DE2652675A1

DE2652675A1 - N-acylderivate von thienamycin, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2652675A1
Application number: DE19762652675
Authority: DE
Inventors: Louis Barash; Burton Grant Christensen; John Hannah; William Joseph Leanza; David Houng-Min Shih
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1975-11-21
Filing date: 1976-11-19
Publication date: 1977-06-02
Also published as: FR2332016A1; SE7612960L; DE2652675C2; CH632509A5; NL7612940A; DK523276A; NL189298C; NL189298B; JPS5277083A; SE427840B; GB1570986A; JPS61346B2; FR2332016B1

Description

Patentanwälte: ^r roc^t

Dr. Dieter F. M ο rf

Dr. Hans-A. Brauns ^% /j% ¹⁹■ November 1976

8 München 88,Pitnzenauersir. 28 * .-_,,.„

MERCK & CO., INC. 126 East Lincoln Avenue, Rahway, N.J., V.St.A

N-Acy!derivate von Thienamycin, Verfahren zu deren Herstellung und diese enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft N-Acylderivate von dem Antibiotikum Thienamycin der folgenden allgemeinen Formel

COOH

1 2
worin R und R unabhängig voneinander Wasserstoff oder Acyl bedeuten. Solche Derivate und deren pharmazeutisch annehmbaren Salze sind als Antibiotika geeignet. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung dieser Derivate, von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche

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285.2875

diese Derivate enthalten und beschreibt auch die Behandlung durch die Verabreichung der Derivate und Zusammensetzungen, wenn antibiotische Wirkungen erzielt werden sollen.

Thienamycin ist das Ausgangsmaterial, das zur Herstellung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung benötigt wird und wird in der US-PS 3 950 357^beschrieben. Dieses Patent wird hinsichtlich der Offenbarung, besonders hinsichtlich der Herstellung und Isolierung von Thienamycin, hiermit einbezogen. Thienamycin hat die folgende Strukturformel:

OH

.N_

.SCH₂CH₂NH₂ COGH.

Die N-Acyl-Thienamycinderivate der vorliegenden Erfindung können durch die folgende Strukturformel II wiedergegeben werden:

OH

JsL

SCH₂CH₂NR¹R² COOM

+) (= DT-OS 25 52 638)

II

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oder, noch einfacher, durch das Symbol (II)

"OH

Th

NR R

.COOM

' II

worin "Th" den bicyclischen Kern des Thienamycins wiedergibt und die OH-, Amino- und Carboxylgruppen des Thienamycins angegeben sind.

M=H, ein Salzkation, ausgewählt aus Alkali- oder Erdalkalimetallen, wie Natrium, Kalium oder Calcium oder ein Aminsalz, wie NH^₃ N(R),, worin R ein Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, und dergleichen;

1 2
R und R sind unabhängig voneinander ausgewählt aus der

1 2 Gruppe, bestehend aus Wasserstoff (R _; und R sind nicht beide Wasserstoff) oder einer Acylgruppe. Die am meisten bevorzugten

\ Verbindungen der Erfindung sind solche, in denen R Wasserstoff

und R Acyl ist. Der Ausdruck "Acyl" schliesst durch Definition die Alkanoyle, einschliesslich Derivate und Analoge davon, ein, wie die Thioanalogen, bei denen der Carbonylsauerstoff durch Schwefel ersetzt ist, sowie auch Diacylreste, bei

1 2

denen R und R miteinander verbunden sind. Eingeschlossen sind auch Schwefel- und Phosphor-Acylanaloge, wie substituierte Sulfonyl-, Sulfinyl- und Sulfenyl-Reste und substituierte P(III)- und P(V)-Reste, wie die substituierten Phosphor-, phosphorig-, phosphonig- und phosphinig-Reste. Solche Acylreste gemäss der Erfindung werden weiter unten definiert.

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Es besteht ein ständiger Bedarf an neuen Antibiotika. Denn unglücklicherweise gibt es keine statische Wirksamkeit für ein gegebenes Antibiotikum, weil die fortwährende Anwendung im breiten Umfang eines solchen Antibiotikums selektiv die Bildung von resistenten Stämmen von Pathogenen erhöht. Darüberhinaus haben die bekannten Antibiotika den Nachteil, dass sie nur gegen gewisse Typen, von Mikroorganismen wirksam sind. Deshalb wird weiterhin nach neuen Antibiotika geforscht. - "

Unerwarteterweise wurde nun gefunden, dass die Verbindungen der vorliegenden Erfindung Antibiotika mit breitem Spektrum sind, die sowohl für tierische und Humantherapie und in unbeseelten Systemen nützlich sind.

Es ist darum ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine neue Klasse von Antibiotika zur Verfügung zu stellen, welche die grundlegende Kernstruktur des Thienamycins (I) haben, die jedoch dadurch gekennzeichnet sind, dass sie N-Acylderivate davon sind. Diese Antibiotika sind aktiv gegen einen breiten Bereich von Pathogenen, für welche sowohl gram-positive Bakterien repräsentativ sind, wie S. aureus, Strep, pyogenes und B. subtilis, und gram-negative Bakterien, wie E. coli, Proteus morganii, Serratia und Klebsie11a, repräsentativ sind. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, chemische Verfahren zur Verfügung zu stellen zur Herstellung solcher Antibiotika und deren nicht-toxischen pharmazeutisch annehmbaren Salze sowie

auch von pharmazeutischen Zusammensetzungen,· die solche Antibiotika enthalten. Die Erfindung beschreibt auch Verfahren zur Behandlung, bei denen solche Antibiotika und Zusammensetzungen verabreicht werden, wenn eine antibiotische Wirkung angezeigt ist.

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Bei einer allgemeinen Darstellung der Verbindungen gemäss der vorliegenden Erfindung (II, oben) können die Acylreste,

1 2

die durch entweder R oder R bezeichnet werden, unter anderem ein substituierter oder unsubstituierter aliphatischer, aromatischer oder heterocyclischen araliphatischer oder heterocyclylaliphatischer Carboxylsäurerest sein, ein substituierter oder unsubstituierter Carbamylrest oder ein Carbothiosäurerest. Eine Gruppe von Acylresten kann dargestellt werden durch die allgemeine Formel

X
-S-R" ,

worin X=O oder S bedeutet und R" bedeutet Wasserstoff; Amino; substituiertes Amino, wie Alkyl- und Dialkylamino, worin der Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; substituierte oder unsubstituierte Reste, wie: geradkettige oder verzweigtkettige Alkylreste, worin der Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; Mercapto, wie Alkylthio, typischerweise umfassend 1 bis 6 Kohlenstoffatome; Arylthio, typischerweise umfassend 6 bis 10 Kohlenstoffatome; Hydroxy, wie Alkoxy, typischerweise umfassend 1 bis 6 Kohlenstoffatome; Aryloxy, welches typischerweise 6 bis 10 Kohlenstoffatome umfasst; Alkenyl- oder Alkyny!gruppen, die typischerweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome umfassen; Aryl wie Phenyl; Aralkyl, wie Benzyl; Cycloalkyl, welches typischerweise 3 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; oder eine Heteroaryl- oder Heteroaralkylgruppe (mono- oder bicyclische), worin die Alkylgruppe typischerweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome umfasst und der hetero-

