DE2756110C2

DE2756110C2 - Verfahren zum Herstellen eines diagnostischen Gerätes und Verwendung des diagnostischen Gerätes

Info

Publication number: DE2756110C2
Application number: DE2756110A
Authority: DE
Inventors: William Albert Ballston Lake N.Y. Healy; David Augustur Schenectady N.Y. Vermilyea; William Jessup Ward Iii
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1976-12-20
Filing date: 1977-12-16
Publication date: 1987-02-05
Also published as: FR2374634A1; FR2374634B1; JPS5396317A; JPS6050302B2; DE2756110A1; US4090849A; GB1538837A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen eines diagnostischen Gerätes zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit ausgewählter biologischer Teilchen in einer Flüssigkeitsprobe durch Auswählen eines Metallsubstrates, Oxidieren der Oberfläche, um darauf eine Oxidschicht mit einer Dicke im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 nm zu erzeugen und Aufbringen einer Proteinschicht auf mindestens einen Teil der Oxidschicht. Die Erfindung betrifft weiter die Verwendung des hergestellten diagnostischen Gerätes.
Ein Verfahren der vorgenannten Art ist in der US-PS 39 26 564 beschrieben. Bei diesem Verfahren erhält man ein diagnostisches Gerät mit einem Überzug aus einer Metallegierung aus einem Edelmetall, wie Gold oder Silber und einem oxidierbaren Metall, wie Indium oder Zinn.
Bei einem anderen diagnostischen Gerät, das in der US-PS 39 79 184 beschrieben und beansprucht ist, ist eine nichttransparente Metalloberfläche (festes Metall oder ein nichttransparenter Metallüberzug auf einem anderen Substrat), die ein verhältnismäßig schlechter Lichtreflektor ist, mit einer dünnen transparenten ersten Schicht aus dielektrischem Material bedeckt. Diese erste Schicht wiederum trägt eine transparente zweite Metallschicht auf der äußeren Oberfläche.
Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten Proteine als einen wesentlichen Teil, während alle Antikörper Proteine sind. Proteine sind große Moleküle hohen Molekulargewichts, d. h. Polymere aus Ketten variabler Anzahl von Aminosäuren. Ein gegebenes proteinartiges Material umfaßt Einheiten, z. B. Proteinmoleküle, Zellen usw., die nicht aneinander haften. Wenn daher ein proteinartiges Material in Berührung mit einem Substrat gebracht ist, dann schlägt es sich als einzige Schicht nieder. Sind die Einheiten von Molekulargröße, dann ist die erhaltene einzige Schicht monomolekular. An einer bereits abgeschiedenen Proteinschicht haftet kein anderes willkürliches Protein. Ein spezifisch mit dem abgeschiedenen Protein reagierendes Protein wird jedoch eine immunologische Verbindung damit eingehen. Gemäß den Lehren der oben genannten US-PS wird diese Feststellung ausgenutzt zur Herstellung medizinisch diagnostischer Geräte, bei denen ein Objektträger eine erste daran haftende Proteinschicht aufweist, und das Gerät wird zur Untersuchung von Flüssigkeitsproben benutzt, in denen man die Anwesenheit des spezifisch damit reagierenden Proteins annimmt. Ist das spezifisch reagierende Protein in dieser Probe vorhanden, dann weist der Objektträger, nachdem man ihn dieser Probe ausgesetzt hat, eine doppelte Proteinschicht auf. Ist dagegen das spezifische reagierende Probein in der Probe nicht vorhanden, dann weist der Objektträger auch nach dem Eintauchen in die Probe nur die ursprüngliche einzige Schicht auf.
Der in der vorliegenden Anmeldung benutzte Begriff " biologisches Teilchen" soll kleinere Proteine, z. B. Plasmaproteine, Antigene, Antikörper, Lectine und Körper aus proteinartigem Material, z. B. Viren, Bakterien, Zellen umfassen, die in der Lage sind, die Antikörpererzeugung anzuregen, wenn sie in ein Tier injiziert werden und/oder die Eigenschaft haben, spezifisch entweder immunologisch oder nichtimmunologisch in Wechselwirkung zu treten.
