DE2915397B2

DE2915397B2 - Gentiobioside, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel

Info

Publication number: DE2915397B2
Application number: DE2915397A
Authority: DE
Inventors: Tetsuo Musashino Tokyo Suami
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-04-15
Filing date: 1979-04-14
Publication date: 1981-07-30
Also published as: FR2422655A1; JPS54151918A; GB2018768A; FR2422655B1; US4251515A; DE2915397C3; GB2018768B; DE2915397A1

Description

HO

in welcher einer der beiden Substituenten X und Y eine Hydroxylgruppe und der jeweils andere die Gruppe -NHCONNOCh₂CH₂CI darstellen und das Zeichen ~ eine Einfachbindung anzeigt, die in «- oder jJ-Stellung vorliegt

2. Verfahren zur Herstellung der Gentiobioside gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein entsprechendes Harnstoffderivat der allgemeinen Formel II

CH₂OH

O-

CH₂

HO

OH

X'

J-O
/oH N-OCH₃

HO ^-f _(ü)

Y'

in welcher einer der beiden Substituenten X' und Y' eine Hydroxylgruppe und der jeweils andere die Gruppe -NHCONHCh₂CH₂CI bedeuten und ~ dieselbe Bedeutung hat wie in Anspruch 1 angegeben, mit einem Nitrosierungsmittel in an sich bekannter Weise nitrosiert.

3. Arzneimittel, bestehend aus einem Gentiobiosid der allgemeinen Formel I gemäß Anspruch 1 in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Verdünnungsmittel, Trägermaterial oder Streckmittel.

Die Erfindung betrifft die Gentiobioside gemäß Anspruch 1, welche ein hohes Maß an inhibierender Wirkung gegen Leukämie und Tumoren aufweisen und die daher zur Behandlung dieser Krankheiten verwendbar sind. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Gentiobioside sowie Arzneimittel, die dieselben enthalten.

Es sind bereits verschiedenartige Verbindungen bekannt, die eine inhibierende Wirkung gegen Leukämie und Tumorkrankheiten aufweisen; eine Klasse dieser Verbindungen umfaßt die Nitrosoharnstoffderivate. Unter diesen können wiederum das Streptozotocin (N-iN'-iiiethyl-N'-nitroso-carbamoylJ-D-glucosamin)
und dessen Derivate, z. B. die Methylglucosaminide als typische Vertreter genannt werden (vgL US-PSen 35 77 406 und 37 67 640). Diese Verbindungen sind in ihrer Wirkung gegen Leukämie und Tumorkrankheiten jedoch noch nicht voll befriedigend, weil sie unerwünschte Nebenreaküonen zeigen. Eine weitere Klasse umfaßt die Glycosylderivate von Nitrosoharnstoffen.

Unter diesen ist die interessanteste Verbindung der 1 -^-ChloräthylJ-S-dJ-D-glucopyranosyl)-1 -nitrosoharnstoff (abgekürzt GANU), der ein breites Antitumor-Wirkungsspektrum bei einer Vielzahl von expeiimentell erzeugten Tumoren aufweist und der infolgedessen zu der Hoffnung Anlaß gibt, daß er auch bei der menschlichen Krebs-Chemotherapie wirksam sein wird (vgl. T. Suami et al, US-PS 40 86 415).

Durch weitere Forschungen konnte jetzt festgestellt werden, daß bestimmte neue Nitrosoharnstoffderivate, nämlich bestimmte Gentiobioside, eine hohe inhibierende Wirkung gegen Leukämie und Tumorkrankheiten aufweisen, und, wie in vivo-Versuche gezeigt haben, eine nur geringe Toxizität besitzen.

Gegenstand der Erfindung sind infolgedessen Gentiobioside der allgemeinen Formel I

30

60 CH₂OH

HO

OCH₃ (I)

in welcher X und Y eine Hydroxylgruppe bzw. die Gruppe -NHCONNOCH₂CH₂Ci - oder umgekehrt — darstellen und ~ als Zeichen für eine Einfachbindung steht, die in x- oder j3-Stellung vorliegen kann.

Im folgenden sind die Nitrosoharnstoffderivate gemäß vorliegender Erfindung zusammengestellt:

Methyl-2'-(3-(2-chloräthyl)-3-(nitrosoureido))-

2'-desoxy-a-gentiobiosid;
Methyl-2'-(3-(2-chloräthyl)-3-(nitrosoureido))-

2'-desoxy-/J-gentiobiosid;
Methyl-2-(3-(2-chloräthyl)-3-(nitrosoureido))-

2-desoxy-«-gentiobiosid;
Methyl-2-(3-(2-chloräthyl)-3-(nitrosoureido))-

2-desoxy-/?-gentiobiosid.

