 Std. bei 20 ⁰C zugetropft. Nach 48-stUndigem Rühren wird 10 Std. zunächst gegen 5 1 Eiswasser, anschließend 6 mal gegen 5 1 entionisiertes Wasser dialysiert, auf den isoelektrischen Punkt von pH 4,8 eingestellt, der Niederschlag abzentrifugiert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Die Papierchromatographie mit ßek. Butanol/Eis« essig/8 M Harnstoff (12:0,9:12) zeigte vollständigen Umsatz des eingesetzten Insulins an.47 / umol insulin and 500 micromoles IT-methylmorpholine are dissolved in 200 ml DLTSO and the solution of 50 / pmol Klammerreagens NpO-U-OLTP in 36 ml of DMSO are added dropwise within 2 hrs. At 20 ⁰ C. After stirring for 48 hours, the mixture is dialyzed first against 5 l of ice water for 10 hours, then against 5 liters of deionized water 6 times, adjusted to the isoelectric point of pH 4.8, the precipitate is centrifuged off, washed with acetone and dried. The paper chromatography with ßek. Butanol / glacial acetic acid / 8 M urea (12: 0.9: 12) indicated complete conversion of the insulin used.

Das Rohprodukt wird an Sephadex G 50 (5,8 χ 120 cm, 5 ml/h,cm²) mit ITa₂HPO./C itronensäure-Puff er, der mit 5-proz. Essigsäure auf pH 4 eingestellt ist, chromatographiert, die IJonomerenfraktion im Elutionsbereich von 2400 - 3000 ml abgetrennt und diese dialysiert und getrocknet.The crude product is purified on Sephadex G 50 (5.8 χ 120 cm, 5 ml / h, cm ² ) with ITa ₂ HPO./C itenoic acid pouches containing 5 percent strength. Acetic acid is adjusted to pH 4, chromatographed, the IJonomerenfraktion in the elution range of 2400 - 3000 ml separated and dialyzed and dried.

Die so gewonnene Monomerenfraktion wird an CH-Cellulose (2,6 χ 30 .cm, 6 ml/h, cm ) mit 7 M Harnstoff in 3-prz. Essigsäure bei linearem ITaCl-Gradientyen von 0-2 Mol/l in 4,Fraktionen zerlegt, unter denen sich die zunächst austretende Hauptfraktion nach den Ergebnissen der oxidativen Sulfitolyse, der Bestimmung J endständigen Phenylalanins B 1 sowie des tryptischen Abbaues ale A 1 - B 29?Insulin-Derivat erwies.The monomer fraction thus obtained is on CH-cellulose (2.6 χ 30 .cm, 6 ml / h, cm) with 7 M urea in 3-prz. Acetic acid at linear ITaCl Gradientyen of 0-2 mol / l in 4, fractions decomposed, among which the first leaving main fraction after the results of oxidative sulfitolysis, the determination of J terminal phenylalanine B 1 and the tryptic degradation ale A 1 - B 29th Insulin derivative proved.

4,0 /uMol dieses A 1 - B 29-Derivates werden in 1,5 ml Tris-Puffer-j der mit 0,1 M HCL auf pH 8,6 gebracht wurde, gelöst, mit 35 mg ITa₂SO, und 35 mg IJa₂S O₇ versetzt, 10 Stunden bei 20 ⁰C4.0 / μmole of this A 1 -B 29 derivative are dissolved in 1.5 ml Tris buffer-j adjusted to pH 8.6 with 0.1 M HCl to give 35 mg of ITa ₂ SO 4, and 35 mg IJa ₂ SO ₇ , 10 hours at 20 ⁰ C.

Z 2 1 4 ΰ 3Z 2 1 4 ΰ 3

gehalten, auf pH 4_fO gebracht und nach 4-ßtündiger Dialyse getrocknet. Die Elektrophorese zeigt ein praktisch einheitliches A 1 - B 29~Hexa-S-Sulfonat an, das auch bei der Verklammerung von Insulin-A-Ketten-Tetra-S-Sulfonat mit B~Ketten-Di-S-Sulfonat bzw. in abgewandelter Form (s. Beißpiel 4) aus derivatiaierten A- und B-Ketten-S-Sulfonaten entsteht,maintained, brought to pH 4 _f O and dried after 4 -Üssiger dialysis. The electrophoresis indicates a practically uniform A 1 - B 29 ~ hexa-S-sulfonate, which also in the clamping of insulin A-chain tetra-S-sulfonate with B ~ chain di-S-sulfonate or in modified Form (see game 4) of derivatized A- and B-chain S-sulfonates,

Kombination:Combination:

4 /uMol A 1 - B 29-Hexa-S-Sulfonat aus den beiden Teilketten4 / μmol A 1-B 29-hexa-S-sulfonate from the two partial chains

