DE2835979C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Durchführen einer chemischen Umwandlung, indem ein Substrat in der Flüssigphase mit einem immobilisierten Enzym in einem Wirbelbett in Berührung gebracht wird. Ein derartiges Verfahren ist aus "Pharmazie in unserer Zeit" 1977, Nr. 2, S. 42 und 43 bekannt.

Es ist bekannt, eine organische oder eine anorganische Verbindung dadurch in eine oder mehrere Verbindungen umzuwandeln, daß eine Lösung des Substrats mit einem immobilisierten Enzym oder einem Gemisch aus Enzymen in Berührung gebracht wird. Unter chemischer Umwandlung wird hier jede Ver­ änderung des Molekülgefüges einer organischen oder einer anorganischen Verbindung verstanden, z. B. durch Hydrolyse, Oxydation, Reduzierung, Isomerisation oder Racemisierung. Enzyme können durch eine physikalische oder eine chemische Bindung an ein organisches oder ein anorganisches Material, oder indem das Enzym oder das Zellenmaterial mit enzymatischer Aktivität ver­ knüpft wird, auf Wunsch in Anwesenheit eines Füllstoffes, immobilisiert werden. In technischem Maßstab wird so Glukose mit Hilfe einer immobili­ sierten Glukoseisomerase in ein Gemisch aus Glukose und Fruktose umge­ wandelt und werden N-Acetyl-L-aminosäuren mit Hilfe einer immobilisierten Aminoacylase deacyliert. Dabei ist üblich, die Lösung des Substrats durch ein festes oder ein fluidisiertes Bett aus teilchenförmigem immobilisiertem Enzym zu leiten. Wegen des Verlustes der enzymatischen Aktivität wird die Füllung der Säule periodisch erneuert. Aus verfahrenswirtschaftlichen Gründen ist es in nahezu allen Fällen üblich, das immobilisierte Enzym­ präparat zu ersetzen, sobald dessen Aktivität auf einen gewissen Prozentsatz zurückgegangen ist, meistens 20 bis 25% von der ursprünglichen Aktivität, sowohl bei diskontinuierlicher Ausführung in nur einer Säule, als auch bei halbkontinuierlicher Ausführung in mehreren seriengeschalteten Säulen. Der Nachteil bei diesem Verfahren ist, daß die Restaktivität der Enzym­ präparate nicht genutzt wird. Ein festes Bett hat ferner den Nachteil, daß der Druckaufbau eines solchen Bettes durch Klumpenbildung und durch Schwel­ lung der Enzymteilchen groß ist. Ferner kann auch Kanalbildung eintreten.

Man hat jetzt nach einem Verfahren gesucht, bei dem die enzymatische Akti­ vität der Enzympräparate ganz oder nahezu ganz genutzt werden kann. Der Zweck ist auch, die Umwandlung des Substrats möglichst vollständig verlaufen zu lassen.

Erfindungsgemäß führt man die chemische Umwandlung einer Ver­ bindung aus, wobei eine wäßrige Lösung des Substrats mit teilchenförmigem, immobilisiertem Enzym in einem Wirbelbett derart in Berührung gebracht wird, indem die Sub­ stratlösung kontinuierlich durch eine Reihe seriengeschalteter, voneinander getrennter Wirbelbetten aus teilchenförmigem, immobilisiertem Enzym geleitet wird, und das teilchenförmige, immobilisierte Enzym diskontinuierlich entgegen der Strömungs­ richtung der Substratlösung von einem Wirbelbett einem nächstgelegenen Wirbelbett zugeführt werden.

Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens sind, daß es sich ein­ fach kontinuierlich durchführen läßt, daß das Enzympräparat erst wegge­ worfen wird, wenn die Aktivität auf einen geringen Prozentsatz von der ursprünglichen Aktivität zurückgegangen ist, daß die Druckunterschiede in der Säule durch den Einsatz eines Wirbelbettes niedrig sind und daß der Umwandlungsgrad des Substrats sehr hoch sein kann, auch bei Verwendung ver­ dünnter Substratlösungen. Ein weiterer Vorteil ist, daß, wenn auch der gleiche Teil von der enzymatischen Aktivität gebraucht würde wie bei den bekannten Verfahren, bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die mit dem Erneuern des Enzyms verbundenen Kosten und Zeit niedriger sind als bei einer Reaktorreihe.

Vorzugsweise führt man das Verfahren in einem flüssigkeitsge­ füllten Säulenreaktor durch, der durch waagerechte, die Substratlösung durchlässige Abscheidungen in mehrere übereinanderliegende Kammern unter­ teilt ist, die je ein Wirbelbett aus teilchenförmigem immobilisiertem Enzym enthalten. Der Reaktor ist mit Mitteln ausgerüstet, durch die Enzym von einer Kammer entgegen der Strömungsrichtung der Substratlösung zur nächst­ gelegenen Kammer geleitet werden kann. Ein solcher Säulenreaktor ist kompakt und läßt sich leicht konstruieren und betreiben.

