DE2835979A1

DE2835979A1 - Verfahren zum durchfuehren enzymatischer umwandlungen

Info

Publication number: DE2835979A1
Application number: DE19782835979
Authority: DE
Inventors: Petrus Franciscus Alp Hendriks
Original assignee: Stamicarbon BV
Current assignee: Stamicarbon BV
Priority date: 1977-08-19
Filing date: 1978-08-17
Publication date: 1979-03-01
Also published as: IT1107204B; DE2835979C2; FR2400386A1; JPS5444088A; GB2003048A; JPS6250113B2; CA1117043A; CH646195A5; BE869496A; IT7850790A0; NL7709179A; GB2003048B; DK344378A; FR2400386B1; US4209591A

Description

,T 2835373

Kennzeichen 2918 /?

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. E. Assmann - Dr. R. Koenigsberger blpl.-Phya.-R. Holzbauer - Dipl.-Ing. F. Klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.

PATENTANWÄLTE

800O München 2 · BräuhausstraBe 4 · Te.efon Sammel-Nr. 225341 ■ Telegram™_; Zumpet · Telex 5=9979

Stamicarbon B.V. Geleen, Niederlande Verfahren zum Durchführen enzymatischer Umwandlungen

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Durchführen einer chemischen Umwandlung, indem ein Substrat in der Flüssigphase mit einem immobilisierten. Enzym in Berührung gebracht wird.

Es ist bekannt, eine organische oder eine anorganische Verbindung dadurch in eine oder mehrere Verbindungen umzuwandeln, dass eine Losung des Substrats mit einem immobilisierten Enzym oder einem Gemisch aus Enzymen in Berührung gebracht wird. Unter chemischer Umwandlung wird hier jede Veränderung des Molekülgefüges einer organischen oder einer anorganischen Verbindung verstanden, z.B. durch Hydrolyse, Oxydation, Reduzierung, Isomerisation oder Racemisierung. Enzyme können durch eine physikalische oder eine chemische Bindung an ein organisches oder ein anorganisches Material oder indem das Enzym oder das Zellenmaterial mit enzymatischer Aktivität verknüpft wird, auf Wunsch in Anwesenheit eines Füllstoffes, immobilisiert werden. In technischem .Massstab wird so Glukose mit Hilfe einer immobilisierten Glukoseisomerase in ein Gemisch aus Glukose und Fruktose umgewandelt und werden N-acetyl-L-aminosäuren mit Hilfe einer immobilisierten Aminoacylase deacyliert. Dabei ist üblich, die Lösung des Substrats durch ein festes oder ein fluidisiertes Bett aus teilchenförmigen! immobilisiertem Enzym zu leiten. Wegen des Verlustes der enzymatischen Aktivität wird die

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Füllung der Säule periodisch erneuert. Aus verfahrenswirtschaftlichen Gründen ist es in nahezu allen Fällen üblich, das immobilisierte Enzympräparat zu ersetzen, sobald dessen Aktivität auf einen gewissen Probentsatz zurückgegangen ist, meistens 20 bis 25% von der ursprünglichen Aktivität, sowohl bei diskontinuierlicher Ausführung in nur einer Säule als auch bei halbkontinuierlicher Ausführung in mehreren seriengeschalteten Säulen. Der Nachteil bei diesem Verfahren ist, dass die Restaktivität der Enzympräparate nicht benutzt wird. Ein festes Bett has ferner den Nachteil, dass der Druckaufbau eines solchen Bettes durch Klumpenbildung und durch Schwellung der Enzymteilchen gross ist. Ferner kann auch Kanalbildung eintreten. Man hat jetzt nach einem Verfahren gesucht, bei dem die enzymatische Aktivität der Enzympräparate ganz oder nahezu ganz benutzt werden kann. Der Zweck is auch, die Umwandlung des Substrats möglichst vollständig verlaufen zu lassen.

Erfindungsgemäss führt man die chemische Umwandlung einer Verbindung aus, indem eine wässrige Lösung des Substrats mit teilchenförmigen! immobilisiertem Enzym derart in Berührung gebracht wird, dass die Substratlösung kontinuierlich durch eine Reihe seriengeschalteter, voneinander getrennter Wirbelbetten aus teilchenförmigen! immobilisiertem Enzym geleitet wird, wobei die Enzymteilchen diskontinuierlich entgegen der Strömungsrichtung der Substratlösung von einem Wirbelbett einem nächstgelegenen Wirbelbett zugeführt werden.

Vorteile des erfindungsgemässen Verfahrens sind, dass es sich einfach kontinuierlich durchführen lässt, dass das Enzympräparat erst weggeworfen wird, wenn die Aktivität auf einen geringen Prozentsatz von der ursprünglichen Aktivität zurückgegangen ist, dass die Druckunterschiede in der Säule durch den Einsatz eines Wirbelbettes niedrig sind und dass der Umwandlungsgrad des Substrats sehr hoch sein kann, auch bei Verwendung verdünnter Substratlösungen. Ein weiterer Vorteil ist, dass, wenn auch der gleiche Teil von der enzymatischen Aktivität gebraucht würde wie bei den bekannten Verfahren, bei dem erfindungsgemässen Verfahren die mit dem Erneuern des Enzyms verbundenen Kosten und Zeit niedriger sind als bei einer Reaktorreihe.

