DE2431483C3 - Process for the preparation of alkali or ammonium salts of insulin - Google Patents
Process for the preparation of alkali or ammonium salts of insulinInfo
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Description
Die gegenwärtig gebräuchlichen Insulinzubereitungen zur Behandlung von Diabetes mellitus lassen sich normalerweise als solche mit kurzer, mittellanger oder verlängerter hypoglycämischer Wirkung bezeichnen. Bei manchen Diabetesfällen, insbesondere bei pädiatrischen Patienten, möchte man jedoch eine Insulinzubereitung haben, die anfangs sowohl rasch wirkt als auch über eine länger andauernde hypoglycämische Wirkung verfügt, und somit eine Insulinzubereitung mit einer Dualwirksamkeit.The currently used insulin preparations for the treatment of diabetes mellitus can usually refer to as those with short, medium, or prolonged hypoglycemic effects. However, in some cases of diabetes, particularly in pediatric patients, one may want an insulin prep which initially acts both quickly and over a longer-term hypoglycemic effect and thus an insulin preparation with dual effectiveness.
In den letzten Jahren wurden derartige Insulinzubereitungen mit Dualwirksamkeit hergestellt, indem man zumindest zwei verschiedene Insulinzubereitungen miteinander vermischte. Eine typische derartige Mischung besteht beispielsweise aus Zinkinsulin, das man von Schweinepankreas erhält, und einer Suspension von Rinderinsulin mit hohem Zinkanteil. Andere Zubereitungen sind Gemische aus einer Zink-Insulin-Lösung mit entweder einer Protamin-Insulin-Suspension oder einer Protamin-Zinkinsulin-Suspension.In recent years, such insulin preparations with dual effectiveness have been made by mixed at least two different insulin preparations together. A typical mix of that kind consists for example of zinc insulin, which is obtained from pig pancreas, and a suspension of Beef insulin with a high zinc content. Other preparations are mixtures of a zinc-insulin solution with either a protamine-insulin suspension or a protamine-zinc insulin suspension.
Alle diese bekannten Insulinzubereitungen mit Dualwirksamkeit sind jedoch, sogar wenn man eine gewisse Dualwirksamkeit erreicht, mit Problemen behaftet. Die Probleme liegen normalerweise beim Lagern, bei der Konservierung, bei der Reinheit, der Stabilität, der Farbe sowie der Verunreinigung mit hyperglycämischem Faktor (Glucagon) und hochmolekularen antigenen Proteinen.However, all of these known dual action insulin preparations are, even if one A certain dual effectiveness achieved, afflicted with problems. The problems usually lie with the Storage, preservation, purity, stability, color and contamination hyperglycemic factor (glucagon) and high molecular weight antigenic proteins.
Die einer Reihe oder gegebenenfalls sogar allen diesen bekannten Insulinzubereitungen mit Dualaktivität anhaftenden Probleme lassen sich nun durch Verwendung von Zubereitungen gemäß US-PS 37 58 683 vermeiden, die aus einem Alkali- oder Ammoniuminsulin und Protamin bestehen. Die hierzu benötigten Alkali- und Ammoniuminsuline werden im allgemeinen nach US-PS 37 19 655 erzeugt Hiernach stellt man den pH-Wert einer insulinhaltigen Lösung auf etwa 7,2 bis 10,0 und die Alkali- oder Ammoniumionenkonzentration auf etwa 0,2- bis 1 ,Omolar ein, wodurch es zur Kristallisation des Alkali- oder Ammoniuminsalins kommt Die mit einer Zinkkristallisation zusammenhängenden Probleme werden dabei zwar vermieden, es bleiben jedoch die normalerweise nur durch Zinkkristallisation entfernbaren Nicht-lnsulinproteinbestandteile im Alkali- oder Ammoniuminsulin. Bei einer Insulinzubereitung mit Dualaktivität muß man sich daher entweder eines Alkali- oder Ammoniuminsulins, das oft die in Zinkinsulin nicht enthaltenen Nicht-Insulinproteinbestandteile enthält, oder eines anderen bekannten Gemisches mit all den damit zusammenhängenden Problemen bedienen. Die auf Basis solcher Alkali- oder Ammoniuminsuline hergestellten protaminhaltigen Insulinzubereitungen haben somit zwar gewisse Vorteile gegenüber den sonstigen bekannten Zubereitungen dieser Art, jedoch zugleich auch die soeben erwähnten Nachteile hinsichtlich des in ihnen enthaltenen nicht optimalen Alkali- oder Ammoniuminsulins.A series or possibly even all of these known insulin preparations with dual activity Adhering problems can now be solved by using preparations according to US-PS 37 58 683, which consist of an alkali or ammonium insulin and protamine. The for this The alkali and ammonium insulins required are generally produced according to US Pat. No. 3,719,655 adjust the pH of an insulin-containing solution to about 7.2 to 10.0 and the alkali or ammonium ion concentration to about 0.2 to 1.0 omolar, causing the alkali or ammonium insaline to crystallize The problems associated with zinc crystallization are avoided while doing it however, the non-insulin protein constituents which can normally only be removed by zinc crystallization remain in alkali or ammonium insulin. In the case of an insulin preparation with dual activity, one must therefore either an alkali or ammonium insulin, which is often the non-insulin protein component not found in zinc insulin contains, or any other known mixture with all of the related Service problems. The protamine-containing insulin preparations produced on the basis of such alkali or ammonium insulins thus have certain advantages over the other known preparations of this type, but at the same time also the disadvantages just mentioned with regard to what is contained in them not optimal alkali or ammonium insulin.