Das erfindungsgemäße Verfahren weist außer der bereits genannten besseren Benutzung des Enzyms und der nahezu vollständigen Umwandlung des Substrats weitere Vorteile auf. So läßt sich die Säule bei gleichbleibender Zufuhrgeschwindigkeit der Substratlösung betreiben und ist es nicht erfor­ derlich, wie bei einer Reaktion in einem festen Bett, einen Rückgang in der Aktivität des Enzympräparats durch Erniedrigung der zugeführten Substratmenge auszugleichen. Bei Umwandlungen, bei denen ein gasförmiges Reaktionsmittel benutzt wird, zum Beispiel Luft bei oxidativen Umwandlungen, kann die Luft unten in die Säule eingeführt werden. Durch die vielen Siebbleche oder Roste wird das Gas jedesmal wieder aufs neue verteilt und tritt keine Bildung von Kanälen und großen Gasblasen auf. Wenn einer oder mehreren Kammern noch Reaktionsmittel oder Hilfsstoffe zugeführt werden, können die Reaktionsbe­ dingungen genauestens geregelt werden. Wenn zum Beispiel bei der Umwandlung eine Base oder eine Säure frei wird, kann dennoch durch Zusetzen einer Säure, einer Base oder eines Puffers an einer oder mehreren Stellen an der Säule ein optimaler pH-Wert aufrechterhalten werden. Wenn das Substrat selbst aktivierend arbeitet, wird dieser Effekt völlig ausgenutzt, weil die Substratkonzentration in denjenigen Teilen des Reaktors am höchsten ist, wo die enzymatische Aktivität des Enzympräparats am meisten zurückgegangen ist. Umgekehrt gilt, daß eine etwaige Bremsung durch die Umwandlungspro­ dukte oder die Nebenprodukte relativ weniger stört, weil die Konzentration der Bremsstoffe dort am höchsten ist, wo auch die Aktivität des Enzympräpa­ rats am höchsten ist. Ferner weist das Verfahren noch die dem Gebrauch eines fluidisierten Bettes inhärenten Vorteil auf, wie eine bessere Temperatur­ beherrschung, eine gute Stoffübertragung und eine geringere Empfindlichkeit gegen Infektionen und bakterielles Wachstum.

Das Verfahren ist insbesondere zum Durchführen von Reaktionen geeignet, bei denen man ganz oder teilweise im sogenannten Michaelis-Bereich arbeitet. In diesem Bereich ist die Umwandlungsgeschwindigkeit nicht nur von der vorhandenen enzymatischen Aktivität, sondern auch von der Substratkonzen­ tration abhängig. Oben in der Säule ist die Substratkonzentration niedrig, jedoch die Aktivität des immobilisierten Enzympräparats hoch, so daß sich doch eine befriedigende Umwandlungsgeschwindigkeit erreichen läßt. Dadurch kann das Verfahren für Umwandlungen mit einem Enzym angewandt werden, das eine niedrige Michaelis-Konstante hat, und für Umwandlungen, die möglichst vollständig verlaufen sollen. Beispiele sind die Behandlung von Abwasser, aus dem zum Beispiel mit Phenoloxidase Phenol oder mit Urease Harnstoff entfernt wird, die Behandlung von optisch aktiven Sub­ straten, wie die selektive Hydrolyse von L-Phenylglycinamid in Anwesenheit von D-Phenylglycinamid mit Aminosäureamiddeamidase und die Umwandlung von Penicillin G zu 6-Aminopenicillinsäure mit Penicillinamidase. Der Vorteil der Erfindung geht deutlich aus der Tatsache hervor, daß sich der Harnstoff­ gehalt in einem Abwasserstrom auf weniger als 10 ppm verringern läßt.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat ferner den Vorteil, daß die benötigte Apparatur einfacher zu konstruieren und zu betreiben ist.

Bei den bekannten Verfahren konnten höchstens fünf seriengeschaltete Reaktoren be­ nutzt werden. Bei diesem System wird periodisch der Reaktor, der am längsten in Betrieb gewesen ist, außer Betrieb genommen, entleert, mit Frischenzym gefüllt und wieder als letzter in der Reihe in Betrieb genommen. Die Sub­ stratlösung wird jedesmal an einen anderen Reaktor angeschlossen. Wegen der Kosten und des Druckfalls im System ist eine größere Anzahl von Reaktoren kaum möglich. Bei der Erfindung können ohne Bedenken zehn oder mehr serien­ geschaltete fluidisierte Betten benutzt werden, so daß ein besserer Gebrauch des Enzyms und eine vollständigere Substratumwandlung möglich sind.

Man kann teilchenförmiges immobilisiertes Enzym mit einem spezi­ fischen Gewicht unter dem der Substratlösung verwenden. In diesem Fall wird die Substratlösung oben in die Säule eingeleitet und unten aus ihr abgeleitet, während das frische immobilisierte Enzym die niedrigstgelegene Kammer der Säule zugeführt wird. Ein solches immobilisiertes Enzym kann dadurch erhalten werden, daß freies Enzym in Abwesenheit von Füllmitteln durch Verknüpfung immobilisiert wird oder daß bei der Immobilisierung ein Füllmittel oder ein Träger mit niedrigem spezifischem Gewicht verwendet wird. Die Fluidisierung kommt in diesem Fall durch die Neigung der Enzymteilchen, in der Flüssig­ keit aufzusteigen, und durch die entgegengesetzte nach unten gerichtete Kraft der durchströmenden Substratlösung zustande.