Vorzugsweise führt man das Verfahren in einem flüssigkeitsgefüllten Säulenreaktor durch, der durch waagerechte, die Substratlösung durchlässige Abscheidungen in mehrere übereinanderliegende Kammer verteilt ist, die je ein Wirbelbett aus teilchenförmigen! immobilisiertem Enzym enthalten. Der Reaktor ist mit Mitteln ausgerüstet, durch die Enzym von

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einer Kammer entgegen der Strömungsrichtung d3r Substratlösung zur gelegenen Kammer geleitet werden kann. Ein solcher Sä'ulenreaktor is kompakt und lässt sich leicht konstruieren und betreiben.

Das erfindungsgemässe Verfahren weist ausser der bereits genannten besseren Benutzung des Enzyms und der nahezu vollständigen Umwandlung des Substrats weitere Vorteile auf. So lässt sich die Säule bei gleichbleibender Zufuhrgeschwindigkeit der Substratlösung betreiben und ist es nicht erforderlich, wie bei einer Reaktion in einem festen Bett, einen Rückgang in der Aktivität des EnzymprMparats durch Erniedrigung der zugeführten Substratmenge auszugleichen. Bei Umwandlungen, bei denen ein gasförmiges Reaktionsmittel benutzt wird, zum Beispiel Luft bei oxidativen Umwandlungen, kann die Luft unten in die Säule eingeführt werden. Durch die vielen Siebbleche oder Roste wird das Gas jedesmal wieder aufs neue verteilt und tritt keine Bildung von Kanälen und grossen Gasblasen auf. Wenn eine oder mehrere Kammern noch Reaktionsmittel oder Hilfsstoffe zugeführt werden, können die Reaktionsbedingungen genauestens geregelt werden. Wenn zum Beispiel bei der Umwandlung eine Base oder eine Säure frei wird, kann dennoch durch Zusetzen einer Säure, einer Base oder eines Puffers an einer oder mehreren Stellen an der Säule ein optimaler pH-Wert aufrechterhalten werden. Wenn das Substrat selbst aktivierend arbeitet, wird dieser Effekt völlig benutzt, weil die Substratkonzentration in denjenigen Teilen des Reaktors am höchsten ist, wo die enzymatische Aktivität des Enzympräparats am meisten zurückgegangen ist. Umgekehrt gilt, dass eine etwaige Bremsung durch die Umwandlungsprodukte oder die Nebenprodukte relativ weniger stört, weil die Konzentration der'Bremsstoffe dort am höchsten ist, wo auch die Aktivität des Enzympräparats am .höchsten ist. Ferner weist das Verfahren noch die dem Gebrauch eines fluidisierten Bettes inhärenten Vorteile auf, wie eine bessere Temperaturbeherrschung, eine gute Stoffübertragung und eine geringere Empfindlichkeit gegen Infektionen und bakterielles Wachstum.

Das Verfahren ist insbesondere zum Durchführen von Reaktionen geeignet, bei denen man ganz oder teilweise im sogenannten Michaelis-Bereich arbeitet.· In diesem Bereich ist die Umwandlungsgeschwindigkeit nicht nur von der vorhandenen enzymatischen Aktivität, sondern auch von der Substratkonzentration abhängig. Oben in der Säule ist die Substratkonzentration niedrig, jedoch die Aktivität des immobilisierten Enzympräparats hoch, so dass sich doch eine befriedigende Umwandlungsgeschwindigkeit erreichen lässt. Dadurch kann das Verfahren für Umwandlungen mit einem Enzym angewandt werden, das eine niedrige Michaelis-Konstante hat, und fOr Umwandlungen, die möglichst vollständig verlaufen sollen. Beispiele"sind die Behandlung von Abwasser, aus dem zum Beispiel mit Phenoloxidase Phenol oder

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mit Urease Harnstoff entfernt wird, die Behandlung von optisch aktiven Substraten, wie die selektive Hydrolyse von L-Phenylglycinamid in Anwesenheit von D-Phenylglycinamid mit Aminosäureamiddeamidase und die Umwandlung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillinsäure mit Penicillinamidase. Der Vorteil der Erfindung geht deutlich aus der Tatsache hervor,dass sich der Harnstoffgehalt in einem Abwasserstrom auf weniger als IO ppm verringern lässt.

Das erfindungsgemässe Verfahren hat ferner den Vorteil, dass die benötigte Apparatur einfacher zu konstruieren und zu betreiben ist. Bei den bekannten Verfahren konnten höchstens fünf seriengeechaltete Reaktoren benutzt werden. Bei diesem System wird periodisch der Reaktor, der am längsten in Betrieb gewesen ist, ausser Betrieb genommen, entleert, mit Frischenzym gefüllt und wieder als letzter in der Reihe in Betrieb genommen. Die Substratlösung wird jedesmal an einen anderen Reaktor angeschlossen. Wegen der Kosten und des Druckfalls im System ist eine grössere Anzahl von Reaktoren kaum möglich. Bei der Erfindung können ohne Bedenken zehn oder mehr seriengeschaltete fluidisierte Betten benutzt werden, so dass ein besserer Gebrauch des Enzyms und eine vollständigere Substratumwandlung möglich sind.

Man kann teilchenförmiges immobilisiertes Enzym mit einem spezifischen Gewicht unter dem der Substratlösung verwenden. In dem Fall wird die Substratlösung oben in die Säule eingeleitet und unten aus ihr abgeleitet, während das frische immobilisierte Enzym die niedrigstgelegene Kammer der Säule zugeführt wird. Ein solches immobilisiertes Enzym kann dadurch bekommen werden, dass freies Enzym in Abwesenheit von Füllmitteln durch Verknüpfung immobilisiert wird oder dass bei der Immobilisierung ein Füllmittel oder ein Träger mit niedrigem spezifischem Gewicht verwendet wird. Die Fluidisierung kommt in diesen Fall durch die Neigung der Enzymteilchen, in der Flüssigr keit aufzusteigen, und durch die entgegengesetzte nach unten gerichtete Kraft der durchströmenden Substratlösung zustande.