Aufgabe der Erfindung ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Alkali- oder Ammoniumsalzen von Insulin, die über eine besondere Reinheit verfugen und auch die sonstigen Nachteile der bisher bekannten Salze dieser Art nicht aufweisen.The object of the invention is therefore to create a new process for the production of alkali or Ammonium salts of insulin, which have a special purity and also the other disadvantages of do not have previously known salts of this type.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß nun durch dasAccording to the invention, this object is now achieved by the
so aus den Ansprüchen hervorgehende Verfahren gelöst.so resulting from the claims method solved.
Die anliegende Zeichnung zeigt Analysen der Polyacrylamid-Scheibengel-Elektrophorese der Natriuminsulinausgangsmaterialien sowie der Natriuminsulinprodukte der Beispiele 2 und 3.The accompanying drawing shows analyzes of the polyacrylamide disk gel electrophoresis of the sodium insulin starting materials and the sodium insulin products of Examples 2 and 3.
Unter Alkali werden erfindungsgemäß Elemente der Gruppe IA bis und einschließlich der Periode 5 des Periodensystems der Elemente (Robert C. Weast, »Handbook of Chemistry and Physics«, 53rd Auflage, The Themical Rubber C, Cleveland, Ohio, 1968, Seite B-3) verstanden. Lithium, Natrium und Kalium werden bevorzugt, wobei man insbesondere Natrium verwendet. According to the invention, alkali includes elements of group IA up to and including period 5 of the Periodic Table of the Elements (Robert C. Weast, "Handbook of Chemistry and Physics," 53rd edition, The Themical Rubber C, Cleveland, Ohio, 1968, page B-3). Lithium, Sodium and Potassium are used preferred, sodium being used in particular.
Von den angegebenen zweiwertigen Metallen wird Zink besonders bevorzugt.Of the divalent metals given, zinc is particularly preferred.
Der pH-Wert der erfindungsgemäß zu verwendenden wäßrigen Lösung wird im allgemeinen auf etwa 7,6 bis etwa 8,6 und vorzugsweise auf etwa 8,2 eingestellt.The pH of the aqueous solution to be used according to the invention is generally from about 7.6 to about 8.6, and preferably set to about 8.2.
Die Konzentration des Salzes aus Insulin und zweiwertigem Metall in der wäßrigen Lösung wird erfindungsgemäß im allgemeinen auf etwa 10 bis etwa 1000 internationale Einheiten pro ml Lösung (E/ml) und vorzugsweise auf etwa 500 E/ml eingestellt.The concentration of the salt of insulin and divalent metal in the aqueous solution is according to the invention in general to about 10 to about 1000 international units per ml of solution (U / ml) and preferably adjusted to about 500 U / ml.
Beispiele für erfindungsgemäß zu verwendende Polymethylendiamintetraessigsäuren sind Hexamethylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure und vorzugsweise Äthylendiamin-N,N,N',N'-tetraessigsäure.Examples of polymethylenediaminetetraacetic acids to be used according to the invention are hexamethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid and preferably ethylenediamine-N, N, N ', N'-tetraacetic acid.
Die jeweilige Polymethylendiamintetraessigsäure kann entweder in Form der freien Säure oder eines entsprechenden Alkali- oder Ammoniumsalzes einge-The respective polymethylenediaminetetraacetic acid can either be in the form of the free acid or a corresponding alkali or ammonium salt
bo setzt werden. Bei Verwendung eines Salzes muß das Kation gleich sein mit dem Kation des gewünschten Alkali- oder Ammoniuminsulins. Darüber hinaus muß auch die Menge eines infolge der Verwendung eines solchen Salzes zugesetzten Kations in Betracht gezogenbo sets to be. If you use a salt, you have to The cation be the same as the cation of the desired alkali or ammonium insulin. In addition, must also takes into account the amount of a cation added as a result of the use of such a salt
h5 werden, wenn man die Menge der gewünschten Alkalioder Ammoniumionen ermittelt.h5 when you get the amount of alkali or desired Ammonium ions determined.
Zur Entfernung des zweiwertigen Metalls von dem Insulin und für eine rasche Kristallisation des Alkali-To remove the divalent metal from the insulin and for rapid crystallization of the alkali
oder Ammoniuminsulins muß die Komponente B) beim erfindungsgemäßen Verfahren in einem Molverhältnis von wenigstens etwa 3 :1 zu den in der Komponente Λ) enthaltenen Metallionen eingesetzt werdea Bei niedrigeren Verhältnissen ist die Kristallisationsgeschwindigkeit des Alkali- oder Ammoniuminsulins aus alkalischer Lösung niedriger. Darüber hinaus ist bei niedrigeren Verhältnissen die Wahrscheinlichkeit größer, daß zumindest einiges zweiwertiges Metall an das Insulin gebunden bleibtor ammonium insulin, component B) in the process according to the invention must be in a molar ratio of at least about 3: 1 to the metal ions contained in component Λ) are used at lower Conditions is the rate of crystallization of alkali or ammonium insulin from alkaline solution is lower. It is also at lower Ratios are more likely to have at least some divalent metal attached to the insulin remains bound
Die Konzentration an Komponente B) muß demzufolge etwa 0,0002- bis etwa 0,05molar sein. Bei einer Konzentration an zweiwertigem Metallinsulin von etwa 500 E/ml ist die bevorzugte Konzentration an Komponente B) etwa 0,01 molar.The concentration of component B) must therefore be about 0.0002 to about 0.05 molar. At a Bivalent metal insulin concentration of about 500 U / ml is the preferred concentration of component B) about 0.01 molar.