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cyclische Ring typischerweise U bis 10 Atome enthält und das Heteroatom oder die Heteroatome ausgewählt sind aus 0, N und S; die vorgenannten Gruppierungen können unsubstituiert sein oder sie können substituiert sein durch Reste₃ wie OH, SH, SR.(R ist Niedrigalkyl oder Aryl, wie Phenyl), Alkyl oder Alkoxygruppen mit 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, Halogen, wie Cl, Br, F und J, Cyano, Carboxy, SuIfamino, Carbamoyl, Sulfonyl, Azido, Amino, substituiertes Amino, wie Alkylamino einschliesslieh quaternäres Ammonium, worin die Alkylgruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome haben, Halogenalkyl, wie Trifluormethyl, Carboxyalkyl, Carbamoylalkyl, N-substituiertes Carbamoylalkyl, worin die Alkylgruppe der vorgenannten vier Reste 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome umfasst, Amidino, Guanidino, N-substituiertes Guanidino, Guanidinoniedrigalkyl und dergleichen. Typische Beispiele für solche Acylgruppen, die hier erwähnt werden können, sind solche, bei denen R" bedeutet Benzyl, p-Hydroxybenzyl, ^-Amino-^-carboxybutyl, Methyl, Cyanomethyl, 2-Pentenyl, n-Amyl, n-Heptyl, Äthyl* 3- oder 4-Nitrobenzyl, Phenäthyl, ß,ß-Diphenyläthyl, Methyldipheny!methyl, Triphenylmethyl, 2-Methoxyphenyl, 2,6-Dimethoxyphenyl, 2,4,6-Trimethoxyphenyl, 3i5-Dimethyl-ⁱi-isoxazolyl, 3-Butyl-5~ methyl-^-isoxazolyl, 5-Methyl-3~phenyl-¹t-isoxazolyl, 3-(2-Chlorphenyl)-5-methyl-4-isoxazolyl, 3-(2,6-Dichlorphenyl)-5-methyl-4-isoxyzolyl, D-ii-Amino-^-carboxybutyl, D_4-N-Benzoylamino-4-carboxy-n-butyl, p-Aminobenzyl, o-Aminobenzyl, m-Aminobenzyl, p-Dimethylaminobenzyl, (3-Pyridyl)-

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methyl, 2-Äthoxy-l-naphthyl, 3-Carboxy-2-chinoxalinyl, 3-(2_a6-Dichlorphenyl)-5-(2-furyl)-ⁱ»-isoxazolyl, 3-Phenyl-4-isoxazolyl, 5-Methy 1-3-(4-guanidinophenyI)-¹I-Isoxazolyl, Jj-Guanidinomethylphenyl, iJ-Guanidinomethylbenzyl, 4-Guanidinobenzyl, 4-Guanidinophenyl, 2,6-Dimethoxy-4-guanidino, o-Sulfobenzyl, p-Carboxymethylbenzyl, p-Carbamoylmethylbenzyl, m-Fluorobenzyl, m-Brombenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Methoxybenzyl, 1-Naphthy!methyl, 3-Isothiazolylmethyl, ^-Isothiazolylmethyl, 5-Isothiazolylmethyl, Guanylthiomethyl, ^-Pyridylmethyl, 5-Isoxazolylmethyl, M-Methoxy-5-isoxazolylmethyl, 4-Methyl-5-isoxazolylmethyl, 1-Imidazolylmethyl, 2-Benzofuranylmethyl, 2-Indolylmethyl, 2-Phenylvinyl, 2-Phenyläthynyl, 1-Aminocyclohexyl, 2- und 3-Tb.ienylaminomethyl, 2-(5-Nitrofuranyl)-vinyl, Phenyl, o-Methoxyphenyl, o-Chlorphenyl, o-Phenylphenyl, p-Aminomethylbenzyl, l-(5-Cyanotriazolyl)-methyl, Difluormethyl,.Dichlormethyl, Dibrommethyl, l-(3-Methylimidazolyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Carboxymethylthienyl)-methyl, 2- oder 3~(^~ Carbamoylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Methylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(Methoxythienyl)-methyl, 2-oder 3-(i}-Chlorthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Sulfothienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Carboxythienyl)-methyl, 3-(1,2,5-ThiadiazolyD-methyl, 3-(4-Methoxy-l,2,5-thiadiazolyl)-methyl, 2-Fury!methyl, 2-(5-Nitrofuryl)-methyl, 3-Furylmethyl, 2-Thienylmethyl, 3-Thienylmethyl, Tetrazolylmethyl, Benzamidinomethyl und Cyclohexylamidinomethyl.

Die Acy!gruppe kann auch ein Rest der Formel sein:

X
Il
-C(CH₂)_nZR"

worin X 0 oder S bedeutet und η 0 bis ¹I-ist und Z

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Sauerstoff, Schwefel, Carbonyl oder Stickstoff bedeutet und R" die vorstehend angegebene Bedeutung hat. Typische Glieder des Substituenten

-CCH₂)_nZR" ,

die hier erwähnt sein sollen, sind Allylthiomethyl, Phenylthiomethyl, Butylmercaptomethy1, cL-Chlorocrotylmercaptomethy1, Phenoxymethyl, Phenoxyäthyl, Phenoxybutyl, Phenoxybenzyl, Diphenoxymethyl, Dimethylmethoxymethyl, Dimethylbutoxymethyl, Dimethylphenoxymethyl, 4-Guanidinophenoxymethyl, !»-Pyridylthiomethyl, p-(Carboxymethyl)-phenoxymethyl, p-(Carboxymethyl)-phenylthiomethyl, 2-Thiazolylthiomethyl, p- (SuIf ο)-phen oxy methy l,p-( Carboxymethyl)-phenylthiomethyl, 2-Pyrimidinylthiomethyl, Phenäthylthiomethyl, l-(5>6,7j8~Tetrahydronaphthyl)-oxoniethyl, N-Methyl-M-pyridylthio, Benzyloxy, Methoxy, Äthoxy, Phenoxy, Phenylthio,· Amino, Methylamino, Dimethylamine, Pyridiniummethyl, Trimethylammoniummethy1,- Cyanomethylthiomethyl, Trifluormethylthiomethyl, i»-Pyridyläthyl, ^J-Pyridylpropyl, ^-Pyridylbutyl, 3-Imidazolyläthyl, 3-Imidazolylpropyl, 3-Imidazolylbutyl, 1-Pyrroloäthyl, 1-Pyrrolopropyl und 1-Pyrrolobutyl.

