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Isolierungsprodukt aus den Früchten der Phytolacca
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americana L., dessen Herstellung und Arzneimittel Gegenstand der Erfindung
ist ein Isolierungsprodukt mit antihepatotoxischer Wirkung aus den Früchten der
Phytolacca-Arten, insbesondere Phytolacca americana L.
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Viele Mittel zur Behandlung von Lebererkrankungen, wie Orotsäure,
Cynarin, Methionin, sind keine eigentlichen Therapeutika, sondern dienen mehr zur
Entlastung der Leber durch Unterstützung der normalen Leberfunktion. Als ätiologische
Lebertherapeutika stehen dem Arzt nur Silymarin und dessen Derivate zur Verfügung.
Die Vielfalt der Ursachen von Leberstörungen und deren unterschiedliche Eigenart
lassen zudem eine Bereicherung der therapeutischen Palette als unbedingt notwendig
erscheinen.
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Es wurde nun überraschenderweise ein neues Produkt mit antihepatotoxischer
Wirkung gefunden, das aus den Früchten der Phytolacca-Arten, insbesondere den in
Südamerika und Korea vorhandenen Arten, ganz besonders der Phytolacca americana
L., gewonnen wird, das gekennzeichnet ist durch folgende Parameter: Schmelzpunkt
246-7 oC unter Zersetzung, Summenformel C18Hi606, Molmasse 328, Elementaranalyse
C 64,98 , H 4,98 %, 0 28,3 %, Rf-Wert 0,17 bei Dünnschichtchromatographie unter
Verwendung von Kieselgel-60-Fer,tigplatten Merck und Chloroform/Aceton/Ameisensäuvre
9/2/1 (V/v/U) als Fließmittelsystem, praktische Unlöslichkeit in Wasser, Chloroform,
Benzol und Petroläther und Löslichkeit in Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Tetrahydrofuran,
Dioxan und Aceton, ein optisches Drehungsvermögen[317 von + 23,70 -1 sowie IR-Absorptionen
bei 3200 cm (-OH), 1650 cm (,ß ungesätt. C=O), 1610 cm t ( DC = CA ) und 1580, 1510
sowie 1450 cm 1 (aromat. System).
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Man kennt zwar bereits Extrakte aus der Frucht und den Wurzeln oder
auch Blättern der Phytolacca americana L., die zur Familie der Phytolaccaceae gehört
(Heinz A. Hoppe, Drogenkunde, Seite 830; Freise, Hager, Jaretzky, Merck-Index; Schindler).
So wurden als Inhaltsstoffe Caryophyllen erhalten. Die Frucht wird als schwarz-roter
Farbstoff zum Färben von Wein sowie in der Homöopathie, als Rheuma- und Grippe-Mittel
sowie gegen juckende Hauterkrankungen verwendet (Heinz A. Hoppe, Drogenkunde, Seite
830). Nach R. Benigni, C. Capra und P.E. Cattorini, Piante Medicinale, Messagerie
Italiane 1962, Vol.I, Seite 609, sowie nach J. Balansard und P. Bernard, Med. Tropicale
8, 207 (1948) und nach J. Balaasard, Ann.Pharm. Franç.9, 638 (1951) werden die Inhaltsstoffe
als Saponine angegeben. Danach wird auch für die Extrakte eine emetische und nach
höherer Dosierung abführende Wirkung angegeben. Bislang wurde jedoch keinerlei hepatotherapeutische
Wirkung festgestellt oder angegeben.
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Das neue antihepatotoxische Isolierungsprodukt wird erfindungsgemäß
dadurch erhalten, daß man fein vermahlene getrocknete Früchte von Phytolacca americana
L. nach einer Behandlung mit Petroläther mit Aceton extrahiert, reinigt und in n-Butanol
auflöst, die n-Butanol-Lösung mit Wasser reinigt, eindampft, und den Rückstand in
Aceton als Elutionsmittel chromatographiert, die pharmakologisch wirksamen Fraktionen
vereinigt und eindampft und den Rückstand aus Methanol umkristallisiert.