Die Konzentration an Alkali- oder Ammoniumkationen ist beim vorliegenden Verfahren im allgemeinen etwa 0,2- bis etwa l.Omolar.The concentration of alkali or ammonium cations in the present process is general about 0.2 to about 1. omolar.
Die Alkali- oder Ammoniumionen lassen sich durch irgendeine wasserlösliche Verbindung oeibringen, die sich unter den angewandten Verfahrensbedingungen nicht nachteilig auf das Insulin auswirkt. Die Alkali- oder Ammoniumionen können darüber hinaus von mehr als einer derartigen wasserlöslichen Verbindung geliefert werden. Das Kation des gewünschten Alkali- oder Ammoniuminsulins bestimmt natürlich die Frage, welche dieser Ionen man einsetzt.The alkali or ammonium ions can be brought in by any water-soluble compound that does not adversely affect the insulin under the process conditions used. The alkali or Ammonium ions can also be provided by more than one such water-soluble compound will. The cation of the desired alkali or ammonium insulin naturally determines the question, which of these ions are used.
Wie bereits erwähnt, läßt sich ein Teil der erforderlichen Alkali- oder Ammoniumionen auch durch Verwendung einer Polymethylendiamintetraessigsäure in Form eines Alkali- oder Ammonium.alzes liefern. Die erforderlichen Ionen können ferner durch die basische Alkali- oder Ammoniumverbindung geliefert werden, die man normalerweise zum Einstellen des pH-Wertes der Lösung auf die gewünschte Alkalität braucht. Schließlich lassen sich die erforderlichen Ionen auch aus einem Alkali- oder Ammoniumsalz erhalten, dessen Anion unter anderem ein Chlorid, Bromid, Fluorid, Jodid, Acetat, Sulfat oder Phosphat sein kann. Die Chlorid- und Phosphatsalze werden hierzu bevorzugt, wobei man insbesondere Chloride verwendet. Die jeweils verwendeten besonderen Alkali- oder Ammoniumionen sollen, wie bereits gesagt, gleich sein wie das Kation des gewünschten Alkali- und Ammoniuminsulins. Normalerweise gelangt man zu den erforderlichen Ionen durch eine Kombination aller drei obenerwähnten Materialien.As already mentioned, some of the required alkali or ammonium ions can also be used by using a polymethylenediaminetetraacetic acid in the form of an alkali or ammonium salt deliver. The required ions can also be supplied by the basic alkali or ammonium compound normally used to adjust the pH of the solution to the desired alkalinity needs. Finally, the required ions can also be obtained from an alkali or ammonium salt, the anion of which can be a chloride, bromide, fluoride, iodide, acetate, sulfate or phosphate, among others. The chloride and phosphate salts are preferred for this purpose, chlorides in particular being used. the The particular alkali or ammonium ions used in each case should, as already stated, be the same as that Cation of the desired alkali and ammonium insulin. Usually one arrives at the required ones Ions by a combination of all three materials mentioned above.
Die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendete alkalische wäßrige Lösung eines Salzes aus Insulin und dem jeweiligen zweiwertigen Metall läßt sich nach irgendeinem dem Fachmann bekannten Verfahren herstellen. Da alle Bestandteile dieser alkalischen wäßrigen Lösung unter den angewandten Verfahrensbedingungen löslich sind, ist die Art der Herstellung dieser alkalischen wäßrigen Lösung nicht kriiisch.The alkaline aqueous solution of a salt of insulin and used in the process according to the invention the respective divalent metal can be by any method known to the person skilled in the art produce. Since all constituents of this alkaline aqueous solution are soluble under the process conditions used, the method of preparation is this alkaline aqueous solution is not critical.
Ein bekanntes und bevorzugtes Verfahren zur Herstellung einer solchen alkalischen wäßrigen Lösung besteht darin, daß man ein derartiges Insulinsalz in einem sauren wäßrigen Medium löst und den pH-Wert der erhaltenen Lösung dann mit einer geeigneten Base auf etwa 7,6 bis etwa 8,6 einstellt. Die Polymethylendiamintetraessigsäure sowie weitere Alkali- oder Ammoniumionen lassen sich zu jeder Zeit zusetzen, und zwar entweder als Feststoffe oder in Form wäßriger Lösungen. Bei Verwendung von Lösungen muß die Zunahme des Gesamtlösungsvolumens in Betracht gezogen werden, damit man die gewünschte Endkonzentration der Bestandteile erhält.A known and preferred method for preparing such an alkaline aqueous solution consists in dissolving such an insulin salt in an acidic aqueous medium and adjusting the pH the resulting solution is then adjusted to about 7.6 to about 8.6 with a suitable base. The polymethylenediaminetetraacetic acid and other alkali or ammonium ions can be added at any time, namely either as solids or in the form of aqueous solutions. When using solutions, the Increases in total solution volume should be considered in order to get the desired final concentration of the ingredients.