Der Begriff "Antigenmaterial" und der Begriff "nach Art eines Antigens aktives Material" bzw. "aktives Antigenmaterial" beschreibt ein Material, das Antigenstellen enthält, wie sie bei Viren, Bakterien usw. auftreten können.
Das in der Anmeldung als "visuelles Auslesen" bezeichnete Verfahren bedeutet, daß das Auslesen von einer Person vorgenommen werden kann, die über Normalsicht oder eine zu 20 : 40 korrigierbare Sicht verfügt, nicht farbenblind ist und nicht durch irgendwelche Instrumente unterstützt wird.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, das eingangs genannte Verfahren dahingehend weiterzubilden, daß man damit diagnostische Geräte erhält, die besser mit dem bloßen Auge auf die Anwesenheit oder Abwesenheit ausgewählter biologischer Teilchen untersucht werden können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß das Metall so ausgewählt ist, daß es die Bildung einer festhaftenden Oxidschicht auf der Oberfläche ermöglicht, vor dem Oxidieren ein Aufrauhen der Oberfläche des Metallsubstrates, damit diese Fläche nichtspiegelnd reflektiert, und ein chemisches Ätzen der Oberfläche erfolgt, um einen ersten vorausgewählten Reflektivitätswert dafür zu erhalten, wobei man durch das Oxidieren den ersten vorausgewählten Reflektivitätswert zu einem zweiten und größeren vorausgewählten Reflektivitätswert verändert, und die erhaltene Oxidschicht ebenfalls nichtspiegelnd reflektiert.
Das bevorzugte Metall ist Titan und die Reflektivität der modifizierten Oberfläche wird in Abhängigkeit von der nachzuweisenden immunologischen Reaktion ausgewählt. Das matte, nichtspiegelnd reflektierende Oberflächenaussehen der modifizierten Oberfläche hat den ausgeprägten Vorteil, daß darauf gebildete Zweischichtstellen, z. B. durch eine Antikörper-Antigenreaktion, mit dem bloßen Auge aus jedem Blickwinkel ohne spezielles Belichten gesehen werden können.
Die Erfindung wird im folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigt
Fig. 1 ein Fließbild, das das Herstellungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung veranschaulicht,
Fig. 2 einen schematischen Querschnitt durch das erfindungsgemäß hergestellte diagnostische Gerät,
Fig. 3 einen Querschnitt, der schematisch die aufgerauhte Oberfläche des Metallbleches zeigt und
Fig. 4 eine Ansicht ähnlich der nach Fig. 3, die die durch das Ätzen bewirkten Veränderungen zeigt.
Wie in Fig. 1 gezeigt, geht man aus von dünnem handelsüblichen Metallblech mit einer Dicke von z. B. etwa 0,25 mm, wobei das Metall ausgewählt ist im Hinblick auf die Fähigkeit, darauf eine festhaftende Oxidschicht zu bilden. Beispiele solcher geeigneten Metalle sind Titan, Tantal, Niob, Wolfram, Zirkonium und Wismut. Es wird angenommen, daß auch verschiedene Legierungen brauchbar sind. Die feste Haftung der Oxidschicht und deren Inertheit wird auf der Grundlage ermittelt, ob diese Oxidschicht die Herstellung und den Gebrauch des klinischen Gerätes übersteht. Nach der Auswahl des geeigneten Metallsubstrates wird die Oberfläche zuerst mit einem feinen Material sandgestrahlt, z. B. im Bereich von 320 Grit Aluminiumoxid bis 600 Grit Karborundum, um diese Oberfläche nichtspiegelnd reflektierend zu machen. Die Oberfläche weist nach dem Sandstrahlen eine relativ gleichmäßige Verteilung von Vertiefungen oder Grübchen auf. Die Spannweiten und Tiefen dieser Grübchen scheinen in der Größenordnung von 7 µm oder weniger zu liegen, wobei die meisten im Bereich von 0,5 bis 7 µm liegen. Diese Oberfläche wird als nächstes chemisch mit Säure geätzt, um das Ausmaß der Oberflächenaufrauhung zu verringern, d. h. den Grad, zu dem das Metall sich durch das Aufschlagen der Teilchen beim Sandstrahlen von der ursprünglichen Oberfläche aus erhoben hat, um dabei einen ersten vorausgewählten Reflektivitätswert zu erzeugen.