Vorzugsweise benutzt man aber teilchenförmiges immobilisiertes Enzym mit einem spezifischen Gewicht über dem der Substratlösung. In diesem Fall wird die Substratlösung aufwärts durch die Säule geleitet und wird Frischenzym in die oberste Kammer des Reaktors eingeleitet und von dort aus über die Reihe darunterliegender Kammern nach unten geleitet, wobei das Enzym in jeder Kammer einen Teil seiner Aktivität verliert. Diese Aus­ führungsform wird nachstehend im einzelnen besprochen werden. Sie wird be­ vorzugt, weil sie an die für Wirbelbetten entwickelten technologischen Kenntnisse anschließt und mehr Variationen in den Typen des zu benutzenden teilchenförmigen immobilisierten Enzyms erlaubt.

Der Transport von Enzymteilchen von einer Kammer zur darunterliegen­ den Kammer läßt sich auf mehrere Weisen verwirklichen. Man kann z. B. Über­ laufrohre anbringen, die die Scheidewand zwischen den zwei Kammern durch­ bohren und jeweils zwei Kammern verbinden. Das Überlaufrohr mündet an der Oberseite in geringem Abstand über der Scheidewand aus. Der Abstand zwischen dieser Ausmündung und der Scheidewand ist die maximale Höhe des Wirbel­ bettes. Wenn der obersten Kammer frische Enzymteilchen zugeführt werden, steigt die Höhe des fluidisierten Bettes und läuft das Übermaß über das Überlaufrohr in die untenliegende Kammer ab und verursacht dort wieder eine Verlagerung von Enzymteilchen zu einer noch niedriger gelegenen Kammer. Aus der niedrigstgelegenen Kammer werden Enzymteilchen abgeführt, die ihre Aktivität inzwischen ganz oder meistenteils verloren haben. Die Scheidewand zwischen den Kammern läßt bei dieser Ausführungsform unter normalen Be­ dingungen lediglich die Substratlösung durch. Als Scheidewand kann eine Sieb­ platte oder ein Drahtgeflecht verwendet werden. Die Überlaufrohre können auch außerhalb der Säule angeordnet sein, mit Ausmündungen in der Säulen­ wand. Das Überlaufrohr mündet an der Unterseite in das fluidisierte Bett aus. Die Rohre werden versetzt zueinander angebracht. Ein solcher Säulen­ reaktor läßt sich einfach konstruieren und betreiben. Ein geringer Nach­ teil ist, daß die Strömungsgeschwindigkeit der Substratlösung gut geregelt werden muß. Bei Spitzenwerten der Strömungsgeschwindigkeit könnte sonst das fluidisierte Bett zu stark expandieren, wodurch über das Überlaufrohr vorzeitig Enzympräparate in die untenliegende Kammer strömen würde. Bevor­ zugterweise wird die Strömungsgeschwindigkeit so geregelt, daß im normalen Betrieb die Höhe des Bettes sich etwas unter der Oberseite des Überlauf­ rohrs befindet. Kurz bevor frisches Enzym zugeführt wird, kann die Strömungs­ geschwindigkeit etwas erhöht werden, so daß das Wirbelbett bis zur Aus­ mündung des Überlaufrohrs reicht.

Der Transport von Enzymteilchen läßt sich auch dadurch ver­ wirklichen, daß jede Kammer mit einer Leitung versehen wird, durch die Enzymteilchen mit Hilfe einer Pumpe, u. U. über ein Puffergefäß, in die untenliegende Kammer abgeführt werden können. Man kann so verfahren, daß zuerst das Enzym aus der niedrigstgelegenen Kammer abgeführt wird. Danach wird das Enzym aus der zweitniedrigsten Kammer gepumpt, und zwar in Form eines Breis, der, nach Wunsch über ein Puffergefäß, zu der niedrigstgelege­ nen Kammer überführt wird. Bei dieser Ausführungsform ist die Strömungs­ geschwindigkeit der Substratlösung viel weniger kritisch. Die größere Investition für Leitungen und eine Pumpe wiegt in den meisten Fällen die höhere Betriebssicherheit auf.

Der Transport von Enzymteilchen läßt sich auch dadurch verwirk­ lichen, daß als Scheidewand zwischen den Kammern Siebplatten oder funktionell gleichwertige Mittel angeordnet werden, die bei einer Flüssigkeitsströmungs­ geschwindigkeit über einem gewissen Schwellenwert kein Enzympräparat durch­ lassen, aber bei einer Strömungsgeschwindigkeit zwischen der minimalen Fluidisationsgeschwindigkeit und diesem Schwellenwert wohl Enzympräparat zur darunterliegenden Zone durchlassen. Eine solche Scheidewand kann aus einer Platte mit angrenzenden abgestumpften kegelförmigen Vertiefungen bestehen, die an der Unterseite offen sind. In diesem Fall wird die Flüssigkeitszufuhr periodisch verringert, wobei die Enzymteilchen zur niedriger gelegenen Zone sinken und ausgearbeitete Enzymteilchen unten aus der Säule abgeführt und eine gleiche Menge frische Enzymteilchen oben in der Kolonne zugeführt werden. Es dürfte klar sein, daß noch weitere Ausführungsformen für den Transport der Enzymteilchen möglich sind. Die oben beschriebenen Verfahren, und insbesondere die ersten zwei, werden wegen ihrer Einfachheit und ihrer Betriebssicherheit bevorzugt.