Die oben benötigte saure wäßrige Lösung des Insulinsalzes sollte einen pH-Wert von etwa 2,5 bis etwa 3,5 haben. Dies läßt sich durch irgendeine Mineralsäure erreichen, wobei Chlorwasserstoffsäure bevorzugt wird. Der bevorzugte pH-Wert der Lösung ist etwa 3, und mpn stellt ihn am besten dadurch her, daß man das zweiwertige Metallinsulin in verdünnter Salzsäure löst. Die saure wäßrige Lösung des Insulinsalzes kann gewünschtenfalls Konservierungsmittel und/oder sonstige Mittel, wie isotonische Mitte!, enthalten. Beispiele geeignter Konservierungsmittel sind Phenol oder Methylparaben. Zu Beispielen geeigneter isotonischer Mittel gehören Glycerin oder Glucose.The acidic aqueous solution of the insulin salt required above should have a pH of about 2.5 to about Have 3.5. This can be achieved by any mineral acid, with hydrochloric acid being preferred. The preferred pH of the solution is about 3, and the best way to establish mpn is by using the Dissolves divalent metal insulin in dilute hydrochloric acid. The acidic aqueous solution of the insulin salt can if desired, contain preservatives and / or other agents, such as isotonic agents !,. Examples Suitable preservatives are phenol or methyl paraben. Examples of suitable isotonic Means include glycerin or glucose.
Falls man ein Konservierungsmittel verwendet, dann sollte dies in einer Konzentration von 0,4% (Gewicht pro Volumen) erfolgen, wobei eine Konzentration von etwa 0,2% bevorzugt wird. Die Verwendung eines Konservierungsmittels ist zweckmäßig, wobei Phenol bevorzugt wird. Der Einsatz von Phenol verbessert zugleich auch die Kristallisationsgeschwindigkeit des gewünschten Alkali- oder Ammoniuminsulins.If a preservative is used, this should be at a concentration of 0.4% (weight per volume), a concentration of about 0.2% being preferred. Using a Preservative is useful, with phenol being preferred. The use of phenol improves at the same time also the rate of crystallization of the desired alkali or ammonium insulin.
Die saure wäßrige Lösung des Insulinsalzes wird dann mit einer geeigneten Base alkalisch gestellt. Bei der verwendeten Base handelt es sich im allgemeinen um ein Alkali- oder Ammoniumhydroxid oder -carbonat oder eine sonstige ähnliche basische Verbindung. Eine konzentrierte wäßrige Lösung des jeweiligen Hydroxids wird bevorzugt, da sich hierdurch eine übermäßige Verdünnung der Insulinsalzlösung und die Bildung vonThe acidic aqueous solution of the insulin salt is then made alkaline with a suitable base. The base used is generally an alkali or ammonium hydroxide or carbonate or other similar basic compound. One concentrated aqueous solution of the respective hydroxide is preferred, since this results in an excessive Dilution of the insulin salt solution and the formation of
«ι Wärme durch einige Verbindungen, wie beispielsweise durch feste Alkalihydroxide, vermeiden lassen.«Ι heat through some connections, such as by solid alkali hydroxides.
Die Polymethylendiamintetraessigsäure und die Alkali- oder Ammoniumionen können der Insulinsalzlösung, wie bereits gesagt, zu jeder Zeit zugegebenThe polymethylenediaminetetraacetic acid and the alkali or ammonium ions can be added to the insulin salt solution, as already said, admitted at any time
jr> werden. Das Insulinsalz läßt sich beispielsweise in verdünnter wäßriger Salzsäure lösen, die die Poiymethylendiamintetraessigsäure enthält. Wahlweise kann man letztere auch zur sauren wäßrigen Lösung des Insulinsalzes geben. Ferner läßt sich die Polymethylendiamintetraessigsäure zu der Insulinsalzlösung geben, nachdem die Lösung alkalisch gestellt wurde.j r > be. The insulin salt can be dissolved, for example, in dilute aqueous hydrochloric acid which contains polyymethylenediaminetetraacetic acid. Alternatively, the latter can also be added to the acidic aqueous solution of the insulin salt. Furthermore, the polymethylenediaminetetraacetic acid can be added to the insulin salt solution after the solution has been made alkaline.