Vorzugsweigse benutzt man aber teilchenförmiges immobilisiertes Enzym mit einem spezifischen Gewicht über dem der Substratlösung. In dem Fall wird die Substratlösung aufwärts durch die Säule geleitec und wird Frischenzym in die oberste Kammer des Reaktors eingeleitet und von dort aus über die Reihe untenliegende Kammern nach unten geleitet, wobei das Enzym in jeder Kammer einen Teil seiner Aktivität verliert. Diese Ausführungsform wird nachstehend im einzelnen besprochen werden. Sie wird bevorzugt, weil sie an die für Wirbelbetten entwickelten technologischen Kenntnisse anschliesst und mehr Variationen in den Typen des zu benutzenden teilchenförmigen immobilisierten Enzyms erlaubt.

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Der Transport von Enzymteilchen von einer Kammer zur untenliegenden Kammer lässt sich auf mehrere Weisen verwirklichen. Man kann z.B. Überlauf rohe anbringen, die die Scheidewand zwischen den zwei Kammern durchbohren und jeweils zwei Kammern verbinden. Das Überlaufrohr mündet an der Oberseite in geringem Abstand über der Scheidewand aus. Der Abstand zwischen dieser Ausmündung und der Scheidewand ist die maximale Höhe des Wirbelbettes. Wenn die oberste Kammer frische Enzymteilchen zugeführt werden, steigt die Höhe des flüidisierten Bettes und läuft das Übermass über das Überlaufrohr in die untenliegende Kammer ab und verursacht dort wieder eine Verlagerung von Enzymteilchen zu einer noch niedriger gelegenen Kammer. Aus der niedrigstgelegenen Kammer werden Enzymteilchen abgeführt, die ihre Aktivität inzwischen ganz oder meistenteils verloren haben. Die Scheidewand zwischen den Kammern lässt bei dieser Ausführungsform unter normalen Bedingungen lediglich die Substratlösung durch. As Scheidewand kann eine Siebplatte oder ein Drahtgeflecht verwendet werden. Dit Uberlaufrohre können auch ausserhalb der Säule angeordnet sein, mit Ausmündungen in der Säulenwand. Das Überlaufrohr mündet an der Untenseite in das fluidisiert^ Bett aus. Die Rohre werden versetzt zueinander angebracht. Ein solcher Säulenreaktor lässt sich einfach konstruieren und betreiben. Ein geringer Nachteil ist, dass die Strömungsgeschwindigkeit der Substratlösung gut geregelt werden muss. Bei Spitzenwerten der Strömungsgeschwindigkeit könnte sonst das fluidisiert^ Bett zu stark expandieren, wodurch über das Überlaufrohr vorzeitig Enzympräparat in die untenliegende Kammer strömen würde. Bevorzugterweise wird die Strömungsgeschwindigkeit so geregelt dass im normalem Betrieb die Höhe des Bettes sich etwas unter der Oberseite des Überlaufsrohrs befindet. Kurz bevor frisches Enzym zugeführt wird kann die Strömungsgeschwindigkeit etwas erhöht werden so dass das Wirbelbett bis zur Ausmündung des Überlaufrohrs reicht.

Der Transport von Enzymteilchen lässt sich auch dadurch verwirklichen, dass jeder Kammer mit einer Leitung versehen wird, durch die Enzymteilchen mit Hilfe einer Pumpe, u.U. über ein Puffergefäss, in die untenliegende Kammer abgeführt werden können. Man kann so verfahren, dass zuerst das Enzym aus der niedrigstgelegenen Kammer abgeführt wird. Danach wird das Enzym aus der zweitniedrigsten Kammer gepumpt, und zwar in Form eines Breis, der nach Wunsch über ein Puffergefäss, zu der niedrigstgelegenen Kammer übergeführt wird. Bei dieser Ausführungsform ist die Stromungsgeschwindigkeit der Substratlösung viel weniger kritisch. Die grössere Investition für Leitungen und eine Pumpe wiegt in den meisten Fällen die höhere Betriebssicherheit auf.

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Der Transport von Enzymteilchen lässt sich auch dadurch verwirklichen, dass als Scheidewand zwischen den Kammern Siebplatten oder funtionell gleichwertige Mittel angeordnet werden, die bei einer Flüssigkeitsströmungsgeschwindigkeit über einem gewissen Schwellenwert kein Enzympräparat durchlassen, aber bei einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen der minimalen Fluidisatioiisgeschwindigkeit und diesem Schwellenwert wohl Enzympräparat zur untenliegenden Zone durchlassen. Eine solche Scheidewand kann aus einer Platte mit angrenzenden abgestumpften kegelförmigen Vertiefungen bestehen, die an der Unterseite offen sind. In dem Fall wird die Flüssigkeitszufuhr periodisch verringert, wobei die Enzymteilchen zur niedriger gelegenen Zone sinken und ausgearbeitete Enzymteilchen unten aus der Säule abgeführt und eine gleiche Menge frische Enzymteilchen oben in der Kolonne zugeführt werden. Es dürfte klar sein, dass noch weitere Ausführungsformen für den Transport der Enzymteilchen möglich sind. Die oben beschriebenen Verfahren, und insbesondere die ersten zwei, werden wegen ihrer Einfachheit und ihrer Betriebssicherheit bevorzugt.