Bei in vivo-Versuchen konnte sichergestellt werden, daß die neuen Gentiobioside gemäß Anspruch 1 der Erfindung ein hohes Maß an inhibierender Wirkung gegen Leukämie und Tumoren aufweisen. Die anti-leukämische Wirkung gegen Leukämia L1210 von Methyl-2'-(3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido)-2'-desoxy-«-gentiobiosid wurde wie folgt geprüft:

Tiere

Männliche BDFi-Mäuse mit einem Alter von etwa 6 Wochen und einem Gewicht von 22 ± 1 g wurden in Gruppen von je 5 Tieren für jeden Versuch verwendet.

Tumorzellen

Leukämia L 1210-Zellen wurden intraperitoneal in einer Konzentration von 1,36x10⁶ Zellen/0,04 ml/Maus eingeimpft.

45

50

55

Verabreichung der Verbindung

Die Verbindung wurde in destilliertem Wasser zur Injektion aufgelöst, so daß man Reihen von Lösungen mit vorbestimmten Konzentrationen erhielt 0,1 ml jeder Lösung wurden jeder Maus einmal täglich, beginnend 24 Stunden nach dem Einimpfen der Tumorzellen und weiter drei aufeinanderfolgende Tage lang intraperitoneal verabreicht Die anti-laukämische Wirkung der Testverbindung wurde mit Hilfe der Überlebenstage, der prozentualen Erhöhung der Lebensdauer, der Anzahl der überlebenden Tiere nach 60tägiger Beobachtung und dem entwickelten Aszites (Volumen der in der Bauchhöhle angesammelten Wassermenge) festgestellt Die prozentuale Erhöhung der Lebensdauer (ILS) wurde wie folgt berechnet:

T-C

100.

T: Mittel der Oberlebenstage der behandelten
ίο Tiere

C: Mittel der Oberlebenstage der unbehandelten

Tiere.

Die Ergebnisse des Versuches sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Dosis	Mittel der uberlebens- tage	ILS	Wasser menge bei Aszites	Zahl der Oberlebenden Tiere
(mg/kg)		(%)	(ml)	(nach 60 Tagen)
32	40,8	466,7	0	3
16	24,6	241,7	03	1
8	14,0	94,4	1,1	0
4	11,6	61,4	0	0
2	8,6	19,4	0	0
Kontrolle (unbehandelt)	7,2	—	03	0

Man erkennt deutlich aus den Versuchsergebnissen, daß die neuen Gentiobioside gemäß der Erfindung einen hohen ILS-Wert bei sehr niedriger Dosis zeigen; es ist daher zu erwarten, daß sie bei der menschlichen Chemotherapie von Leukämie und Tumorkrankheiten mit Erfolg einsetzbar sein werden.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Arzneimittel, welches eine aus- to reichende Menge eines Gentiobiosides gemäß Formel I in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Streckmittel, Trägermittel oder Verdünnungsmittel enthält.

Das Arzneimittel kann in einer beliebigen bekannten Verabreichungsform vorliegen, d. h. in Formen, die für eine orale Verabreichung oder für die Injektion bei Menschen oder für eine Injektion oder intraperitoneale Verabreichung bei Tieren geeignet sind. Das Arzneimittel kann infolgedessen in Form von Ampullen, Kapseln, Tabletten, Pulvern, Körnchen vorliegen.

Zur therapeutischen Behandlung von Leukämie und Tumorkrankheiten bei Menschen und Tieren wird ein Gentiobiosid der Formel I dem Patienten in ausreichender Menge und in geeigneten Intervallen verabreicht. Die Menge hängt dabei von der im Einzelfall verwendeten Verbindung, der Zusammensetzung des Arzneimittels, der Art der Anwendung, der Verabreichungsart sowie anderen Faktoren ab. Weitere Faktoren, die die Wirkung des Medikamentes beeinflussen, müssen ebenfalls in Rechnung gesetzt werden, zu diesen gehören beispielsweise das Alter, das Körpergewicht, das Geschlecht sowie eine eventuelle Diät des Patienten, die Zeit der Verabreichung, die Art der Verabreichung, der Stoffwechsel und die Ausscheidungen des Patienten, eventuelle Arzneimittelkombinationen, die Sensibilität des Patienten sowie schließlich die Schwere und andere Bedingungen der Krankheit. Die optimale Dosis in einem bestimmten Fall muß daher vom Fachmann unter Berücksichtigung aller vorstehenden Faktoren festgesetzt werden.

Die Gentiobioside der Formel I gemäß vorliegender Erfindung können in einfacher Weise hergestellt werden, indem man die entsprechenden Harnstoffderivate in an sich bekannter Weise nitrosiert.