Die Polymethylendiamintetraessigsäure wird normalerweise zu sauren Lösungen in Form eines Alkalioder Ammoniumsalzes zugesetzt. Wegen einer verbes-The polymethylenediaminetetraacetic acid usually becomes acidic solutions in the form of an alkali or Ammonium salt added. Because of an improved
4r> serten Wasserlöslichkeit ist eine vollständige Neutralisation aller in ersterer vorhandener Carboxylgruppen zweckmäßig. Andererseits wird die Polymethylendiamintetraessigsäure zu der alkalischen Lösung normalerweise auch als freie Säure zugegeben. Bei dem4 r> serten Water is a complete neutralization of all in the former existing carboxyl functional. On the other hand, the polymethylenediaminetetraacetic acid is normally also added to the alkaline solution as the free acid. In which
w bevorzugten Verfahren zur Herstellung der alkalischen wäßrigen Lösung an Insulinsalz setzt man Alkali- oder Ammoniumionen in Verbindung mit der Zugabe der jeweiligen Polymethylendiamintetraessigsäure zu. Weitere Ionen werden durch die Base geliefert, die man verwendet, um die saure Lösung alkalisch zu stellen. Die restlichen erforderlichen Ionen werden durch Zusatz einer entsprechenden Menge an Alkali- oder Ammoniumsalz geliefert. Dieses Salz gibt man normalerweise vor dem Alkalischstcllcn der Lösung zu. Eine derartige Zugabe kann zu jeder Zeit erfolgen, wie dies für den Zusatz von Polymeihylendiamintetraessigsäure beschrieben wurde. In the preferred process for preparing the alkaline aqueous solution of insulin salt, alkali or ammonium ions are added in conjunction with the addition of the respective polymethylenediaminetetraacetic acid. Additional ions are supplied by the base, which is used to make the acidic solution alkaline. The remaining ions required are supplied by adding an appropriate amount of alkali or ammonium salt. This salt is normally added to the solution before it is made alkaline. Such an addition can take place at any time, as has been described for the addition of polymethylenediaminetetraacetic acid.
Ein anderes bekanntes Vorfahren /ur Herstellung einer alkalischen wäßrigen Lösung an Insiilinsal/Another known ancestor / ur manufacture an alkaline aqueous solution of insilinsal /
b5 besteht darin, daß man das jeweilige Insulinsal/ in einem wäßrigen alkalischen Medium, das einen pH Wen mmi etwa 8 bis etwa 9,5 hat, löst und den pH Wen der erhaltenen Lösung dann auf etwa 7,b bis etwa 8.(1b5 consists in the fact that one insulin sal / in a aqueous alkaline medium having a pH Wen mmi about 8 to about 9.5 dissolves and then adjusts the pH Wen of the resulting solution to about 7, b to about 8. (1
einstellt. Die Alkalität der ursprünglichen wäßrigen Lösung erhält man normalerweise durch Verwendung einer Alkali- oder Ammoniuinbase, wie dies oben beschrieben wurde. Die Alkalinitätserniedrigung läßt sich dann durch Zugabe einer verdünnten Mineralsäure erreichen, wobei Chlorwasserstoffsäure und Phosphorsäure bevorzugt werden. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, das Lösungen höherer Konzentrationen an Insulinsalz sich möglicherweise schwieriger herstellen lassen als verdünnte Lösungen, da dessen Löslichkeit in alkalischen Lösungen niedriger ist.adjusts. The alkalinity of the original aqueous Solution is usually obtained by using an alkali or ammonium base, as above has been described. The alkalinity can then be lowered by adding a dilute mineral acid with hydrochloric acid and phosphoric acid being preferred. It should, however, point to it Be advised that solutions of higher concentrations of insulin salts may be more difficult can be prepared than dilute solutions, as its solubility in alkaline solutions is lower.
Die Zugabe an Polymethylendiamintetraessigsäure und eventuell erforderlichen Alkali- oder Ammoniumionen kann zu jeder Zeit vorgenommen werden. Normalerweise gibt man beides vor der abschließenden Einstellung des pH-Wertes zu.The addition of polymethylenediaminetetraacetic acid and any alkali or ammonium ions that may be required can be done at any time. Usually you do both before the final Adjustment of the pH value too.
Sobald die alkalische wäßrige Lösung des Insulinsalzes hergestellt ist, kristallisiert das Alkali- oder Ammonium aus der Lösung aus, und zwar normalerweise bei Umgebungstemperatur, wobei man gewünschtenfalls jedoch auch bei höheren oder niedrigeren Temperaturen arbeiten kann. Die Kristallisationstemperatur sollte im allgemeinen jedoch bei weniger als etwa 300C liegen.As soon as the alkaline aqueous solution of the insulin salt is prepared, the alkali metal or ammonium crystallizes out of the solution, usually at ambient temperature, although it is also possible to work at higher or lower temperatures if desired. However, the crystallization temperature should be less than about 30 0 C in general.
Die so hergestellten Kristalle von Alkali- oder Ammoniuminsulin werden dann in bekannter Weise isoliert. Diese Isolierung erfolgt am besten durch Zentrifugieren, wobei man anschließend mit verdünnter Alkali- oder Ammoniumsalzlösung (normalerweise etwa 0,5molar), Aceton, absolutem Alkohol und Äther wäscht und die erhaltenen Kristalle dann im Vakuum trocknet.The crystals of alkali or ammonium insulin thus produced are then used in a known manner isolated. This isolation is best done by centrifugation, which is then followed by dilution Alkali or ammonium salt solution (usually about 0.5 molar), acetone, absolute alcohol, and ether washes and the crystals obtained are then dried in vacuo.
