DE2857086A1 - Microbial insecticides - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf mikrobielle bzw. mikrobische Insektizide. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf eine mikrobielle Insektizid—zusammensetzung sowie auf die Herstellung und Verwendung derselben.

Mikrobielle Insektizide auf Virus- oder Bakterienbasis bieten beträchtliche Vorteile gegenüber üblichen chemischen Insektiziden. Im allgemeinen sind mikrobielle Insektenkrankheitserreger nicht toxisch und gegenüber anderen Lebensformen ungefährlich. Zusätzlich weisen mikrobielle Insektizide einen vergleichsweise hohen Grad an Spezifität auf und gefährden infolgedessen nicht die nützlichen Insekten. Darüber hinaus ist ein empfänglicher Insektenwirt besonders langsam darin, eine Resistenz gegen mikrobielle Krankheitserreger zu entwickeln. Mikrobielle Insektizide können in vergleichsweise geringen Dosierungen verwendet werden, sie können in wirksamer Weise als Stäubemittel oder in Sprayform angewandt sowie in Kombination mit chemischen Insektiziden

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eingesetzt werden.

Beispielsweise ist Bacillus thuringiensis (B. t.), ein sporenbildendes Bakterium als mikrobieller Insektenkrankheitserreger zur Bekämpfung zahlreicher blattfressender Insekten in ihrem Larvenzustand bekannt, einschließlich beispielsweise der Alfaifaraupen, der Tomatenhornschnecken, der Tabakhornschnecken, der Weißkohlspannerraupen, der Weißkohlspinnwebenschnecken, der Heerwürmer, der Schwammspinner, der Walnußraupen, der Kohlschaben, der überall verbreiteten grünen Käfer, der europäischen Getreidewürmer und anderer Mitglieder der Gattung der Lepidoptera.

Leider sind die Wirksamkeit und die Verwendungsmöglichkeit vieler mikrobieller Insektenpathogene aufgrund ihrer extremen Sensitivität gegenüber Sonnenlicht streng begrenzt. Es ist bekannt, daß nichtionisierende Strahlung mit hoher Photonenenergie (beispielsweise ultraviolette Strahlen des Sonnenlichts) eine desaktivierende Wirkung auf verschiedene mikrobielle Insektenkrankheitserreger bzw. -pathogene ausübt. Vgl. dazu beispielsweise "Photoprotection Against Inactivation of Bacillus thuringiensis Spores by Ultraviolet Rays", Aloysius Krieg, Journal of Invertebrate Pathology, Vol. 25, S. 267-268 (1975). Es ist beispielsweise bekannt, daß ultraviolette Strahlen mit einer Wellenlänge von 253»7 nm eine markierte, außergewöhnliche Desaktivierung des Bacillus thuringiensis (B.t.) Sporen induzieren, so daß sie unfähig sind, weiter zu keimen und

auszuwachsen. Eine Dosierung von 18 m Ϊ sec/cm einer derartigen UV Strahlung desaktiviert 99»9 % der B.t. Sporen. Es wurde festgestellt, daß die Halbwertszeit von B.t., der UV Strahlung des Sonnenlichts in der Natur ausgesetzt war, annähernd sechs Minuten beträgt. In ähnlicher Weise wurde festgestellt, daß die Halbwertszeiten bestimmter einge-

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schlossener bzw. okkludierter Viren, die ebenfalls der UV Strahlung des Sonnenlichts in der Natur ausgesetzt waren, eineinhalb Stunden betragen. Infolgedessen ist die Wirksamkeit der in der Regel durch Versprühen zum Einsatz gelangten mikrobiellen Insektizide in der Natur schnell verloren gegangen.

Da die Nukleinsäuren ein Extinktionsmaximum mit einer Wellenlänge von etwa 260 mn aufweisen, nimmt man an, daß das durch UV Strahlung induzierte Absterben der B.t. bei 253,7 nm sowie bestimmter okkludierter Viren bei vergleichbaren Wellenlängen durch eine Photoreaktion der genetischen Substanz, insbesondere von Desoxyribonukleinsäure (DNA) hervorgerufen werden können. Infolgedessen hat man vorgeschlagen, (vgl. vorgenannte Literaturstelle S. 267)» daß B.t. Sporen dadurch vor der Desaktivierung durch UV Strahlung geschützt werden können, daß man die B.t. Sporen mit DNA oder mit einer vergleichbaren Nukleinsäure in physikalischem Sinne mischt, die die UV Strahlen absorbieren können. Eine derartige vergleichbare Nukleinsäure kann beispielsweise Ribonukleinsäure (RNA) sein, die ein Extinktionsmaximum von etwa 260 nm aufweist. Dennoch hat sich diese Arbeitsweise als unwirksam herausgestellt.