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Alternativ kann die Acy!gruppe ein Rest der Formel

-C-CHR"
R"¹

sein, worin R" die oben angegebene Bedeutung hat und R™ ein Rest ist, wie Amino, Hydroxy, Azido, Carbamoyl, Guanidino, Amidino, Acyloxy, Halogen, wie Chlor, Fluor, Brom, Jod, Sulfamino, Tetrazolyl, Sulfo, Carboxy, Carbalkoxy, Phosphono und dergleichen. Typische Glieder des Substituenten

-CHR"

■ R"^f ,

die hier erwähnt sein sollen, sind oC-Aminobenzyl, eC-Amino-(2-thienyl)-methyl, oe-(Methylamino)-benzyl, oGAminomethyl-

-s-

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mercaptopropyl, oC-Amino-3- oder -^-chlorbenzyl, c^ 3- oder -4-hydroxybenzyl, cC-Amino-2,ⁱt-dichlorbenzyl, oC-Amino-3jⁱt-dichlorbenzyl, D (-J-oC-Hydr oxy benzyl, oC-Carboxybenzyl, oC7-Amino-(3-thienyl)-inethyl, D(-)-o(^:-Ainino-3-chlor-4-hydroxybenzyl, c£-Amino-(cyclohexyl)-me thy l,oG-(5~Tetrazolyl)-benzyl, 2-Thienylcarboxymethyl, 3-Thienylcarboxymethyl, 2-Purylcarboxymethyl, 3-Furylcarboxymethyl, cC-Sulfaminobenzyl, 3-Thieny Is ulf aminome thy 1, cC- (N-Methy Is ulf amino) -ben zy 1, D(-)-2-Thienylguanidinomethyl, D(-)-c<^guanidinobenzyl, oC-Guanylureidobenzyl, cC-Hydroxybenzyl, cG-Azidobenzyl, oC-Fluorbenzyl, 4-(5-Methoxy-l,3-oxadiazolyl)-aminomethyl_a li_(5_jvi_e-thoxy-l, 3-oxadiazolyl)-hydroxymethyl, 4-(5-Methoxy-1,3-sulfadiazolyD-hydroxymethyl, 4-(5-Chlorthienyl)-aminomethyl, 2-(5-Chlorthienyl)-hydroxymethyl₅ 2-(5~ Chlorthienyl)-carboxymethyl, 3-(l,2-Thiazolyl)-aminomethyl₃ 3-(1,2-ThiaζοIyI)-hydroxymethyl, 3-(l,2-Thiazolyl)-carb oxy methyl, S-djiJ-ThiazolyD-aminomethyl, 2-(l,4-ThiazolyD-hydroxymethyl, 2-(l,4-Thiazolyl)-carboxymethyl, 2-Benzothienylaminomethyl, 2-Benzothienylhydroxymethyl, 2-Benzothieny!carboxymethyl, o^-Sulfobenzyl, oC-Phosphonobenzyl, o(rDiäthylphosphono und oirMonoäthylphosphono.

Weitere interessante Acylreste in dieser Klasse, bei denen X = Sauerstoff ist, sind:

0
-CCHR⁹R ,

worin R^ und R nachfolgend definiert werden. R bedeutet Wasserstoff, Halogen, wie Chlor, Fluor, Brom, Jod, Amino, Guanidino, Phosphono^ Hydroxy, Tetrazolyl, Carboxy, SuIfο oder Sulfamino und R bedeutet Phenyl, substituiertes

- 10 -

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Phenyl, ein mono- oder bicyclisches Heterocyclyl, enthaltend ein oder mehrere Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatome im Ring, wie Furyl, Chinoxalyl, Thienyl, Chinolyl, Chinazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, Tetrazolyl, Oxadiazolyl, Thiadiazolyl und dergleichen, substituierte Heterocyclen, Phenylthio, Phenyloxy, Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, heterocyclische oder substituierte heterocyclische Thiogruppen oder Cyano.

3 -4

Die Substituenten an den Gruppierungen R und R können sein Halogen, Carboxymethyl, Guanidino, Guanidinomethyl, Carb oxyami dorne thy 1, Aminoäthyl, Nitro, Methoxy oder Methyl. Wird R ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus

4" Wasserstoff, Hydroxy, Amino oder Carboxy und· R . ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phenyl oder einem 5- oder 6-gliedrigen heterocyclischen Ring mit ein oder zwei Schwefel-, Sauerstoff- oder Stickstoffheteroatomen, wie Tetrazolyl, Thienyl, Furyl und Phenyl, so sind die folgenden Acylreste typische Beispiele: Phenylacetyl, 3-Bromphenylacetyl, p-Aminomethylpheny!acetyl, ^-CarboxymethylphenyI-acetyl, ^-Carboxyamidomethylpheny!acetyl, 2-Fury!acetyl, 5-Nitro-2-furylacetyl, 3-Furylacetyl, 2-Thieny!acetyl, 5-Chlor-2-thienylacetyl, 5-Methoxy-2-thienylacetyl, oC-Guanidino-2-thienylacetyl, 3-Thieny!acetyl, 2-(ⁱJ-Methylthienyl)-acetyl, 3-Isothiazolylacetyl, *J-Methoxy-3-isothiazolylacetyl, 4-Isothiazolylacetyl, J>-¥iethy 1-^-isothiazolylacetyl, 5-Isothiazolylacetyl, 3-Chlor-5-isothiazolylacetyl, 3-Methyl-l,2,5-oxadiazolylacetyl, 1,2,5-Thiadiazolyl-^-acetyl, 3-Methy1-1,2,5-thiadiazoly!acetyl, 3-Chlor-1,2,5-thiadiazoly!acetyl, 3-Methoxy-l,2,5-thiadiazoly1-acetyl, Phenylthioacetyl, ^-Pyridylthioacetyli Cyanoacetyl, 1-Tetrazolylacetyl, oC-Fluorphenylacetyl, D-Phenylglycyl, ^-Hydroxy-D-phenylglycyl, 2-Thienylglycyl, 3-ThienyIglycyl,

- 11 -

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Phenylmalonyl, 3-Chlorphenylmalonyl, 2-Thienylmalonyl, 3-Thienylmalonyl, oC-Phosphonopheny!acetyl, oC-Aminocyclohexadienylacetyl, o^Sulfaminopheny!acetyl, oGHydroxyphenylacetyl, oC-Tetrazolylphenylacetyl und cC-Sulfophenylacetyl.