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Vorzugsweise werden fein vermahlene, getrocknete Früchte von Phytolacca
americana L. dreimal 0,5 bis 1,5 Stunden, bevorzugt 1 Stunde, jeweils mit dem 2,5
bis 4,5-fachen, bevorzugt 3,5-fachen, ihres Gewichts an Petroläther (Siedebereich
60 - 70 C) bei 45 bis 55 OC, bevorzugt 50 C, unter starkem Rühren extrahierend behandelt.
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Das so vorbehandelte Material wird dreimal 0,5 bis 1,5 Stunden, bevorzugt
1 Stunde, jeweils mit dem 2,5 bis 4,5-fachen, bevorzugt 3,5-fachen seines Gewichts
an Aceton bei 45 bis 55 OC, bevorzugt 50 OC, unter starkem Rühren extrahiert. Der
Aceton-Extrakt wird bei 35 bis 45 C, bevorzugt 40 OC, im Vakuum bei 5 - 50, vorzugsweise
20 mbar eingedampft und der erhaltene Rückstand zweimal mit Chloroform (je 1/4 bis
1/2, bevorzugt 1/3 des ursprünglichen Gewichts der Droge) aufgerührt und filtriert.
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Der zurückbleibende Feststoff wird im Verhältnis t:10 bis 1:14, bevorzugt
1:12, in n-Butanol aufgelöst und die n-Butanol-Lösung 3 bis 5mal, bevorzugt 4mal,
mit etwa 1/3 bis 2/3, vorzugsweise mit der halben Volumenmenge Wasser ausgeschüttelt.
Die so gereinigte n-Butanol-Phase wird bei 35 bis 45 OC, vorzugsweise 40 OC, im
Vakuum bei 5 - 50, vorzugsweise 20 mbar eingedampft.
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Der Rückstand wird mit dem 0,05 bis 0,15-fachen, bevorzugt O,10-fachen
des Gewichts der ursprünglichen Droge in Aceton aufgelöst und filtriert. Die erhaltene
Aceton-Lösung wird an Sephadex LH 20 unter Verwendung von Aceton als Elutionsmittel
in einer Säule chromatographiert.
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Die pharmakologisch wirksamen Fraktionen (analytisch ermittelt z.
B. durch D.C.) werden vereinigt und bei 35 bis 45 OC, bevorzugt 40 OC, im Vakuum
bei 5 - 50, vorzugsweise 20 mbar eingedampft. Der resultierende Rückstand wird aus
Methanol umOristallisiert.
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Die gewählte Verfahrensweise hat folgende Vorteile: 1. Durch die Entfettung
mit Petroläther (die nur Fette entfernt) kann bei der Chloroform-Behandlung eine
effektivere Abtrennung weiterer lipophiler Begleitstoffe erreicht werden.
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2. Man erreicht eine effektive aber s c h o n e n d e vollständige
Extraktion, da Aceton den Wirkstoff am besten aus der Droge herauslöst.
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3. Die Behandlung mit Chloroform führt zur Abtrennung lipophiler Begleitstoffe
(Abtrennung von Terpenoiden).
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4. Bei der n-Butanol/Wasser flüssig-flüssig-Extraktion im Verhältnis
2:1 erhält man eine Abtrennung hydrophiler Begleitstoffe - vor allem Zucker -, die
in der Wasserphase verbleiben.
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5. Die Chromatographie des angereicherten Extrakts über Sephadex LH
20 (Dextrangel) führt zu einem besonders reinen Produkt. Das Sorptionsmittel kann
nach jeder Chromatographie durch Auswaschen mit Aceton und Methanol regeneriert
werden und ist damit für einen weiteren Chromatographievorgang einsatzbereit.
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6. Die Droge kann, wie sie vorliegt, eingesetzt werden, d. h. ohne
Fruchtfleisch und Samen zu trennen.
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Als Produkt erhält man einen hellgelben mikrokristallinen Feststoff
mit den vorgenannten Eigenschaften.