Bei der vorliegenden Erfindung werden Substanzen, die in der Lage sind, Strahlung zu absorbieren, die sonst den in Frage kommenden mikrobiellen Insektenkrankheitserreger desaktivieren würde, in eine Schutzschicht eingebaut, die ihrerseits den Krankheitserreger bzw. das Pathogen in Form einer Mikrokapsel umgibt. Derartige Substanzen dienen dazu, die schädliche Strahlung zu unterbrechen und zu blockieren, bevor die lichtempfindliche Substanz des Insektenpathogens erreicht wird.
Die erfindungsgemäße insektizide Zusammensetzung mit einem

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mikrobiellen bzw. mikrobischen Wirkstoff auf Virus- oder Bakterienbasis, der in eine Mikrokapsel eingebettet ist, zeichnet sich dadurch aus, daß die Mikrokapsel eine Nukleinsäure und eine proteinhaltige Substanz enthält, wobei der Mikrokapselaufbau selbst in wirksamer Weise den Wirkstoff vor der durch Sonnenlicht induzierten Desaktivierung schützt. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen Insektizidenzusammensetzung besteht darin, daß man eine gepufferte wässrige Lösung eines mikrobiellen Insektenkrankheitserregers mit einer wässrigen Lösung einer Nukleinsäure mischt und sodann diese Mischung mit einer wässrigen Lösung einer proteinhaltigen Substanz mischt, wodurch sich Mikrokapseln von selbst bilden, die das Pathogen oder den Krankheitserreger in sich eingebettet haben.

Im allgemeinen ist die erfindungsgemäße Substanz, die zur Unterbrechung der schädlichen Strahlung dient, eine Nukleinsäure; bevorzugt enthält diese Substanz Ribonucleinsäüre (RNA). Es können auch verschiedene andere Substanzen und Kombinationen von Substanzen in Verbindung mit der Nukleinsäure eingesetzt werden, und zwar in Abhängigkeit, von dem spezifischen, zu schützenden Insektenkrankheitserreger und von der zum Einsatz bestimmten Mikrokapselbeschichtungsanordnung. Mit umfaßt werden folgende Substanzen (jedoch nicht im Sinne einer Beschränkung auf dieselben): Protamin, Zytochrom C, Soja Protein, Hämoglobin, Gallerte usw. In der Regel kann jegliches Protein verwendet werden, wenn die Reaktionsbedingungen in der Weise eingestellt werden, daß die Bildung von Mikrokapseln erleichtert wird. Derartige Bedingungen umfassen die Arbeitsweise mit veränderter Ladung, das Einstellen des pH Wertes)der Konzentration der einzelnen Komponenten, usw.

Die Mikrokapseln, in denen das mikrobielle Insektenpathogen

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eingebettet ist, können in vorteilhafter Weise unter Verwendung jeglicher bekannter Arbeitsweise hergestellt werden, um die sog. koazervierten Tröpfchen oder Mikrokapseln zu erzeugen. Eine derartige Arbeitsweise wurde im Zusammenhang mit der Studie der Entstehung des Lebens auf der Erde entwickelt und wurde sodann beim Aufbau von prezellularen Modellen verwendet. Vgl. dazu beispielsweise Evreinova, et al., Journal of Colloid and Interface Science, Vol. 36, Nr. 1 (1971).

Die beigefügten, zur Erläuterung der Erfindung dienenden Figuren zeigen folgendes:

Fig. 1 zeigt eine Kurve, die die optische Dichte (d. h. die Absorption) über dem solaren UV Bereich typischer Mikrokapseln wiedergibt, die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind. Die Fig. 2-6 zeigen Kurven, die experimentelle Vergleichsdaten aus den Beispielen 1, 2, 4, 5 und 6 wiedergeben, die im nachhinein näher beschrieben werden. In den Fig. 2—4 wird die Anzahl der lebensfähigen Sporen, auf einen ml der Originalprobe extrapoliert, als Funktion der Zeitdauer der Bestrahlung mit der UV Strahlung wiedergegeben. In den Fig. 5 und 6 ist der Prozentgehalt des B.t., der als überlebende Substanz verbleibt, als Funktion der Bestrahlungszeit wiedergegeben.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Mikrokapseln unter Verwendung der oben genannten Arbeitstechnik wie folgt hergestellt. Eine wässrige Lösung mit einer Nukleinsäure wie z. B. RNA und ein Puffermittel wie z. B. Phosphat, das dafür bestimmt ist, den pH Wert genau da zu halten, wo er die Ladung an der RNA, an dem Protein und der Mikrobe optimiert (in dem Falle, wo die

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Mikrobe gegenüber dem pH Wert empfindlich ist, sollte dies so gut wie möglich berücksichtigt werden), werden mit einer wässrigen Lösung mit einem geeigneten Protein gemischt, wie z. B. Protamin, Gelatin, Sojaextrakt (soy isolate), Hämoglobin usw. oder synthetische Aminosäurepolymeren. Protein-Nukleinsäure-Mikrokapseln, die besonders fest und annähernd kugelförmig sind, bilden sich spontan unter Mischung dieser beiden Lösungen.