Die Reaktionsbedingungen werden vorzugsweise so gewählt, daß die Restaktivität des aus dem Reaktor abgeführten Enzyms höchstens 15% von der Anfangsaktivität ist und vorzugsweise niedriger ist als 5% von der Anfangs­ aktivität. Es kann vorteilhaft sein, daß, wie nachstehend noch beschrieben werden wird, sogar eine oder mehrere Kammern ganz desaktiviertes Enzym ent­ halten. Es gibt jedoch Fälle, in denen es möglich ist, Enzym mit einer höheren Restaktivität, z. B. zwischen 15 und 20%, abzuführen.

Der Reaktor enthält mindestens drei, vorzugsweise jedoch mindestens fünf Kammern. Aufgrund praktischer Erwägungen setzt man vorzugsweise einen Reaktor mit 5 bis 20 Kammern ein. Die Kammern und die fluidisierten Betten in ihnen brauchen nicht alle dasselbe Volumen zu besitzen.

Die mittlere Verweilzeit des teilchenförmigen immobilisierten Enzyms im Reaktor ist stark von dem Enzymtyp, dem Substrat und den Reaktions­ bedingungen abhängig. Im allgemeinen wird sie zwischen etwa einer Woche und mehreren Monaten liegen. Die mittlere Verweilzeit des Substrats im Reaktor hängt unter anderem von dem Substrattyp, dem Enzymtyp, der Substratkonzen­ tration und dem gewünschten Umwandlungsgrad ab. Im allgemeinen liegt sie zwischen 0,5 und 120 Minuten, in den meisten Fällen zwischen 5 und 30 Minuten.

Das umzuwandelnde Substrat wird in Form einer, vorzugsweise wäßrigen, Lösung zugeführt, die ferner weitere Reaktionsmittel, den pH-Wert regelnde Mittel, Aktivatoren, Mittel zum Binden störender Verunreinigungen und etwaigenfalls inerte Verbindungen enthalten kann. Gegebenenfalls läßt sich auch eine Emulsion verwenden. Die Substratlösung kann u. U. vorbehandelt sein, zum Beispiel durch Entgasung, Sterilisation, Behandlung mit Aktivkohle usw. Die Substratlösung kommt zuerst mit Enzympräparat in Berührung, das seine enzymatische Aktivität ganz oder großenteils verloren hat. Die Substrat­ lösung kann Verunreinigungen, zum Beispiel Schwermetalle, enthalten, die das Enzym desaktivieren, indem sie sich physikalisch oder chemisch mit dem Enzym binden. In diesem Fall ist es von Vorteil, eine erste Zone einzusetzen, die viele Enzymteilchen enthält, daß sich hier die Verunreinigungen ganz oder großenteils mit den Enzymteilchen binden, die alsdann aus dem System abgeführt werden. Die Konzentration des Substrats in der Lösung kann inner­ halb weiter Grenzen schwanken, eine Voraussetzung ist nur, daß die Lösung noch eine gute Fluidisation verwirklichen kann. Wenn die Umwandlungsstufe Teil einer synthetischen Straße ist, kann die Substratkonzentration zum Beispiel 40 Gewichts-% oder mehr sein, in den meisten Fällen jedoch zwischen 5 und 30 Gewichts-%, u. a. in Abhängigkeit von der Löslichkeit des Substrats. Dient die Umwandlung aber der Entfernung von Verunreinigungen, so ist die Konzentration meistens viel niedriger, zwischen 0,01 und 1 Gewichts-%. Die Geschwindigkeit, mit der die Substratlösung durch die Säule geführt wird, hängt hauptsächlich von dem Fluidisationsverhalten der Enzymteilchen und von der Reaktoranordnung ab. Die optimale Strömungsgeschwindigkeit kann anhand theoretischer Berechnungen und Versuche bestimmt werden. In den meisten Fällen kann eine Strömungsgeschwindigkeit zwischen 0,005 und 0,20 m/s ange­ wandt werden.

Die zu benutzenden teilchenförmigen Enzympräparate können auf ver­ schiedene Weisen hergestellt sein. Im allgemeinen werden Präparate aus teilchenförmigem organischem oder anorganischem Trägermaterial bevorzugt, an das das Enzym oder enzymhaltige Zellen oder Zellenreste unmittelbar oder über ein Kupplungsmittel chemisch gebunden sind, sowie durch Vernetzung von Enzymen oder Zellenmaterial erhaltene Präparate, in Anwesen­ heit oder Abwesenheit eines Füllmittels. Man kann aber auch zum Beispiel Präparate verwenden, die durch Ausfällung von Enzymen oder Zellenmaterial mit einem Flocku­ lierungsmittel erhalten sind, oder durch Einkapselung von Enzymen oder Zellenmaterial in eine organische Polymerisatform oder durch Bindung von Enzymen oder Zellenmaterial an ein ggf. vernetztes Polymerisat erhaltene Präparate.

Als Trägermaterial oder Füllstoff kommen besonders Glas, Sand, Silica, Kohlenstoff, Aluminium, Zirkonoxid, Titanoxid und Metalle, wie Nickel, in Betracht. Der Träger oder Füllstoff kann vorbehandelt sein, damit eine bessere Bindung gewährleistet ist. Als Kupplungsmittel kommen besonders polyfunktionelle Verbindungen, wie Glutaraldehyd, Silane, Polyisocyanate, Azide, Polycarbonsäuren und deren Anhydride in Betracht.