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Bei der chemischen Analyse wurde eine Verbindung im Isolierungsprodukt
der Strukturformel
ermittelt.
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Diese Verbindung wurde mit der Bezeichnung nAmericanin" versehen.
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Das Isolierungsprodukt kann auf übliche Weise in seine physiologisch
verträglichen Salze überführt werden. Zur Salzbildung geeignete schwach-basische
Agenzien sind beispielsweise Alkali- und Alkalihydrogencarbonate und Amine wie Triäthanolamin,
Trimethylamin, Triäthylamin, Aminozucker usw..
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Das obengenannte Produkt kann sowohl als Rohextrakt als auch als kristaIlines
Produkt für medizinische Zwecke als Lebertherapeutikum verwendet werden. Es kann
in verschiedenen pharmazeutischen Formen wie Tabletten, Kapseln, Granulaten, Dragees,
Zäpfchen oder als flüssiges Präparat oral, anal oder parenteral zur Anwendung kommen.
Die Humandosis liegt bei 200 - 450 mg/Tag, je nach Schwere des Falles.
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Bei dem beschriebenen Isolierungsprodukt aus den Früchten der Phytolacca
americana L. sowie dessen Salzen wurde überraschenderweise schon bei den ersten
tierexperimentellen Untersuchungen eine ausgeprägte Schutzwirkung gegen leberschädigende
Einflüsse gefunden. Es entfaltet einen besonders starken protektiven und stabilisierenden
Effekt auf die zellulären und intrazellulären Biomembranen, insbesondere auf die
Leberzellen, d. h. eine starke Leberschutzwirkung und kann daher beispielsweise
bei der Behandlung von Lebererkrankungen Verwendung finden.
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Zum Nachweis der antihepatotoxischen Wirksamkeit des erfindungsgemäßen
Produkts wurden weibliche Mäuse mit dem Lebergift Phalloidin (3 mg/kg; i.p.) geschädigt
(Kontrolltiere) und die Testtiere zusätzlich mit dem erfindungsgemäßen Isolierungsprodukt
behandelt.
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Das Isolierungsprodukt wurde in DMSO + Polyäthylenglykol (1:1) gelöst
i.v. verabreicht, und zwar in Dosen von 50 bzw. 100 mg/kg eine Stunde vor der Phalloidin-Injektion.
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Eraebnia: Von den mit Phalloidin vergifteten Mäusen starben 85 %,
während die Todesrate durch Behandlung mit 50 bzw. 100 mg/kg Isolierungsprodukt
auf 60 ffi bzw. 30 ffi gesenkt werden konnte (Beobachtungszeitraum: 7 Tage; Anzahl':
20 Tiere je Gruppe).
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Die Toxizität (i.v.) des erfindungsgemäßen Produkts wurde bei männlichen
bzw. weiblichen Mäusen geprüft. Dabei wurden Werte von 820 mg/kg (für männliche
Mäuse) bzw. 800 mg/kg (für weibliche Mäuse) gefunden.
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Nachfolgend wird die Herstellung des erfindungsgemäßen Produkts an
Hand eines erläuternden Beispiels beschrieben:
Beispiel 100 kg
fein vermahlene, getrocknete Früchte von Phytolacca americana L. werden mit Hilfe
eines Ultra-Turrax-Gerätes dreimal je 1 Std. lang mit 400 1 Petroläther (Siedebereich
60 - 70 OC) bei 50 OC extrahiert. Die so vorbehandelte Droge wird dann dreimal einer
1-stündigen Turrax-Extraktion mit je 400 1 Aceton bei 50 0 unterworfen. Die vereinigten
° Aceton-Extrakte werden bei 40 0 im Vakuum eingedampft. Der erhaltene Rückstand
wird anschließend zweimal mit je 30 1 Chloroform ausgerührt. Die Mischung wird filtriert
und der zurückbleibende Feststoff im Verhältnis 1:12 in n-Butanol gelöst. Die n-Butanol-Lösung
wird viermal mit der halben Volumenmenge Wasser ausgeschüttelt. Danach wird die
Butanol-Phase bei 40 0 im Vakuum eingedampft und der Rückstand in 10 1 Aceton gelöst.