Es ist wichtig festzustellen, daß, obwohl alle die oben aufgeführten proteinischen Substanzen und andere Substanzen in befriedigender Weise für die Herstellung der Mikrokapseln verwendet werden können, darauf geachtet werden sollte, daß der pH Wert der Mischung der Lösungen an der sauren Seite bezogen auf den isoelektrischen Punkt des betreffenden Proteins gehalten wird, da dies für die Bildung der Mikrokapseln notwendig ist. Wenn ein Protein verwendet wird, das bei einem gegebenen pH Wert unlöslich ist, wird man den pH Wert in einen Bereich einstellen müssen, bei dem das Protein löslich ist, oder man muß andere Schritte unternehmen, um das Protein löslich zu machen. Derartige Schritte umfassen den partiellen Abbau, die Modifikation der Ladung oder die Zugabe anderer Komponenten zu dem Puffermittel (z. B. Detergenzien, Alkohole, oberflächenaktive Mittel usw.). Wenn die Schaumbildung einer oder mehrerer Komponenten ein Problem darstellt, können Mittel vom Simethicone Typ mit aufgenommen werden (vgl. dazu US-PS 2 441 098). Wenn RNA als Nukleinsäure verwendet wird, sollte der pH Wert der Mischung der Lösungen bei einem Wert von 4,3 oder gerade etwas darüber gehalten werden, um zu verhindern, daß die RNA aus der Mikrokapsel ausfällt, wobei das Protein notwendigerweise die Mikrokapsel verläßt und zurück in Lösung geht.

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Wie aus der zuvor beschriebenen Verfahrensweise zur Herstellung von Mikrokapseln, d. h. koazervierten Tröpfchen, ersichtlich ist, wird die betreffende Substanz, nämlich die Nukleinsäure, die dazu verwendet wird, die gefährliche Strahlung zu unterbrechen und zu absorbieren, direkt in die Mikrokapselstruktur eingebettet, wodurch eine besonders schutzfähige Beschichtung erzeugt wird.

Die bimolekulare Struktur der Mikrokapseln schafft ein thermodynamisch stabiles Zusammenwirken zwischen den einzelnen Komponenten, so daß sogar ohne anschließende chemische Vernetzung, wie im nachhinein beschrieben, die Komponenten nicht einzeln aus den Mikrokapseln herausdiffundieren. Außerdem bewirkt der bimolekulare Aufbau, daß die Mikrokapseln hoch geladen sind. Diese Ladungen dienen dazu, daß die Mikrokapseln an den Pflanzenoberflächen anhaften. Derartige Ladungen können dadurch kontrolliert werden, daß man ein geeignetes Protein auswählt und dieses sodann für die Herstellung der Mikrokapseln verwendet.

Die Größe der Mikrokapseln kann dadurch überwacht werden, daß man die Konzentration der Nukleinsäure und des Proteins in dem Reaktionskolben kontrolliert. Beispielsweise können 100 /u Perlen durch Mischen von 5 % RNA mit 10 % Protaminsulfat hergestellt werden. Es bilden sich die Kapseln und setzen sich sodann an dem Boden des Reaktionskolbens ab. Die meisten von ihnen sind im Bereich von 100 /u. Obwohl im allgemeinen ein vergleichsweise großer Konzentrationsbereich hinsichtlich der Nukleinsäure und des Proteins bei der Herstellung dieser Mikrokapseln in Frage kommt, wird bei der vorliegenden Erfindung für die Herstellung der Mikrokapseln (d. h. zum Einschließen der mikrobiellen Insektenpathogene) ein Nukleinsäure:Protein-Verhältnis im Bereich von etwa 1:5 bis 5:1 bevorzugt. Wenn der Insekten-

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pathogen Bacillus thuringiensis in die Mikrokapseln eingebettet werden soll, verwendet man bevorzugt RNA als Nukleinsäure und Protaminsulfat als Protein und verwendet bevorzup;t ein RNA:Protaminsulfat-Verhältnis von annähernd 1:2.

Bei diesen Ausführungsformen der Erfindung, bei denen es erwünscht ist, Mikrokapseln der oben beschriebenen Art zu verwenden, kann das mikrobielle Insektenpathogen in die Mikrokapseln dadurch eingebettet (d. h. eingeschlossen) werden, daß man das Pathogen in einfacher Weise mit einer wässrigen Lösung des gewünschten Puffermittels, z. B. einem Phosphat, mischt und sodann diese Suspension wiederum mit einer wässrigen Lösung der gewünschten Nukleinsäure mischt. Die sich ergebende Suspension wird sodann mit einer wässrigen Proteinlösung der oben beschriebenen Art gemischt, und das Pathogen bzw. der Krankheitserreger wird sodann in die sich von selbst bildenden Protein-Nukleinsäure-Mikrokapseln eingebettet. Alternativ kann die Mikrobe in die proteinische Lösung eingebracht werden und sodann mit einer wässrigen Lösung der gewünschten Nukleinsäure gemischt werden.

Gemäß der Erfindung hat man festgestellt, daß ein anschließendes Schütteln des Reaktionskolbens, in dem die Lösungen gemischt werden sollen, die Mikrokapseln veranlaßt, zu koaleszieren und sich spontan umzuwandeln, mit dem Ergebnis, daß sich in der Regel zusätzliche Pathogene in den Mikrokapseln einbetten lassen.