1 2

Die Acylreste R und R können ebenfalls ausgewählt sein aus Schwefel-(l) und Phorphor-(2)-Resten:

(O)m

¹¹ i

-S-Y · -P-Y*

Il "■ I

(O)n y

worin hinsichtlich.1, m und η ganze. Zahlen sind, die ausgewählt sind zwischen 0 und 1 und Y = O^ Vr₉ -N(R")ο

ff)

und R"; worin Vr^ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkalikationen und organischen Basen und R" die obengenannte Bedeutung hat, beispielsweise Alkyl, Alkenyl, Aryl und Heteroaryl. Hinsichtlich J2, ist X = 0 oderS; η = 0 oder 1; und Y^f und Y" sind ausgewählt aus den Gruppen, bestehend aus 0^Θ lP₃ -N(R")₂, R" und ZR", worin alle Symbole die vorher angegebene Bedeutung haben, und beispielsweise R" und ZR" typischerweise folgende Bedeutung haben: Alkyl, Alkenyl, Aryl, Heteroaryloxy, Y' und Y", einschIiess lieh der R"-Gruppen, die miteinander verbunden sein können unter Ausbildung von cyclischen Estern, Ester-Amid und Amid-Funktionen. Typische Beispiele für ^l sind N-(Methylsulf onyl)-thienamycin, N-(o-Nitrophenylsulfonyl)-thienamycin, N-(p-Chlorphenylsulfinyl)-thienamycin, N-(o-Nitro-

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phenylsulfenyl)-thienamycin_s N-Sulfamoylthienamycin, N-Dimethylsulfamoy!thienamycin und das Natriumsalz von Thienamycin-N-sulfonsäure. Typische Beispiele für 2 sind N-(Diinethoxyphosphino)-thienamycin, M-Dibenzyloxyphosphino)-thienamycin, N-(Dihydroxyphosrhino)-thienamycindinatriumsalz, N- (Dirne thoxyphosphinyl)-thien-

amycin, N-(Dimethoxyphosphinothioyl)-thienamycin, N-(DibenzyloxyphosphinyD-thienamycin und N-(DihydroxyphosphinyD-thienamycindinatriumsalz.

Eine Acylklasse von besonderem Interesse

1 2

sind solche AcyIreste, R und R der Strukturformel II, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus üblichen bekannten N-Acyl-Blockierungs- oder Schutzgruppen, wie Carbobenzyloxy, ringsubstituiertes Carbobenzyloxy, wie o- und p-Nitrocarbobenzyloxy, p-Methoxycarbobenzyloxy, Chloracetyl, Bromacetyl, Pheny!acetyl, tert.-Butoxycarbonyl, Trifluoracetyl, Bromäthoxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Dichloracetyl, o-Nitrophenylsulfenyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl, Brom-tert.-butoxycarbonyl, Phenoxyacetyl; nicht-acylierte Schutzgruppen, wie Triniedrigalkylsilyl, beispielsweise Trimethylsilyl und tert.-Butyldimethy 1 silyl sind auch von Interesse.

Die folgenden Reste sind_tin Übereinstimmung mit dervor-

1

genannten Definition von Acy 1| besonders bevorzugt für R und R

der Struktur II : Formyl, Propionyl, Butyryl,

Chloracetyl, Kethoxyacetyl, Aminoacetyl, Methoxycarbonyl, ftth oxy carbonyl, Methylcarbamoyl, Äthylcarbamoyl, Phenylthiocarbonyl, 3-Aminopropionyl, 4-Aminobutyryl, N-Methyl-

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aininoacetyl, Ν,Ν-Dimethylaininoacetyl, Ν,Ν,Ν-Trimethylaminoacetyl, 3-(N,N-Dimethyl)-aminopropionyl, 3-(N,N,N-Trimethyl)-aminopropionyl, Ν,Ν,Ν-Triäthylaminoacetyl, Pyridiniuraacetyl, Guanidinoacetyl, 3-GuanidinopropionyI₃ N -Methylguanidinopropiony1, Hydroxyacetyl, 3-Hydroxypropionyl, Acryloyl, Propynoyl, Malonyl, Phenoxycarbonyl, Amidinoacetyl, Acetamidinoacetyl, Amidinopropionyl, Acetamidinopropionyl, Guanylureidoaeetyl, Guanylcarbamoyl, Carboxymethylaminoacetyl, Sulfoacetylaminoacetyl, Phosphonoacetylaminoacetyl, N -Dimethylaminoacetamidinopropionyl, Ureidocarbonyl, Dimethylaminoguanylthioacetyl, 3-(l-Methyl-^-pyridinium)-propionyl, 3-(5-Aminoiniidazoll-yl)-propionyl, 3-Methyl-l-Imidazoliuinacetyl, 3-Sydnonylacetyl, o-Aminomethylbenzoyl, o-Aminobenzoyl, . Guanylthioacetyl.

O s s

Ii Ii !LOCH,

-P(OCH₃)₂ , -P(OCH ) , -ρ ³

^v0Na

I! -Il Il

-PtN(CH₃)₂]_2/ -P-N(CH ) -P[N(CHO,]

^xONa ' ^J ^

-P-]
ONa

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1 2

Eine weitere bevorzugte Klasse von Acylresten (R und R der Strukturformel II oben) sind endständig substituierte Acyle, bei denen der Substituent eine basische Gruppe ist, die substituiert oder unsubstituiert sein kann: Amino, Amidino, Guanidino, Guanyl und Stickstoff enthaltende mono- und bicyclische Heterocyclen (aromatisch und nicht-aromatisch), bei denen das Heteroatom oder die Heteroatome zusätzlich zum Stickstoff ausgewählt sind aus Sauerstoff und Schwefel. Solche substituierten AcyIe können durch die folgende Formel:

-C(CH₂)-A —(CH₂)J

gekennzeichnet werden, worin m und η ganze Zahlen von 0 bis 5 sind;

A ist 0, NR¹ (R' ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), S oder A ist eine Einfachbindung; und Y _; ist ausgewählt aus den folgenden Gruppen:

1.) Amino oder substituiertes Amino:

-N(R )₂ und -N(R)₃ ,

worin die Werte für R unabhängig ausgewählt sind aus: Wasserstoff; N(R^f)₂ (R' ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Niedrigalkoxyl mit 1 bis S Kohlenstoffatomen; Niedrigalkoxyniedrigalkyl, worin die Alkoxy !gruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst und die Alky!gruppe 2 bis G Kohlenstoffatome hat;

- 15 -

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Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin die Cycloalkylgruppe 3 bis β Kohlenstoffatome umfasst und die Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoff atome hat, und wobei zwei R- Gruppen miteinander verbunden sein können über das N-Atom, an welches sie gebunden sind unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Atomen.