8 g Zinkinsulin, bestehend aus 70% Rindciinsulin und 30% Schweineinsulin, werden in 400 ml saurem Phenolwasser gelöst, das man durch Lösen von 0.8 g Phenol in 400 ml 0.01 η wäßriger Chlorwasserstoffsäure herstellt. Die erhaltene Lösung wird in vier gleiche Teile aufgeteilt, und jeden dieser Teile versetzt man mit 0.2 g Natriumchlorid. Die vier Teilmengen werden als Proben 1 bis 4 gekennzeichnet. Drei der vier Proben werden in der im folgenden beschriebenen Art mit Äthylendiamintetraessigsäure-tetranatriumsalz versetzt.8 g zinc insulin, consisting of 70% beef insulin and 30% pork insulin are dissolved in 400 ml of acidic phenol water, which is obtained by dissolving 0.8 g Produces phenol in 400 ml of 0.01 η aqueous hydrochloric acid. The resulting solution is divided into four equal parts divided, and each of these parts is mixed with 0.2 g of sodium chloride. The four subsets are used as samples 1 to 4 marked. Three of the four samples are treated in the manner described below with ethylenediaminetetraacetic acid tetra-sodium salt offset.
man einmal mit Aceton, zweimal mit absolutem Alkohol und einmal mit Äther wäscht. Nach Trocknen im Vakuum erhält man folgende Ausbeuten an Natriuminsulin: one washes once with acetone, twice with absolute alcohol and once with ether. After drying in The following yields of sodium insulin are obtained in a vacuum:
k(in/enlrali(in Molar
k (in / enlrali (in
Jede Lösung wird dann durch Zugabe von 40prozentigem wäßrigem Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 8.2 eingestellt. Bei den Proben 2 bis einschließlich 4 beginnen sich unmittelbar darauf Kristalle von Natriuminsulin zu bilden. Die Probe 1 bildet jedoch sogar nach 3stündigem Rühren keine Kristalle.Each solution is then added by adding 40 percent aqueous sodium hydroxide adjusted to a pH of 8.2. For samples 2 to 4 inclusive Sodium insulin crystals begin to form immediately. However, sample 1 even simulates No crystals after stirring for 3 hours.
Die Probe 1 wird mit 0.1 molarer wäßriger Äthylendiamintetraessigsäure (in Form des Tetranatriumsalzes) behandelt. Bei einer EDTA-Konzentration von etwa 0.006 Mol beginnt die Kristallisation von Natriuminsulin. Jede Probe rührt man über Nacht. Die Kristalle von Natriuminsulin werden dann abzentrifugiert. woraufSample 1 is treated with 0.1 molar aqueous ethylenediaminetetraacetic acid (in the form of the tetrasodium salt). With an EDTA concentration of approx Sodium insulin begins to crystallize at 0.006 mol. Each sample is stirred overnight. The crystals of Sodium insulin is then centrifuged off. on what
Die Stärke des Natriuminsulins (sowie aller bei den folgenden Beispielen erhaltenen Insuline) wird durch einen immunologischen Versuch nach dem Verfahren von G.W. Probst, et al., J. Pharm. Sei.. 55. 1408 (1966) ermittelt. Die normale Standard-Abweichung bei diesem Verfahren beträgt ±15 bis 25%.The strength of the sodium insulin (as well as all of the insulins obtained in the following examples) is determined by an immunological test according to the method of G.W. Probst, et al., J. Pharm. Sci. 55, 1408 (1966) determined. The normal standard deviation for this procedure is ± 15 to 25%.
2 g gereinigtes Natriuminsulin (von Rinderpankreas). das über eine Stärke von 27,0 E/mg verfügt und kleinere Mengen weniger saurer Proteinverunreinigungen enthält, werden in 400 ml 0.5 η-Essigsäure gelöst. Die erhaltene Lösung versetzt man mit etwa 20 ml absolutem Alkohol sowie 0,4 ml einer 20prozentigen Zinkchloridlösung, wobei letzlere 40 mg Zinkchlorid pro Gramm Insulin entspricht. Der pH-Wert der Lösung wird dann durch Zugabe von 20prozentigem Ammoniumhydroxid auf 5,95 eingestellt, und die Lösung hält man dann etwa 72 Stunden auf etwa 5° C. Die dabei entstandenen Zinkinsulinkristallc werden abzentrifugiert. einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und dann in 50 ml saurem Phenolwasser gelöst, das wie in Beispiel 1 hergestellt wird. Die Lösung wird mit saurem Phenolwasscr auf 100 ml verdünnt. Die erhaltene Lösung versetzt man dann mit 2,0 g Natriumchlorid (was zu einer an Natriumchlorid 0.34molaren Lösung führt) sowie mit 0.208 g EDTA (in Form des Tetranatriumsalzes, was zu einer 0.005molarcn Lösung an Äthylendiamintctraessigsäurc führt). Die Lösung wird hierauf mit 40prozcntigcm wäßrigem Natriumhydroxid auf pH 8.2 eingestellt. Es beginnen sich Kristalle von Natriuminsulin zu bilden. Man läßt die Kristallisation über Nacht bei Raumtemperatur fortlaufen. Die dabei erhaltenen Kristalle von Natriuminsulin werden abzcritriiugiert. gewaschen und wie in Beispie! ! beschrieben getrocknet. Die Ausbeute an Natriuminsulin beträgt 1.864 g. was einer prozentualen Ausbeute von 93.2% entspricht. Die Stärke des Natriuminsulins liegt bei 27,0 E/mg.2 g of purified sodium insulin (from bovine pancreas). that has a strength of 27.0 U / mg and smaller Contains amounts of less acidic protein impurities, are dissolved in 400 ml of 0.5 η-acetic acid. the The solution obtained is mixed with about 20 ml of absolute alcohol and 0.4 ml of a 20 percent strength Zinc chloride solution, the latter corresponding to 40 mg zinc chloride per gram of insulin. The pH of the The solution is then adjusted to 5.95 by adding 20 percent ammonium hydroxide, and the solution it is then kept at about 5 ° C. for about 72 hours. The resulting zinc insulin crystals are centrifuged off. washed once with distilled water and then dissolved in 50 ml of acidic phenol water, which is prepared as in Example 1 is made. The solution is diluted to 100 ml with acidic phenolic water. The received The solution is then mixed with 2.0 g of sodium chloride (resulting in a 0.34 molar solution of sodium chloride leads) as well as with 0.208 g EDTA (in the form of the tetrasodium salt, resulting in a 0.005 molar solution leads to ethylenediamine octraacetic acid). The solution is then treated with 40% aqueous sodium hydroxide adjusted to pH 8.2. Sodium insulin crystals begin to form. Allow crystallization continue overnight at room temperature. The resulting crystals of sodium insulin are signed off. washed and as in example! ! described dried. The yield of sodium insulin is 1,864 g. what a percentage yield of 93.2%. The strength of sodium insulin is 27.0 U / mg.