Die Abmessungen, die Form und das spezifische Gewicht der Enzym­ präparatteilchen werden so gewählt, daß sie sich leicht fluidisieren lassen und unter Betriebsbedingungen keine oder nahezu keine Trennung in Fraktio­ nen zu ersehen geben. Bekanntlich gibt es eine Beziehung zwischen dem Durch­ messer und der Form der Teilchen, ihrem spezifischen Gewicht und der Strömungsgeschwindigkeit in einem fluidisierten Bett in der Flüssigphase. Wo möglich, wird man die Abmessung und die Form der Teilchen so wählen, daß die Bettexpansion bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 4 bis 5 cm/sec etwa 2 ist. Das spezifische Gewicht der Teilchen hängt von der Menge und der Art des Füllstoffs ab. Andere Bedingungen sind jedoch durchaus möglich.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren können alle Enzyme benutzt werden, die in immobilisierter Form eine ausreichend große enzymatische Aktivität aufweisen. So können Enzyme verwendet werden, die zu den Klassen der Hydrolasen, der Oxidasen, der Isomerasen, der Ligasen und der Transfe­ rasen gehören. Beispiele sind Aminosäureacylase, Aminosäureamidase, Pepti­ dase, Urease, Phenoloxidase, Inulase, Laktase, Asparaginase, Fumarase, Glukose­ oxidase, Penicillinamidase, Hydantoinase, Trypsin, Papain, Chymotrypsin, Amino­ peptidase. Es ist möglich, eine Mischung aus Enzymen zu verwenden statt eines einzigen Enzyms. Auch kann man der Säule an einer zwischen der Zufuhr und der Abfuhr von Enzymen gelegenen Stelle noch eine zusätzliche Menge teilchenförmiges immobilisiertes Enzym beigeben. Dieses Enzym kann ein anderes sein als das oben der Säule zugeführte Enzym.

Die Temperatur, bei der die Umwandlung stattfindet, kann innerhalb des Bereichs gewählt werden, der von dem Schmelzpunkt der Substratlösung und der Temperatur bestimmt wird, bei der das Enzym desaktiviert wird, im allge­ meinen zwischen 0°C und 80°C, insbesondere zwischen 20°C und 60°C. Die zu wählende Temperatur hängt selbstredend hauptsächlich von dem benutzten Enzym ab.

Der Druck, bei dem die Umwandlung erfolgt, ist unwichtig. In den meisten Fällen wird man bei etwa atmosphärischem Druck arbeiten. Wenn bei der Umwandlung gasförmige Reaktionsmittel verwendet werden oder gasförmige Produkte anfallen, kann es vorteilhaft sein, einen höheren Reaktionsdruck anzuwenden, um die gasförmigen Verbindungen in der wäßrigen Phase gelöst zu halten. Beim Abbau von Harnstoff mit immobilisierter Urease kann zum Beispiel ein Druck zwischen 5 und 10 bar angewandt werden, um Ammoniak und Kohlendioxid in Lösung zu halten. Die Anwesenheit gasförmiger Reaktions­ mittel und Reaktionsprodukte muß jedoch nicht störend sein, so daß man auch einen niedrigeren Druck anwenden kann. In diesem Fall ist an der Oberseite der Säule ein Gas-Flüssigkeitsabscheider mit einer Gasabfuhr anzubringen.

Der pH-Wert, bei dem die Umwandlung durchgeführt wird, wählt man so, daß die enzymatische Aktivität des immobilisierten Enzyms optimal ist. In den meisten Fällen wird es sich um einen pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 handeln. Gewisse Enzyme lassen sich jedoch auch bei einem viel niedrigeren pH-Wert, zum Beispiel zwischen 3,5 und 5, oder einem höheren pH-Wert, zum Beispiel zwischen 8,5 und 10,5 verwenden.

Das Verfahren wird anhand der Fig. 1 erläutert. Ein säulenför­ miger Reaktor (1) ist an der Unterseite mit einer Zufuhr (2) für Substrat­ lösung und an der Oberseite mit einer Abfuhr (3) für die Lösung des umge­ wandelten Produkts versehen. Ferner enthält er oben eine Zufuhr (4) für immo­ bilisiertes teilchenförmiges Enzym in Trockenform oder in Form einer wäßrigen Suspension. Der Reaktor ist durch waagerechte Siebplatten (5, 5 ¹, 5 ¹¹ usw.) in Kammern unterteilt, die je ein fluidisiertes Bett (6, 6 ¹, 6 ¹¹ usw.) aus Enzym­ teilchen enthalten. Die Kammern sind durch Überlaufrohre (7, 7 ¹, 7 ¹¹ usw.) mitein­ ander verbunden. Das Überlaufrohr (8) von der niedrigsten Kammer aus mündet in die Abfuhrleitung (9) mit Absperrhahn (10) für das abgearbeitete Enzym. Unter Betriebs­ verhältnissen ist die Säule ganz mit Flüssigkeit gefüllt und wird die Substrat­ lösung von unten nach oben durch die Säule geleitet. Die Wirbelbetten reichen normalerweise nicht ganz zur Mündung der Überlaufrohre. In gewis­ sen Zeitabständen wird frisches Enzym aus einem nicht eingezeichneten Vorratsbehälter über Hahn 11 und Leitung 4 in einer gewissen Menge in die oberste Kammer eingespeist. Dies verursacht einen Transport von Enzym nach unten durch die Säule und eine Abfuhr von Enzym über das Überlaufrohr 8, Leitung 9 und Absperrhahn 10. Die Abfuhr 3 kann mit einem Gas-Flüssigkeitsscheider 12 versehen sein. Falls die Anwesenheit von Enzym im Produktstrom ganz unzu­ lässig ist, kann die Abfuhr 3 auf einem Filter angeschlossen werden zwecks Entfernung von sehr feinen Teilchen, welche möglicherweise von der Flüssig­ keit mitgerissen sein könnten.