2.) Amidino und substituiertes Amidino:

-N=C-N(R )₂
. R

worin die Werte für R ' unabhängig voneinander ausgewählt sind aus den Gruppen: Wasserstoff; N(R¹)„ (R* ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Niedrigalkoxyl mit 1 bis 6 .Kohlenstoffatomen, Niedrigalkoxyniedrigalkyl, worin die Alkoxylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und die Alkylgruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält (falls der Niedrigalkoxyniedrigalkylrest an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, umfasst die Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome); Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin die Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome umfasst; zwei R-Gruppen können miteinander verbunden sein mit dem Atom, an das sie gebunden sind unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Atomen;

3.) Guanidino und substituiertes Guanidine:

, -NH-C-N(R )₂ ,
NR

worin R die oben angegebene Definition unter 2. hat.

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• as.

¹J.) Guanyl und substituiertes Guanyl:

-C=NR
N(R' )₂ .

worin R¹ die Definition, wie vorher in 2. angegeben, hat.

5.) Sticksto-ff enthaltende mono- und bicyclische Heterocyclen (aromatisch und nicht-aromatisch) mit 4 bis Kernatomen, worin das Heteroatom oder die Heteroatome ausser Stickstoff ausgewählt sind aus Sauerstoff und Schwefel. Solche Heterocyclen werden typischerweise illustriert durch die folgende Aufzählung von Resten (R¹ ist H oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen):

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- 17 -

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N-R'

/O

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- 18 -

Die folgenden spezifischen Acylresto, die in diese Klasse fallen, sind zusätzlich repräsentativ und werden bevorzugt

I Γ

CCIi₂CH₂NHC-H O KH

Il

Ii CCH₂CH₂N (CH₃)

JL

ο Ick	NH I	"KH NHC-
O Ich	CH₂CH.	Θ
Il

(CH₃)

Il

CCH-S-C

q Il

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• - 19 _

Selbstverständlich kann aber jeder Acylrest bei der Ausübung der Erfindung verwendet werden und fällt unter den Umfang der Erfindung.

Im allgemeinen werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem man Thienamycin (I) mit einem Acylierungsmittel behandelt, beispielsweise einem Acylhalogenid oder einem Acylanhydrid, wie einem aliphatischen, aromatischen, heterocyclischen, araliphatischen oder heterocyclischen aliphatischen Carbonsäurehalogenid oder -anhydrid. Andere Acylierungsmittel, die auch verwendet werden können, sind beispielsweise gemischte Carbonsäureanhydride und insbesondere Niedrigalky!ester von gemischten Carboxyl-Carbonsäureanhydriden; auch Carboxy !säuren in Gegenwart eines Carbodiimids, wie l^-Dicyclohexylcarbodiimid, und ein aktivierter Ester von Carboxylsäuren, wie p-Nitropheny!ester, sind geeignet.

Die Acylierungsreaktion kann durchgeführt werden bei Temperaturen im Bereich von etwa -20 bis etwa 100 C, aber vorzugsweise wendet man Temperaturen an im Bereich von -8⁰C bis 25°C. Jedes Lösungsmittel, in dem die Reaktanten löslich sind und das im wesentlichen inert ist, kann verwendet werden, beispielsweise polare Lösungsmittel, wie Wasser, Alkohole und polare organische Lösungsmittel, im allgemeinen . wie Dimethylformamid (DMP), Hexa-

methylphosphoramid (HMPA), Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), Acetonitril, heterocyclische Amine, wie Pyridin, Äthylacetat, wässrige Mischungen der vorgenann- ■ ten, sowie auch halogenierte Lösungsmittel, wie Methylenchlorid und Chloroform. Die Umsetzung wird eine Zeitlang durchgeführt, die im Bereich von etwa 5 Minuten bis zu einem Maximum von 3 Stunden dauert, aber im allgemeinen reicht eine Reaktionszeit von etwa 0,5 bis etwa 1 Stunde

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aus. Die folgende Gleichung beschreibt dieses Verfahren unter Verwendung eines Carbonsäurehalogenids; es ist jedoch selbstverständlich, dass man durch Verwendung eines Carbonsäureanhydrids oder eines anderen funktionellen äquivalenten Acylierungsmittels gleiche Produkte erhalten kann:

OH

Acy !halogenid ν „ -, _C0QH

CH₂CH₂IiR¹' _R ²

Im allgemeinen, wenn bei der oben beschriebenen Acylierungsreaktion ein Säurehalogenid (geeignete Halogenide sind Chloride, Jodide oder Bromide) oder ein Säureanhydrid verwendet wird, wird die Umsetzung in Wasser oder einer wässrigen Mischung eines polaren organischen Lösungsmittels', wie Aceton, Dioxan, THF, DMF, Acetonitril und dergleichen in Gegenwart eines geeigneten basichen Akzeptors, wie NaHCO,, MgO, NaOH, KpHPO₁, und dergleichen vorgenommen.

Beim Durchführen der hier beschriebenen Umsetzung ist es im allgemeinen nicht notwendig, die 2-Carboxygruppe oder die l^f-Hydroxygruppe zu schützen; in den Fällen, in denen das Acylierungsmittel ausserordentlich wasserempfindlich ist, ist es manchmal vorteilhaft, die Acylierung in einem nicht-wässrigen Lösungsmittelsystem vorzunehmen. Triorganosilyl (oder Zinn)-Derivate des Thienamycins ergeben schnell die Tris-Triorganosilylderivate, beispielsweise Tris-Trimethylsily!thienamycin Th(TMS)₅:

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- OTMS
Th__ HHTMS

- COOTMS

- 21 -

Diese Derivate, die leicht löslich in organischen Lösungsmitteln sind, werden auf einfache Weise hergestellt, indem man Thienamycin mit einem Überschuss an Hexamethyldisilazan und einer stöchiometrischen Menge von Trimethylchlorsilan bei 25°C unter kräftigem Rühren unter einer N«- Atmosphäre umsetzt.

Die erfindungsgemässen Produkte (II) bilden eine Vielzahl von pharmakologisch annehmbaren Salzen mit anorganischen und organischen Basen; eingeschlossen sind beispiels*/eise Metallsalze aus Alkali- und Erdalkalihydroxiden, -carbonaten oder -bicarbonaten und Salze, die sich ableiten von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie Monoalkylaminen, Dialky!aminen, Trialky!aminen, Niedrigalkanolaminen, Diniedrigalkanolaminen, Niedrigalkylendiaminen, Ν,Ν-Diarylalkyl-niedrigalkylendiaminen, Aralky!aminen, aminosubstituiertenNiedrialkanolen,= N,N-di-niedrigalkylaminosubstituierte Niedrigalkanοle, Amino-, Polyamine- und guanidinosubstituierte Niedrigalkansäuren und stickstof fenthaltenden heterocyclischen Aminen. Typische Beispiele schliessen Salze ein, die sich ableiten von Natriumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimethylamin, Triäthylamin, Piperidin, Morpholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Ethanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, Theophyllin, N-Methylglucamin und dergleichen. Säureadditionssalze, beispielsweise solche mit Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefel-, Salpeter-, p-Toluolsulfon- und Methansulfonsäure können

- 22 -

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■lt.

auch verwendet werden und zwar in den Fällen, in denen der Acylrest eine basische Gruppe enthält.

