DE2814408A1

DE2814408A1 - Ampholyt und verfahren zu dessen herstellung

Info

Publication number: DE2814408A1
Application number: DE19782814408
Authority: DE
Inventors: John Lennart Soederberg
Original assignee: Pharmacia Fine Chemicals AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 1977-04-26
Filing date: 1978-04-04
Publication date: 1978-11-02
Also published as: FR2395253A1; FR2395253B1; GB1596427A; JPS53146976A; DE2814408C2; SE7704783L; SE415731B; US4334972A; CA1139304A

Description

— C _

28U4Q8

Unsere Nr. 21 864 Pr/br

Pharmacia Pine Chemicals AB Uppsala, Schweden

Ampholyt und Verfahren zu deesen Herstellung

Die Erfindung betrifft einen wasserlöslichen Ampholyten, beispielsweise zur Verwendung flir Trennzwecke als Puffersubstanz und/oder als Trägerelektrolyt und ein Verfahren zu dessen Herstellung.

Ampholyte, d.h. Gemische aus amphoteren Substanzen werden mehr und mehr als sogenannte Trägerampholyte in der Trenntechnik verwendet. Trägerampholyte werden besonders für isoelektrisches Fokussieren gebraucht (eine Elektrophorese-Technik). Sie sind außerdem wertvoll als Puffersübstanzen, beispielsweise bei Chromatographieverfahren und als Trägerelektrolyte, beispielsweise bei der Isotachophorese. Die ersten Trägerampholyte von größerem Interesse waren Proteinhydrolysate. H.Svensson (Acta Chem. Scand. 16 (1962) 456-466) hat später ein synthetisches Gemisch aus 40 verschiedenen Amphoteren vorgeschlagen. Das erste, im

(R} Handel erhältliche Produkt (Ampholine^{v ;} von LKB-Produkter AB, Bromma, Schweden) bestand aus carboxyethylierten Oligorceren von Polyethylenimin. Ein weiteres handelsübliches Produkt (Servalyte von Serva Feinbiochemica, Deutschland) bestand aus Polyethyleniminoligomeren, die mit Propansulton behandelt worden waren. Alle diese Trägerampholyte besitzen den Nachteil, daß die Leitfähigkeit und Pufferkapazität im pH-Bereich von 5 bis 8 sehr gering sind und als Folge davon ungleichmäßiges Fokussieren und lokale überhitzung erfolgen.

80984 47 0669

281U08

Die beiden vorstehend genannten handelsüblichen Produkte werden aus dem außergewöhnlich stark carcinogenemEthylenimin synthetisiert und das letztere aus dem stark carcinogenem Propansulton. Die Herstellung dieser Ampholyte ist deshalb gefährlich und teuer.

Bei der Elektrophorese ergaben die ursprünglichen Ampholyte pH-Gradienten zwischen pH von etwa 3 und pH von etwa 10. Da engere Bereiche erforderlich sind, wurde das pH 3 bis 10 Intervall zu engeren Teilintervallen fraktioniert durch präparative Elektrophorese. Die Kapazität dieser Methode ist gering,und die Methode ist schwierig und gefährlich durchzuführen. Man kann gerade pH-Gradienten erzielen, indem man solche Fraktionen der engeren Intervalle in gewissen Proportionen mischt, jedoch erzielt man auf diese Weise größere Mengen an überflüssigem Ampholyt in uninteressanten pH-Intervallen, die verworfen werden müssen.

Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß man auf billige und einfache Weise Trägerampholyte herstellen kann, die nicht die Nachteile der bisher bekannten Ampholyte aufweisen und die direkt in Form eines Produktes erhalten werden können und bei der Elektrophorese zu engen pH-Gradienten führen, wodurch die . schwierige und teure präparative Elektrophorese ausgeschaltet wird. Produkte mit weiteren pH-Gradienten können erhalten werden, indem man erfindungsgemäße Produkte mit unterschiedlichen pH-Gradienten mischt. Die erfindungsgemäßen Produkte sind außerdem wertvoll, weil sie bei der Elektrophorese eine besonders gleichmäßige .Leitfähigkeitsverteilung über den interessierenden pH-Gradienten ergeben.

Damit ein Ampholyt als ein guter Trägerampholyt funktioniert, ist es erforderlich, daß die Pufferkapazität am isoelektrischen Punkt (pi) so hoch wie möglich ist. Dies kann nur erreicht werden, wenn die pKa-Werte der in den Ampholyten enthaltenen

44/0869

_ ·7 —

protolytischen Gruppen in einem engen Bereich um den isoelektrischen Punkt verteilt sind. In bisher bekannten Trägerampholyten ist die Pufferkapazität über den gesamten pH-Bereich von 2 bis 11 verteilt, wobei nur ein geringer Teil in der Nähe des isoelektrischen Punktes liegt. (Außerdem sind die Pufferkapazitäten von bekannten Ampholyten oft ungleichmäßig dahingehend verteilt, daß sie im Bereich von 3 bis 4 und 8,5 bis 9,5 maximal sind.)

Der isoelektrische Punkt eines Ämphoters liegt normalerweise zentral oder annähernd zentral zwischen zwei aufeinanderfolgenden pKa-Werten. Somit liegt der isoelektrische Punkt immer bei einem lokalen Minimum in der Pufferkapazität, was weiterhin die Notwendigkeit bestärkt, pKa-Werte zu haben, die eng um den pi liegen.

Frühere Verfahren basierten auf dem Konzept, daß die Einführung vieler protolytischer Gruppen in ein Molekül eine weite Ausbreitung der pKa-Werte verursacht und daß es unmöglich ist, die pKa-Werte um einen spezifischen Punkt zu konzentrieren(siehe beispielsweise SE-PS 314 227 oder die entsprechende US-PS 3 485 736).

Mit Hilfe der Erfindung kann man nun Ampholytgemische mit isoelektrischen Punkten innerhalb eines engen Bereiches direkt synthetisieren, die gleichzeitig engliegende pKa-Werte aufweisen und somit beim pi auch hohe Pufferkapazität besitzen.