Eine weitere Ausführungsform wird anhand der Fig. 2 erläutert. Der säulenförmige Reaktor 1 ist mit Siebplatten 2 versehen, die ihn in Kammern (a, b, c, d, e) unterteilen. Ferner ist er mit einer Zufuhr 3 für die Substrat­ lösung, einer Abfuhr 4 für die Prozeßflüssigkeit, die das umgewandelte Substrat enthält, und einer Zufuhr 5 für frisches teilchenförmiges Enzym versehen. Jeder Schuß enthält eine Leitung 6, die in eine gemeinsame Lei­ tung 7 ausmündet, die wiederum in einen Lagerbehälter 8 einführt. Der Lager­ behälter 8 enthält an der Oberseite eine Flüssigkeitsabfuhrleitung 9, die an der Saugseite einer Pumpe 13 angeschlossen ist. Der Lagerbehälter 8 ist ferner mit einer Flüssigkeitszufuhrleitung 10 versehen, die an der Druckseite der Pumpe 13 verbunden ist. Eine Leitung 11 verbindet die Abfuhr 4 mit der Saug­ seite der Pumpe 13, und eine Leitung 14 verbindet die Druckseite der Pumpe 13 mit der Zufuhr 3. Die Ventile 15, 15 ¹, 15 ¹¹ usw. sind in den Leitungen 6, 6 ¹, 6 ¹¹ usw. angebracht. Die Flüssigkeitsabfuhrleitung 9, Flüssigkeitszufuhrleitung 10, Leitung 11 bzw. Leitung 14 enthalten je ein Ventil 16, 18, 17 bzw. 19. An die Leitung 7 schließt eine Abfuhrleitung 12 mit dem Ventil 20 an, bestimmt für die Abfuhr von Enzym. Im normalen Betriebszustand ist das ganze System mit Flüssigkeit gefüllt und sind sämtliche Ventile geschlossen. Die Substratlösung durchströmt die Säule und hält das in den Kammern a bis e befindliche Enzym in flui­ disiertem Zustand. Beim Transport von Enzymen wird zuerst die Kammer e ent­ leert. Während die Zufuhr von Substratlösung nach wie vor ungeändert bleibt, werden die Pumpe 13 angefahren und die Ventile 15, 16 und 19 geöffnet. Dadurch werden die Enzymteilchen aus der Kammer e in fluidisierter Form oder als Suspension über die Leitungen 6 und 7 in den Lagerbehälter 8 geführt. Der umhergepumpte Flüssigkeitsstrom ist gering, so daß sich der Zustand in den anderen Kammern kaum ändert. Die Leitung 7 mündet unten in den Lagerbehälter 8 aus, der mit einem verengten Teil versehen ist, um die Abfuhr der Teilchen zu fördern (bleibende Fluidisierung). Da der durch die Flüssigkeitsabfuhrleitung 9 und Leitung 14 verpumpte Flüssigkeitsstrom gering ist, sammeln sich die Enzymteilchen in fluidisiertem Zustand im Lagerbehälter 8 und bleiben die Flüssigkeitsabfuhrleitung 9 und Leitung 14 sowie die Pumpe 13 frei von Feststoff. Wenn alles Enzym aus der Kammer e ent­ fernt ist, werden die Ventile 15, 16 und 19 geschlossen und die Ventile 17, 18 und 20 geöffnet. Die Enzymteilchen werden jetzt aus dem Lagerbehälter 8 herausgedrückt und über die Leitung 7 und Abfuhrleitung 12 abgeführt. Alsdann wird auf die oben beschriebene Weise der Inhalt der Kammer d in den Behälter und danach in die Kammer e geleitet. Ebenso bringt man den Inhalt der anderen Kammern in eine niedriger gelegene Kammer. Zum Schluß wird eine Beschickung frischer Enzymteilchen in die oberste Kammer gebracht. Wenn gewünscht, können die einzelnen Leitungen, Ventile und der Zwischenlagerbehälter mit Anschlüssen an einem Spülsystem mit reinem Wasser versehen werden.

Es wird darauf hingewiesen, daß die Leitungen 6 usw. schräg in die Wirbelbetten hineinragen unter einem Winkel von z. B. 30° bis 80° mit der Horizontale. Dadurch bleiben sie bei geschlossenen Ventilen 15 usw. innen frei von Festteilchen. Die verengte Unterseite des Zwischenlagerbe­ hälters ist von Bedeutung, damit sämtliche Enzymteilchen mit Hilfe der Druckleitung wieder aus dem Behälter abgeführt werden können. Ferner ist empfehlenswert, daß vor dem Entleeren der Kammer als Fördermedium Sub­ stratlösung verwendet wird, die wiederum der Säule zurückgeführt wird, und daß zum Füllen der Kammern als Medium die austretende substratfreie Flüssigkeit benutzt wird. Es tritt also keine Kontamination auf. Die Fig. 2 zeigt um der Übersichtlichkeit willen einen Reaktor mit fünf Kammern. In der Praxis wird bei dieser Ausführung ein Reaktor mit einer größeren Anzahl von Kammern eingesetzt werden, zum Beispiel 10 oder mehr.