Die Salze können Monosalze sein, wie das Mononatriumsalz, welches man erhält, wenn man 1 Äquivalent Natriumhydroxid mit einem Äquivalent des Produktes (II) umsetzt, ebenso können es gemischte Di-Salze sein. Solche Salze erhält man, indem man 1 Äquivalent einer Base mit einem zweiwertigen Kation, wie Calciumhydroxid, mit einem Äquivalent des Produktes (II) umsetzt. Die Salze dieser Erfindung sind pharmakologisch annehmbare nicht-toxische Derivate, die als aktive Bestandteile in geeigneten pharmazeutischen Einzeldosierungsformen verwendet werden können; sie können auch mit anderen Arzneimitteln kombiniert werden zur Herstellung von Zusammensetzungen mit einem breiteren Aktivitätsspektrum.

Die neuen Thienamycinderivate der Erfindung sind wertvolle antimikrobe Substanzen, die aktiv sind gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Pathogene, wie Bacillus subtilis, Salmonella schottmuelleri und Proteus vulgaris. Die freien Säuren und insbesondere deren Salze, wie Amin- und Metallsalze, insbesondere die Alkali- und Erdalkalisalze, sind brauchbare Bacterizide und können verwendet werden, um beeinflussbare Pathogene von zahnärztlichen und medizinischen Ausrüstungsgegenständen zu entfernen, um Mikroorganismen abzutrennen und für therapeutische Behandlungen bei Menschen und Tieren. Für den letzteren Anwendungszweck können pharmakologisch annehmbare Salze mit anorganischen Basen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind und wie sie bei der Anwendung von Penicillinen und Cephalosporinen verabreicht werden, verwendet werden. Beispielsweise können für diesen Zweck

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die Alkali- und Erdalkalisalze und primäre, sekundäre und tertiäre Aminsalze verwendet v/erden. Diese Salze können kombiniert werden mit pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeiten und festen Trägerstoffen, um geeignete Einzeldosierungsformen, wie Pillen, Tabletten, Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Elixiere und dergleichen zuzubereiten nach Verfahren, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind.

Die neuen Verbindungen sind neue wertvolle Antibiotika, die aktiv sind gegen verschiedene gram-positive und gramnegative Bakterien und die deshalb in der Human--und Veterinärmedizin Verwendung finden.Die Verbindungen der Erfindung können deshalb als antibakterielle Arzneimittel für die Behandlung von Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive und gram-negative Bakterien verursacht werden, beispielsweise gegen Staphylococcus aureus, Escherischia colijStrep. pyogenes, Klebsieila pneumoniae> Bacillus' RUbtilis, Salmonella typhosa, Pseudomonas und Bacterium proteus, Die erfindungsgemässen-Bacterizide -können weiter verwendet werden als Additive für Futtermittel und zum Konservieren ■ von Nahrungsmitteln"-und als Desinfektionsmittel." Sie können beispielsweise in wässrigen Zusammensetzungen in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 100 Teile des Antibiotikums pro Million Teile Lösung verwendet werden, um das Wachstum von schädlichen Bakterien auf medizinischen und dentaltechnischen Ausrüstungen zu zerstören oder zu inhibieren

- oh.
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und auch als Bakterizide bei industriellen Anwendungen, beispielsweise bei auf V/asser aufgebauten Anstrichmitteln, beim Weißwasser von Papiermühlen, um das Wachstum von schädlichen Bakterien zu inhibieren.

Die erfindungsgemässen Produkte können allein verwendet v/erden oder in Kombination mit aktiven Bestandteilen in einer Vielzahl von pharmazeutischen Zubereitungen. Diese Antibiotika und ihre entsprechenden Salze können in Form von Kapseln oder als Tabletten, als Pulver oder als flüssige Lösungen oder als Suspensionen und Elexiere verwendet werden. Sie können oral, intravenös oder intramuskulär verabreicht werden.

Die Zusammensetzungen werden vorzugsweise in einer solchen Form zubereitet, dass sie im Magen-Darm-Kanal absorbiert werden. Tabletten und Kapseln für eine orale Verabreichung können in Einzeldosierungsform vorliegen und können übliche Excipientien, wie Bindemittel, enthalten, beispielsweise Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbose, Traganth oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, beispielsweise Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbose oder Gyleerin; Schmiermittel, beispielsweise Magnesiumstearat, Talkum, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; Zerfallmittel, beispielsweise Kartoffelstärke oder geeignete Befeuchtungsmittel, wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können in bekannter Weise beschichtet werden. Orale flüssige Präparationen können in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren und dergleichen vorliegen oder können als trockenes Produkt hergestellt werden, damit sie dann mit Wasser oder einem anderen

709822/1028 _ 25 ■ _

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ft.

geeigneten Trägermaterial vor ihrer Verwendung angemacht v/erden können. Solehe flüssigen Zubereitungen können übliche Additive, wie Suspensionsmittel, beispielsweise Sorbose, Sirup, Methylcellulose, Glukose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte essbare öle enthalten, beispielsweise Mandelöl, fraktioniertes Kokosnussöl, ölester, Propylenglykol oder Äthylalkohol enthalten; Konservierungsmittel, beispielsweise Methyl- oder Propylp-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure. Suppositorien enthalten die üblichen hierfür geeigneten Substanzen, beispielsweise Kakaobutter oder andere Glycerine.

Zusammensetzungen für Injektionen können in Einzeldosierungen in Form von Ampullen hergestellt werden oder in Behältern mit zugesetzten Konservierungsmitteln für Mehrfächdosierungen. Die Zusammensetzungen können in Form von Suspensionen, Lösungen oder. Emulsionen in öl oder' wässrigen Trägermaterial! en und sie können F or muli erdungsmittel, wie Suspensionsmittel, Stabilisierungsmittel und/ oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ können die aktiven Bestandteile in Form von Pulver-vorliegen, damit sie mit einem geeigneten Trägermaterial, beispieIsweise · sterilem, keimfreien Wasser vor der Anwendung angemacht werden können. - " ·

Die Zusammensetzungen können auch in geeigneten Formen für die Absorption zubereitet werden durch die Schleimhäute der Nase und das Hals- und Bronchialgewebe und sie können in einfacher Weise auch in Form von pulvrigen oder

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3r.

flüssigen Sprays für Inhalationen zubereitet v/erden oder in Form von Pastillen oder Zubereitungen für Halspinselung. Für die medizinische Anwendung an den Augen oder Ohren können die Zubereitungen als besondere Kapseln in flüssiger oder halbflüssiger Form vorliegen oder sie können als Tropfen und dergleichen verwendet werden. Für topische Anwendungen kann man hydrophobe oder hydrophile Basen als Salben, Cremes, Lotionen, Salbungsmittel oder Pulver formulieren.