Obwohl die nach der zuvor beschriebenen Arbeitsweise hergestellten Mikrokapseln einen gewissen Stabilitätsgrad besitzen (d. h. eine Bruchfestigkeit und eine Koaleszenzbeständigkeit), ist es von Vorteil, wenn man ihre Stabilität steigert, um die Abtrennung der eingebetteten Pathogene von den nicht eingebetteten Pathogenen zu erleichtern und

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insgesamt ihre Handhabung weiter zu erleichtern. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird diese Stabilisierung dadurch bewerkstelligt, daß man die Mikrokapselproteinmoleküle dadurch chemisch vernetzt, daß man _; sie mit Vernetzungsmitteln wie z. B. Glutaraldehyd, Imidoestersubstanzen, Dithiobissuccimidylpropionat usw. behandelt. Wenn man Glutaraldehyd verwenden möchte, sollte . eine wässrige Lösung von 0,25 Gew.-% oder weniger verwendet werden, da erfindungsgemäß festgestellt wurde, daß, wenn man die Glutaraldehydkonzentration steigert, bestimmte Pathogene, insbesondere der Bacillus thuringiensis dazu neigt, desaktiviert zu werden. Es wird festgestellt, daß der Vernetzungsgrad (depth of crosslinking) dadurch ziemlich einfach kontrolliert werden kann, daß man Zeit, Konzentration,-Temperatur und die anderen Bedingungen der Vernetzungsreaktion überwacht. Beispielsweise kann der Vernetzungsgrad dadurch kontrolliert werden, daß man die Vernetzungsreaktion durch Zugabe eines kleinen Moleküls stoppt, das seinerseits mit dem Vernetzungsmittel reagiert (z. B. Zugabe von Lysine zu Glutaraldehyd) oder indem man geringe Konzentrationen des Vernetzungsmittels verwendet.

Derartige chemische Vernetzungen der Mikrokapseln bieten eine Reihe von Vorteilen: 1. Stabilisierung gegenüber den Scherkräften, die beim Sprühauftragen der Insektizide auftreten; 2. Aufrechterhalten, sofern es erwünscht ist, von flüssigen Zentren innerhalb der Mikrokapseln; 3. Aufrechterhalten, sofern es erwünscht ist, eines pH Wertes im Innern der Mikrokapsel, der geringer ist, als der der Umgebung der Mikrokapsel (d. h. die alkalischen Verdauungssäfte des Insektendarms), so daß das Innere der Mikrokapsel auf einem pH Wert in der Nähe des optimalen pH Wertes für die Lebensfähigkeit, Lagerung usw. des mikrobiellen Pathogens gehalten werden kann; 4. Kontrolle der Position in dem Insektendarm, wo das

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Pathogen übertragen wird (d. h. je größer der Vernetzungsgrad desto weiter fortgeschritten wird sich die Übertragung im Ineektendarm abspielen und umgekehrt) wodurch die Infektivität des Pathogens gesteigert wird.

Erfindungsgemäß hat man festgestellt, daß das mikrobielle Insektenpathogen in die zuvor beschriebenen Mikrokapseln noch viel leichter und in noch größerer Anzahl eingebettet (d. h. eingeschlossen) werden können, wenn man ihre Nettooberflächenladung zuerst so modifiziert, als ob man sie nahezu vollständig negativ oder nahezu vollständig positiv macht. Eine derartigeVeränderung der Oberflächenladung kann beispielsweise durch kontrollierte Zugabe eines proteinmodifizierenden Mittels wie z. B. Bernsteinsäureanhydrid, Imidoester und ähnliche Substanzen bewerkstelligt werden (vgl. dazu Gary E. Means and Robert E. Feeney, Chemical Modifications of Proteins, Holden Day, Inc., 1971)» Im allgemeinen wird die Wirksamkeit dieser, die Oberflächenladung modifizierende Arbeitsweise dadurch gesteigert, daß man die mikrobielle Pathogenzusammensetzung zunächst getrennt in einem organischen Lösungsmittel (z. B. einer 60 gew.-^igen äthanolischen Lösung) und dann in einem anorganischen Lösungsmittel (z. B. einer 1M Natriumchloridlösung) wäscht.

Da das in seiner Oberflächenladung modifizierte Pathogen offensichtlich mit der gleichgeladenen Komponente der Mikrokapsel für die Positionen innerhalb der Kapsel konkurriert, sollte darauf geachtet werden, daß die Konzentration derartiger gleichgeladener Komponenten auf einen Betrag reduziert wird, der den Einbau des Pathogens in die Mikrokapsel zuläßt. Wenn es erwünscht ist, Bacillus thuringiensis Zellen, Sporen und Toxinkristalle in eine RNA-Prcteinmikrokapsel der zuvor beschriebenen Art einzubetten bzw. einzuschließen, werden diese Komponenten auf eine stark negative Oberflächen-

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ladung eingestellt. Es kann dann notwendig sein, die Konzentration der RNA-Lösung (RNA ist auch negativ geladen) geringfügig zu reduzieren, bevor man die Lösung mit der proteinischen Lösung mischt.

In ähnlicher Weise kann es in einem derartigen Mikrokapselsystem notwendig sein, wenn die Oberflächenladung des Pathogens auf eine stark positive Oberflächenladung eingestellt worden ist, die Konzentration der proteinischen Lösung (Protein ist positiv geladen) geringfügig zu reduzieren, bevor man die Lösung mit der RNA-Lösung mischt. Das zuletzt aufgeführte System ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung vorzuziehen, da es keine Reduzierung der Menge des die Strahlung absorbierenden Materials (d. h. der RNA) notwendig macht.

