DE2732175A1

DE2732175A1 - Oxytocin-analoga, ihre herstellung und pharmazeutische mittel

Info

Publication number: DE2732175A1
Application number: DE19772732175
Authority: DE
Inventors: Tomislav Dr Barth; Joseph Henry Dr Cort; Karel Dr Jost; Zdenek Dr Veznik
Original assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Current assignee: Czech Academy of Sciences CAS
Priority date: 1976-07-16
Filing date: 1977-07-15
Publication date: 1978-02-02
Also published as: NL7707939A; BE856553A; CS194980B1; IT1143741B; US4237119A; GB1560958A; CA1069436A; AU2666777A; JPH0357083B2; DK156198C; US4349544A; FR2358160A1; AU510212B2; DK156198B; SE7707174L; NZ184655A; JPS5420140A; FR2358160B1; DE2732175C2; DK312177A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf Oxytocin-Analoga, die als Mittel bzw. Wirkstoff in Mitteln insbesondere zur Einleitung der Entbindung, einer Erleichterung der Befruchtung sowie einer Erhöhung der Milchbildung bei Menschen und Säugetieren, vor allem bei Nutzvieh, vorteilhaft verwendbar sind, ferner auf ihre Herstellung und pharmazeutische Mittel.

Aus der Fachliteratur ist bekannt, daß das natürliche Hormon Oxytocin sowohl eine Kontraktion der Gebärmutter im letzten Driitel der Schwangerschaft als auch eine Kontraktion des Ovidukts und der Milchsammelkanäle bewirkt, was

233-(S9131)-PSE

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mit einer Ejektion von Milch verbunden ist. Das natürliche Hormon hat jedoch zwei wesentliche Nachteile: a) Die Wirkungsdauer nach der einzelnen Verabreichung ist nur sehr kurz, so daß beispielsweise während einer Entbindung Injektionen von Oxytocin in 30-Minuten-Intervallen verabreicht werden müssen, was schwierig ist und für den Arzt wie auch den Tierarzt oft aus praktischen Gründen völlig ausgeschlossen ist; b) Oxytocin verursacht ferner eine Vasokonstriktion des Uterus, was sowohl für die Frucht als auch die Nidation eines befruchteten Eies ungünstig ist.

Es bestand daher ein großes Interesse daran, über ein Oxytocikum zu verfügen, das, beispielsweise bei Verabreichung durch Injektion, eine über viele Stunden anhaltende Wirkung besitzt.

Analoga von Oxytocin mit verlängerter oxytozischer Wirksamkeit wurden bereits beschrieben, vor allem l-Desamino-1.6-dicarba-oxytocin (Kobayashi A., Hase S., Kiyoi R., Sakakibara S.: BuI. Chem. Soc. Japan 4£, 3Ί91 (1969); Walter R., Yamanaka Y., Sakakibara S.: Proc. Nat. Acad. Sei. US 71., 19OI (197¹O); Dicarba-Analoga des Oxytocins weisen zwar eine verlängerte Wirksamkeit auf, besitzen jedoch zugleich nur eine sehr niedrige spezifische Aktivität, so daß eine entsprechend große Menge solcher Produkte verwendet werden muß (vgl. Barth T., KrejSi I., Kupkovä B., JoSt K.: Eur. J. Pharmacol. 24, 183 (1973), Barth T., KrejSi I., VanSSkova J., JoSt K., Rychlik I.: Eur. J. Pharmacol. 2£, 67 (197¹O).