Um einen objektiven Standard zum Reproduzieren des Rauhigkeits- und Farbhelligkeitsgrades zu schaffen, wie er zum Herstellen eines annehmbaren diagnostischen Gerätes erwünscht ist, wurde ein gut kalibrierts Macbeth RD-100 Densitometer dazu benutzt, das Reflektionsvermögen der behandelten Metalloberfläche zu messen. Dieses Reflektionsvermögen wird nach der American Standards Association (ASA) als diffuse Reflektionsdichte gemessen. Die Skala dieses besonderen Instrumentes gibt ein lineares Maß der optischen diffusen Reflektionsdichte, und die Dichtegraduierungen befinden sich im gleichen Abstand voneinander. Eine Auswahl von Filtern ist für die jeweils benutzte besondere Lichtquelle vorgesehen. Die Werte für die Dichte-Einheiten wurden gemessen unter Verwendung einer handelsüblichen Wolframlampe (6,3 V, 0,15 A), deren Licht nicht ermüdet, verbunden mit einem handelsüblichen "visuellen" Filter. Die angewandten Meßbedingungen standen in Übereinstimmung mit der ASA Spezifikation PH. 2.17.-1958. Mit den in der vorliegenden Anmeldung aufgeführten Werten können Werte für andere Densitometer, die mit dem in der Anmeldung aufgeführten Werten vergleichbar sind, leicht bestimmt werden.
Die chemisch zu einer Reflektivität im Bereich von etwa 0,3 bis 0,5 Dichte-Einheiten (gemessen mit dem oben genannten Macbeth Densitometer) geätzten Plättchen haben sich als für den ersten vorausgewählten Reflektivitätswert brauchbar erwiesen. Je geringer der Wert der Dichteeinheiten, um so heller war das Aussehen der Oberfläche.
Das chemische Ätzen findet in einem vorzugsweise erhitzten Säurebad statt, in dem zwei oder mehr Säuren der Gruppen H₂SO₄, HNO₃ und HF vorhanden sind. Die ausgewählten Säuren sowie die eingesetzten Mengen davon und die Temperatur des Bades variiert mit dem jeweils für das Substrat ausgewählten Metall und der für optimal für das Herstellungsverfahren angesehenen Zeitdauer. Brauchbare Ätzbäder sind durch Routineversuche gemäß den hierin angegebenen Richtlinien ermittelbar. Es wurde festgestellt, daß durch Anwenden von Ultraschall während des Ätzens ein saubereres Produkt erhalten wird. Ein für Titan-, Tantal- und Niobsubstrate brauchbares Säureband enthält 3 Vol.-% gleicher Volumina von HF und HNO₃ erwärmt auf 35°C.
Danach wird das chemisch geätzte Blech anodisch zur Bildung einer Oxidschicht 11 mit einer Dicke im Bereich von etwa 10 bis etwa 50 nm oxidiert, wobei die wie vorher beschrieben behandelte Oberfläche ein mattes Aussehen annimmt und nichtspiegelnd reflektiert. Die bevorzugte Dicke der Oxidschicht liegt im Bereich von etwa 25 bis etwa 30 nm.