Gegenstand der Erfindung ist infolgedessen auch ein Verfahren zur Herstellung der Gentiobioside der Formel I gemäß der weiter vorn gegebenen Definition, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Harnstoffderivat der allgemeinen Formel II

CH₂OH

CH₂

HO

OCH₃ (II)

in welcher einer der beiden Substituenten X' und Y' eine Hydroxylgruppe und der jeweils andere die Gruppe -NHCONHCH2CH2CI bedeuten und ~ die bereits weiter vorn angegebene Bedeutung hat mit einem Nitrosierungsmittel in an sich bekannter Weise nitrosiert

Die Nitrosierung wird in an sich bekannter Weise durchgeführt. Als Nitrosierungsmittel können beispielsweise Alkalimetallnitrite, Stickstofftrioxid, Distickstofftetroxid oder Nitrosylchlorid in üblicher Weise verwendet werden. Als Alkalimetallnitrite eignen sich insbesondere Natrium- und Kaliumnitrit. Die Nitrosierung

wird im allgemeinen bei einer Temperatur von etwa -10 bis 30⁰C in einem inerten Reaktionsmedium durchgeführt Geeignete Reaktionsmedien sind organische Lösungsmittel wie Aceton, Methanol, Äthylacetat, Äther, Dioxan und Tetrahydrofuran; auiierdem organische Säuren wie Ameisensäure und Essigsäure, wäßrige Lösungen solcher Säuren und schließlich Lösungen von anorganischen Säuren wie Chlorwasserstoffsäure. Unter diesen Bedingungen ist für die Umsetzung eine Zeitspanne von etwa 1 bis 12 Stunden bis zur Beendigung derselben erforderlich.

Nach Beendigung der Nitrosierungsreaktion kann das Reaktionsgemisch gegebenenfalls durch Umkristallisieren aus einem geeigneten Lösungsmittel, durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz oder in beliebiger anderer Weise gereinigt werden, um die anorganischen Salze zu entfernen.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

M»ithyl-2'-(3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido)-2'-desoxy-a-gentiobiosid (Verbindung A)

(1) Methyl-2,3_r3',4,4',6'-hexa-O-acetyl-2'-(benzyl-

oxycarbonylamino)-2'-desoxy-«-gentiobiosid

(Verbindung 1)

3,4,6-Tri-0-acetyl-2-(benzyloxycarbonylamino)-2-desoxy-«-D-glucopyranosylbromid (2,99 g) und Methyl-2,3,4-tri-O-acetyl-«-D-giucopyranosid (1,66 g) wurden in 35 ml trockenem Benzol gelöst Die Lösung wurde mit 2,7 g Quecksilbercyanid und 3,5 g wasserfreiem Calciumsulfat versetzt Die entstandene Mischung wurde 2 Stunden zum Rückfluß erhitzt und danach bei Raumtemperatur 19 Stunden gerührt Die entstandene Lösung wurde filtriert und das Filtrat wurde mit 150 ml Chloroform verdünnt. Die verdünnte Lösung wird mit einer gesättigten Natriumchloridlösung und anschließend mehrfach mit kaltem Wasser gewaschen, dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum unter 40⁰C eingeengt. Der verbleibende Rückstand wird mit Äther gewaschen und aus Äthanol zur Kristallisation gebracht Man erhält auf diese Weise die im Titel angegebene Verbindung 1 in kristalliner Form. Ausbeute 943 mg (26%). F. 162-163°C; (ä)? +68,7° (c 1,0; Chloroform).

Gewichtsanalyse für C33H43NO18:

Berechnet: C 53,43, H 5,83, N 1,89%;
gefunden: C 53,29, H 5,96, N 1,99%.

(2) Methyl-2'-(benzyloxycarbonylamino)-2'-desoxy-Λ-gentiobiosid (Verbindung 2)

195 mg der gemäß Stufe (1) hergestellten Verbindung wurden in 30 ml Methanol, der mit Ammoniak gesättigt worden war, gelöst. Man ließ die Lösung bei Raumtemperatur über Nacht stehen und engte sie dann im Vakuum ein. Der Rückstand wurde mit Athylacetat dreimal gewaschen und aus Methanol zur Kristallisation gebracht. Man erhielt auf diese Weise die im Titel genannte Verbindung 2 in kristalliner Form. Ausbeute 91mg (72%). F.: 212-214°C. («)7 +37,6° (c 1,0; Wasser).

Gewichtsanalyse für C21H31NO12:

Berechnet: C 51,53, H 6,38, N 2,86%;
Befunden: C 51,32, H 6,30, N 2,83%.

(3) Methyl-2'-methyl-2'-desoxy-«-gentiobiosid
(Verbindung 3)

393 mg der gemäß vorstehender Stufe (2) hergestellten Verbindung 2 wurden in 5 ral Methanol und 11 ml Wasser gelöst und mit Wasserstoff bei einem Wasserstoffdruck von 3,4 kg/cm² in Gegenwart von 200 mg Palladiumschwarz als Katalysator katalytisch reduziert Bei der Dünnschichtchromatographic (TLC) des Reaktionsgemisches an Silikagel unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus 28%igem Ammoniak, Butanol, Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis 5:8:10:7 ergab sich kein Fleck für die Ausgangsverbindung bei Rf 0,68, sondern ein neuer Fleck bei Rf 0,46. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wurde das Filtrat eingeengt Man erhielt auf diese Weise die Verbindung 3, welche eine positive Ninhydrin-Reaktion gibt Ausbeute 348 mg (99%).