Wenn beispielsweise Glutaminsäure und Asparaginsäure mit Epichlorhydrin copolymerisiert werden, stellte sich heraus, daß sich die pKa-Werte der Carboxylgruppen nur um einige Zehntel einer pH-Einheit unterscheiden. Sowohl Asparaginsäure als auch Glutaminsäurehaben zwei Carboxylgruppen und eine Aminogruppe, wobei der pi- zentral zwischen den pKa-Werten der Carboxylgruppen liegt.

80984 4/0611

281UQ8

Aminosäure	ρ:	Ka₁	PKa₂	P	Ka	Pl
Asparaginsäure	2	,1	3,9	9	,8	3,0
Glutaminsäure	2	,2	4,3	9	,7	3,3

Bei der Copolymerisation entstehen Oligomere mit isoelektrischen Punkten, die im wesentlichen zwischen pH 3,0 und 3,3 liegen, d.h. der Bereich ist begrenzt durch den pi der vorliegenden monomeren Aminosäuren. Mit jedem erzielten pi ist der Abstand zum nächstliegenden pKa-Wert geringer als eine pH-Einheit. Außerdem puffern 2/3 aller protolytischen Gruppen beim pi. Die Anzahl an unterschiedlichen Amphoteren wird sehr hoch. Wenn man d,l-Asparaginsäure und d,l-Glutaminsäure verwendet, die mit d- oder 1-Epichlorhydrin nur zu Hexameren copolymerisiert werden, werden 1 680 verschiedene Amphotere innerhalb eines pH-Bereichs von 0,3 pH-Einheiten geschaffen. Dies übersteigt in einem sehr weiten Maße das was bisher erreicht wurde. Die Anzahl an guten Amphoteren (d.h. Amphotere, worin der engste Abstand zwischen pi und dem pKa-Wert etwa gleich einer pH-Einheit ist) ist etwa 10 χ größer als das was bisher für den gesamten pH-Bereich von 3 bis 10 für handelsübliche Produkte erzielt wurde. Wenn d,lrEpichlorhydrin verwendet wird, werden mehr als 50 verschiedene Amphotere erhalten, das istjmehr als 300 χ mehr Amphotere als bisher bekannte Trägerampholyte. Eine enorm große Anzahl an Amphoteren kann im Gemisch erhalten werden, indem man mehr als 2 Komponenten polymerisiert.

Wenn man beim Polymerisationsverfahren mehr oder andere Aminodicarbonsäuren zumischt, ist es möglich, andere pH-Bereiche oder unterschiedliche Längen innerhalb eines Bereichs von 2 bis 4 zu erzielen. Der pH-Bereich 4 bis 5 ist abgedeckt durch Mischen von Aminocarbonsäuren mit Aminodicarbonsäuren. Die Breite des pH-Bereichs kann außerdem durch Veränderung des Polymerisationsgrades etwas eingestellt werden. Ein höherer Polymerisationsgrad ergibt einen engeren Bereich.

809844/0ΘΘ9

28H408

Auf analoge Weise wie mit Aminodicarbonsäuren können Diaminocarbonsäuren zu Ampholyten polymerisiert werden, die engere pH-Bereiche abdecken, jedoch dann auf der alkalischen Seite. Beispielsweise kann man Ampholyte erhalten, die den pH-Bereich 9,5 bis 10,5 abdecken durch Copolymerisieren von d,l-Arginin und d,l-Lysin mit Epichlorhydrin. Die Situation auf der alkalischen Seite ist etwas komplizierter, da die pKa-Werte sich bei den Aminogruppen ändern, die durch die Polymerisationsteilnehmer alkyliert werden (z.B. Epichlorhydrin oder 1,3-Dibrompropan).. Bestimmte Aminogruppen können geschützt werden, indem man bei einem ge- ι eigneten pH-Wert polymerisiert, wobei die pKa-Werte dieser Amino- ] gruppen im wesentlichen unverändert bleiben. ^!

Ein wichtiger Faktor besteht darin, daß der pKa-Wert vorausgesagt werden kann, wenn unter Polymerisation alkyliert wird. Auf diese Weise ist es möglich, eine Synthese so zu gestalten, daß die pKa-Werte in einem interessierenden pH-Bereich erzeugt , werden, wo die Ausgangssubstanzen keine Pufferkapazität aufweisen. Die nachstehende Tabelle wird als Ausgangspunkt für die Diskussion verwendet:

pKa-

CH₂-CH₂-CH₂

H₀C—NH : NH,,

^Λ ') .ο · tu. υ . ο./ - ι γ

2
H₂C . 10,6 · ' 10,0 . .8,7. -7,4,

H₂C—NH NH₂

CH₂ CH₂ . -

H₂C—NH NH₂

I ' ⁹;^{8 9}J³

H₉C—NH NH₉ . '.

ΛίΤΙ /ITT

V^Xl, ^xI ₉

809344/0669

I - 10 -

28U408

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß, wenn die Stickstoffatome durch zwei Kohlenstoffatome getrennt sind, der Abstand zwischen dem niedrigsten und dem höchsten pKa-Wert etwa 6 pH-Einheiten beträgt. Wenn die Anzahl an Stickstoffatomen steigt, vergrößert sich ebenfalls die Breite des Bereiches, während gleichzeitig eine Verringerung im pH-Bereich von 5 bis 8 erzielt wird.

Aus der Tabelle ist außerdem ersichtlich, daß, wenn die Stickstoffatome durch 3 Kohlenstoffatome getrennt werden, der Abstand zwischen dem niedrigsten und dem höchsten pKa-Wert nur etwa 3 pH-Einheiten beträgt. Wenn sich die Anzahl an Stickstoffatomen in homologen Reihen vergrößert, ändert sich überraschenderweise die Breite des Bereiches nicht wesentlich.