Ausser einem Trägermaterial können die erfindungsgemässen Zusammensetzungen auch weitere Bestandteile, vrie Stabilisatoren, Bindemittel, "Antioxidantien, Konservierungsmittel, Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskositätsmittel oder Geschmacksatoffe und dergleichen enthalten..Darüberhinaus können in <bn Zusammensetzungen auch andere aktive Bestandteile vorhanden sein, um ein breiteres Spektrum der antibiotischen Aktivität zu bewirken.

Für die Veterinärmedizin können die Zusammensetzungen beispielsweise als innerhalb der Brust einlegbare Zubereitungen mit einer entweder schnellen oder langsamen Abgabewirkung formuliert werden.

Die zu verabreichenden Dosierungen hängen zu einem erheblichen Teil von dem Zustand des behandelten Patienten ab und von dem Gewicht des Patienten, der Verabreichungsroute und der Häufigkeit der Verabreichung, wobei die parenterale Route für allgemeine Infektionen bevorzugt wird und die orale Route für Infektionen der Eingeweide. Im allgemeinen

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enthält eine tägliche orale Dosierung etwa 15 bis etwa 600 mg aktiven Bestandteil pro kg Körpergewicht des Patienten bei einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag. Eine bevorzugte tägliche Dosierung für Erwachsene liegt im Bereich von etwa 80 bis 120 mg an aktivem Bestandteil pro kg Körpergewicht.

Die vorliegenden Zusammensetzungen können in verschiedenen Einzeldosierungsformen verabreicht werden, beispielsweise in festen oder in flüssigen oral aufnehmbaren Dosierungsformen. Die Zusammensetzungen pro Einzeldosierung, ob sie flüssig oder fest ist, soll etwa O₃I £ bis 99 % an aktivem Material enthalten, wobei der bevorzugte Bereich zwischen etwa 10 und 60 % liegt. Die Zusammensetzungen enthalten im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 1500 mg an aktivem Bestandteil; im allgemeinen ist es jedoch bevorzugt, eine Dosierungsmenge im Bereich von etwa 250 bis 1000 mg zu verwenden. Bei einer parenteralen Verabreichung ist die Einzeldosierung im allgemeinen die reine Verbindung in einer leicht angesäuerten wässrigen sterilen Lösung oder in Form eines löslichen Pulvers,-das zum Auflösen bestimmt ist.

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In den folgenden Beispielen, welche die Erfindung beschreiben, ohne diese jedoch zu beschränken, werden die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch das nachstehende Symbol gekennzeichnet:

—OH

I—COOM

worin die drei funktionellen Gruppen dargestellt sind.

709822/102Ö

Beispiel 1

NHC CH-vO"

J_ COON_a

Herstellung des Natriumsalzes von N-(O-FormyI)-D-mandeloyIthienamy ein

Zu Thienamycin (40 mg) in 10 ml Wasser werden nach und nach bei 0⁰C 12*1 mg NaHCO.., 8 ml Dioxan und dann unter Rühren 1,2 Äquivalente N-(0~Formyl)-l-mandeloylchlorid während eines Zeitraumes von einer Minute zugegeben. Nach 6-minütiger Gesamtreaktionszeit wird die Mischung dreimal mit kaltem Äthyläther extrahiert. Die Elektrophorese eines wässrigen Anteils (0,05m, pH 7,wässriger Phosphatpuffer, 50 V/cm, 20 Minuten) zeigt eine 67#ige Umwandlung zu dem gewünschten Produkt an. Der pH wird mit Im H-JPO^-Lösung auf 2,2 eingestellt und die Lösung wird dreimal extrahiert mit Äthylacetat. Die Äthylacetat (EtOAc)-Lösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet und zweimal mit zwei Äquivalenten einer NaHCO,-Lösung extrahiert. Der wässrige, gefrier-'getrocknete Extrakt enthält 164 optische Dichteeinheiten (ODU) bei 302 nm bei einer UV-Analyse bei pH 7,0, von denen 95 % nach Behandlung mit Hydroxylamin während einer Stunde ausgelöscht werden. Die Ausbeute beträgt 53 %» Eine Elektrophorese, wie zuvor durchgeführt, zeigt einen Punkt mittels Bioautographie 4 cm in Richtung der Anode an. KMR ((/D₂O) 1,30 Cd, J = 6 Hz), CH₃CH; 2,8-3,7 Cm, CH₂) 4,0-4,5 (m, CH ß-Lactam), 4,73, HDO; 5,97 (s, CgH₅CHCHO), 7,53 Cs, C₆H₅), 8,30.Cs, C₆H₅CHOCHO).

709822/10 28 - 30 -

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Beispiel

I—OH

H
Th-4—NC-CH-

. 0 OH

COONa

Herstellung des Natriumsalzes von N-D-Mandeloy!thienamycin

Die in der Überschrift beschriebene Verbindung wird nach der Verfahrensweise des Beispiels 1 hergestellt, aber vor der EtOAc-Extraktion lässt man den wässrigen Extrakt eine Stunde bei 25°C stehen. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7, wässriges Phosphat, 0,05m) zeigt einen Punkt bei der Bioautographie, 4cm in Richtung zur Anode; KMR (cTD₂O) 1,50 (d, J = 6 Hz), CH CH; 2,8-3,8 (m, 4,2-4,6 (m, CH ß-Lactam), 4,96 Ts7 HDO); 5₅40 (3,

Beispiel 3

Natriumsalz von N-Propiony!thienamycin

Zu Thienamycin (25 mg in 6 ml Wasser bei 0 C) werden nacheinander gegeben 38,6 mg NaHCO-, 5 ml Dioxan und dann unter Rühren ein Äquivalent von Propionsäureanhydrxd während eines Zeitraumes von 3 Minuten. Nach 1Ö Minuten wird die Mischung dreimal mit kaltem Xthylather extrahiert. Die

- 31 -

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•Vs.

Elektrophorese des wässrigen Extraktes (0,05m, pH 7, Phosphatpuffer, 50 V/cm, 20 Minuten) zeigt an, dass kein freies Thienamycin vorhanden ist. Der wässrige Extrakt wird auf pH 6,8 eingestellt und enthält 600 ODU bei 302 nm mittels UV-Analyse, welche zu 95 % nach einstündiger- Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht wird. KMR ((C₃ DpO) 1,42 (m CH₃CH₃, CH₃CH); 2,48 (q, CH₂CH₃); 2,86-2,90 (m, . CH₂), 4,30-4,70 (m, CH ß-Lactam), 4,86 (HDO).