(4)Methyl-2'-(3-(2-chloräthyl)-ureido)-2'-desoxy-(x-gentiobiosid (Verbindung 4)

348 mg der gemäß Verfahrensstufe (3) hergestellten Verbindung 3 wurden in 5 ml Methanol gelöst Zu der Lösung wurden langsam 0,12 ml 2-Chloräthylisocyanat gegeben, wobei unter Eiskühlung gerührt wurde. Die Absetzung eines weißen Niederschlages konnte beobachtet werden. Man ließ 30 Minuten verstreichen; danach wurde das Reaktionsgemisch bei Raumtempe-

3(j ratur über Nacht stehengelassen. Bei der TLC der entstandenen Lösung mit einem Lösungsmittelgemisch aus 28%igem Ammoniak, Butanol, Äthanol und Wasser im Volumenverhältnis von 5 :8 :10 :7 ergab sich ein Einzelfleck bei Rf 0,56. Die Lösung wurde im Vakuum unterhalb 30⁰C eingeengt Der Rückstand wurde mit Äther gewaschen. Auf diese Weise erhielt man ein Rohprodukt in einer Menge von 343 mg (93%). Durch Umkristallisieren des Produktes aus 50%igem wäßrigem Methanol (10 ml) erhielt man in kristalliner Form die Verbindung 4. Ausbeute 172 mg (47%). F.: 196 - 197°C (unter Zersetzung). («): +29,9° (c 0,6, Wasser).

Gewichtsanalyse für Ci₆HmN₂CIOi 1:

Berechnet: C 41,70, H 6,34, N 6,08, Cl 7,69%;
gefunden: C 41,74, H 6,21, N 5,88, Cl 7,49O/o.

(5) Methyl-2'-(3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido)-2'desoxy-«-gentiobiosid (Verbindung A)

262 mg der Verbindung 4, die gemäß Beispiel 1 (4) hergestellt worden war, wurden in 5 ml 99%iger Ameisensäure suspendiert. Die Suspension wurde unter Rühren und unter Eiskühlung mit 60 mg Natriumnitrit in kleinen Teilmengen versetzt Das Reaktionsgemisch wurde unter Eiskühlung eine weitere Stunde gerührt; danach wurde die Mischung mit Wasser verdünnt und mit einer einem Volumen von 100 ml entsprechenden Menge eines Kationen-Austauscherharzes in der H ⁺ Form (Amberlite IR-120®) behandelt. Das Kationen-Austauscherharz wurde anschließend abfiltriert und das bo Filtrat wurde im Vakuum bei Raumtemperatur eingeengt. Man erhielt auf diese Weise einen schwach gelb gefärbten kristallinen Rückstand (266 mg), bei dem es sich um die Verbindung A handelte. Ausbeute 98%. F.: 112-113°C (unter Zersetzung), (λ) + 32,9.

Cewichtsanalyse für C₁₆H₂B

Berechnet: C 39,21, H 5,76, N 8,58, Cl 7,24%;
gefunden: C 39,33, H 5,70, N 8,54, Cl 7,14%.

Beispiel 2

Methyl-2'-(3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido)-2'-desoxy-jS-gentiobiosid (Verbindung B)

(l)Methyl-2,3,3',4,4',6'-hexa-O-acetyl-2'-benzyl-

oxycarbonylamino-2'-desoxy-/3-gentiobiosid

(Verbindung 5)

Methyl-i^-tri-O-acetyl-^-D-glucopyranosid (2,04 g; 6,4 mMol) und Quecksilbercyanid (5,10 g; 20,OmMoI) wurden in 100 ml trockenem Benzol gelöst Die Lösung wurde mit 8 g wasserfreiem Calciumsulfat versetzt und unter wasserfreien Bedingungen und unter Rühren auf 4O⁰C gehalten. Nach 30 Minuten wurde 3,4,6-Tri-O-acetyl-2-(benzyloxycarbonylamino)-2-desoxy-«-D-glucopyranosylbrciitid (!0,04 g; 20,0 rnMoJ) zu dem Reaktionsgemisch gegeben, worauf 3 Stunden zum Rückfluß erhitzt wurde. Das Reaktionsgemisch ließ man dann bei Raumtemperatur stehen; schließlich wurde das unlösliche Material abfütriert Das Filtrat wurde mit 150 ml Chloroform versetzt; die entstandene Mischung wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung (zweimal mit je 150 ml) und dann mit Wasser (fünfmal mit je 150 ml) gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet Nach Abfiltrieren des Natriumsulfates wurde das Filtrat im Vakuum eingeengt Man erhielt auf diese Weise einen schwach braun gefärbten Sirup. Dieser Sirup wurde aus Äthanol zur Kristallisation gebracht und nochmals aus Äthanol umkristallisiert Auf diese Weise erhielt man die im Titel genannte Verbindung 5 in Form weißer Kristalle. Ausbeute 1,25 g (26,4%). F.: 182-183°C.(λ);⁷ -6° (c 1,0;Chloroform).R_f0,60(Benzol-Aceton Volumenverhältnis 5 :2).

Gewichtsanalyse für C33H43O18N:

Berechnet: C 53,44, H 5,84, N 1,89%;
gefunden: C 53,42, H 5,76, N 1,86%.