Serien dieses letztgenannten Typs (d.h. mit drei Kohlenstoffatomen zwischen den Stickstoffatomen) entstehen, wenn Ammoniak oder Amine mit z.B. 1,3-Dibrompropan polymerisiert werden. Wenn die Polymerisation beispielsweise mit Epichlorhydrin durchgeführt wird, wird eine Hydroxylgruppe am mittleren Kohlenstoffatom jeder Bindung eingeführt. Diese ß-Hydroxylgruppen verursachen eine systematische Verschiebung des gesamten pKa-Bereichs ohne die Breite desselben zu vergrößern. Anstelle zwischen etwa 7,5 und 10 anzukommen,wie in dem Beispiel, wird der Bereich etwa 6 bis 9. Wenn die Aminogruppen im Polymer substituiert sind, wird eine weitere systematische Verschiebung der pKa-Werte erzielt. Beispielsweise hat N(6-Carboxyhexyl)~ keine wesentliche Veränderung des·pKa-Werts zur Folge, N(2-Carboxyethyl)- hat eine Herabsetzung von -< 0,5 pH-Einheiten zur Folge, N-Carboxymethylhat eine Herabsetzung von r*> 0,5 pH-Einheiten zur Folge und N(N'-Carboxymethylamidomethyl)- (d.h. HOOC-CH₂-NH-CO-Ch₂-) hat eine Herabsetzung von ^ . 1 pH-Einheit zur Folge. Die Herabsetzung von mehr als grob gesagt 1,5 pH-Einheiten wird durch Substituierung erzielt, beispielsweise mit N-Hydroxygruppen oder

809844/0669

28U408

N-Nitriloraethylgruppen. Die in vorstehendem Beispiel gezeigten Polymeren werden am einfachsten erhalten, indem man die folgenden Aminosäuren mit einem Epihalogenhydrin polymerisiert: 6-Aminohexansäure, ß-Alanin, Glycin, Glycylglycin, Hydroxylamin und Aminoacetonitril. Damit der pi der Polymere in den interessierenden Bereichen liegt (diejenigen Bereiche, die eine hohe Pufferkapazität aufweisen), müssen die Proportionen zwischen Aminogruppen und Carboxylgruppen eingestellt werden, in diesem Falle mit einem Surplus von Aminogruppen. Dies geschieht dadurch, daß man die Aminosäure oder Aminosäuren mit Aminen copolymerisiert. Im einfachsten Fall wird Ammoniak verwendet. Wenn man den pKa-Wert z.B. um 0,5 pH-Einheiten herabsetzen will, kann 2-Aminoethanol beispielsweise verwendet werden, während,, wenn man den pKa-Wert erhöhen will, eine entsprechende Menge Ethylamin beispielsweise verwendet werden kann. Als Alternative zu Aminen können Diamxnomonocarbonsäuren verwendet werden,beispielsweise Histidin und Lysin. Bei einem hohen Reaktions-pH (10) werden beide Aminogruppen im Lysin polymerisiert, während bei einem niedrigeren pH·-(8,5) nur diea-Aminogruppe in der Polymerisation alkyliert wird, während der pKa-Wert der anderen Aminogruppen nur am Rande beeinflußt wird. Eine ähnliches Ergebnis wird erhalten, wenn Ethylendiamin bei unterschiedlichen pH-Werten polymerisiert wird. Eine alternative Methode zum Schützen des pKa-Werts einer Aminogruppe in einer Diaminoverbindung besteht darin, die Verb_ indung vor der Polymerisation zu ethylieren. Beispielsweise Copolymerisation von Aminosäuren mit N,N-Diethylaminoethylamin.

So lassen sich Ampholyte mit pl-Werten innerhalb eines Bereiches von 0,5 bis 3 pH-Einheiten durch direkte Synthese unter Anwendung der vorstehend genannten Methode herstellen. Wenn man einen pl-Bereich zwischen beispielsweise pH 2,5 und 10,5 erzielen möchte, kann eine Vielzahl von engen Bereichen gemischt werden. Ein solches

809844/0889

28U408

tausende zehntausende

Gemisch kann / bis / von unterschiedlichen Amphoteren enthalten, beispielsweise mehr als_> etwa 1 000 bis beispielsweise etwa 100 000 oder mehr, beispielsweise etwa 10 000 verschiedene Amphotere.

Der erfindungsgemäße Ampholyt ist dadurch gekennzeichnet, daß er das Reaktionsprodukt aus

a) einer oder mehreren Aminosäuren, Hydroxylaminen, Aminen der allgemeinen Formel

R²
R¹ - N< (I)

worin R-¹ Wasserstoff, die Gruppe H N-(CH ) -,in der η eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, oder die Gruppe H₂N-(CH₂) -NH-(CH₂) -, und R² und R⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Hydroxyethyl bedeuten oder mit dem dazwischenliegenden Stickstoffatom eine Imidazolyl-, Morpholinyl- oder Piperaziny!gruppe bilden, oder Di- oder Tripeptiden, wobei die Aminosäuren und die Di- und Tripeptide mindestens 1 Stickstoffatom mit I oder 2 daran gebundenen Wasserstoffatomen enthalten und keine anderen aromatischen Gruppen als Imidazolyl enthalten und ein Molekulargewicht von höchstens 200 aufweisen, wobei mindestens eine dieser Verbindungen mindestens eine Carboxylgruppe enthält,oder einem Salz dieser Verbindungen und

b) mindestens einem bifunktionellen Alkylierungsmittel mit einer geraden oder verzweigten Alkylenkette mit 2 bis 10, vorzugsweise 3 oder 6 bis 10 C-Atomen, die gegebenenfalls mit 1 bis 3 Hydroxylgruppen und/oder 1 bis 3 Carboxylgruppen substituiert und/oder durch 1 bis 3 Sauerstoffatome unterbrochen ist, wobei höchstens ein anderes Atom als Kohlenstoff oder Wasserstoff an ein und dasselbe Kohlenstoffatom in der

80984 4/

281U08

Alkylenkette gebunden ist,

in einem Molverhältnis von bJ zu a) von 1:2 bis 9:10, vorzugsweise 2:3 bis 7:8, enthält.

Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend genannten Ampholyten.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine oder mehrere Aminosäuren, Hydroxylamine, Amine der allgemeinen Formel

R²
R¹ - N^ (I)

worin. R Wasserstoff, die Gruppe HpN-(CH₂) -, in der η eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, oder die Gruppe H₂N-(CH₂) -NH-(CH₂) - und R² und R⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Hydroxyethyl bedeuten oder mit dem dazwischenliegenden Stickstoffatom eine Imidazolyl-, Morpholinyl- oder Piperazinylgruppe bilden, oder Di- oder Tripeptide, wobei die Aminosäuren und die Di- und Tripeptide mindestens ein Stickstoffatom mit 1 oder 2 daran gebundenen Wasserstoffatomen enthalten und keine anderen aromatische Gruppen als Imidazolyl enthalten und ein Molekulargewicht von höchstens 200 aufweisen, wobei mindestens eine dieser Verbindungen mindestens eine Carboxylgruppe enthält, oder ein Salz dieser Verbindungen mit

b) mindestens einem bifunktionellen Alkylierungsmittel mit einer geraden oder verzweigten Alkylenkette mit 2 bis 10, vorzugsweise 3 oder 6 bis 10 C-Atomen, die gegebenenfalls mit 1 bis 3 Hydroxylgruppen und/oder 1 bis 3 Carboxylgruppen substituiert und/oder durch 1 bis 3 Sauerstoffatome unterbrochen ist, wobei höchstens ein anderes Atom als Kohlenstoff oder Wasserstoff an ein und dasselbe Kohlenstoffatom in der Alkylenkette gebunden ist,

809844/0669

28U408

in einem Molverhältnis von I₃) zu Q) von 1:2 bis 9:10, vorzugsweise 2:3 bis 7:8, umsetzt.

Die für den erfindungsgemäßen Trägerampholyten verwendeten Ausgangsmaterialien können im Prinzip alle natürlich vorkommenden oder synthetischen Aminosäuren sein, die 1 oder vorzugsweise 2 an ein Stickstoff gebundene · Wasserstoffatomjfenthalten und keine anderen aromatischen Gruppen als Imidazolyl enthalten und ein Molekulargewicht von höchstens 200 aufweisen. Beispiele für solche Aminosäuren sind Glycin, Alanin, ß-Alanin, Sarcosin, Serin, Cystein, Cysteinsäure, a-Aminobuttersäure, ß-Aminobuttersäure, ¹^-Aminobutter säure, a-Aminoisobuttersäure, Glycylglycin. Asparagin, Asparaginsäure, Homocystein, Threonin, Homoserin, Glutamin, Glutaminsäure, Hydroxyglutaminsäure, Valin, Isovalin, Norvalin, Methionin, Pentahomoserin, ζ-Aminocapronsäure, Leucin, Isoleucin, Norleucin, Cystin, Lysin, Histidin, Hexahomoserin, Diaminobernsteinsäure und Arginin. Bevorzugte Aminosäuren dieser Aufzählung sind Glycin, ß-Alanin, Glycylglycin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Serin, ^-Aminocapronsäure, Histidin, Diaminobernsteinsäure und Arginin.

Als Beispiele für Salze der unter (a) aufgeführten Verbindungen seien Säureadditionssalze mit Mineralsäuren genannt, z.B. HCl und HpSOκ, und Alkalimetallsalze, z.B. Natrium- und Kaliumsalze. Vorzugsweise wird die d,l-Form der Aminosäuren und der anderen Reaktionsteilnehrcer gemäß a) und b) ausgeviählt, um optische Aktivität des Reaktionsproduktes zu vermeiden und die Anzahl an Amphoteren in dem erhaltenen ämphoteren Gemisch zu erhöhen. Jedoch können, xvenn das Produkt nicht optisch inaktiv sein soll, Reaktionsteilnehmer der d-Porm ader 1-Form verwendet werden.

809844/0669

Beispiele von Aminen der Formel

,2

(I)

zur Verwendung als Ausgangsmaterial für erfindungsgemäße Trägerampholyte sind Ammoniak, Methylamin, Dimethylamin, Ethylamin, Diethylamin, Methylethylamin, Hydroxyethylamin, Methylhydro^yethylamin, Ν,Ν-Diethylendiamin, N-Ethy!ethylendiamin, Imidazol, Morpholin, N-Aminoethylmorpholin, Piperazin und Aminoethylpiperazin.

Beispiele für Dipeptide und Tripeptide zur Verwendung als Ausgangsmaterialien für die erfindungsgemäßen Trägerampholyte sind Glycylglycin, Glycylglycylglycin und die Dipeptide und Tripeptide, die sich aus den \>Orstehend genannten bevorzugten Aminosäuren bilden können, wobei das Molekulargewicht auf höchstens 200 begrenzt wird.

Vorzugsweise werden mindestens 2 (beispielsweise mindestens 3) der Aminogruppen enthaltenden Verbindungen, vorstehend unter a) genannt, bei der Synthese der erfindungsgemäßen Ampholyte verwendet, um eine große Vielzahl von Amphoteren in den Ampholyten zu erhalten. In diesem Zusammenhang kann eine große Vielzahl solcher Aminoverbindungen bei der Synthese nebeneinander verwendet werden, obgleich aus praktischen Gründen eine Zahl von weniger als 20 im allgemeinen gewählt wird.

Zu den Beispielen erfindungsgemäß verwendbarer bifunktioneller Alkylierungsmxttel gehören Verbindungen des Typs X-A-Y, worin

8098U/0669

" ¹⁶ " 281UQ8

X und Y gleich oder verschieden sind und jeweils ein Halogenatom, vorzugsweise Chlor oder Brom bedeuten und A eine gerade oder verzweigte Alkylenkette mit. 3 bis 10 C-Atomen bedeutet, die gegebenenfalls mit 1 bis 3 Hydroxylgruppen und/oder 1 bis 3 Carboxylgruppen substituiert und/oder durch 1 bis 3 Sauerstoffatome unterbrochen ist, oder eine entsprechende Epoxidverbindung, die aus den Verbindungen der vorstehend genannten Formel erhalten werden kann, indem man Halogenwasserstoff abspaltet. Von diesen Verbindungen sind diejenigen, die 3 oder 6 bis 10 C-Atome enthalten, bevorzugt. Besonders bevorzugte Verbindungen sind diejenigen, die 3 oder 6 C-Atome enthalten, insbesondere Epihalogenhydrine, l,3-Dihalogen-2-propanole.und 2,3-Dihalogen-1-propanole, d.h. Verbindungen der Formeln

C - CH - CH₂ - Y (II)

OH
X-CH₂-CH-CH₂-Y (III)

Y
X-CH₂-CH-CH₂OH (IV)

worin X und Y vorstehend genannte Bedeutung haben. Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare bifunktionelle Alkylierungsmittel des Typs X-A-Y sind Epichlorhydrin, Epibromhydrin, !,S-Dichlor^-propanol, 1,3-Dichlorpropan, l,2-r3,4-Diepoxybutan, Diglycidylether, 1,2-Ethandioldiglycidylether, 1,4-Butandioldiglycidylether, Glycerin-l^-diglycidylether und 1,3-Dibrom-2-carboxypropan.