Da der Schutz der lichtempfindlichen mikrobiellen Insektenpathogene gegen die durch die schädliche Strahlung der Sonne hervorgerufene Desaktivierung eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung darstellt, ist es bei der Auswahl der für die Herstellung der Mikrokapseln verwendeten Substanzen verständlicherweise von großer Bedeutung, daß man Materialien aussucht, die eine derartige schädliche Strahlung besonders stark absorbieren. Obwohl auch andere Substanzen ausgewählt werden können, ist eine Nukleinsäure die besonders bevorzugte Substanz, wie z. B. Ribonukleinsäure (RNA) und ganz besonders bevorzugt man die Verwendung einer Kombination von einer Nukleinsäure und eines Proteins. Die Absorption der Mikrokapseln, die RNA und Protamin enthalten, und gemäß der oben beschriebenen Arbeitsweise hergestellt worden sind, wird in Fig. 1 wiedergegeben. Die Fig. 1 zeigt die Absorption einer 0,1 #igen Lösung von Mikrokapseln (z. B. Mikrokapseln die durch Kombination von 0,1 % RNA und 0,1 % Protamin hergestellt worden sind) über dem Solar-UV-Bereich aufgetragen.

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In manchen Fällen bietet das Vorhandensein einer Nukleinsäure in der Mikrokapsel noch einen zweiten Vorteil. Es wurde darauf hingewiesen, daß der durch Wellenlängen des Sonnenlichtes, die größer sind als 313 nm, hervorgerufene Schaden im Falle von vielen Mikroben in erster Linie das Ergebnis der Reaktion zwischen den Nukleinsäuren der Mikrobo und freien Radikalen darstellt(man nimmt an, daß die schädliche Bestrahlung des Tyrosin HgO- erzeugt, das wechselseitig wiederum freie Radikale liefert). Die in dem Mikrokapselaufbau vorhandene Nukleinsäure tendiert dazu, spezifisch mit den freien Radikalen zu reagieren, die sonst mit der Nukleinsäure der Mikrobe reagieren würden. Dadurch wird jeglicher Schaden verhindert.

Da der krankheitserregende Effekt des mikrobiellen Wirkstoffes solange nicht verwirklicht werden kann, solange der Wirkstoff in der Mikrokapsel eingebettet verbleibt, sollte bei der Auswahl der bei der Herstellung der Mikrokapseln verwendeten Materialien darauf geachtet werden, daß man solche aussucht, die eine Übertragung des Wirkstoffes nach Aufnahme der Mikrokapseln durch das Insekt zulassen. Obwohl auch andere Substanzen ausgewählt werden könnten, hat man gemäß der Erfindung festgestellt, daß Mikrokapseln, die ein Protein und eine Nukleinsäure (z. B. RNA) enthalten, besonders vorteilhafte Ubertragungseigenschaften bieten.

Nach Aufnahme der Mikrokapseln durch das Insekt, werden die Mikrokapseln durch Proteasen und Nukleasen im Verdauungstrakt, d. h. im Darm des Insekts angegriffen, was eine Aufnahme der Mikrobe bewirkt. Infolgedessen ist es wichtif¹;, Mikrokapselnmaterialien auszuwählen, die nicht resistent sind gegenüber derartigen Reaktionen. Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß, wenn man Bacillus thuringiensis (Zellen, Sporen und Toxinkristalle) in Mikrokapseln einschließt, die

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RNA und Protamin enthalten, und sie sodann bei Raumtemperatur in Gegenwart von den Verdauungssäften des Insekts inkubiert, die Aufnahme des Bazillus innerhalb von Minuten beginnt und im Verlauf von einer nachfolgenden halben Stunde gesteigert und abgeschlossen wird.

Außerdem wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß, wenn der in Mikrokapseln aus RNA und Protamin eingebettete Bacillus thuringiensis bei Raumtemperatur in Gegenwart von Aminosäuren und/oder Zuckersorten inkubiert wird, wie man sie beispielsweise im Verdauungstrakt eines Insektes finden würde, die keimenden Sporen selbst die Mikrokapseln in annähernd 2 Stunden auflösen. Diese Reaktion spielt sich nicht nur in Wasser oder gepufferter Lösung ab, so daß die Mikrokapseln intakt auf den Blattoberflächen verbleiben.

Es wird festgestellt, daß, obwohl das bakterielle Pathogen Bacillus thuringiensis das einzige bisher im Detail beschriebene mikrobielle Insektenpathogen ist, die vorliegende Erfindung für die Verwendung eines jeglichen lichtempfindlichen mikrobiellen Insektenpathogens einschließlich solcher auf Virusbasis geeignet ist. Das nachfolgende Beispiel 6 zeigt die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung auf einen bakteriellen Virus. Die in Beispiel 6 wiedergegebenen Ergebnisse zeigen, daß die vorliegende Erfindung auch für die Verwendung beim Schutz von Insektenviren geeignet ist.