Die Dicke der zu verwendenden Oxidschicht ist derart, daß ein zweiter vorausgewählter Reflektivitätswert erhalten wird, der wiederum in dem Wissen ausgewählt wird, welche Proteinschicht darauf abgeschieden wird und welche Farbveränderung aufgrund der nachzuweisenden Reaktion zu erwarten ist. Es wurde festgestellt, daß im allgemeinen für größere Proteinmoleküle die brauchbare Reflektivität nach dem anodischen Oxidieren im Bereich bis herunter zu 0,50 Dichte-Einheiten oder weniger liegen kann, während für kleinere Proteinmoleküle die brauchbare Reflektivität nach dem anodischen Oxidieren einen Wert von etwa 0,85 Dichte-Einheiten hat. Bei der Herstellung eines diagnostischen Gerätes zum Nachweisen einer spezifischen Reaktion ist der zweite vorausgewählte Reflektivitätswert numerisch größer als der erste vorausgewählte Reflektivitätswert.
Obwohl die Herstellung der Oxidschicht am bequemsten durch anodisches Oxidieren erfolgt, ist es möglich, die Oxidation auch durch Erhitzen in einer oxidierenden Umgebung auszuführen. In diesem Zusammenhang wird Bezug genommen auf das Buch L. Young, "Anodic Oxide Films", (Academic Press 1961) und das buch von M. R. Rife und F. Kovitz, "Introducition to Organic Electrochemistry", (Marcel Dekker Inc., 1974).
Um die verschiedenen gewünschten Reflektivitätswerte unter Verwendung eines gegebenen Bades für die anodische Oxidation herzustellen, muß nur die Spannung verändert werden, d. h. eine geringere Spannung führt zu einem heller gefärbten Trägerblech. Für Tantalsubstrate führt eine Veränderung von 0,2 V bei der Spannung zu einer Änderung von 0,3 bis 0,4 nm bei der Oxidschichtdicke. Wegen dieser Empfindlichkeit gegenüber Spannungsänderungen sollten diese Änderungen durch Anwendung einer geeigneten Schaltung möglichst gering gehalten werden. Nachdem ein Wert für den zweiten vorausgewählten Reflektivitätswert festgelegt worden ist, wird das anodische Oxidieren solange ausgeführt, bis dieser Wert erreicht ist.
Die mit dem Oxid bedeckte Metalloberfläche wird als nächstes mit einer Proteinschicht 12 auf mindestens einem Teil der behandelten Metalloberfläche versehen, z. B. einer Schicht aus aktivem Antigenmaterial, das spezifisch mit ausgewählten biologischen Teilchen reagiert, wen es diesen ausgesetzt wird. Nach dem Spülen kann das diagnostische Gerät 13 verwendet und zum Verkauf verpackt werden.
Bei Gebrauch wird die auf die Anwesenheit der ausgewählten biologischen Teilchen zu prüfende Flüssigkeitsprobe auf einen Teil der bereits darauf befindlichen spezifischen Proteinschicht, z. B. als diskrete Tropfen aufgebracht. Sind die ausgewählten biologischen Teilchen in der Flüssigkeitsprobe vorhanden, dann treten sie mit dem spezifischen Protein in Wechselwirkung und wo diese Berührung stattfindet, entwickelt sich eine zweite Proteinschicht. Dieser Doppelschichtbereich sollte aufgrund des Farbkontrastes gegenüber der einfachen Proteinschicht mit dem bloßen Auge auf der matten hellgefärbten nichtspiegelnd reflektierenden Oberfläche leicht sichtbar sein, wenn für die zweite vorausgewählte Reflektivität der richtige Wert ausgewählt worden ist. Sind dagegen in der Flüssigkeitsprobe die ausgewählten biologischen Teilchen nicht vorhanden, dann entwickelt sich natürlich keine zweite Schicht.
Dieses Verfahren ist gleichermaßen anwendbar auf diskrete Metallteile, z. B. solche mit den Abmessungen 2,5 cm × 5 cm × 0,25 mm Dicke, wie auf ein kontinuierliches Metallband z. B. ein solches mit 2,5 cm Breite und 0,25 mm Dicke.