809844/0669

Aus praktischen Gründen werden bei der Synthese oft nur 1 oder 2 solcher bifunktioneller Alkylierungsmittel (d.h. brückenbildende Mittel) gemäß b) verwendet, jedoch kann eine größere Anzahl an unterschiedlichen solcher brückenbildender Mittel in ein und derselben Synthese verwendet werden.

Erfindungsgemäße Ampholyte werden erfindungsgemäß dadurch hergestellt, daß man eine oder mehrere Verbindungen der unter a) angegebenen Gruppe mit mindestens einem unter b) angegebenen bifunktioneilen Alkylierungsmittel in einem Molverhältnis von b) zu a) von 1:2 bis 9:10, vorzugsweise 2:3 bis 7:8 umsetzt, wobei mindestens eine · der Verbindungen unter a) eine solche ist, die mindestens eine Carboxylgruppe enthält. Zweckmäßigerweise werden von den verschiedenen Verbindungsgruppen unter a) 2 Aminosäuren, 1 Amin und 1 Dipeptid oder Tripeptid oder 2 Amine, 1 Aminosäure und 1 Dipeptid oder Tripeptid kombiniert, jedoch können auch weniger oder mehr Komponenten miteinander kombiniert werden.

Beispiele für Kombinationen von Verbindungen der Gruppe a) sind: Glycin, ß-Alanin, Ammoniak und Glycylglycin; Glycin, ß-Alanin, Ethylendiamin und Glycylglycin; Glycin, ß-Alanin, Ethylendiamin, N,N-Diethy!ethylendiamin und Glycylglycin;

Arginin, Glycin, ß-Alanin, Ammoniak, N,N-Diethy!ethylendiamin und Glycylglycin;

Asparaginsäure, ß-Alanin und Glycylglycin; Glutaminsäure, ß-Alanin und Glycylglycin; Mesodiamxnobernsteinsaure, Asparaginsäure und Glycylglycin; Asparaginsäure, 6-Aminohexansäure und Glycylglycin; Glycin, ß-Alanin, Imidazol und Glycylglycin; Ammoniak, Hydroxylamin, Glycylglycin und anschließende Behandlung mit Na-Chloracetat;

809844/0669

- 1 R

28U408

Valin, Glutaminsäure und Serin;

Hexamethylendiamin, 1,^-Diaminobutan, 1 j3""Diaminopropan und Glycylglycin und anschließende Behandlung mit Natriumchloracetat; Piperazin, Bis-(3-aminopropyl)-amin und Glycylglycin und anschlies sende Behandlung mit Natriumchloracetat; Aminoethylmorpholin, Aminoethylpiperazin, Piperazin und Glycylglycin und anschließende Behandlung mit Natriumchloracetat; dl-Asparaginsäure und dl-Glutaminsäure; Histidin, a-Aminobuttersäure und Ammoniak; Asparagin, ß-Alanin, Methylamin und Alanylglycin; Glutamin, ß-Aminobuttersäure, Ammoniak und Alanylalanin; Threonin, ß-Alanin, Ethylamin und Glycylalanin; Methionin, ß-Alanin, Ammoniak und Glycylglycylglycin; Cysteinsäure, ß-Alanin_sund Glycylglycin; Glycin, ß-Alanin, Ammoniak und Alanylalany!glycin; Glycin, ß-Alanin, Ammoniak und Glycylalanylalanin; Glycin, ß-Alanin, Ammoniak und Alanylalanylalanin.

Die Reaktion zwischen den Komponenten a) und b) erfolgt in Wasser, Dirnethylsulfoxid, Dimethylformamid, Methanol, Ethanol oder ähnlichen Lösungsmitteln oder Gemischen davon. Die Reaktion erfolgt zweckmäßigerweise in einem alkalischen Medium, beispielsweise bei einem pH-Wert von 9 bis 11 und bei einer Reaktionstemperatur von beispielsweise 20 bis 50 C, vorzugsweise 30 bis 50°C. Im allgemeinen beträgt die Reaktionszeit von 3 bis 20 Stunden in Abhängigkeit von der Wahl des Ausgangsmaterials und der Reaktionstemperatur. Bekanntlich ermöglicht eine höhere Reaktionstemperatur eine kürzere Reaktionszeit. Die Reaktion wird durch Neutralisieren mit einer starken Säure, z.B. HCl beendet. Die erhaltene Reaktionslösung wird entsalzt, beispielsweise durch Gelfiltration.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung kann das Reaktionsprodukt aus den Komponenten a) und b) anschließend mit einer

809844/0669

halogenierten (vorzugsweise in α-Stellung) niederen aliphatischen Mono-, Di- oder Tricarbonsäure mit 2 bis 6 C-Atomen, vorzugsweise einer Halogenessigsäure, beispielsweise Chloressigsäure, Bromessigsäure oder Iodessigsäure, vorzugsweise in Form eines Salzes mit einem Alkalimetall (z.B. Natrium- oder Kalium) behandelt werden. Diese anschließende Behandlung erfolgt direkt an dem aus der vorstehenden Reaktion erhaltenen Reaktionsgemisch vor der Neutralisierung und ohne Zwischenisolierung des Reaktionsproduktes. Diese anschließende Behandlung erfolgt bei Temperaturen von 10 bis 80°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur und innerhalb einesZeitabschnittes, der von etwa 24 Stunden im niedrigeren Teil des Temperaturbereichs bis etwa 4 Stunden im oberen Teil dieses Bereichs schwanken kann. Neutralisation und Entsalzung wie vorstehend erfolgen anschließend an diese Behandlung.