Die Reaktionsbedingungen v/erden vorzugsweise so gewählt, dass die Restaktivität des aus dem Reaktor abgeführten Enzyms höchstens 15% von der Anfangsaktivität ist und vorzugsweise niedriger ist als 5% von der Anfangsaktivität. Es kann vorteilhaft sein, dass, wie nachstehend noch beschrieben werden wird, sogar eine oder mehrere Kammern ganz desaktiviertes Enzym enthalten. Es gibt jedoch Fälle in denen es ganz verantwortet ist Enzym mit einer höheren Restaktivität, z.B. zwischen 15 und 20%, abzuführen.

Der Reaktor enthält mindestens drei, vorzugsweise jedoch mindestens fünf Kammern. Auf grund praktischer Erwägungen setzt man vorzugsweise einen Reaktor mit 5 bis 20 Kammern ein. Die Kammern und die fluidisierten Betten in ihnen brauchen nicht alle dasselbe Volumen zu besitzen.

Die mittlere Verweilzeit des teilchenförmigen immobilisierten Enzyms im Reaktor ist stark von dem Enzymtyp, dem Substrat und die Reaktionsbedingungen abhängig. Im allgemeinen wird sie zwischen etwa einer Woche und mehreren Monaten liegen. Die mittlere Verweilzeit des Substrats im Reaktor hängt unter anderm von dem Substrattyp, dem Enzymtyp, der Substratkonzentration und dem gewünschten Umwandlungsgrad ab. Im allgemeinen liegt sie zwischen 0,5 und 120 Minuten, in den meisten Fällen zwischen 5 und 30 Minuten.

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Das umzuwandelnde Substrat wird in Form einer, vorzugsweise

wässrigen, Lösung zugeführt, die ferner weitere Reaktionsmittel, den pH-Wert regelnde Mittel, Aktivatoren, Mittel zum Binden störender Verunreinigungen und etwaigenfalls inerte Verbindungen enthalten kann. Ggf. lässt sich auch eine Emulsion verwenden. Die Substratlösung kann u.U. vorbehandelt sein, zum Beispiel durch Entgasung, Sterilisation, Behandlung mit Aktivkohle usw. Die Substratlösung kommt zuerst mit Enzympräparat in Berührung, das seine enzymatische Aktivität ganz oder grossenteils verloren hat. Die Substratlösung kann Verunreinigungen, zum Beispiel Schwermetalle, enthalten, die das Enzym desaktivieren, indem sie sich physikalisch oder chemisch mit dem Enzym binden.. In dem Fall ist es von Vorteil, eine erste Zone einzusetzen, die viele Enzymteilchen enthält, dass sich hier die Verunreinugtingen ganz oder grossenteils mit den Enzymteilchen binden, die alsdann aus dem System abgeführt werden. Die Konzentration des Substrats in der Lösung kann innerhalb weiter Grenzen schwanken, eine Voraussetzung ist nur, dass die Lösung noch eine gute Fluidisation verwirklichen kann. Wenn die Umwandlungsstufe Teil einer synthetischen Strasse ist, kann die Substratkonzentration zum Beispiel 40 Gewichts-% oder mehr sein, in den meisten-Fällen jedoch zwischen 5 und 30 Gewichts-%, u.a. in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Substrats. Dient die Umwandlung aber der Entfernung von Verunreinigungen, ist die Konzentration meistens viel niedriger, zwischen 0,01 und 1 Gewichts-%. Die. Geschwindigkeit, mit der die Substratlösung durch die Säule geführt wird, hängt hauptsächlich von dem Fluidisationsverhalten der Enzymteilchen und von der Reaktoranordnung ab. Die optimale Strömungsgeschwindigkeit kann anhand theoretischer Berechnungen und Versuche bestimmt werden. In den meisten Fällen kann eine Strömungsgeschwindigkeit zwischen 0,005 und 0,20 m/s angewandt werden.

Die zu benutzenden teilchenförmigen Enzympräparate können auf verschiedene Weisen hergestellt sein. Im allgemeinen werden Präparate aus teilchenförmigen! organischem oder anorganischem Trägermaterial bevorzugt, an das das Enzym oder enzymhaltige Zellen oder Zellenreste unmittelbar oder über ein Kupplungsmittel chemisch gebunden sind, sowie durch Vernetzung von Enzymen oder Zellenmaterien erhaltene Präparate, wohl oder nicht in Anwesenheit eines Füllmittels. Man kann aber auch zum Beispiel Präparate verwenden, die durch Präzipitierung von Enzymen oder Zellenmaterial mit einen Flockulierungsmittel erhalten sind, oder durch Einkapselung von Enzymen oder Zellenmaterial in eine organische Polymerisatform oder durch Bindung von Enzymen oder Zellenmaterial an ein ggf. vernetztes Polymerisat erhaltene Präparate.

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Als Trägermaterial oder Füllstoff kommen besonders Glas, Sand, Silica, Kohlenstoff, Aluminium, Zirkonoxid, Titanoxid und Metalle, wie Nickel, in Betracht. Der Träger oder Füllstoff kann vorbehandelt sein, damit eine bessere Bindung gewährleistet ist. Als Kupplungsmittel kommen besonders polyfunktionelle Verbindungen, wie Glutaraldehyd, Silane, Polyisocyanate, Azide, Polycarbonsäuren und deren Anhydride in Betracht.