Nach Abtrennung der nicht gelösten Anteile wird die Lösung über Sephadex LE 20 unter
Verwendung von Aceton als Elutionsmittel in einer Säule chromatographiert.
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Die den Wirkstoff enthaltenden Fraktionen werden vereinigt ° und bei
40 0 im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Methanol umkristallisiert.
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Als Endprodukt wird eine Substanz mit folgenden chemischen und physikalischen
Parametern erhalten: Aussehen: hellgelber mikrokristalliner Feststoff Löslichkeit:
löslich in Dimethylsulfoxid, Dixethylformamid, Tetrahydrofuran, Dioxan und Aceton,
gering löslich in Methanol, Äthanol und Butanol, praktisch unlöslich in Wasser,
Chloroform, Benzol und Petroläther Schmelzpunkt: 246 - 7 oC (Zersetzung)
Summenformel:
C18H1606 C18H16O6 Molmasse: 328 Elementaranalyse: C 64,98 (ber. 65,85) H 4,98 (ber.
4,91) 0 28,3 (ber. 29,24) Dünnschichtchromatographie: Kieselgel-Fertigplatten (Merck)
Fließmittel: Chloroform, Aceton, Ameisensäure 9/2/1 (V/v/v) Entwicklung: unter Kammersättigung
Detektion: Sprühreagens 2,4-Dinitrophenylhydrazin/Schwefelsäure (i g 2,4-Dinitrophenylhydrazin
in 2 ml konz. Schwefelsäure aufgeschlämmt und mit Methanol auf 100 ml aufgefüllt)
Nach dem Besprühen der Platte wird 20 Minuten auf 120 °C erwärmt. Die Substanz erscheint
als intensiv gelbe Zone auf hellgelbem Grund.
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Rf-Wert: 0,17 Das, IR-Spektrnm und Massenspektrum wird in den angefügten
Figuren 1 und 2 wiedergegeben.
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Galenische Beispiele-Herstellung von Tabletten: 70 kg des erfindungsgemäßen
Wirkstoffes werden mit folgenden Hilfsstoffen gemischt: 10,000 kg Polyvinylpyrrolidon
14,l^00 kg Mikrokristalline Zellulose 17,400 kg Amylum tritici 6,500 kg Aerosil
10,000 kg Stearinsäure 371,700 kg Laktose DIN 80 Anschließend werden Tabletten von
0,50 g (70 mg Wirkstoff enthaltend) gepreßt.
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Herstellung von injizierbaren Präparaten (Ampullen): Zur Herstellung
von 10.000 Ampullen werden 1,5945 kg Methylglucaminsalz des erfindungsgemäßen Wirkstoffes
in 48,6 Liter physiologischer Kochsalzlösung, der 4 % Polyvinylpyrrolidon (M.G.10.000)
zugesetzt werden gelöst. Der pH-Wert soll 7,6 nicht unterschreiten. Die Lösung wird
sterilfiltriert und in sterile braune 5 ml-Ampullen eingefüllt, so daß der Inhalt
pro Ampulle 159,45 mg N-Methylglucaminsalz entsprechend 100 mg des erfindungsgemäßen
Wirkstoffes beträgt.
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Herstellung von Zäefohen: 318,9 g des Methylglucaminsalzes des'erfindungsgemäßen
Wirkstoffes werden mit 500 g geschmolzenem Hautfett DAB 7 angerieben. Unter Rühren
werden 1.181,1 g geschmolzenes Hartfett DAB 7 hinzugegeben und aus der Masse Zäpfchen
gegossen. Jedes Zäpfchen zu 2,0 g enthält 318,9 mg Methylglucaminsalz, entsprechend
200 mg des erfindungsgemäßen Wirkstoffes.
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