Gegebenenfalls kann das erhaltene Amphoterengemisch fraktioniert werden. Fraktionierung kann beispielsweise mit Hilfe von Ultrafiltration, Gelfiltration, Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionsverfahren, Elektrophorese oder fraktionierte Fällung erfolgen.

In diesem Zusammenhang kann beispielsweise ein Gemisch erhalten werden, das eine engere ·Molekulargewichtsverteilung und/oder eingestellte Bereichsbreite der pl-Wertg und/oder eine gleichmäßigere Leitfähigkeitsverteilung aufweist.

Geringe Mengen an möglicherweise nicht umgesetzten Ausgangssubstanzen können ebenfalls durch Fraktionierung entfernt werden.

Das erfindungsgemäße Gemisch amphoterer Substanzen enthält vorzugsweise gar keine oder nur einen geringen Teil (beispielsweise ■weniger als 10 Gew.-%) Moleküle mit einem Molekulargewicht über

809844/0689

28U408

1 500, vorzugsweise 1 000, beispielsweise 800 oder 700.

Die Molekulargewichtsverteilung wird vorzugsweise so gewählt, daß mehr als 90 Gew.-% des Gemische in einen Molekulargewichtsbereich von 100 bis 1 50O₃ vorzugsweise 150 bis 1000, wie bis 80O₃ fällt.

Das Durchschnittsmolekulargewicht (Gewichtsmittel M_n.)liegt im allgemeinen zwischen 300 und 800, beispielsweise im Bereich von 350 bis 700, z.B. 400 bis 600, wie 400 bis 500,und das Durchschnittsmolekulargewicht (Zahlenmittel M ) liegt im allgemeinen im Bereich von 200 bis 50O₃ beispielsweise im Bereich von 300 bis 400.

Die vorstehend genannten Molekulargewichtsdaten basieren auf analytischer Gelfiltration mit Polyethylenglykolen als Standard.

Gemäß der Erfindung lassen sich Produkte erzielen, die eine niedrige (und auch gleichmäßige) Lichtabsorption im sichtbaren Bereich sowie im UV-Bereich (beispielsweise bei 280 nm) über einen weiten pH-Bereich aufweisen.

Die erfindungsgemäßen Produkte besitzen sehr vorteilhafte Eigenschaften, beispielsweise beim isoelektrischen Fokussieren und bei der Isotachopnorese und als Trägerelektrolyte und/oder Puffer, beispielsweise bei verschiedenen biochemischen Untersuchungen.

Nachstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

8098U/0669

Beispiel 1

Ein Dreihalsrundkolben, der mit einem Rührer, Thermometer, zwei Tropftrichtern und einer pH-Elektrode ausgestattet war, wurde mit 0,23 Mol Ammoniumchlorid, 0,185 Mol ß-Alanin und 0,184 Mol Glycin und 150 ml destilliertem Wasser beschickt. Nachdem sich alle Peststoffe·aufgelöst hatten, wurden 0,23'Mol Natriumhydroxid zugesetzt. Einer der Tropftrichter enthielt eine spezifische Menge von 10? Natriumhydroxidlösung, die tropfenweise dem Kolben zugesetzt wurde, bis der pH-Wert des Reaktionsgemischs 10 betrug. 0,50 Mol Epichlorhydrin wurden langsam tropfenweise vom anderen Tropftrichter zugesetzt. Gleichzeitig wurde Natriumhydroxidlösung vom ersten Tropftrichter zugesetzt, um sicherzustellen, daß der pH-Wert nicht unter 10,0 absank. Die Tropfgeschwindigkeit wurde so gesteuert, daß die Temperatur 50⁰C nicht überstieg.

Nach Beendigung der Epichlorhydrinzugabe ließ man die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur fortschreiten. Die dem Kolben zugesetzte Menge an Natriumhydroxid wurde sorgfältig durch Messen der in dem Tropftrichter verbleibenden Menge bestimmt, wonach der Synthese eine entsprechende Menge (in Mol) Salzsäure zugesetzt würde. Nach der Neutralisation wurde die gesamte Synthese durch Chromatographie an einer Säule, die 7,5 1 Sephadex G-15 / (Kügelchen aus mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran von Pharmacia Pine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) entsalzt. Das verwendete Eluierungsmittel war destilliertes Wasser. Es wurden 250 ml-Praktionen entnommen und die Ampholytmenge in diesen Fraktionen durch Titration an 1 ml-Proben zwischen einem pH-Wert von 4 und 7 bestimmt. Der Salzgehalt der Fraktionen wurde durch Leitfähigkeitsmessung bestimmt. Diejenigen Fraktionen, die Ampholyt, jedoch kein Salz enthielten, wurden unter Vakuum verdampft, bis 1 ml der Lösung beim Titrieren zwischen einem pH-Wert

80984-4/0660

-22- 28U408

von 4 und 7 1,0 raMol Natriumhydroxid verbrauchte.

Das Produkt wurde als Trägerampholyt im isoelektrischen Fokussieren getestet. Für diesen Zweck wurde eine dicke Suspension hergestellt, indem man 6,25 ml der Ampholytlösung mit einer Natriumhydroxidpufferkapazität von 1,0 mMol je ml Lösung zwischen den vorstehend genannten pH-Grenzen mit 7.50 g Sephadex G-75 Superfein (Kügelchen von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran von Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) und 86,25 ml destilliertem Wasser mischte. Gegebenenfalls kann anstelle von Wasser eine 12,5#ige Saccharoselösung in destilliertem Wasser verwendet werden. Etwa 5 Minuten lang wurde Luft von der Sus-' pension unter Vakuum abgezogen, wonach eine Schicht der Suspension 1 mm dick auf eine dünne Glasplatte mit den Maßen 12,5 x 25 cm ausgestrichen wurde. In einem gegenseitigen Abstand von 23 cm wurden auf die Glasplatte 2 Filterpapierstreifen mit den Maßen 12,5 x 0,5 x 0,3 cm getan, wovon dfeir' eine eine 1 molare Natriumhydroxidlösung und uüir andere lmolare Schwefelsäure enthielten. Die Glasplatte wurde dann auf die Kühlplatte einer Flachbettelektrophoreseapparatur getan. Platinmetallelektroden wurden auf die Filterpapierstreifen getan. Die Elektrode, die in Kontakt mit der Schwefelsäure stand, wurde an das positive Ende einer sogenannten konstant wirkenden Stromquelle (constant-effect power supply) angeschlossen. Die andere Elektrode wurde an den negativen Pol angeschlossen. Die Stromeinheit wurde auf 15 Watt und die Era/spannung auf 2000 Volt eingestellt. Die Elektrophorese dauerte 6 Stunden.