(2) Methyl-2'-(benzyloxycarbonylamino)-2'-desoxy-/3-gentiobiosid (Verbindung 6)

620 mg bzw. 0,82 mMol der gemäß vorstehender Verfahrensstufe (!) hergestellten Verbindung 5 wurden in mit Ammoniak gesättigtem Methanol (60 ml) gelöst Die Lösung ließ man in der Kälte 10 Stunden stehen; der Abschluß der Deacetylierungsreaktion wurde mit Hilfe der TLC festgestellt wobei ein Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 1 :1 verwendet wurde. Es zeigte sich bei der Prüfung ein Einzelfleck bei Rf 0,16. Die entstandene Lösung wurde im Vakuum eingeengt wobei man einen weißen festen Rückstand erhielt Dieser Rückstand wurde mit Äthylacetat (fünfmal mit je 2 ml) gewaschen, um das als Nebenprodukt gebildete Acetamid zu entfernen. Man erhielt auf diese Weise das Deacetylierungsprodukt, d. h. die Verbindung 6 als weiße feste Substanz. F.: 185 bis 187,5⁰C

(3) Methyl-2'-amino-2'-desoxy-/i-gentiobiosid
(Verbindung 7)

Die gemäß vorstehender Verfahrensstufe (2) gewonnene Verbindung 6 wurde ohne Reinigung weiterverw.endet

Die Verbindung wurde in einer Mischung ans 10 ml Wasser und 10 ml Methanol gelöst Die Lösung wurde mit 250 mg Palladium-schwarz versetzt und mit Wasserstoff bei einem Wasserstoffdruck von 2,67 kg/cm² unter Rühren im Verlauf von 5 Stunden reduziert. Bei der TLC des Reaktionsgemisches unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems n-Butanol-Äthanol-Wasser-28%iger Ammoniak (Volumenverhältnis 8 :10 :7 :5) zeigte sich ein Einzelfleck bei Rf 0,43, der eine positive Ninhydrin-Reaktion gab. Das Palla- ·> diumschwarz wurde abfütriert und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt. Man erhielt auf diese Weise das Reduktionsprodukt, nämlich die Verbindung 7 als sirupartigen Rückstand.

(4)Methyl-2'-(3-(2-chloräthyl)-ureido)-2'-desoxy-/9-gentiobiosid (Verbindung 8)

Die gemäß vorstehender Verfahrensstufe (3) hergestellte Verbindung 7 wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Sie wurde in 5 ml Methanol gelöst und die entstandene Lösung wurde mit 0,25 ml bzw. 1,37 mMol 2Ch!oräthy!isocyanst langsam, tropfenweise unter Rühren und unter Eiskühlung versetzt Sofort begannen sich weiße Kristalle abzuscheiden, so daß das Rühren nicht fortgesetzt werden konnte. Die gesamte Mischung wurde für weitere 12 Stunden in der Kälte stehengelassen und dann im Vakuum eingeengt Man erhielt so einen festen weißen Rückstand. Dieser Rückstand wurde aus einer Mischung aus 5 ml Wasser und 5 ml Methanol umkristallisiert Man erhielt auf diese Weise die im Titel genannte Verbindung 8 in Form von weißen Nadeln. Ausbeute 126 mg (333%, bezogen auf die Verbindung 5). F.: 174-176⁰C (unter Zersetzung), (a)}' -40° (c 1,0, Wasser). Rf-Wert = 0,55 (min n-Butanol-Äthanol-Wasser-28%iger Ammoniak im Volumenverhältnis 8:10:7:5). IR-Spektrum: 1625cm-', 1575cm-'.

Gewichtsanalyse für '

Berechnet: C 41,70, H 6,34, N 6,08, Cl 7,69%;
gefunden: C 41,44, H 6,25, N 5,81, Cl 731%.

(5)Methyl-2'-(3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido)-2'-desoxy-j3-gentiobiosid (Verbindung B)

Die gemäß vorstehender Stufe (4) hergestellte Verbindung 8 (100 mg; 0,217 mMol) wurde in 3 ml Aceton suspendiert In die Suspension wurde unter Eiskühlung 40 Minuten lang Stickstofftrioxid-Gas eingeblasen. Während des Einblasens veränderte das Reaktionsgemisch seine zunächst trüb-weiße Farbe, die in ein tiefes blau-grün umschlug. Die Mischung wurde anschließend im Vakuum eingeengt wobei gelöstes Stickstofftrioxid ausgeschieden wurde. Die Farbe des Konzentrates wurde blaß-gelb. Das Aceton wurde abdestilliert und der Rückstand wurde zweimal mit je 5 ml η-Hexan gewasehen. Bei der Zugabe von 3 ml Isopropyläther zu dem Rückstand bildete sich ein schwach-gelblich-weißer Niederschlag, der durch Zentrifugieren von der überstehenden Flüssigkeit getrennt wurde. Diese letztgenannte Flüssigkeit wurde erneut mit 3 ml Isopropyläther versetzt und dieselbe, vorstehend beschriebene Operation wurde noch einmal wiederholt Die gesammelten schwach-gelblich-weißen Niederschläge wurden mit Hufe einer Vakuumpumpe abgesaugt, um das Lösungsmittel zu entfernen. Man erhielt auf diese Weise die Verbindung B als schwach-gelb gefärbte feste Substanz. Ausbeute 43 mg (40%). RrWert=0,78 (Aceton-Methanol im Vohimenverhältnis 1:1). UV-Absorptionsspektrum: 2537A. IR-Spektrum: 1700 (>C=0); 1530 (—N—H); 1490 cm-' (-N=O).