Falls die Abscheidung besteht aus einer Siebplatte mit Löchern, deren Durchschnitt größer ist als der Durchschnitt der Enzymteilchen, könnten diese Teilchen durch die Säule nach unten fallen und sich unten an­ sammeln, wenn die Strömungsgeschwindigkeit der Substratlösung sich stark ver­ ringern würde, z. B. bei einer Störung. Um dies zu vermeiden, kann man eine andersartige Abscheidung anwenden, z. B. einen Glockenboden, oder es können Widerstände eingebaut werden. Eine sehr geeignete Lösung des Problems besteht darin, daß man über jede Reihe von Löchern einen im Querschnitt dreieckigen Balken anbringt, so daß dessen Basis, welche breiter ist als der Durchschnitt der Löcher, sich sehr kurz über der Oberfläche der Siebplatte befindet. Die Substratlösung kann frei durch die Löcher und den Spalt zwischen Platte und Balken nach oben fließen. Wird die Fluidisationsgeschwindigkeit unterschritten, so sammeln sich die Enzym­ teilchen im trogförmigen Raum zwischen den nebeneinander liegenden Balken und lagern sich dort ab. Wenn die Strömungsgeschwindigkeit wieder genügend hoch ist, werden die Teilchen aufgewirbelt und wieder fluidisiert.

Die Erfindung wird anhand nachstehender Beispiele erläutert werden.

Beispiel 1

In einem 5-Litergefäß werden unter Rühren 150 g Sand (Korngröße 175 bis 250 µm) unter Stickstoff 2150 ml Fermentationsflüssigkeit beige­ geben, die durch Züchten von Bacillus pasteurii erhalten worden ist. Danach werden in 10 Minuten 350 ml einer 0,1-%-Lösung eines Ausflockungsmittels (Praestol 44 K) zugesetzt, wonach man noch 15 Minuten rührt. Der Nieder­ schlag wird abfiltriert und dreimal mit 300 ml Wasser gewaschen, das 1 mMol/l Mercaptoethanol enthält. Die Festmasse, bestehend aus Sand und Zellmaterial, wird 2,5 Stunden lang bei 55°C und einem Druck von 16 kPa getrocknet. Man erhält 151,2 g trockenes Festprodukt. In einer nächsten Stufe werden 149 g Festmasse unter Zugabe von Stickstoff in ein Gemisch von 175 ml Aceton und 69 ml einer wäßrigen Lösung von Mercaptoethanol (1 mMol/l) eingerührt. Dieser Suspension werden bei Zimmertemperatur in 2 Minuten 6,5 ml einer 20%igen wäßrigen Lösung von Glutardialdehyd mit einem pH-Wert von 7,0 zugesetzt, wonach man noch 20 Minuten rührt. Die Festmasse wird dann abfiltriert, viermal mit 150 ml einer wäßrigen Mercaptoethanollösung (1 mMol/l) gewaschen, 2 Stunden lang bei 50°C und verringertem Druck (16 kPa) getrocknet und gemahlen. Die Ureaseaktivität des körnigen Produkts ist 28,5 Einheiten je Gramm Feststoff.

Die Aktivität wird bestimmt, indem 2,0 g Feststoff 50 ml einer 2%igen Harn­ stofflösung in einem 0,1 molaren Glycinpuffer nach Sörensen mit einem pH- Wert von 9,2 bei einer Temperatur von 40°C beigegeben werden. Die in 15 Minuten bei 40°C gebildete CO₂-Menge wird kalorimetrisch bestimmt. Die Akti­ vität wird in Einheiten ausgedrückt. Eine Einheit ist die Substratmenge in Mikromol, die je Gewichtseinheit Enzym in der Minute umgewandelt wird.

Wenn die Korngröße des Sands über 250 µm ist, wird teilchen­ förmiges immobilisiertes Enzym mit einer Aktivität von 26,6 Einheiten je Gramm Feststoff erhalten.

Diese Präparate können im nachstehend beschriebenen Apparat ver­ wendet werden.

Beispiel 2

Ein Reaktor zum Anwenden des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht aus einem Rohr mit einem Innendurchmesser von 114 mm und einer Länge von 2200 mm, in dem sechs Platten in einer Entfernung von 300 mm voneinander angebracht sind. Jede Platte ist mit 42 Löchern von 2 mm Durchmesser versehen mit kurz darüber eingebauten dreieckigen Balken und wird durch ein Überlaufrohr mit einem Innendurchmesser von 11 mm durchbohrt, das um 100 mm über und um 280 mm unter die Platte hinausragt. An der Unterseite ist jedes Überlaufrohr auf einen Durchmesser von 3 mm verengt. Unten ist das Rohr mit einem Auffang­ gefäß mit Ablaßhahn für abgearbeitetes Enzym und einer Flüssigkeitszu­ fuhrleitung verbunden. An der Oberseite ist das Rohr mit einer Flüssig­ keitsabfuhr versehen. Der Apparat läßt sich bei Strömungsgeschwindig­ keiten bis 0,05 m/s einsetzen. Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,01 m/s ist die Bettexpansion etwa 2, wenn unregelmäßig gebildete Teilchen mit 176 bis 380 µm Durchmesser und einem spezifischen Gewicht von 2640 kg/m³ benutzt werden. Bei Verwendung von Teilchen mit einem Durchmesser von 516 bis 840 µm wird eine Bettexpansion von 2 bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,025 m/s erreicht.