Nach Beendigung der Elektrophorese wurde der pH-Wert jeden Zentimeter zwischen den Elektrodenstreifen mit Hilfe einer Ingold-Oberflächenelektrode gemessen. Es wurde ein Diagramm des pH-Wertes als eine Funktion des Abstandes von der Kathode gezeichnet, wonach die Intervall-Längen daran gemessen wurden. Man erhielt

809844/0669

~²³~ 28U408

dabei einen geradlinigen pH-Gradienten zwischen pH 4 und 7j der 85 % des Abstandes zwischen den Elektrodenlösungen einschloss.

Der Arapholyt wurde außerdem als eine l$ige Lösung in der von H.Svensson beschriebenen Säulentechnik getestet (Archives of Biochemistry und Biophysics, Supplement 1, Seiten 132-138, 1962). Die Säule wurde durch einen UV-Monitor (LKB-Uvicord III) und durch einen Leitfähigkeits-Monitor (Chromatronix) eluiert,. wobei man Kurven der UV-Absorption und der Leitfähigkeit als Funktion des pH-Wertes erhielt· Man fand, daß die Leitfähigkeit niedrig und außergewöhnlich gleichmäßig über den pH-Bereich von 4 bis 7 war. Auch die UV-Absorption war niedrig und außergewöhnlich gleichmäßig.

Beispiel 2

Dieser Versuch wurde auf die gleiche Weise· wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung folgender Bestandteile:

0,100 Mol Ammoniumchlorid
0,250 Mol Glycin
0,250 Mol ß-Alanin
0,100 Mol NaOH.

Beim isoelektrischen Fokussieren auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhielt man einen pH-Gradienten zwischen pH 4 und 6, der 75 % des Abstandes zwischen den Elektrodenlösungen abdeckte.

In der in Beispiel 1 beschriebenen Säulentechnik erhielt man gleichmäßige und niedrige Leitfähigkeits- und UV-Absorptionskurven über den pH-Bereich von 4 bis 6.

80984A/0669

Beispiel 3

Dieser Versuch wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung folgender
Amine und Aminosäuren:

0,110 Mol Ethylendiamin
0,245 Mol ß-Alanin
0,184 Mol Glycin
O,O6l3 Mol Glycylglycin.

Beim isoelektrischen Fokussieren auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise erhielt man einen pH-Gradienten zwischen pH 4 und 8, der 87 % des Abstandes zwischen den Elektrodenlösungen abdeckte.

In der in Beispiel 1 beschriebenen Säulentechnik erhielt man gleichmäßige und niedrige Leitfähigkeits- und UV-Absorptionskurven über den pH-Bereich von 4 bis 8.

Beispiel 4

Dieser Versuch wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung folgender
Aminosäuren:

0,2 Mol Glycin -

0,2 Mol Glycylglycin

0,30 Mol ß-Alanin.

Beim isoelektrischen Fokussieren erhielt man einen pH-Gradienten zwischen pH 3,7 und 5,2, der 92 % des Abstandes zwischen den Elektrodenlösungen abdeckte.

809844/0669

28U4Ö8

In der in Beispiel 1 beschriebenen Säulentechnik erhielt man gleichmäßige und niedrige Leitfähigkeits- und UV-Absorptionskurven über den pH-Bereich von 3,7 bis 5,2.

Beispiel 5

0,04 Mol Ammoniumchlorid
0,11 Mol 6-Aminocapronsäure
0,08 Mol ^-Aminobuttersaure
0,08 Mol ß-Alanin
0,03 Mol Glycin
0,06 Mol Glycylglycin
0,07 Mol Iminodiessigsäure
0,06 Mol d,!-Glutaminsäure
0,07 Mol d,l-Asparaginsäure
0,04 Mol Natriumhydroxid.

Beim isoelektrischen Fokussieren erhielt man einen pH-Gradienten zwischen pH 2,5 und 5,3, der 95 % des Abstandes zwischen den Elektrodenlösungen abdeckte.

Bei der in Beispiel 1 beschriebenen Säulentechnik erhielt man gleichmäßige und niedrige Leitfähigkeits- und UV-Absorptionskurven über den pH-Bereich von 2,5 bis 5,3·

Beispiel 6

Die Synthese wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung folgender Amine und Aminosäuren:

8098U/0689

28U408

0,13 Mol Ethylendiamin
0,24 Mol ß-Alanin
0,22 Mol Glycin
0,03 Mol Glycylglycin.

Nach dem Entsalzen wurde die Synthese an 50 g eines Kationenaustauschers absorbiert, der eine Kapazität von 3,0 m Äquivalenten je g aufwies (CM Sephadex C-25, Kügelchen von mit Epichlorhydrin vernetztem Dextran, das mit Carboxymethylgruppen substituiert war, von Pharmacia Pine Chemicals AB, Uppsala, Schweden). Der Ionenaustauscher wurde mit Wasser gewaschen, wonach der Ampholyt mit einer IM Natriumchloridlösung freigesetzt wurde. Nach einer weiteren Entsalzung wurde der Ampholyt auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise verdampft.

Beim isoelektrischen Fokussieren erhielt man einen pH-Gradienten zwischen pH 7 und 9, der 78 % des Abstandes zwischen den Elektrodenlösungen abdeckte.

In der in Beispiel 1 beschriebenen Säulentechnik erhielt man gleichmäßige und niedrige Leitfähigkeits- und UV-Absorptionskurven über den pH-Bereich von 7 bis 9·

Beispiel 7

Die Synthese wurde auf die gleiche Weise wie in Beispiel 6 beschrieben durchgeführt, jedoch unter Verwendung folgender Amine und Aminosäuren:

0,075 Mol Ammoniumchlorid
0,068 Mol Ethylendiamin
0,050 Mol Glycin
0,100 Mol 6-Aminocapronsäure

809844/0689

28U408

0,075 Mol Glycylglycin

O₃175 Mol ß-Alanin

0,075 Mol Natriumhydroxid.