Gewichtsanalyse

Berechnet: C 39,21, H 5,99, N 8£3, C3 7,24%;
gefunden: C 39,01, H 6Ä H 833, Q 7,18%.

Beispiel 3

MethyI-2-(3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido)-2-desoxyoc-gentiobiosid (Verbindung C)

(1) Methyl-2',3,3',4,4'₎6'-hexa-O-acetyl-2-(benzyloxycarbonylamino)-2-desoxy-«-gentiobiosid (Verbindung 9)

6,0 g (23,7 mMol) Quecksilbercyanid und 12 g wasserfreies Calciumsulfat wurden zu 120 ml trockenem Ben- ι ο zol gegeben. Die Mischung wurde auf einem ölbad auf 40⁰C erhitzt und mit Methyl-3,4-di-O-acetyl-2-(benzyl-

oxycarbonylamino)-2-desoxy-«-D-glucopyranosid (3,4 g; 9,6 mMol) und 2,3,4,6-Tetra-O-acetyI-ot-D-gIucopyranosylbromid (7,5 g; 17,4 mMol) versetzt. Die Mi- schung wurde dann auf 80° C erhitzt, eine Stunde bei dieser Temperatur gehalten, wieder auf 45° C abgekühlt, mit Quecksilbercyanid (6,0 g; 23,7 mMol) und 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-a-D-glucopyranosylbromid (7,5 g; 17,4 mMol) versetzt und über Nacht zum Rückfluß erhitzt. Nach dieser Zeit wird die Bildung der Titelverbindung als Kondensationsprodukt durch TLC geprüft, wobei als Lösungsmittelsystem Benzol-Aceton im Volumenverhältnis 5:1 verwendet wurde. Das Reaktionsgemisch wurde mit 180 ml Chloroform verdünnt, zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung und viermal mit Wasser gewaschen, eine Stunde mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und schließlich im Vakuum eingeengt Man erhielt auf diese Weise die Verbindung 9 als schwachgelb gefärbten Sirup. Diese Verbindung wurde für die nachfolgende Deacetylierung ohne weitere Reinigung verwendet

(2) Methyl-2-(benzyloxycarbonylamino)-2-desoxy-A-gentiobiosid (Verbindung 10)

Die Verbindung 9, die in Form eines Sirups in der voraufgegangenen Verfahrensstufe (1) erhalten worden war, wurde in 60 ml Methanol gelöst Unter Rühren und EiskUhlung wurde die Lösung mit 6 ml 0,1 η methanolischer Natriummethoxidlösung versetzt Zur Vervoll- ständigung der Umsetzung blieb die Mischung eine Stunde bei Raumtemperatur stehen. Danach zeigte das Reaktionsgemisch bei der TLC bei Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Äthanol im Volumenverhältnis 1 :1 keinen Fleck für die Ausgangsverbindung, sondern einen Hauptfleck bei Rf 0,45. Die Mischung wurde mit Kationenaustauscherharz in der H+-Form neutralisiert Das Harz wurde dann abfiltriert, und das Filtrat wurde im Vakuum eingeengt Durch Zugabe eines Lösungsmittelgemisches aus Methanol und Äther wurde das Produkt zur Kristallisation gebracht Durch Umkristallisieren aus einer Mischung aus Methanol und Wasser erhielt man schließlich die Verbindung 10 in einer Ausbeute von 890 mg, das sind L82 mMol bzw. 21,2%, bezogen auf das als Ausgangsmaterial eingesetzte Methyl-3,4-di-O-acetyl-2-(benzyloxycarbonylamino^-desoxy-a-D-glucopyranosid. F^ 235-236^oG (<x)F +503° (c LO, Wasser).

Gewichtsanalyse für CaH₃INO₁₂: _Μ

Berechnet: C 51,53, H 6£8, N 236%; gefunden: C 51,78, H 6,41, N 275%.

(3) Memyl^-i^-chloräthyTHireido^-desoxy-

(X-gentiobiosid (Verbindung 11)

200mg Palladium-schwarz wurden in 5ml Wasser suspendiert Die Suspension wurde unter einem Wasserstoffdruck von 2£1 kg/cm² 30 Minuten geschüttelt, so daß sich ein wasserstoff-gesättigter Zustand ergab.