werden in 0,1 M ITaHCO₃/Propanol (1:1) gelöst, mit 1 M ₂₃ auf pH 8,2 gebracht und unter TL in 26 yuMol Tributylphosphin in 1,1 ml n-Propanol eingetragen, ITach 1,5-stündigem Stehen bei 20 ⁰C unter Έ wird mit 250 ml Ua-Glycinat-Puffer des pH 10,6 verdünnt und 48 Std, bei 4 C an der Luft stehen gelaasen. Anschließend bringt man mit Eisessig auf pH 4,0, engt i. Vak. auf 50 ml ein und fällt das Kombinationsprodukt (Insulin A 1 B 29-Derivat) mit gesättigter Pikrinsäurelb'sung aus. Es entsteht in 80 % Ausbeute, bezogen auf χ 1 - B 29-Hexa-S-Sulfonat und liefert nach Entfernung der Klammerfunktion mit 83-prozentiger Essigsäure/Ameisensäure/HpO (7:1:2) (1,5 Std,, 20 ⁰C) elektrophoretisch mit Referenz identisches biologisch voll aktives Insulin,are dissolved in 0.1 M ITaHCO ₃ / propanol (1: 1), brought to pH 8.2 with 1 M ₂₃ and added under TL in 26 .mu.mol tributylphosphine in 1.1 ml of n-propanol, ITach 1.5 hours Stand at 20 ⁰ C under verdün is diluted with 250 ml of Ua-glycinate buffer of pH 10.6 and 48 hours, at 4 C in the air are gelaasen. Then it is brought to pH 4.0 with glacial acetic acid, concentrated i. Vak. to 50 ml and precipitates the combination product (insulin A 1 B 29 derivative) with saturated Pikrinsäurelb'sung. It is obtained in 80 % yield, based on χ 1 -B 29-hexa-S-sulfonate and after removal of the stapling function with 83 percent acetic acid / formic acid / HpO (7: 1: 2) (1.5 hrs, 20 ⁰ C) electrophoretically identical to reference biologically fully active insulin,

Beispiel 3: Anwendung von Klammerreagenz WpO-V-OHp Entsprechend Beispiel 2, Jedoch unter Anwendung des Klammerreagenz UpO-V-ONp gewonnenes A 1 - B 29-Hexa-S-Sulfonat wird nach den ebenfalls unter Beispiel 2 angeführten Kombinationsbedingungen in das Insulin A 1 - B 29-Derivat übergeführt. Es entsteht in über 60 %'Ausbeute, bezogen auf A 1 - B 29-Hexa-S-Sulfonat und ergibt nach Entfernung der Klammergruppe mit 4 η HCl/Dioxan elektrophoretisch einheitliches, biologisch voll aktives Insulin,Example 3: Use of Stapling Reagent WpO-V-OHp According to Example 2, but using the stapling reagent UpO-V-ONp recovered A 1 - B 29-hexa-S-sulfonate is converted into insulin A according to the combination conditions also mentioned in Example 2 1 - B 29 derivative converted. It is produced in more than 60 % yield, based on A 1 -B 29-hexa-S-sulfonate, and, after removal of the group with 4 N HCl / dioxane, results in electrophoretically uniform, biologically fully active insulin.

Beispiel 4t Kombination von A-Ketten-Tetra-S~Sulfonat mit IT -Boc-B-Ketten-Di-S-SulfonatExample 4t Combination of A-chain tetra-S-sulfonate with IT-Boc-B chain di-S-sulfonate

0,7 g Insulin-A-Ketten-Tetra-S-Sulfonat, gelöst in 25 ml 90-proz. DMF werden mit N-Methylmorpholin auf pH.7,5 gebracht und0.7 g insulin A chain tetra-S-sulfonate, dissolved in 25 ml 90% strength. DMF are brought to pH 7.5 with N-methylmorpholine and

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mit 0,7 g ITpO-U-OlTp versetzt. ITach 15-stündigem Rühren bei 20 ⁰C fällt man mit Essigester 0,6 g monofunktionell substituierter Α-Kette (AI-U-OlJp) aus, nimmt in 25 ml DMP auf und fügt 0,6 g N -Boc-B-Ketten-Di-S-Sulfonat sowie 40 mg TT-Hydro« xybenzotriazol zu, bringt mit Triethylamin auf pH 9, rührt eine Stunde bei 20 ⁰C und fällt mit Essigester aus. Man erhält 1,2 g de3 A 1 - B 29-Hexa-S-Sulfonates, das zusätzlich in Position B 1 die Boc-Gruppe aufweist♦added with 0.7 g ITpO-U-OlTp. After 15 hours of stirring at 20 ⁰ C is precipitated with ethyl acetate 0.6 g of monofunctionally substituted Α-chain (AI-U-OlJp), takes up in 25 ml of DMP and adds 0.6 g of N -Boc-B chains -di-S-sulfonate and 40 mg of TT-Hydro "xybenzotriazol to, brings with triethylamine to pH 9, stirred for one hour at 20 ⁰ C and falls with Essigester from. This gives 1.2 g de3 A 1 - B 29-hexa-S-sulfonate, which additionally in position B 1, the Boc group has ♦

Die weitere Verarbeitung zum B 1- Boc - A 1 - B 29-Insulin-Derivat erfolgt analog zu Beispiel 1 unter Punkt Kombination beschrieben, Nach Ausfüllung des Kombinationsproduktes wird an Sephadex G 75 gereinigt und die Klammerfunktion U einschließlich der Boc-Gruppe mit 4 η HCl/Dioxan entfernt. Man erhält 0,5 g Rohinsulin, das erneut an Sephadex G 75 aufgereinigt wird.The further processing to B 1- Boc - A 1 - B 29 insulin derivative is carried out analogously to Example 1 under point combination, After filling the combination product is purified on Sephadex G 75 and the stapling function U including the Boc group with 4 η HCl / dioxane removed. 0.5 g of crude insulin is obtained, which is purified again on Sephadex G 75.

Claims

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Invention claim:

A process for the preparation of insulin analogues and derivatives, characterized in that the two partial chains before the actual combination reaction by twilight over the amino groups A.1 / B 29 sterically preoriented and that for clamping reversible bifunctional groups of the type U, V and W of Formula schemes are used which can be easily introduced into the respective amino groups by active ester methods, which lead to bifunctional urethanes of high acid lability and which are very gently split again after the combination of the two chains to form insulin with suitable cystine bridges can.

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