Beispiel 3

Abwasser, das 1,0 Gewichts-% Harnstoff enthält, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren in einer Reaktorsäule mit einer Länge von 9,45 m und einem Innendurchmesser von 1,20 m behandelt werden, die durch waagerechte Siebplatten in zwölf Kammern unterteilt ist, mit je einer Höhe von 0,67 m. Die Siebplatten sind auf die im Beispiel 2 beschriebene Weise konstruiert und mit Überlaufrohren versehen, welche bis 0,46 m über die Siebplatten reichen. Die Säule enthält an der Unterseite eine Flüssigkeits­ zufuhr und an der Oberseite eine Flüssigkeitsabfuhr. In die oberste Kammer mündet eine Zufuhrleitung für immobilisiertes Frischenzym aus, und das Überlaufrohr der niedrigsten Kammer ist mit einer Abfuhrleitung verbunden.

Ein geeignetes Enzympräparat wird erhalten, indem man Urease ent­ haltendes Zellmaterial aus einer Kultur von Bacillus pasteurii zusammen mit Sand als Füllstoff in einem Gewichtsverhältnis von 1 zu 5 immobilisiert. Es werden fluidisierbare Teilchen mit einer durchschnittlichen Korngröße von 300 bis 700 µm, einem spezifischen Gewicht von 1780 kg/m³, einer Aktivität von 300 Einheiten/g und einer Halbzeit von 1000 Stunden erhalten. Die Flui­ disationsgeschwindigkeit ist 0,0035 bis 0,025 m/s. In der Säule wird stündlich 30,9 m³ Abwasser eingespeist mit einem pH von etwa 9, einer Tempe­ ratur von 35°C und einem Druck von 300 kPa. Jede Kammer enthält 453 kg Enzymteilchen, in der Form eines 0,45 m hohen Wirbelbettes.

Der Gehalt an Harnstoff im gereinigten Abwasser und die Rest­ aktivität des abgeführten Enzyms werden bedingt durch die Menge des pro Zeiteinheit zugeführten Frischenzyms. Falls einmal pro 48 Stunden 72 kg Frischenzym eingespeist wird, so wird ein Harnstoffgehalt von etwa 10 ppm und eine Restaktivität von etwa 9% erhalten werden. Falls einmal pro 48 Stunden 100 kg Frischenzym zugeführt wird, so wird ein Harnstoffgehalt von etwa 2 ppm und eine Restaktivität von etwa 16,5% erhalten werden.

Claims (6)

1. Verfahren zum Durchführen einer chemischen Umwandlung, wobei eine Substratlösung mit teilchenförmigem, immobili­ siertem Enzym in einem Wirbelbett in Berührung gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Substratlösung durch eine Reihe seriengeschalteter, getrennter Wirbelbetten aus dem teilchenförmigen, immobilisierten Enzym geleitet wird und das teilchenförmige, immobilisierte Enzym diskontinuierlich entgegen der Strömungsrichtung der Substratlösung von einem Wirbelbett einem nächstgelegenen Wirbelbett zugeführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein teilchenförmiges, immobilisiertes Enzym mit einem spezi­ fischen Gewicht über 1,0 einen Säulenreaktor, der durch waag­ rechte, für die Substratlösung durchlässige Abscheidungen in mehrere Kammern eingeteilt ist, die je ein Wirbelbett aus teilchenförmigem, immobilisiertem Enzym enthalten, und die mit Mitteln für den Transport des teilchenförmigen, immobi­ lisierten Enzyms von einer Kammer zur nächstgelegenen ver­ sehen sind, diskontinuierlich von oben nach unten durchlaufen läßt, während die Substratlösung den Säulenreaktor von unten nach oben durchläuft.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Säulenreaktor ein teilchenförmiges, immobi­ lisiertes Enzym abzieht, das weniger als 15% seiner ursprüng­ lichen Aktivität besitzt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Säulenreaktor ein teilchenförmiges, immobilisiertes Enzym abführt, das weniger als 5% seiner ursprünglichen Akti­ vität besitzt.

5. Vorrichtung zur Durchführung eines der Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bestehend aus einem Säulenreaktor, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Säulenreaktor mehrere über­ einandergelegene Kammern verteilt sind, wobei die Kammern durch waagrechte, flüssigkeitsdurchlässige Abscheidungen getrennt sind, der Säulenreaktor an der Oberseite mit einer Flüssig­ keitsabfuhrleitung und einer Zufuhrleitung für teilchenförmiges, immobilisiertes Enzym, an der Unterseite mit einer Flüssig­ keitszufuhrleitung und einer Abfuhrleitung für teilchenförmiges, immobilisiertes Enzym sowie mit Mitteln für den Transport von teilchenförmigem, immobilisiertem Enzym in fluidisiertem oder suspendiertem Zustand von einer Kammer in die daruntergelegene versehen ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel für das Befördern von teilchenförmigem, immobili­ siertem Enzym aus Überlaufrohren bestehen, die die waagrechte Abscheidung durchbohrend und sich an der Unterseite bis auf kurze Entfernung über der Abscheidung der untengelegenen Kammer erstreckend gestaltet sind.