Die Verbindung 10 (850 mg; 1,73 mMol), die gemäß voraufgegangener Verfahrensstufe (2) hergestellt worden war, wurde in einem Lösungsmittelgemisch aus Wasser und Methanol im Volumenverhältnis 1 :1 gelöst. Die entstandene Lösung wurde zu der wasserstoffgesättigten Suspension gegeben. Die katalytische Reduktion erfolgte unter einem Wasserstoffdruck von 2,81 kg/cm² in 2,5 Stunden. Danach zeigte das Reaktionsgemisch bei der TLC bei Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol-Äthanol-Wasser-17%igem Ammoniak im Volumenverhältnis von 4:5:2:4 keinen Fleck der Verbindung 10, jedoch einen neuen Fleck bei Rf 0,5, der eine positive Ninhydrin-Reaktion gibt Das Palladium-schwarz wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum eingeengt; dabei verbleibt ein transparenter sirupartiger Rückstand.

Dieser Rückstand wird in 15 ml Methanol gelöst und mit 0,2 ml bzw. 2,41 mMol 2-Chloräthylisocyanat tropfenweise unter Rühren und Eiskühlung versetzt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, wobei sie sich in ein weißes Gel verwandelt. Dieses Gel wird in einer kleinen Menge einer Mischung aus Wasser und Äthanol gelöst und die Lösung, die bei der TLC unter Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol-Äthanol-Wasser-17°/oigem Ammoniak im Volumenverhältnis 4:5:2:4 einen Einzelfleck bei Rf 0,6 — der eine negative Ninhydrin-Reaktion gibt — zeigt, wird im Vakuum eingeengt Die zurückbleibenden Kristalle werden mit einem Lösungsmittelgemisch aus Äthanol und Äthylacetat im Volumenverhältnis 1 :1 gewaschen, und zwar zweimal mit je 30 ml. Man erhält so die Verbindung 11. Ausbeute 620 mg, 1,35 mMol, 72%, berechnet auf die Verbindung 10. F.: 151,0 bis 151,5⁰C (unter Zersetzung). («)S° +54,2° (c 1,0, Wasser).

Gewichtsanalyse für C16H29N2O11CI:

Berechnet: C 41,70, H 634, N 6,08, Cl 7,69%; gefunden: C 41,74, H 6,21, N 5,88, Cl 7,49%.

(4)Methyl-2-(3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido)-2-desoxy-«-gentiobiosid (Verbindung C)

Die gemäß vorstehender Verfahrensstufe (3) hergestellte Verbindung 11 (200 mg; 0,4 mMol) wurde in 5 ml Aceton suspendiert In die Suspension wurde unter Eiskühlung 3 Minuten lang Stickstofftrioxid eingeleitet wobei das Reaktionsgemisch durchsichtig und dunkelblau wird. Bei der TLC zeigen sich bei Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 1:1 Flecke sowohl der Ausgangsverbindung als auch des Produktes bei Rf 0,6 bzw. Rf 0,4. Nach einer Stunde verfärbt sich das Reaktionsgemisch in gelblichgrün, wobei der Fleck der Ausgangsverbindung bei Rf 0,6 verschwindet und nur noch ein Einzelfleck bei Rr 0,4 bleibt; es wurde dasselbe Lösungsmittelgemisch benutzt wie vorstehend angegeben. Die Mischung wurde im Vakuum eingeengt, und der verbleibende sirupartige Rückstand wurde mit n-Hexan gewaschen und aus Isopropyläther zur Kristallisation gebracht Man erhielt so die Verbindung C mit einer Ausbeute von 159 mg, 032 mMol (73%). F^ 67-68°C (Zersetzung). («)? +39,4° (c IA Wasser).

Gewichtsanalyse für C16H28N3O12CI:

Beredmet: C 38£7, H 5,77, N 832, α 6£2%; gefunden: C 3SgI, H 5£9, N 858, Cl 7,24%.

Beispiel 4

Methyl-2-(3-(2-chloräthyI)-3-nitrosoureido)-2-desoxy-j3-gentiobiosid (Verbindung D)

carbonylamino)-2-desoxy-j3-gentiobiosid
(Verbindung 12)