Es ist ferner ein kurzzeitig wirkendes Analogon von Oxytocin bekannt (£2-Tyr(OMe)3-oxytocin), das im Vergleich zu natürlichem Oxytocin eine um eine Größenordnung niedrigere Aktivität am Myometrium besitzt, dessen vasokonstriktive Wirkung jedoch um zwei Größenordnungen geringer ist (vgl. Hodr J., 5tembera Z.K., Brotänek V., Rudinger J.,

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Vondräfcek J.: The influence of methyloxytocin on glycide metabolismus of mother and foetus intrauterine dangers to the foetus, Excerpta Medica, Amsterdam 1966, S. 445), so daß bei Anwendung einer zehnfachen Menge von ^2-0-Methyltyrozin^-oxytocin als Oxytocin-Analogon zwar dieselbe Expulsionskraft aus dem graviden Uterus erzielbar ist, jedoch ohne den ungünstigen hypoxischen Einfluß auf die Frucht. Dieses kurzzeitig wirkende Analogon von Oxytocin wird bereits hergestellt und klinisch verwendet (Methyloxytocin SPOPA); seine pharmakologisch vorteilhaften Eigenschaften sind nachgewiesen (Bärtschi R., Hüter J., Römer V.W.: Geburtshilfe und Frauenheilkunde J>2, 826 (1972)).

Ahnlich wie bei Oxytocin muß jedoch auch hier durch kontinuierliche Infusion verabreicht und die Kontraktion des Uterus sowie die Herztätigkeit der Frucht sorgfältig mitverfolgt werden, um ungünstigen Einflüssen auf die Frucht vorzubeugen.

Diese Nachteile werden durch das erfindungsgemäße, langzeitig wirkende Strukturanalogon von Oxytocin bzw. durch diese Substanz enthaltende pharmazeutische Mittel behoben. Das erfindungsgemäße Oxytocin-Analogon stellt ein Strukturanalogon von Oxytocin dar, dessen Disulfidgruppe durch eine Thioäthergruppe ersetzt ist; es besitzt die Formel:

CH₂-CO-NH-CH-CO-IIe-GIn-ASn-CH-CO-PrO-LeU-GIy-NH₂ , CH₂ Y CH₂

worin bedeuten:

X=H oder CH,, und

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Y s CH₂-S oder S-

Die wirksame Dosis beträgt 10 ng bis 100 .ug pro kg Körpergewicht.

Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäße Substanz bzw. pharmazeutische Mittel, die sie als Wirkstoff enthalten, vor allem auf folgenden Indikationsgebieten vorteilhaft anwendbar sind:

1) Zur Einleitung der Entbindung in der Human" und Veterinärmedizin,

2) zur Erleichterung der Befruchtung in der Human- und Veterinärmedizin nach künstlicher Insemination sowie

3) zur Ejektion von Milch bei Zuchttieren.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Analoga von Desamino-oxytocin der Formel I erfolgt durch an sich bekannte Verfahren zur Synthese von Peptiden in Lösung (Jost K.: Collection, Czechoslov. Chem. Commun. ^6, 218 (1971); JoSt K., Sonn F.: Collection Czechoslov. Chem. Commun. 3£, 234 (1971); Rudinger J., JoSt K.: CS-PS 1*»9 028).

Die Produkte wurden für die Untersuchungen in Form eines gefrorenen Pulvers aufbewahrt; die chemischen, physikochemischen und pharmakologischen Eigenschaften einiger ausgewählter Vertreter sind in der Tabelle I aufgeführt.

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Verbindung	Formel (MC)	4HgO	ber.	C	Analyse % H	% N	Optische Drehung D (Lösungs mittel)	Verteilungs koeffizient K	•	Dünnschicht chromatogra phie ^RF
Ia X=H, Y=CHg-S	^C44^H67^N11°12^S*		gef.	50,52	7,23	14,73	-71,7°	2,15	0,20(SBN)
	(1046)	IHgO	ber.	50,42	6,62	14,61	(Wasser)		0,35(SBA)
Ib X=H, Y=S-CHg	C₁₁₁₄H₆₇N_nO₁₂S.		gef.	53,26	7,01	15,53	-84,5°	1,95	0,20(SBN) ^
	(992)	2HgO	ber.	53,13	7.09	14,90	(IH-CH₃COOH)		0,35(SBA) 2 ro
Ic C=CH₃,Y=CHg-S	^C45^H69^NU°12^S·		gef.	52,78	7,18	15,5	-69.0°	3,15	cn 0,35(SBN)
	•'(1024)		52,29	6,90	14,88	(IM-CH₃COOH)	0,36(SBA)

K = Verteilungskoeffizient im System 2-Butanol und 0,05 t Essigsäure; SBN = 2-Butanol. 25 % Ammoniak, Wasser (85:7,7:7,5) ; SBA - A-Butanol, 90 % Ameisensäure, Wasser (75:13,5:11,5).