Proben des Natriuminsulinausgangsmaterials und des Natriuminsulinendproduktes von Beispiel 2 werden durch Polyamidscheiben-Gel-Elektrophorese nach dem Verfahren von R. L Jackson, et aL Diabetes. 21. 235 (1972) untersucht.Samples of the sodium insulin starting material and the The final sodium insulin product of Example 2 is determined by polyamide disk gel electrophoresis according to the Method of R. L Jackson, et al. Diabetes. 21st 235 (1972) investigated.
F i g. 1 zeigt eine Darstellung der elektrophoretischen Analyse des Natriuminsulinausgangsmaterials. F i g. 2 ist eine Darstellung der elektrophoretischen Analyse des Natriuminsulinendprodukts- Bei diesen Figuren ist mit 1 das Polyacrylamidgel angegeben, die Symbole 2 und 3 bezeichnen Nichtinsulinproteine, und die Symbole 4 sowie 5 geben Insulin und insuünähnliche Proteine an.F i g. 1 shows a representation of the electrophoretic Analysis of the sodium insulin starting material. F i g. 2 is an illustration of the electrophoretic analysis of the Sodium insulin end product - In these figures, 1 indicates the polyacrylamide gel, symbols 2 and 3 denote non-insulin proteins, and symbols 4 and 5 denote insulin and insulin-like proteins.
Die Arbeitsweise von Beispiel 2 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß man als Ausgangsmaterial ein aus Schweinepankreas isoliertes Natriuminsulin verwendet, das eine Stärke von 25,0 E/mg aufweist. Die Endausbeute an Natriuminsulin beträgt 1,862 g, was einer prozentualen Ausbeute von 93.1% entspricht. Die Stärke des Produkts liegt bei 28,9 E/mg.The procedure of Example 2 is repeated with with the exception that a sodium insulin isolated from pig pancreas is used as the starting material, which has a strength of 25.0 U / mg. The final yield of sodium insulin is 1.862 g, which is one corresponds to a percentage yield of 93.1%. The strength of the product is 28.9 U / mg.
Das Ausgangsmaterial (Fig. 3) und das Endprodukt (Fig.4) von Beispiel 3 werden durch Polyacrylamidscheibengel-Elektrophorese nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren untersucht. In diesen Figuren ist mit 1 das Polyacrylamidgel angegeben, die Symbole 6, 7 sowie 8 bezeichnen Nichtinsulinproteine, und die Symbole 9 und 10 sind Insulin oder insulinähnüche Proteine.The starting material (Fig. 3) and the final product (Fig. 4) of Example 3 are determined by polyacrylamide disk gel electrophoresis investigated according to the method described in Example 2. In these figures the polyacrylamide gel is indicated with 1, the symbols 6, 7 and 8 denote non-insulin proteins, and the Symbols 9 and 10 are insulin or insulin-like Proteins.
Aus den Fig. 1 bis 4 wird klar, daß durch das Verfahren die Nichtinsulinproteine entfernt werden. Diese entscheidende Verbesserung der Reinheit des erhaltenen Alkali- oder Ammoniuminsulins läßt sich darüber hinaus nicht aus der Stärke sowie anderen Daten allein entnehmen.From Figs. 1 to 4 it is clear that by the Procedure that removes non-insulin proteins. This crucial improvement in the purity of the obtained alkali or ammonium insulin can also not be derived from starch or others Take data alone.