Die Abmessungen, die Form und das spezifische Gewicht der Enzympräparatteilchen werden so gewählt, dass sie sich leicht fluidiseren lassen und unter Betriebsbedingungen keine oder nahezu keine Trennung in Fraktionen zu ersehen geben. Bekanntlich gibt ®s eine Beziehung zwischen dem Durchmesser und der Form der Teilchen, ihrem spezifischen Gewicht un der Strömungsgeschwindigkeit in einem fluidisiertem Bett in der Flüssigphase. Wo möglich, wird man die Abmessung und die Form der Teilchen so wählen, dass die Bettexpansion bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 bis 5 cm/sec etwa 2 ist. Das spezifische Gewicht der Teilchen hängt von der Menge und der Art des Füllstoffs ab. Andere Bedingungen sind jedoch durchaus möglich.

Bei dem erfindungsgema'ssen Verfahren können alle Enzyme benutzt werden, die in immobilisierter Form eine ausreichend grosse enzymatische Aktivität aufweisen. So können Enzyme verwendet werden, die zu den Klassen der Hydrolasen, der Oxidasen, der Isomerasen, der Ligasen und der Transferasen gehören. Beispiele sind Aminosäureacylase, Aminosäureamidase, Peptidase, Urease, Phenoloxidase, Inulase, Laktase, Asparaginase, Fumarase, Glukoseoxidase, Penicillinamidase, Hydantoinase, Trypsin, Papain, Chymotrypsin, Aminopeptidase. Es ist möglich, eine Mischung aus Enzymen zu verwenden statt eines einzigen Enzyms. Auch kann man der Säule an einer zwischen der Zufuhr und der Abfuhr von Enzymen gelegenen Stelle noch eine zusätzliche Menge ' teilchenförmiges immobilisiertes Enzym beigeben. Dieses Enzym kan ein anderes sein als das oben der Säule zugeführte Enzym.

Die Temperatur, bei der die Umwandlung stattfindet, kann innerhalb des Bereichs gewählt werden, der von dem Schmelzpunkt der Substratlösung und der Temperatur bestimmt wird, bei der das Enzym desaktiviert wird, im allgemeinen zwischen 0 °C und 80 ⁰C, mehr insbesondere zwischen 20 °C und 60 °C. Die zu wählende Temperatur hängt selbstredend hauptsächlich von dem benutzten Enzym ab.

Der Druck, bei dem die Umwandlung erfolgt, ist unwichtig. In den meisten fällen wird man bei etwa atmosphärischem Druck arbeiten. Wenn bei der Umwandlung gasförmige Reaktionsmittel verwendet werden oder gasförmige Produkte anfallen, kann es vorteilhaft sein, einen höheren Reaktionsdruck anzuwenden, um die gasförmigen Verbindungen in der wässrigen Phase gelöst

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zu halten. Beim Abbau von Harnstoff mit immobilisierter Urease kann zum Beispiel ein Druck zwischen 5 und 10 Bar angewandt werden, um Ammoniak und Kohlendioxid in Lösung zu halten. Die Anwesenheit gasförmiger Reaktionsmittel und Reaktionsprodukte muss jedoch nicht störend sein, so dass man auch einen niedrigeren Druck anwenden kann. In dem Fall ist an der Oberseite der Säule ein Gas-Flüssigkeitsabscheider mit einer Gasabfuhr anzubringen.

Der pH-Wert, bei dem die Umwandlung durchgeführt wird, wählt man so, dass die enzymatische Aktivität des immobilisierten Enzyms optimal ist. In den meisten Fällen wird es sich um einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 handeln. Gewisse Enzyme lassen sich jedoch auch bei einem viel niedrigeren pH-Wert, zum Beispiel zwischen 3,5 and 5, oder einem höheren pH-Wert, zum Beispiel zwischen 8,5 und 10,5 verwenden.

Das Verfahren wird anhand der Figur 1 erläutert. Ein säulenförmiger Reaktor (1) ist an der Unterseite mit einer Zufuhr (2) für Substratlösung und an der Oberseite mit einer Abfuhr (3) für die Lösung des umgewandelten Produkts versehen. Ferner enthält er oben eine Zufuhr (4) für immobilisiertes teilchenförmiges Enzym in Trockenform oder in Form einer wässrigen Suspension. Der Reaktor is durch waagerechte Siebplatten (5, 5 , 5^ usw. ) in Kammern verteilt, die je ein fluidisiertes Bett (6, 6 , 6 usw.) aus Enzym-

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teilchen enthalten. Die Kammern sind durch Überlauf rohre (7, 7 · ' usw.) miteinander verbunden. Das Überlauf rohr (8) von'der niedrigsten Kammer aus mündet in die Abfuhrleitung (9) mit Absperrhahn (10) für das abgearbeitetes Enzym. Unter Betriebsverhältnissen ist die Säule ganz mit Flüssigkeit gefüllt und wird die Substratlösung von unten nach oben durch die Säule geleitet. Die Wirbelbetten reichen normalerweise nicht ganz zur Mündung der Überlaufsrohren. In gewissen Zeitabständen wird frisches Enzym aus einem nicht eingezeichneten Vorratsbehälter über Hahn 11 und Leitung 4 in einer gewissen Menge in die oberste Kammer eingespeist. Dies verursacht einen Transport von Enzym nach unten durch die Säule und eine Abführ von Enzym über den Überlauf 8, Leitung 9 und Hahn 10. Die Abfuhr 3 kann mit einem Gas-Flüssigkeitsscheider 12 versehen sein. Falls die Anwesenheit von Enzym im Produktstrom ganz unzulässig ist kann die Abfuhr 3 auf einem Filter angeschlossen werden zwecks Entfernung von sehr feinen Teilchen welche möglicherweise von des Flüssigkeit mitgerissen sein könnten.