Zusätzlich wurde der Ampholyt auf 15O g Ionenaustauscher adsorbiert.

Beim isöelektrischen Fokussieren erhielt man einen pH-Gradienten zwischen pH 5 und 8, der 75 % des Abstandes zwischen den Elektrodenlösungen abdeckte.

In der in Beispiel 1 beschriebenen Säulentechnik erhielt man gleichmäßige und niedrige Leitfähigkeits- und UV-Absorptionskurven über den pH-Bereich von 5 bis 8.

Beispiel 8

0,10 Mol Arginin

0,10 Mol 3,3'-Bis-aminopropylamin

0,05 Mol Lysin

0,05 Mol Ν,Ν-Diethylaminoethylamin

0,20 Mol d,l-Histidin.

In diesem Falle wurden 0,40 Mol Epiehlorhydrin verwendet.

Beim isoelektrischen Fokussieren erhielt man einen pH-Gradienten zwischen pH 8 und 10,5, der 80 % des Abstandes .zwischen den Elektrodenlösungen abdeckte.

In der in Beispiel 1 beschriebenen Säulentechnik erhielt man gleichmäßige und niedrige Leitfähigkeits- und UV-Absorptionskurven über den pH-Bereich von 8 bis 10,5.

Beispiel 9

Gleiche Mengen anteile der gemäß Beispiel 5, 7 und 8 herge- · stellten Ampholytlösungen wurden miteinander vermischt und das Gemisch durch isoelektrisches Fokussieren getestet. Man erhielt einen pH-Gradienten zwischen pH 2,5 und 10,5, der 95 % des Abstandes zwischen den Elektrodenlösungen abdeckte.

Für: Pharmacia Fine Chemicals AB Uppsala_f Schweden

/■

. Wolff

Rechtsanwalt

809844/0689

Claims

BEIL, WOLFF £ BEIL 33 Son! 1978 RECHTS ^'A'*·."'E ADELONC ι KASSE ί= 3 2814408 FRANKFURTAM MAIN 80 Patentansprüche:

1. V/asserlöslicher Ampholyt, dadurch gekennzeichnet, daß er das Reaktionsprodukt aus

R²
R¹ - N^ (I)

worin R¹ Wasserstoff, die Gruppe H₂N-(CH₂) -,in der η eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, oder die Gruppe H₂N-(CH₂) -NH-(CH₂) -, und R² und R⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Hydroxyethyl bedeuten oder mit dem dazwischenliegenden Stickstoffatom eine Imidazolyl-, Morpholinyl- oder Piperazinylgruppe " bilden, oder Di- oder Tripeptiden, wobei die Aminosäuren und die Di- und Tripeptide mindestens 1 Stickstoffatom mit 1 oder 2 daran gebundenen Wasserstoffatomen enthalten und keine anderen aromatischen Gruppen als Imidazolyl enthalten und ein Molekulargewicht von höchstens 200 aufweisen, wobei mindestens eine dieser Verbindungen mindestens eine Carboxylgruppe enthält.oder einem Salz dieser Verbindungen und

/0S69

281UG8

Alkylenkette gebunden ist,

in einem Molverhältnis von b) zu Q) von 1:2 bis 9:10, vorzugsweise 2:3 bis 7:8, enthält.

2. Wasserlöslicher Ampholyt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bifunktionelle Alkylierungsmittel folgende Formel, aufweist:

H₂C - CH - CH₂ - Y (II)

OH
X - CH₂ - CH - CH₂ - Y (III)

Y
oder X - CH₂ - CH - CH₃ - OH (IV)

worin X und Y gleich oder verschieden sind und jeweils ein Halogenatom, vorzugsweise Chlor oder Brom, bedeuten.

3· Wasserlöslicher Ampholyt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß er das Reaktionsprodukt aus den Verbindungen a) und b) enthält, das anschließend mit einer Halogenessigsäure behandelt wurde, vorzugsweise in Form eines Salzes mit einem Alkalimetall.

4. Verfahren zur Herstellung eines wasserlöslichen Ampholyten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) eine oder mehrere Aminosäuren, Hydroxylamine, Amine der allgemeinen Formel

R¹ - W (I)

8098U/06BÖ

M "Z. _

28U408

worin R Wasserstoff, die Gruppe H₉N-(CH₃) -,in der η eine ganze Zahl von 2 bis 6 ist, oder die Gruppe H₂N-(CH₂) -NH-(CH₂) - und R² und R⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Hydroxyethyl bedeuten oder mit dem dazviischenliegenden Stickstoffatom eine Imidazolyl-, Morpholinyl- oder Piperaziny!gruppe bilden, oder Di- oder Tripeptide, wobei die Aminosäuren und die Di- und Tripeptide mindestens ein Stickstoffatom mit 1 oder 2 daran gebundenen W.asserstoffatomen enthalten und keine anderen aromatische Gruppen als Imidazolyl enthalten und ein Molekulargewicht von höchstens 200 aufweisen, wobei mindestens eine dieser Verbindungen mindestens eine Carboxylgruppe enthält, oder ein Salz dieser Verbindungen mit

in einem Molverhältnis von b) zu 05) von 1:2 bis 9:10, vorzugsweise 2:3 bis 7:8, umsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch ¹J, dadurch gekennzeichnet, daß man. als bifunktionelles Alkylierungsmittel eine Verbindung der Formel

H„C - CH - CH₀ - Y . (II)

²\ / ²

80984Ä/066©

28U408

OH X - CH₀ - CH - CH„ - Y (HI)

Y
oder X - CH₂ - CH - CH₂OH (IV)

verwendet, worin X und Y gleich oder verschieden sind und ein Halogenatom, vorzugsweise Chlor oder Brom, bedeuten.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man das erhaltene Reaktionsprodukt anschließend mit einer Halogenessigsäure.vorzugsweise in Form eines Salzes mit einem Alkalimetall behandelt.

809 8 4 4/0689