Das vorbereitete Substrat, d. h. vor dem Aufbringen der Proteinschicht zur Erzeugung des fertigen diagnostischen Gerätes, ist zum Nachweis der Erscheinung, bei der biologische Teilchen spezifisch miteinander in Wechselwirkung treten, in weitem Rahmen anwendbar. Die bevorzugte Konstruktion des diagnostischen Gerätes ist jedoch die, bei der die Schicht 12 aus Antigenmaterial besteht.
Es ist eine einfache Sache, den zweiten vorausgewählten Reflektivitätswert, der für eine gegebene spezifische Reaktion für die anodisch oxidierte Oberfläche benutzt werden soll, auszuwählen. Nachdem man die spezifische Reaktion bestimmt hat und von einem Metallsubstrat ausgegangen ist, das wie hierin beschrieben hergestellt wurde, um eine anodisch oxidierte Oberfläche mit einer Reflektivität von 0,80 Dichte-Einheiten zu haben, werden die richtige erste und die zweite Schicht biologischer Teilchen aufgebracht und untersucht. Erhält man einen nur ungenügenden Kontrast, dann kann man leicht bestimmen, ob die Reflektivität verringert, z. B. für heller gefärbte Oberflächen, oder erhöht, z. B. für dunkler gefärbte Oberflächen, werden soll. Die optimale Reflektivität für den maximalen Kontrast ergibt sich durch routinemäßiges Variieren der nacheinander hergestellen Substrate.
Sind die Metallplättchen nur durch das oben beschriebene Oberflächenaufrauhen und das oben beschriebene anodische Oxidieren hergestellt worden, dann ergaben sich dunkle Plättchen, die nur einen schlechten Fleckkontrast ergaben. Dasselbe Ergebnis wurde erhalten, wenn man die Metallplättchen durch wie oben beschriebenes chemisches Ätzen und wie oben beschriebenes anodisches Oxidieren herstellte.
Gute Plättchen wurden dagegen aus Titan nur durch anodisches Oxidieren des Substrates erhalten, wenn das Substrat bereits eine sehr glatte Oberfläche hatte, doch wurde das visuelle Ablesen durch die Notwendigkeit kompliziert, das Plättchen in genau der richtigen Weise zu halten, damit das Licht reflektiert wurde und man in der Lage war, die darauf gebildeten Flecke mit zwei Schichten zu beobachten.
Mit dem oben beschriebenen Verfahren sind dagegen die Zweischichtstellen leicht von jedem Winkel aus auf der nichtspiegelnd reflektierenden Oberfläche sichtbar. Die Eigenschaft "nichtspiegelnd reflektierend" kommt durch die Schrittfolge des Aufrauhens und Ätzens zustande, während die Helligkeit der Farbe von der Spannung abhängt, die beim anodischen Oxidieren angewandt wurde.
Die beste Ausführungsform des diagnostischen Gerätes ist die folgendermaßen erhaltene:
Titanblech mit einer Dicke von 0,25 mm wurde einem Dampfsandblasen ausgesetzt, wozu 320 Grit Aluminumoxidpulver in Wasser eingebracht und unter Druck aufgesprüht wurde. Die erhaltene Oberfläche war dunkel und nichtspiegelnd reflektierend. Die typische Reflektivität für eine solche sehr gleichmäßig aufgerauhte Oberfläche beträgt etwa 0,70 Dichte-Einheiten und unter Vergrößerung erscheint die Außenlinie der erhaltenen Oberfläche wie die in Fig. 3 abgebildete. Dann wurde das aufgerauhte Titan chemisch geätzt mit einer 3 Vol.-% igen Lösung etwa gleicher Volumenteile Fluorwasserstoff- und Salpetersäure, die auf 35°C erwärmt war. Je nach der besonderen Konzentration der Ätzlösung wurde das Ätzen, das unter Anwendung von Ultraschallvibration erfolgte, für 30 bis 90 und vorzugsweise für etwa 50 Sekunden ausgeführt und man erhielt eine nichtspiegelnd reflektierende Oberfläche, die eine leicht silbrige Farbe aufwies. Das dadurch modifizierte Oberflächenprofil ist in Fig. 4 gezeigt und ergab eine Reflektivität von 0,40 + 0,2 Dichte-Einheiten. Als nächstes wurde die Titanfolie anodisch bei 11,5 V für etwa 15 Sekunden in 0,29 molarer Ammoniumpentaboratlösung anodisch oxidiert. Auf diese Weise anodisch oxidierte Substrate entwickeln eine Oxidschicht von etwa 30 nm Dicke und haben eine Reflektivität von 0,80 + 0,02 Dichte-Einheiten und eine bronze oder gelb/orange Färbung.