Angewandte Testverfahren: A s isolierter Rattenuterus, B = uterotonische Aktivität der Ratte in situ, C s vasodepressorische Aktivität (Hahn), D s isolierte Milchdrüse (Ratte), E s Laktationsaktivität in vivo (Ratte), F = antidiuretische Aktivität (Ratte).

Verbindung	• •	A	Biologische Aktivität (IU/ir.g)	B	C D	E	P	24
	1899	1206	1127 581	604	118
Ia X=H, Y=CH₂-S	929	2792	571 755	456	0,9
Ib IC=H, Y=S-CH₂	10	40	67	35
Ie C=CH,,Y=CH₂-S

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ORIGINAL INSPECTED

Sämtliche Substanzen sind in Wasser gut löslich; die Injektionslösungen wurden durch Auflösen von 0,1 mg der Verbindungen in 1 ml physiologischer Lösung unter sterilen Bedingungen und unter Einstellung des pH-Wertes auf 3 bis Ί hergestellt. Die Lösungen wurden unter sterilen Bedingungen bei 5 °C gelagert.

Die Anwendung der erfindungsgemäßen Substanzen sowie der erfindungsgemäßen Mittel, die diese Substanzen als Wirkstoff enthalten, bietet zahlreiche pharmakologische und klinische Vorteile:

1) Sowohl im Hinblick auf eine Kostensenkung in der ärztlichen Fürsorge als auch zur Sicherung der Gesundheit von Neugeborenen ist es erwünscht, über langfristig wirkende Oxytocine zu verfügen, mit denen der gesamte Entbindungsvorgang durch eine einzige Injektion hervorgerufen werden kann, was durch intravenöse Gabe von 5 /Ug/kg der erfindungsgemäßen Oxytocine möglich ist.

Bei Kälbern ist es für deren Gesundheit wichtig, ihnen einen möglichst raschen Zugang zum Kolostrum als Quelle von Immunglobulinen zu ermöglichen. Dies ist verständlicherweise umso mehr möglich, wenn die Entbindung während der normalen Arbeitszeit vor sich geht, da die erfindungsgemäße Verwendung der beanspruchten Oxytocin-Analoga zu einer langanhaltenden Wirkung führt.

Diese Wirkung wird erzielt

a) durch Abwesenheit einer N-Ot-Aminogruppe von L-Cystein, wodurch eine Aminopeptidase-Spaltung der Moleküle und Entstehung inaktiver Produkte verhindert wird;

b) durch Substitution der Disulfidbindung durch eine

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Thioätherbindung, die eine Inaktivierung der Moleküle verhindert, sowie

c) durch allfällige Substitution der Hydroxylgruppe von 2-Tyrosin durch eine Methoxylgruppe.

Einen weiteren Vorteil der Verwendung der erfindungsgemäßen Analoga von Oxytocin stellt der Umstand dar, daß die Entbindung beispielsweise frühmorgens an einem normalen Arbeitstag eingeleitet werden kann und die Entbindung am gleichen Tage nachmittags eintritt. Die Induktion der Entbindung kann ferner auch mehrere Tage vor einer vorausgesetzten Spontanentbindung vorgenommen werden.

Bei Mutterschweinen ist die Entbindung; einer größeren Zahl von Ferkeln oft für das Muttertier sehr erschöpfend, weshalb oftmals die letzten Ferkel anoxisch werden und sterben oder vom Muttertier zurückgewiesen werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen beschleunigen die Entbindung in gleichen Dosen, ohne eine durch Vasokonstriktion des Uterus verursachte Anoxie hervorzurufen.