Methyl-3,4-di-0-acetyl-2-(benzyloxycarbonylamino)-2-desoxy-j3-D-glucopyranosid (710 mg; 1,67 mMol) wurde in 40 ml trockenem Benzol gelöst Die Lösung wurde mit 3,0 g bzw. 6,2 mMol Quecksilbercyanid und 5,0 g wasserfreiem ■ Calciumsulfat versetzt und unter Rühren 30 Minuten auf 5O⁰C erhitzt Danach wurden 2,6 g bzw. 6,1 mMol 2,3,4,6-Tetra-O-acetyl-a-D-glucopyranosylbromid zugesetzt, und die Mischung wurde über Nacht auf 70° C erhitzt, damit die Reaktion zu Ende ablaufen konnte. Das Reaktionsgemisch wurde nach Abkühlen auf Raumtemperatur filtriert. Der Rückstand wurde mit 60 ml Chloroform gewaschen, und die Waschlösungen wurden mit dem Filtrat vereinigt Die vereinigte Chloroform-Benzol-Lösung wurde zweimal mit je 15OmI gesättigter Natriumchloridlösung und viermal mit je 50 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingeengt, wobei man einen Sirup erhielt Zu diesem Sirup wurden 30 ml Äthanol gegeben, und die Mischung wurde erhitzt, so daß sich eine Lösung bildete, die über Nacht im Kühlschrank abgestellt wurde. Das überstehende Äthanol wurde abdekantiert so daß man einen sirupartigen Rückstand erhielt, indem sich teilweise Kristalle abgesetzt hatten. Dieser Rückstand wurde durch Chromatographie an Silikagel (C-200,100 ml) gereinigt, wobei ein Gemisch aus Benzol und Aceton im Volumenverhältnis 10:1 als Laufmittel verwendet wurde. Man erhielt auf diese Weise die Verbindung 12 in kristalliner Form. Ausbeute 340 mg (27,0%). F.: 189 bis 190,5-C. («)? -3° (c 1,0, CHCl₃).

(2) Methyl-2-(benzyloxycarbonylamino)-2-desoxy-/?-gentiobiosid (Verbindung 13)

Die gemäß vorstehender Verfahrensstufe (1) hergestellte Verbindung 12 (340 mg; 0,45 mMol) wurde in mit Ammoniak gesättigtem Methanol (20 ml) gelöst Die Lösung ließ man unter Eiskühlung über Nacht stehea Danach zeigte sich bei der TLC, daß der Fleck der Ausgangsverbindung verschwunden war. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuumeingeengt; der Rückstand wurde zweimal mit je 10 ml Äthylacetat gewaschen und aus Methanol umkristallisiert Man erhielt so die Verbindung 13 in Form weißer Kristalle. Ausbeute 180 mg (79,3%). F.: 225-227°C.

(3)Methyl-2-(3-(2-chloräthyl)-ureido)-2-desoxy-j3-gentiobiosid (Verbindung 14)

170 mg der gemäß vorstehender Verfahrensstufe (2) hergestellten Verbindung 13 wurden in 10 ml einer Mischung aus Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 1:1 gelöst Die Lösung wurde mit 100 mg Palladium-schwarz versetzt, welches zuvor aktiviert worden war. Die katalytische Reduktion wurde bei einem Wasserstoffdruck von 2,81 kg/cm² bei Raumtemperatur in 2 Stunden durchgeführt Nach dem Abfiltrieren des Palladium-schwarz wurde das Filtrat im Vakuum eingeengt, wobei ein sirupartiger Rückstand verblieb. Die TLC des Rückstandes bei Verwendung eines Lösungsmittelgemisches aus n-Butanol-Äthanol-Wasser-17%igem Ammoniak im Volumenverhältnis von 4:5:2:4 zeigte einen Einzelfleck bei Rf 0,55, der eine positive Ninhydrin-Reaktion gibt

Der sirupartige Rückstand wurde ohne weitere Reinigung in 5 ml Methanol gelöst Die Lösung wurde mit 0,2 ml bzw. 2,41 mMol 2-Chloräthylisocyanat versetzt, und zwar tropfenweise und unter Eiskühlung. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht stehengelassen. Danach lag ein weißes Gel vor. Diese Mischung wurde im Vakuum zur Trockne eingedampft; der Rückstand wurde mit 10 ml Methanol versetzt Die entstandene Mischung wurde erhitzt, damit sich der Rückstand soweit wie möglich auflöste. Nach dem Abkühlen und Filtrieren erhielt man die Verbindung 14, die einen Fleck bei Rf 0,65 in der TLC zeigt, wenn man als Lösungsmittelgemisch n-Butanol-Äthanol-Wasser-17%iges Ammoniak im Volumenverhältnis von 4:5:2:4 verwendet Ausbeute 107mg (68,8%). F.: 152—153°C (unter Zersetzung).

(4) Methyl-2-(3-(2-chloräthyl)-3-nitrosoureido)-2-desoxy-/J-gentiobiosid (Verbindung D)

Die gemäß vorstehender Verfahrensstufe (3) hergestellte Verbindung 14 (100 mg; 0,217 mMol) wurde in 3 ml Aceton suspendiert Unter Eiskühlung wurde 5 Minuten lang N₂O₃-GaS eingeleitet Die Reaktion wurde unter Eiskühlung 1 Stunde fortgesetzt Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum eingeengt und zweimal mit je 5 ml η-Hexan gewaschea Zu dem Konzentrat wurden dann 5 ml Propyläther gegeben, wobei man die Verbindung D als schwach-gelblich-weiß gefärbtes Pulver erhielt Ausbeute 83 mg (77,6%). F.: 67° C (unter Zersetzung); («)? -27,4° (c OA H₂O).

Claims

Patentansprüche:

1. Methyl-2'- und Methyl-2-[3-(2-chloräthyI)-3-nitrosoureido]-2-desoxy-Ä- und -jJ-gentiobioside der allgemeinen Formel I

CH₂OH

CH₂