Eine weitere Auführungsform wird anhand der Figur 2 erläutert. Der säulenförmige Reaktor 1 ist mit Siebplatten 2 versehen, die ihn in Kammern (a, b, c, d, e) verteilen. Ferner ist er mit einer Zufuhr 3 für die Substratlösung, einer Abfuhr 4 für die Prozessflüssigkeit, die das umgewandelte

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Substrat enthält, und einer Zufuhr 5 für frisches teilchenförmiges Enzym versehen. Jeder Schuss enthält eine Leitung 6, die in eine gemeinsame Leitung 7 ausmündet, die wiederum in einen Lagerbehälter 8 einführt. Der Behälter 8 enthält an. der Oberseite eine Flüssigkeitsabfuhrleitung 9, die an der Saugseite einer Pumpe 13 angeschlossen ist. Der Behälter 8 is ferner mit einer Flüssigkeitszufuhrleitung 10 versehen, die an der Druckseite der Pumpe 13 verbunden ist. Eine Leitung 11 verbindet die Leitung 4 mit der Saugseite der Pumpe 13, und eine Leitung 14 verbindet die Druckseite der Pumpe 13 mit der Leitung 3. Die Ventile 15, 15 , 15 usw. sind in den Leitungen 6, 6 , 6 usw. angebracht. Die Leitungen 9, 10, 11 bzw. 14 enthalten je ein Ventil 16, 18, 17 bizw. 19. An die Leitung 7 schliesst eine Abfuhr leitung 12 mit dem Ventil 20 an, bestimmt für die Abfuhr von Enzym. Im normalen Betriebszustand ist das ganze System mit Flüssigkeit gefüllt und sind sämtliche Ventile geschlossen. Die Substratlösung durchströmt die Säule und hält das in die Kammern £ bis £ befindliches Enzym in,f luidisiertemZustand. Beim Transport von Enzymen wird zuerst die Kammer e_ entleert. Während die Zufuhr von Substratlösung nach wie vor ungeändert bleibt, werden die Pumpe 13 angefahren und die Ventile 15, 16 und 19 geöffnet. Dadurch werden die Enzymteilchen aus der Kammer e_ in fluidisierter Form oder als Suspension über die Leitungen 6 und 7 in den Behälter 8 geführt. Der umhergepumpte Flüssigkeitsstrom ist gering, so dass sich der Zustand in die anderen Kammern kaum ändert. Die Leitung 7 mündet unten in den Behalter 8 aus, der mit einem verengten Teil versehen ist, um die Abfuhr der Teilchen zu fördern (bleibende Fluidisierung).Da der durch die Leitungen 9 und 14 verpumpte Flüssigkeitsstrom gering ist, sammeln sich die Enzymteilchen in fluidisiertem Zustand im Behälter 8 und bleiben die Leitungen 9 und 14 sowie die Pumpe 13 frei von Feststoff. Wenn alles Enzym aus der Kammer e_ entfernt ist,werden die Ventile 15, 16 und 19 geschlossen und die Ventile 17, 18 und 20 geöffnet. Die Enzymteilchen werden jetzt aus dem Behälter 8 herausgedrückt und über die Leitungen 7 und 12 abgeführt.Alsdann wird auf die oben beschriebene Weise der Inhalt der Kammer ei in den Behälter und danach in die Kammer £ geleitet. Ebenso bringt man den Inhalt der anderen Kammern in eine niedriger gelegene Kammer. Zum Schluss wird eine Beschickung frischer Enzymteilchen in die oberste Kammer gebracht. Wenn gewünscht, können die einzelnen Leitungen, Ventile und der Zwischenlagerbehälter mit Anschlüssen an einem Spülsystem mit reinem Wasser versehen werden.

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Es wird darauf hingewiesen, dass die Leitungen 6 usw. schräg in die Wirbelbetten hineinragen unter einen Winkel von z.B. 30 ° bis 80° mit der Horizontale. Dadurch bleiben sie bei geschlossenen Ventilen 15 usw. innen frei von Pestteilchen. Die verengte Unterseite des Zwischenlagerbehälters ist von Bedeutung, damit sämtliche Enzymteilchen mit Hilfe der Druckleitung wieder aus dem Behälter abgeführt werden können. Ferner ist empfehlenswert, dass vor dem Entleeren der Kammern als Fördermedium Substratlösung verwendet wird, die wiederum der Säule zurückgeführt wird, und dass zum Füllen der Kammern als Medium die austretende substratfreie Flüssigkeit benutzt wird. Es tritt also keine Kontamination auf. Die Figur zeigt der Übersichtlichkeit willen einen Reaktor mit fünf Kammern. In der Praxis wird bei dieser Ausführung ein Reaktor mit einer grösseren Anzahl von Kammern eingesetzt werden, 'zum Beispiel 10 oder mehr.