In einer spezifischen Konstruktion wurden die so erhaltenen Titansubstrate mit einer ersten Schicht aus Rinderserumalbumin versehen, gewaschen und getrocknet. Die vom Rinderserumalbumin bedeckte Oberfläche war auf der anodisch oxidierten Obefläche kaum nachweisbar. Dann wurde die Rinderserumalbuminschicht mit einer oder mehreren Tropfen Kaninchenantiserum BSA in Berührung gebracht und für etwa 4 Stunden inkubiert. Die Zweischichtstellen treten klar hervor, da sie eine rötliche Farbe haben, die deutlich mit der bronzegefärbten BSA bedeckten Schicht kontrastiert.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen eines diagnostischen Gerätes zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit ausgewählter biologischer Teilchen in einer Flüssigkeitsprobe durch Auswählen eines Metallsubstrats, Oxidieren der Oberfläche, um darauf eine Oxidschicht mit einer Dicke im Bereich von etwa 10 bis 50 nm zu erzeugen und Aufbringen einer Proteinschicht auf mindestens einen Teil der Oxidschicht, dadurch gekennzeichnet, daß
das Metall so ausgewählt ist, daß es die Bildung einer festhaftenden Oxidschicht auf der Oberfläche ermöglicht,
vor dem Oxidieren ein Aufrauhen der Oberfläche des Metallsubstrates, damit diese Fläche nichtspiegelnd reflektiert, und
ein chemisches Ätzen der Oberfläche erfolgt, um einen ersten vorausgewählten Reflektivitätswert dafür zu erhalten, wobei man durch das Oxidieren den ersten vorausgewählten Reflektivitätswert zu einem zweiten und größeren vorausgewählten Reflektivitätswert verändert, und die erhaltene Oxidschicht ebenfalls nichtspiegelnd reflektiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der erste vorausgewählte Reflektivitätswert vergleichbar einem Wert im Bereich von etwa 0,30 bis etwa 0,50 Dichte-Einheiten, wie sie auf einem Macbeth RD-100 Densitometer unter Verwendung eines visuellen Filters gemessen werden, ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Aufrauhen unter Bildung von Grübchen bzw. Vertiefungen erfolgt, deren Spannweite und Tiefe je etwa 7 µm oder weniger betragen.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Metall ausgewählt ist aus Titan, Tantal, Niob, Zirkonium und Wismut.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichet, daß die Oxidschicht durch anodisches Oxidieren hergestellt ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das anodische Oxidieren in einer Ammoniumpentaboratlösung ausgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite vorausgewählte Reflektivitätswert vergleichbar einem Wert im Bereich von etwa 0,50 bis etwa 0,85 Dichte-Einheiten, wie sie auf einem Macbeth RD-100/Densitometer unter Verwendung eines visuellen Filters gemessen werden, ist.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das chemische Ätzen in einem Säurebad ausgeführt wird, das mindestens zwei Säuren aus der Gruppe Fluorwasserstoff-, Salpeter- und Schwefelsäure enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke der Oxidschicht im Bereich von etwa 25 bis etwa 30 nm liegt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein ein aktives Antigenmaterial ist.

11. Verwendung eines nach den Ansprüchen 1 bis 10 hergestellten diagnostischen Gerätes zum Nachweisen der Anwesenheit oder Abwesenheit ausgewählter biologischer Teilchen in einer Flüssigkeitsprobe.