Die folgenden Beispiele erläutern mehrere verschiedenartige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.

Beispiel 1

1 x 10- Bacillus thuringiensis Sporen, einschließlich Bakterienzellen, Sporen und sporenfreie (kristalline) Körper,

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die aus einer Sporenbildungstragerkultur stammen, wurden in 10 ml einer 0,15 N Phosphatpufferlösung bei einem pH Wert von 7,5 gemischt. 1,5 ml dieser Lösung wurden mit 1,5 ml einer gepufferten, 1,34 gew.-#igen wässrigen Lösung einer Hefe-RNA gemischt. (Erhalten von Sigma mit einer Qualität B). Sodann wurden 0,4 ml dieser Suspension unter konstantem Rühren mit 1,9 ml einer gepufferten, 0,36 gewzeigen wässrigen Lösung von Protaminsulfat gemischt (erhalten von Sigma mit der Qualität B).

Es bildeten sich spontan RNA-Protaminmikrokapseln und jede von ihnen umschloß mehrere der bakteriellen Zellen und/oder Sporen und/oder sporenfreien Körper. Ein Schütteln der Mischung ergab einen Bruch und anschließende spontane Neubildung zusätzlicher Mikrokapseln. Die Mikrokapseln wurden sodann auf eine Petriglasscheibe aufgebracht und dem Licht einer Keimlampe ausgesetzt (Typ General Electric G30T8, ?0 Watt), Die Petrischeiben wurden dann sodann in eine rotierende Schüttelvorrichtung 78 cm unter die Lampe angeordnet, und man ließ die Schüttelvorrichtung mit 30 Umdrehungen pro Minute laufen. Die Lebensfähigkeit wurde dadurch bestimmt, daß man die Probe auf Kopf-Herz-Infusionsagar auftrug, erhalten von Difco (by plating on brain heart infusion agar).

Während die Bestrahlung mit einer keimtötenden ultravioletten Strahlung (Strahlungspeak bei 254 nm) ausreicht, um 99»99 % jeglichen ungeschützten Bacillus thuringiensis (B.t,) abzutöten, überlebte nahezu jeder B.t., der in den Mikrokapseln eingebettet bzw. eingeschlossen war (d. h. die geschützten Bakterienzellen und/oder Sporen und/oder sporenfreien Körper). Dies wird in Fig. 2 wiedergegeben. Das frühzeitige Absterben, durch die markierte Linie "geschützter B.t." + als Ursache des niedrigen Prozentgehaltes

des B.t., der wirklich in den Mikrokapseln eingebettet ist« angenommen. + wiedergegeben, wird

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Unter dem Mikroskop wurde ein Prozentgehalt an wirklich eingebettetem B.t. im bereich von 0,5 bis 1,5 % festgestellt.

Beispiel 2

Es wurden Mikrokapseln mit darin eingebettetem B.t. wie in Beispiel 1 hergestellt. Es wurden sodann 1 mg/ml Dithiobissuccimidylpropionat in DMSO zugegeben, um die Mikroperlen zu vernetzen und zu stabilisieren. Es wurden sodann 0,2 ml dieser Lösung in einen 0,22 /u Milliporefilter eingebracht und unter Vakuum getrocknet. Die Filter wurden sodann wie in Beispiel 1 ohne Schüttelvorgang bestrahlt. Danach wurde geschüttelt und die Filter wurden in einer verdünnten Pufferlösung ausgewaschen und sodann wie in Beispiel 1 auf Agar aufgetragen. Die Ergebnisse dieser Arbeitsweise sind in Fig. 3 wiedergegeben.

Beispiel 3

1 χ 1O⁷ B.t. Sporen, die aus einer Sporenbildungsträgerkultur erhalten waren, wurden zunächst in einer 60 #igen äthanolischen Lösung gewaschen und sodann in einer 1 Μ NaCl Lösung gewaschen, wobei der B.t. aus diesen Waschlösungen durch Zentrifugieren abgetrennt wurde. Der gewaschene B.t. wurde sodann in 20 ml einer 1 M Natriumkarbonatpufferlösung bei einem pH Wert von 8,0 suspendiert.

Danach wurde Bernsteinsäureanhydrid, ein ρτοΐeinmodifizierendes Agens zu der Suspension hinzugegeben, und zwar in Form von sechs getrennten Zugaben von 2,5 mg/ml. Diese Zugaben wurden unter konstantem Rühren vorgenommen, und die Mischung wurde sodann 10 Minuten zwischen einer jeden Zugabe gerührt. Der pH Wert wurde bei 8,0 £ 0,1 durch Zugabe von NaOH gehalten. Sobald die Reaktion abgeschlossen war, was durch ein Aufhören des pH Wert-Wechsels angezeigt wurde, wurde der B.t. durch Zentrifugieren abgetrennt und gewaschen. Dieser modifizierte B.t. (negativ geladen) wurde sodann in

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RNA-Protaminmikrokapseln eingebaut, gemäß der Verfahrensweise von Beispiel 1, und die Mikrokapseln wurden sodann gemäß Beispiel 2 vernetzt.