Falls die Abscheidung besteht aus einer Siebplatte mit Löcher welcher Durchschnitt grosser ist als der Durchschnitt der Enzymteilchen könnten diese Teilchen durch die Säule nach unten fallen und sich unten ansammeln wenn die Strömungsgeschwindigkeit der Substratlösung sich stark verringern würde, z.B. bei einer Störung. Um dies zu vermeiden kann man eine anderartige Abscheidung anwenden, z.B. ein Glockenboden, oder es können Widerstände eingebaut werden. Eine sehr geeignete Lösung des Problems besteht darin, dass man über jede Reihe von Löcher einen im Querschnitt dreieckigen Balken anbringt, so dass dessen Base, welche breiter ist als der Durchschnitt der Löcher, sich sehr kurz über die Oberflache der Siebplatte befindet. Die Substratlösung kann frei durch den Löchern und den Spalt zwischen Platte und Balken nach oben fliessen. Wird die Fluidisationsgeschwindigkeit unterschritten, so sammeln sich die Enzymteilchen im trogformigem Raum zwischen den nebeneinander liegenden Balken und lagern sich dort ab. Wenn die Strömungsgeschwindigkeit wieder genügend hoch ist werden die Teilchen aufgewirbelt und wieder fluidisiert. Die Erfindung wird anhand nachstehender Beispiele erläutert werden.

Beispiel 1

In einem 5-Litergefäss werden unter Rühren 150 g Sand (Korngrösse 175 bis 250 /im) unter Stickstoff 2150 ml Fermentationsflüssigkeit beigegeben, die durch Züchten von Bacillus pasteuri erhalten worden ist. Danach werden in 10 Minuten 350 ml einer 0,1-%-Lösung eines Ausflockungsmittels (Praestol 44 K) zugesetzt, wonach man noch 15 Minuten rührt. Der Niederslag wird abfiltriert und dreimal mit 300 ml Wasser gewaschen, dass 1 jnMol/1 Mercaptoethanol enthält. Die Festmasse, bestehend aus Sand und Zelimaterial, wird 2,5 Stunden lang bei 55 C und einem Druck von IS kPa

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getrocknet. Man erhält 151,2 g trockenes Festprodukt. In einer nächsten Stufe werden 149 g Festmasse unter Zugabe von Stikstoff in ein Gemisch von 175 ml Aceton und 69 ml einer wässrigen Lösung von Mercaptoethanol (1 mMol/1) eingerührt. Dieser Suspension werden bei Zimmertemperatur in 2 Minuten 6,5 ml einer 20%-igen wässrigen Lösung von Glutardialdehyd mit einem pH-Wert von 7,0 zugesetzt, wonach man noch 20 Minuten rührt. Die Festmasse wird dann abfiltriert, viermal mit 150 ml einer wässrigen Mercaptoethanollösung (1 mMol/1) gewaschen, 2 Stunden lang bei 50 C und verringertem Druck (16 kPa) getrocknet und gemahlen. Die Ureaseaktivität des körnigen Produkts ist 28,5 Einheiten je Gramm Feststoff.

Die Aktivität wird bestimmt, indem 2,0 g Feststoff 50 ml einer 2%-igen Harnstoff lösung in einem 0,1 molaren Glycinpuffer nach Sörensen mit einem pH-Wert von 9,2 bei einer Temperatur von 40 °C beigegeben werden. Die in 15 Minuten bei 40 °C gebildete CO -Menge wird kalorimetrisch bestimmt. Die Aktivität wird in Einheiten ausgedrückt. Eine Einheit ist die Substratmenge in Mikromol, die je Gewichtseinheit Enzym in der Minute umgewandelt wird.

Wenn die Korngrösse des Sands über 250 ßm ist, wird teilchenförmiges immobilisiertes Enzym mit Einer Aktivität von 26,6 Einheiten je Gramm Feststoff erhalten.

Diese Präparate können im nachstehend beschriebenen Apparat verwendet werden.

Beispiel 2

Ein Reaktor zum Anwenden des erfindungsgemässen Verfahrens besteht aus einem Rohr mit einem Innendurchmesser von 114 mm und einer Länge von 2200mm, in dem sechs Platten in einer Entfernung von 300 mm voneinander angebracht sind. Jede Platte ist mit 42 Löchern von 2 mm Durchmesser versehen mit kürz darüber eingebauten dreieckigen Balken und wird durch ein Uberlaufrohr mit einem Innendurchmesser von 11 mm durchbohrt, das um 100 mm über und um 280 mm unter die Platte hinausragt. An der Unterseite ist jedes Uberlaufrohr auf einen Durchmesser von 5 mm verengt. Unten ist das Rohr mit einem Auffanggefäss mit Ablasshahn für abgearbeitetes Enzym und einer Flüssigkeitszufuhrleitung verbunden. An der Oberseite ist das Rohr mit einer Flüssigkeitsabfuhr versehen. Der Apparat lässt sich bei Strömungsgeschwindigkeiten bis 0,05 m/s einsetzen. Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,01 m/s ist die Bettexpansion etwa 2, wenn unrege!massig gebildete Teilchen mit 176 bis 380 um Durchmesser und einem spezifischen

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Gewicht von 2640 kg/m benutzt werden. Bei Verwendung von Teilchen mit einem Durchmesser von 516 bis 840 ßm wird eine Bettexpansion von 2 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,025 m/s erreicht.

Beispiel 3

Abwasser dass 1,0 Gewichts-% Harnstoff enthält kann mit dem erfindungsgemässen Verfahren in einer Reaktorsäule mit einer Länge von 9,45 m und einem Innendurchmesser von 1,20 m behandelt werden, die durch waagerechte Siebplatten in zwölf Kammern verteilt ist, mit je eine Höhe von 0,67 m. Die Siebplatten sind auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise konstruiert und mit Überlauf rohren versehen welche bis 0,46 m über die Siebplatten reichen. Die Säule enthält an der Unterseite einen Flüssigkeitszufuhr und an'der Oberseite einen Flüssigkeitsabfuhr. In die oberste Kammer mündet eine Zufuhrleitung für immobilisiertes Frischenzym aus, und das Überlaufrohr der niedrigsten Kammer ist mit einer Abfuhrleitung verbunden.