2) Bei geringen Dosen (1 /Ug/kg), die mit einer einmaligen Injektion verabreicht werden, wird eine andauernde Entleerung des Euters erzielt und so die Entnahme der Milch erleichtert.

Es war zwar bekannt, daß die Oxytocin-Analoga einen anhaltenden kontraktiven Einfluß auf isolierte Milchdrüsen von Ratten aufweisen (Barth T., Jost K., Rychlik L.: Endocrinol. exper. £, 35 (1975); Barth T., Flegel M., Jost K.: Endocrinol. exper. K), 65 (1976)), jedoch konnte erst aufgrund des nachstehenden Beispiels 1 nachgewiesen werden, daß eine Gabe bei einer nicht anästhetisierten Kuh eine über viele Stunden anhaltende Milchejektion hervorzurufen vermag.

Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen 709885/0722

-Jr-

näher erläutert.

Beispiel 1

Auslösung der Entbindung und Induktion der Milchejektion bei Kühen.

Die in Tabelle I angeführten Verbindungen sind Oxytocin-Analoga, die meist eine höhere Aktivität besitzen (Barth T., Krej6i I., Kupkovä B., JoSt K.: Europ. J. Pharmacol. 2_4, (1973)) und eine verlängerte Wirkung einzelner Kontraktionen am Rattenuterus in vivo (Barth T., KrejSi I., Van8c*kova J., JoSt K., Rychlik I.: Europ. J. Pharmacol. 2Jj, 67 (197¹O) im Vergleich zum natürlichen Hormon aufweisen. Da die entsprechenden Versuchsbedingungen keinen Schluß darauf erlaubten, ob eine protrahierte Wirkung auch bei trächtigen Tieren beobachtet werden kann, und ob nicht bei anästhetisierten normalen Tieren vorteilhafte Phasenkontraktionen hervorgerufen werden, die eine Abtreibung der Frucht erleichtern, wurden folgende Versuche durchgeführt:

Zu den Versuchen wurde eine Kuh mit einem Körpergewicht von 630 kg herangezogen, die im 287. Tag der Trächtigkeit stand und deren vorausberechneter Tag der Entbindung zwei Tage nach dem Versuch lag. Die Cervix war am äußeren Wall auf etwa 3 cm erweitert, jedoch am inneren Wall nicht geöffnet. Das Euter war gut mit Kolostrum gefüllt. Es wurden keinerlei Anzeichen spontaner Kontraktionen der Gebärmutter ermittelt und kein Eintritt der Frucht in die Entbindungswege festgestellt. Die Entbindung war daher offensichtlich noch nicht in Gang gekommen. Die Kuh erhielt in drei aufeinanderfolgenden Dosen 0,5, 1,0 und 1,5 mg des Analogon Ic (vgl. Tabelle I) in die Vena jugularis verabreicht. 5 Minuten nach der ersten Injektion hatte sich der Tonus der Gebärmutter erhöht, und es wurde eine spontane Ejektion von Kolostrum festgestellt, die bis etwa 6 Stunden nach der

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letzten Injektion andauerte. Da das Euter gefüllt blieb, mußte eine Bildung neuen Kolostrums vor sich gehen. Gleichzeitig begannen innerhalb 5 Minuten nach der ersten Injektion Kontraktionen der Gebärmutter. Es wurde keine tonische Kontraktion der Gebärmutter festgestellt, die über längere Zeit anhielt. Dabei traten Fötalbewegungen auf, wobei die Kuh "Entbindungsstellung" einnahm und Perioden des Liegens sowie ausgeprägter Bauchpreßaktivität als klinische Anzeichen des Entbindungsbeginns zeigte. Die Kontraktionen dauerten anfangs 2 bis 5 Minuten in Intervallen von 10 bis 20 Minuten Dauer, worauf deren Häufigkeit anstieg. Es wurden keinerlei klinische Anzeichen einer Toxizität im Hinblick auf die Respiration oder das Verhalten des Tieres wahrgenommen. Danach wurde der Eintritt der Frucht in die Entbindungswege sowie eine fortlaufende Erweiterung der Kehle festgestellt (50 min: äußerer Wall 7 cm, es wurde der Schleimpfropfen herausgedrückt; 60 min: äußerer Wall 8 cm, innerer Wall 2 cm; l80 min: äußerer Wall 8 cm, innerer Wall 3 cm; 280 min: äußerer Wall 10 cm, innerer Wall 5 cm usw.).