6 g Zinkinsulinkristalle (70% aus Rinderpankreas, 30% aus Schweinepankreas) werden in 300 ml Säure-Phenol-Wasser, hergestellt gemäß Beispiel 1. gelöst. Eine 100-ml-Teilmenge dieser Lösung löst man mit 2,5 g (0,033 Mol) Kaliumchlorid. Der pH-Wert der leicht trüben Lösung wird durch Zugabe von 3,5 ml lOprozentigem wäßrigem Kaliumhydroxid auf 8,2 eingestellt. Die erhaltene trübe Lösung versetzt man mit 0,3 g (0,001 Mol) Äthylendiamintetraessigsäure. Der pH-Wert der Lösung wird dann durch Zusatz von lOprozentigem Kaliumhydroxid erneut eingestellt, bis er sich bei 8.2 stabilisiert. Die Lösung wird 48 Stunden bei Umgebungstemperatur (etwa 25°C) gerührt. Während der ersten 12 Stunden beginnt die Kristallisation. Das erhaltene Kaliuminsulin wird abfiltriert, zweimal mit absolutem Alkohol und dann einmal mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute an Kaliuminsulin beträgt 1,736 g (86,8%). Das erhaltene Produkt hat eine Stärke von 24,9 F./mg, sein Kaliumgehalt beträgt 1,48%, und der Feuchtigkeitsgehalt liegt bei 10,1%.6 g zinc insulin crystals (70% from bovine pancreas, 30% from pig pancreas) are dissolved in 300 ml acid-phenol-water, prepared according to Example 1. dissolved. A 100 ml portion of this solution is dissolved in 2.5 g (0.033 mole) potassium chloride. The pH of the slightly cloudy solution is increased by adding 3.5 ml of 10 percent aqueous potassium hydroxide adjusted to 8.2. The cloudy solution obtained is admixed with 0.3 g (0.001 Mole) ethylenediaminetetraacetic acid. The pH of the solution is then increased by adding 10 percent Potassium hydroxide readjusted until it stabilizes at 8.2. The solution is 48 hours at ambient temperature (about 25 ° C) stirred. Crystallization begins during the first 12 hours. That The potassium insulin obtained is filtered off, twice with absolute alcohol and then once with ether washed and dried in vacuo. The yield of potassium insulin is 1.736 g (86.8%). The received Product has a strength of 24.9 F./mg, its potassium content is 1.48%, and the moisture content is included 10.1%.
Eine 100-ml-Teilmenge der gemäß Beispiel 4 hergestellten Zinkinsulinlösung wird mit 1,4 g (0,033 Mol) Lithiumchlorid versetzt. Die Lösung stellt man durch Zugabe von 6,2 ml 1 n-Lithiumhydroxid auf pH 8,2 ein. Die trübe Lösung wird mit Äthylendiamintetraessigsäure behandelt, und den pH-Wert dieser Lösung stabilisiert man dann nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren mit 1 n-Lithiumhydroxid auf 8,2. Das Kristallisationsverfahren erfolgt ebenfalls in der in Beispiel 4 beschriebenen Weise, wobei man ähnliche Ergebnisse erhält. Das erhaltene Lithiuminsulin wird in der in Beispiel 4 angegebenen Weise gesammelt, wodurch man 1,234 g (61,6%) Produkt erhält, das über eine Stärke von 27,8 E/mg verfügt, einen Lithiumgehalt von 2,37% aufweist und einen Feuchtigkeitsgehalt von 3,6% hat.A 100 ml portion of the zinc insulin solution prepared according to Example 4 is added to 1.4 g (0.033 Mol) lithium chloride added. The solution is made up by adding 6.2 ml of 1N lithium hydroxide pH 8.2 a. The cloudy solution is treated with ethylenediaminetetraacetic acid, and the pH value of this The solution is then stabilized by the method described in Example 4 with 1N lithium hydroxide 8.2. The crystallization procedure is also carried out in the manner described in Example 4, with similar procedures Results. The lithium insulin obtained is collected in the manner indicated in Example 4, giving 1.234 g (61.6%) of product having a strength of 27.8 U / mg, a lithium content of 2.37% and has a moisture content of 3.6%.
Die in Beispiel 5 beschriebene Arbeitsweise wird wiederholt, wobei man anstelle von Lithiumchlorid 1,8 g Ammoniumchlorid, und anstelle von Lithiumhydroxid 60 ml 1 n-Ammoniumhydroxid verwendet. Nach Zugabe von Äthylendiamintetraessigsäure und Einstellen des pH-Wertes mit 1 n-Ammoniumhydroxid kommt es sogar nach 24 Stunden zu keiner Kristallisation. Es werden weitere 1,8 g Ammoniumchlorid zugesetzt. Nach weiterem 24stündigem Rühren kommt es zu einer Kristallisation. Das erhaltene Ammoniuminsulin wird in der in Beispiel 4 beschriebenen Weise isoliert, wodurch man 1,018 g (50,9%) Produkt erhält, das über eine Stärke von 27.6 E/mg verfügt und einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,3% hat. Das Insulin ergibt eine sulfatierte Asche von 0.08%.The procedure described in Example 5 is repeated using 1.8 g instead of lithium chloride Ammonium chloride, and 60 ml of 1N ammonium hydroxide used instead of lithium hydroxide. After adding of ethylenediaminetetraacetic acid and adjusting the pH value with 1 n-ammonium hydroxide it comes no crystallization even after 24 hours. Another 1.8 g of ammonium chloride are added. After stirring for a further 24 hours, crystallization occurs. The ammonium insulin obtained is in isolated in the manner described in Example 4, whereby 1.018 g (50.9%) of product is obtained, which via a Strength of 27.6 U / mg and has a moisture content of 7.3%. The insulin results in a sulfated one Ashes of 0.08%.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen1 sheet of drawings
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