Ein geeignetes Enzympräparat wird erhalten indem man Urease enthaltendes Zellmaterial aus einer Kultur von Bacillus pasteurii zusammen mit Sand als Füllstof in einem Gewichtsverhältnis von 1 zu 5 immobilisiert. Es werden fluidisierbare Teilchen mit einer durchschnittlichen Korngrösse von 300 bis 700 ßm, einem spezifischen Gewicht von 1780 kg/m , einer Aktivität von 300 Einheiten/g und einer Halbzeit von 1000 Stunden erhalten. Die Fluidisationsgeschwindigkeit ist 0,0035 bis 0,025 m/s. In der Säule wird stündlich 30,9 m Abwasser eingespeist mit einem pH von etwa 9, einer Temperatur von 35 C und einem Druck von 300 kPa. Jede Kammer enthalt 453 kg Enzymteilchen, in der Form eines 0,45 m hohes Wirbelbettes.

Der Gehalt an Harnstoff im gereinigtem Abwasser und die Rest- . aktivität des abgeführten Enzyms werden bedingt durch die Menge des pro Zeiteinheit zugeführten Frischenzyms. Falls einmal pro 48 Stunden 72 kg Frischenzym eingespeist wird, so wird ein Harnstoffgehalt von etwa 10 ppm undeine Restaktivität von etwa 9% erhalten werden. Falls einmal pro 48 Stunden 100 kg Frischenzym zugeführt wird, so wird ein Harnstoffgehalt von etwa 2 ppm undeine Restaktivität von etwa 16,5% erhalten werden.

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Claims

2835373 PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Durchführen einer chemischen Umwandlung, indem eine Lösung eines Substrats mit teilchenförmigen! immobilisiertem Enzym in Berührung gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, dass die Substratlösung durch eine Reihe seriengeschalteter getrennter Wirbelbetten aus teilchenförmigen! Enzym geleitet wird und das Enzym diskontinuierlich entgegen der Strömungsrichtung der Substratlösung von einem Wirbelbett einem nächstgelegenen Wirbelbett zugeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung in einem Säulenreaktor stattfindet, der durch waagerechte, die Substratlösung durchlässige Abscheidungen in mehreren Kammern eingeteilt ist, die je ein Wirbelbett aus teilchenförmigen! Enzym enthalten, und die mit Mitteln für den Transport des Enzyms von einer Kammer zur nächstgelegenen versehen sind.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das teilchenförmige Enzym über ein Überlaufrohr von einer Kammer einem nächstgelegenen zugeleitet wird.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass das teilchenförmige Enzym über Öffnungen in der Abscheidung der zwei Kammern von einer Kammer in einen nächstgelegenen befördert wird, welche Öffnungen derart gebildet sind, dass sie bei einer Strömungsgeschwindigkeit über einem gewissen Schwellenwert keine Enzymteilchen durchlassen, bei einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen diesem Schwellenwert und der minimalen Fluidisationsgeschwindigkeit jedoch wohl Enzymteilchen durchlassen.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein Reaktor mit Kammern eingesetzt wird, die je eine abschliessbare Leitung enthalten, die in einen gemeinsamen Lagerbehälter ausmünden, der mit einem Anschluss ausgerüstet ist, Flüssigkeit oben aus dem Behälter zu führen, und mit einem Anschluss, dem Behälter Flüssigkeit zuzuführen, derart, dass Enzymteilchen in fluidisdertem oder suspendiertem Zustand von einer Kammer in den Lagerbehälter befördert werden können und von da aus wieder in eine weitere Kammer.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die in jede

ο Kammer ausmündende Leitung in der Kammer einen Winkel zwischen 30 und 80 mit der Horizontale macht.

909809/0951 ORIGINAL INSPECTED

2835379

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man ein teilchenförmiges immobilisiertes Enzym mit einem spezifischen Gewicht über 1,0 verwendet, das diskontinuierlich die Säule von oben nach unten durchläuft, während die Substratlösung die Säule von unten nach oben durchläuft.

8. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das aus der Säule abgeführte Enzym weniger als 15% von seiner ursprünglichen Aktivität besitzt.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das abgeführte Enzym weniger als 5% von seiner ursprünglichen Aktivität besitzt.

10. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Säule 5 bis 20 Kammern enthält, in denen ein Wirbelbett aus teilchenförmigen! immobilisiertem Enzym vorhanden ist.

11. Vorrichtung zum Durchführen enzymatischer Umwandlungen, bestehend aus einer in mehrere übereinandergelegene Kammern verteilten Säule, wobei die Kammern durch waagerechte, flüssigkeitsdurchlässige Abscheidungen getrennt sind, welche Säule an der Oberseite mit einer Flüssigkeitsabfuhrleitung und einer Zufuhrleitung für teilchenförmiges immobilisiertes Enzym versehen ist, an der Unterseite mit einer Flüssigkeitszufuhrleitung und einer Abfuhrleitung für teilchenförmiges immobilisiertes Enzym sowie mit Mitteln für den Transport von teilchenförmigen! immobilisiertem Enzym in fluidisiertem oder suspendiertem Zustand von einer Kammer in den daruntergelegenen.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Mittel für die Beförderung von Enzym aus Überlaufrohren bestehen, die die waagerechte Abscheidung durchbohren und sich an der Unterseite bis auf kurze Entfernung über der Abscheidung der untengelegenen Kammer erstreckt.

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