8 Stunden nach den Injektionen mit einer Dosis von 3 mg entsprechend 5/Ug/kg Körpergewicht des Tieres wurde ein gesundes Kalb geboren.

Da einzelne Injektionen des natürlichen Hormons Oxytocin nur während 20 Minuten verabreicht wurden, ist die Langzeitwirkung des angewandten Analogons nachgewiesen. Nach der Entbindung war die Kuh in einem guten Zustand, und die Laktation kam normal in Gang. Es wurden keinerlei Anzeichen einer Toxizität weder bei der Kuh noch beim Kalb beobachtet. Der Entbindungsverlauf war normal.

Der gesamte Vorgang kann durch einmalige intravenöse Injektion in die Vena jugularis nach Wunsch gegen Ende der erwarteten Entbindungszeit hervorgerufen werden.

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Gleiche Erfahrungen wurden bei einer trächtigen Sau erzielt, die 12 gesunde Ferkel zur Welt brachte. Außer der oben beschriebenen Induktion der Entbindung bei einer Kuh wurde die Entbindung daneben bei 6 weiteren KUhen induziert. Bei

4 KUhen wurde dabei das erfindungsgemäße Mittel bzw. die erfindungsgemäße Verbindung nur einmal in einer Dosis von

5 mg verabreicht. In zwei weiteren Fällen folgte darauf eine zweite Injektion von 2,5 mg pro Tier. Das mittlere Intervall zwischen der ersten Induktion und der Entbindung betrug 4,7 - 1,7 Stunden, und zwar innerhalb 0,5 bis 8,5 Stunden, was also entsprechend innerhalb der normalen Arbeitszeit liegt.

In sämtlichen untersuchten Fällen wurden keinerlei toxische Erscheinungen beobachtet; die Kontraktionen waren gut und wirksam, und es wurden gesunde, normale, nicht anoxische Kälber geboren, die nach der Geburt in gutem Zustand waren und keinerlei Anzeichen einer metabolischen Acidose aufwiesen. Die Kühe waren normal und die Milcherzeugung gut.

Beispiel 2 Erleichterung der Befruchtung, Einfluß auf den Ovidukt.

Es ist bekannt, daß Oxytocin einen kurzzeitigen peristaltischen Kontraktionseinfluß auf den Ovidukt hervorruft. Dieser Einfluß erleichtert und beschleunigt die Bewegung der Eier im Ovidukt in Richtung gegen den Hohlraum der Gebärmutter, wo eine bessere Ernährung und ein besseres Festhalten im Endometrium erzielt werden können, ohne daß es gleichzeitig zu einer Beeinflussung der Hämodynamik des Endometriums kommt.

Weibliche weiße Mäuse mit einem Gewicht von 20 g wurden durch Vaginalabstrich untersucht, um das östrale Stadium

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ihres Zyklus festzustellen. Die Mäuse im Oestrus wurden mit Pentobarbital anästhetisiert (30 mg/kg oder etwa 0,6 mg pro Maus; intraperitoneal); die Bauchhöhle wurde durch einen Querschnitt geöffnet und der Ovidukt mit sichtbarer Anhäufung von Eiern mit einem Sektionsmikroskop beobachtet. Unter den Anästhesebedingungen wurde keine peristaltische Bewegung des Ovidukts festgestellt. Es wurde intravenös eine Dosis von 2 ng/Maus Oxytocin injiziert; bei 10 Tieren wurde eine peristaltische Aktivität festgestellt, die während einer Dauer von 22,6 - 3,5 Minuten auftrat.