Es wurde festgestellt, daß der modifizierte B.t. wesentlich leichter und in einer wesentlich höheren Anzahl eindringt, als es bei den nichtmodifizierten B.t. der Fall ist, die in den Beispielen 1 und 2 verwendet wurden. Mutmaßlich liegt die Ursache dafür darin begründet, daß die Oberflächenladunp; des B.t. von positiv zu negativ verändert wurde.

Beispiel 4

Es wurde eine Lösung mit ungeschütztem B.t. (Zellen, Sporen und Toxinkristalle) und geschütztem B.t. (d. h. eingebettet in Mikrokapseln, wie es in Beispiel 5 beschrieben worden ist, jedoch ohne Vernetzung) und zwar 60 % ungeschützter und 40 % geschützter Anteile (mikroskopisch bestimmt) einer Strahlung von 254 nm ausgesetzt, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist.

Nach 15 Minuten einer derartigen Bestrahlung blieben im wesentlichen überhaupt keine ungeschützten Sporen am Leben, wohingegen 1 χ 10 geschützte Sporen (d. h. 40 % der gesamten ursprünglichen Mischung) nach einer Stunde Bestrahlung am Leben blieben. Die Lebefähigkeit wurde wie in Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse dieses Beispiels werden in Fig. 4 wiedergegeben.

Beispiel 5

1 χ 10" Sporen des Bacillus thuringiensis (einschließlich Zellen, Sporen und sporenfreier Kristalle) wurden in 10 ml einer 0,15 N Phosphatpufferlösung bei einem pH Wert von 7,5 suspendiert (B.t. wurde vie in Beispiel 3 hergestellt und modifiziert). 0,5 Gramm RNA (von Calbiochem, Qualität B) wurde in dieser Suspension gelöst und durch heftiges Mischen in einem Vortex Mischgerät gemischt. Die Suspension wurde

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sodann zu einer gepufferten, 10 gew.-i&Lgen Protaminsulfatlösung (Calbiochem, Qualität B) zugegeben und 5 Sekunden lang heftig geschüttelt. Sodann wurden 25 % Glutaraldehyd (von Sigma) zu der Lösung hinzugegeben, um eine endgültige Konzentration von 0,15 Volumenprozent zu erzielen. Nach 30 Minuten bildete sich ein Pellet auf dem Boden des Reaktionskolbens, wobei das Pellet aus 100 bis 150 /u großen Mikrokapseln bestand. Der Überschuß wurde abgezogen und das Pellet wurde bis auf ein endgültiges Volumen von 20 ml durch Schütteln resuspendiert. Diese Lösung wurde sodann in ein 0,22 /U Milliporefilter eingebracht und über Nacht unter Vakuum getrocknet. Diese Filter wurden dem Sonnenlicht ausgesetzt (1:00 pm, RH 23 %, Temperatur 32°C). Die Filter wurden sodann in gepuffertem Acetat (0,15 N, pH 4,0) gewaschen, um die Mikrokapseln aufzubrechen und den B.t. aufzunehmen, der wie in Beispiel 1 plattiert wurde. Die Ergebnisse dieses Versuches sind in Fig. 5 wiedergegeben. Nahezu alle ungeschützten Sporen wurden nach 30 Minuten abgetötet.

Beispiel 6

Der Zweck dieses Beispiels liegt darin, den Schutz eines Virus gemäß der vorliegenden Erfindung aufzuzeigen. Die Reaktionsweisen eines Insektenvirus und eines bakteriellen Virus (sog. Bakteriophage) sollten ähnlich sein, da beide von Grund auf aus einer Nukleinsäure in einer Proteinschicht bestehen. Dementsprechend wurde die Arbeitsweise der vorliegenden Erfindung auf den bakteriellen Virus vom Typ E_x coli, phage T-4 eingestellt.

Die T-4- bakteriellen Phagen ließ man in einer Nährflüaigkeit mit 0,5 % NaCl (P-Nährlösung) wachsen. Der E^ coli BB wurde in 100 ml P-Nährlösung geimpft und sodann über Nacht wachsen gelassen. Am Morgen wurde sodann eine 1:100 Verdünnung mit frischer Nährlösung hergestellt und man ließ

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diese Lösung dann für eine weitere Stunde wachsen. 1 χ Λ0[ Phagen wurden sodann zu dieser schnell wachsenden E^ coli BB Kultur zugegeben und man ließ sie sodann 6 Stunden bei 37°C unter heftigem Schütteln weiter wachsen. Am Ende dieser Zeitspanne wurden 5 Tropfen Chloroform hinzugegeben, um alle Bakterien in der Kultur abzutöten. Diese bildete dann das Phagenausgangsmaterial.

Es wurden Mikrokapseln hergestellt, indem man 0,100 Gramm Protaminsulfat in 10 ml Phagenausgangsmaterial mischte. Diese Suspension wurde sodann zu 1 Gew.-% RNA in einer P-Nährlösung hinzugegeben. Die Mikroperlen bildeten sich spontan. Die Bestrahlung mit UV wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Es wurden zeitlich abgestimmte Proben gezogen und Verdünnungen in einer P-Nährlösung gemacht. Die lebensfähigen Phagen wurden nach der Methode bestimmt, die beschrieben ist in: Grace C. Rovozzo und Carroll N. Burk, A Manual of Basic Virological Techniques, Prentice-Hall Biological Techniques Series, 1973» S. 168, wobei man P-Nährlösung-Agar und E_2- coli BB als Indikatorbakterien verwendete.