Die Verabreichung einer Dosis von 2 ng/Maus des Analogon Ib (vgl. Tabelle I), die intravenös durchgeführt wurde, führte zum gleichen Ergebnis, jedoch mit einer durchschnittlichen Dauer von 113 - 15 Minuten. Das Analogon Ic (vgl. Tabelle I) ergab die gleiche Wirkungsdauer, jedoch für eine Dosis von 20 ng/Maus.

Dieselben Versuche wurden nach künstlich hervorgerufener Ovulation durch Injektion von 20 Einheiten Gonadotropin aus einem Serum trächtiger Stuten (die Beobachtung erfolgte l8 Stunden nach der Gonadotropin-Injektion) mit den gleichen Ergebnissen wiederholt.

Bei Tieren wird zur künstlichen Befruchtung ein gefrorenes Sperma verwendet, das dabei einen Teil seiner Kapazität einbüßt. Die Häufigkeit der Trächtigkeit durch eine künstliche Insemination beträgt bei Kühen etwa 50 %. Ein Ansteigen dieses Wirkungsgrades hat daher eine große wirtschaftliche Bedeutung (vgl. Knifton A.: Res. vet. Sei. IjJ, 288 (1975)). Durch Verkürzung des für den Kontakt des Eies mit dem Sperma erforderlichen Zeitintervalls erhöht sich die Wahrscheinlichkeit einer Befruchtung (vgl. Guiloff E., Ibarra-Polo A.A., Gomez-Rogers C: Fertil. Steril. 2j>, 9*»6 (1971); Hauschild R., Seewald H.J.: Zenbl. Gynäk. 9£, IO3O (197Ό; Jones D.E.,

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Ruchesbusch Y., Bayard F.: J. Reprod. Pert. JO, 23 (1975)), insbesondere, wenn hierfür die erfindungsgemäßen Verbindungen bzw. die entsprechenden Mittel verwendet werden, die in den angewandten Dosen keine endometriale Vasokonstriktion verursachen. Da es erst einige Stunden nach der Insemination zu einem Kontakt zwischen Ei und Sperma kommen kann, ist daraus ersichtlich, daß die mit den erfindungsgemäßen Verbindungen bzw. Mitteln erzielbare langanhaltende Wirkung hauptsächlich dadurch eintritt, daß die Hyperperistaltik des Ovidukts erhalten bleibt.

Die Applikation erfolgt durch intravenöse Injektion (1 .ug/kg) gleichzeitig mit der Insemination.

In der Humanmedizin treten oft Fälle auf, in denen eine vorzeitige Entbindung aus bestimmten Gründen erwünscht ist, beispielsweise bei diabetischen Müttern, um ein übermäßiges Wachstum der Frucht zu verhindern. Hier ist eine intravenöse Applikation der erfindungsgemäßen Analoga in einer Dosis von 200 bis 300 »ug pro Patient bzw. der erfindungsgemäßen Mittel mit der entsprechenden Wirkstoffkonzentration vorteilhaft.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können sowohl als solche als auch in Form pharmazeutischer Zusammensetzungen unter Zusatz pharmazeutisch üblicher Hilfs- und Trägerstoffe hergestellt und appliziert werden.

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Claims

Ansprüche

1. Jbxytocin-Strukturanaloga der allgemeinen Formel

CH₂-CO-NH-CH-CO-IIe-GIn-ASn-NH-CH-CO-PrO-LeU-GIy-NH₂

worin bedeuten:

X=H oder CH und Y = CH₂-S oder S-CH₃.

2. Pharmazeutische Mittel für die Human- und Veterinärmedizin, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens eine der Verbindungen nach Anspruch 1, ggf. zusammen mit pharmazeutisch üblichen Hilfs- und Trägerstoffen, als Wirkstoff enthalten.

3. Pharmazeutische Mittel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Dosiereinheiten zu 10 ng bis 100 .ug/kg Körpergewicht vorliegen.

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