Die Ergebnisse dieses Versuches werden in Fig. 6 wiedergegeben. Diese Daten zeigen, daß der ungeschützte Virus vollständig in annähernd 5 Minuten abgetötet worden war. Andererseits zeigte der in Mikrokapseln eingebettete Virus, nach einem Initialtropfen ähnlich dem wie in den Bakterienversuchen, eine hohe UV Lichtresistenz (annähernd 40 % waren vorder Desaktivierung geschützt).

Selbstverständlich ist der Ausdruck Nukleinsäure, wie er in der Beschreibung verwendet wird so zu verstehen, daß er alle Polynukleotide umfaßt. In ähnlicher Weise ist der Ausdruck Protein so zu verstehen, daß er alle Polypeptide mit einschließt.

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Zusammenfassend stellt die vorliegende Erfindung eine verbesserte insektizide Zusammensetzung mit einem mikrobiellen Wirkstoff auf Virus- oder Bakterienbasis, eingebettet in einer Mikrokapsel, wobei die Mikrokapsel ein für die Absorption von Strahlung geeignetes Material enthält, um den Wirkstoff vor der durch Sonnenlicht induzierten Desaktivierung zu schützen. In der Regel enthält die Mikrokapsel eine Nukleinsäure und eine proteinhaltige Substanz und wird durch chemische Vernetzung stabilisiert.

Außerdem wird gemäß der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen Insektizidenzusammensetzung zur Verfügung gestellt, wonach man eine gepufferte wässrige Lösung eines mikrobiellen Insektenpathogens mit einer wässrigen Lösung einer Nukleinsäure mischt und sodann diese Mischung mit einer wässrigen Lösung einer proteinhaltigen Substanz erneut mischt, wodurch sich spontan Mikrokapseln mit in sich eingebetteten bzw. eingeschlossenen Pathogenen bilden. In der Regel werden die Mikroperlen anschließend dadurch stabilisiert, daß man sie mit chemischen Vernetzungsmitteln behandelt, und im allgemeinen wird das mikrobielle Insektenpathogen vor den zwei Mischungsstufen durch Waschvorgänge gereinigt und sodann durch Addition einer proteinmodifizierenden Substanz in seiner Oberflächenladung verändert, um eine gleichförmigere Oberflächenladung zu erzielen.

030607/0006

Claims (11)

1. Patentansprüche

   ^ 1J Insektizide Zusammensetzung mit einem mikrobiellen Wirkstoff auf Virus- oder Bakterienbasis, der in eine Mikrokapsel eingebettet ist, dadurch gekennzeichnet , daß die Mikrokapsel eine Nukleinsäure und eine proteinhaltige Substanz enthält, wobei der Mikrokapselaufbau den mikrobiellen Wirkstoff vor der durch Sonnenlicht induzierten Desaktivierung schützt.
2. 2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch

   e -

   kennzeichnet

   daß der wirksame Durchmesser

   der Mikrokapsel im Bereich von 10 bis I50 Mikron
3. 3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch

   e -

   kennzeichnet , daß die Mikrokapsel durch chemische Vernetzung stabilisiert ist.

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4. 4·. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der mikrobielle Wirkstoff einen Virus enthält.
5. 5. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der mikrobielle Wirkstoff Bacillus thuringiensis enthält.
6. 6. Verfahren zur Herstellung einer mikrobiellen, Insektizidenzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) eine gepufferte wässrige Lösung, die einen mikrobiellen Insektenkrankheitserreger enthält, mit einer wässrigen Lösung einer Nukleinsäure mischt; und

   b) diese Mischung mit einer wässrigen Lösung einer proteinhaltigen Substanz mischt, wodurch Mikrokapseln gebildet werden, die den Krankheitserreger in sich eingebettet haben.
7. 7· Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennz e ic h η e t , daß man die Mikrokapseln nachträglich durch Behandlung mit chemischen Vernetzungsmitteln stabilisiert.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch geke η η zeichnet , daß man den mikrobiellen Insektenkrankheitserreger vor den zwei Mischstufen durch Waschen reinigt und seine Oberflächenladung durch Zugabe eines proteinmodifizierenden Wirkstoffes verändert, der in der Lage ist, eine gleichförmigere Oberflächenladung zu erzielen.
9. 9- Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß der mikrobielle Insektenkrankheits-

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   erreger Bacillus thuringiensis, die Nukleinsäure RNA und die proteinhaltige Substanz Protamin enthalten.
10. 10. Insektizide Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß der mikrobielle Wirkstoff eine im wesentlichen gleichförmige Oberflächenladung aufweist, sobald er in die Mikrokapsel eingebettet ist.
11. 11. Verwendung einer wirksamen Menge der Insektizidenzusammensetzung nach Anspruch 1 zur Bekämpfung von Insektenschädlingen in entsprechend verseuchten Gebieten.

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