Beispiel 4

Natriumsalz von N-(Methoxyacetyl)-thienamycin

Zu Thienamycin, (55 mg in 6 ml VJasser bei 0⁰C) werden nach und nach 68 mg NaHCO₃, 6 ml Dioxan und unter Rühren während eines Zeitraumes von 1,5 Minuten 1,1 Äquivalente Methoxyacetylchlorid gegeben. Die Mischung wird weitere 10 Minuten gerührt. Die Mischung wird dreimal mit kaltem Äthyläther extrahiert.· Die Elektrophorese eines wässrigen Extraktes (0,05m, pH 7, Phosphatpuffer, 50 V/cm, 20 Minuten) zeigt an, dass kein freies Thienamycin vorhanden ist. Der wässrige Extrakt wird auf pH 6,8 eingestellt und enthält 105 ODU bei 302 nm mittels UV-Analyse, welche zu 95 % nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht wird. KMR (</", D₂O) 1,56 (m, CHCH₃), 2,84-3,60 (CH₂), 3,72 (s, OCH₃), 4,29 (s, OCH₂), 4,98 (s, HDO).

- 32 -

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-ft.

Beispiel 5

Lithiumsalz von N-Cp-NitrobenzoyloxycarbonyD-thienaniycin

Zu Thienamycin (220 mg in 60 ml Wasser bei 0 C) werden nach und nach 679 ntg NaHCO-, 60 ml Dioxan und dann unter Rühren 1,1 Äquivalente p-NitrobenzyIchlorformat während eines Zeitraumes von l_a5 Minuten zugegeben. Man lässt die Mischung 10 Minuten reagieren und extrahiert sie dann dreimal mit kaltem Äthyläther. Die Elektrophorese (0,05m, pH 7, Phosphatpuffer, 50 V/cm, 20 Minuten) zeigt, dass kein freies Thienamycin vorhanden ist. Der wässrige Extrakt wird mit Im H-JPO^-Lösung auf pH 2,2 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert. DerÄthylacetatextrakt wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und mit 0,1η LiOH nochmals extrahiert bis zu einem pH von 8,2. Der endgültige pH wird auf 7,0 mit Im H-PO₁J eingestellt und die Probe wird gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt 205 mg (54 %).

Beispiel

Herstellung des Natriumsalzes von N-(o-Nitrobenzyloxycarbonyp-thienamycin

Zu Thienamycin (*J3 mg bei 0 C) wird eine l:l-Mischung von Tetrahydrofuran-HpO (10 ml) gegeben. Die Mischung wird schnell gerührt während 132 mg NaHCO, (10 Äquivalente) zugegeben werden und dann werden unter Rühren während

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2 Minuten tropfenweise H Äquivalente o-Nitrobenzylchlorformat zugegeben. Nach 30 Minuten wird der pH mit 25£iger H,PC>2,-Lösung auf '7 eingestellt und die Lösung wird dreimal mit Äther extrahiert. Der wässrige Anteil wird im Vakuum bei 25°C verdampft und dann auf den pH 2,2 bei. 0⁰C gebracht. Man gibt festes NaCl hinzu und die kalte saure Lösung wird dreimal mit Calciumäthylacetat extrahiert, Die Äthylacetatextrakte werden kombiniert und schnell rückgewaschen mit kalter Salzlösung und dann getrocknet über Magnesiumsulfat j filtriert und rückextrahiert mit 10 ml Wasser, enthaltend 1,7 Äquivalente festes NaHCO,. Der Extrakt wird im Vakuum gefriergetrocknet bei Umgebungstemperatur und enthält 366 ODU bei 303 nm mittel UV-Analyse in H₂O bei pH 7,0, welche zu 95 % nach 1,5-stündiger Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht werden. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7, 0,05m Phosphatpuffer) zeigt einen Punkt mittel Bioautographie (MB-108 Staph. aureus), 3,7 cm in Richtung zur Anode. IR (u, Film) 5,62 (ß-Lactam); 5,'78 breit, (Urethan). Das KMR stimmt mit der Struktur überein.

Beispiel 7

Herstellung des Lithiumsalzes von N-(TrichloräthoxycarbonyD-thienamycin

Th-

—OH

NHC-O-CH-CCl,

COOLi

709822/1028 ^3H

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Zu Thienamycin (40 mg in 18 ml 1:1 THP-H 0 bei 0⁰C) werden unter Rühren 225 mg (15,2 Äquivalente) NaHCO, gegeben und dann gibt man während 2 Minuten tropfenweise unter Rühren 1,8 Äquivalente TrichloräthyIchlorformat, gelöst in 0,6 ml THP, hinzu. Nach 6 Minuten wird der pH auf 7,2 mit 25#iger HJPOj. eingestellt und die Lösung wird mit Äther extrahiert. Der wässrige Anteil wird nach Entfernung von jeglichen Mengen anhaftendem Äther im "Vakuum dann bei 0⁰C auf pH 2,5 gebracht und mit kaltem Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereint und schnell mit kalter Salzlösung rückgewaschen, getrocknet mit wasserfreiem MgSO₁,, filtriert und rückextrahiert mit 0,01m LiOH bis zum pH 6,8.. Der wässrige Extrakt wird von jeglichem Äthylacetat im Vakuum befreit und gefriergetrocknet. Der restliche Rückstand enthält 936 ODU (39,7 %) gemessen durch UV-Analyse bei 302 nm welche nach Behandlung mit Hydroxylamin während einer Stunde in 0,05m Phosphatpuffer (pH 7) zu 90 % ausgelöscht werden. Die Ausbeute beträgt 32 mg. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7, 0,05m Phosphat) zeigt eine Zone mittels Bioautographie (MB lOS, Staph. aureus), 2,4 cm in Richtung zur Anode. Flüssigchromatographie auf C.g Bondapak (Waters Assoc.) in wässrigem lO^igem THP zeigt einen Hauptpeak, frei von jeglichem unreagiertem Thienamycin.

Beispiel8 Herstellung von N-Bromacety!thienamycin

Zu einer gekühlten Lösung von Thienamycin (28,8 mg) und Natriumbicarbonat (0,3 g) in 10 ml Wasser und 8 ml Dioxan

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wird unter Rühren eine Lösung aus 0,25 g Bromessigsäureanhydrid in 2 ml Dioxan während eines Zeitraumes von 20 Minuten gegeben. Der pH wird auf 8 bis 8,3 aufrechterhalten. Die Mischung wird weitere 10 Minuten gerührt, mit Äther überschichtet und durch Zugabe von 8#iger Salpetersäure bis zum pH 7 neutralisiert. Die ätherische Schicht wird abgetrennt und die wässrige Schicht wird zweimal mit Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird unter vermindertem Druck auf 0,5 ml eingedampft, mit 2 ml Wasser verdünnt und auf 50 ml XAD-2 Harz gegeben. Die Säule wird mit Wasser eluiert. Die ersten 80 ml werden verworfen und die nächsten 100 ml werden gesammelt. Das Lösungsmittel wird dann ausgetauscht gegen lO^iges THF und weitere 100 ml werden gesammelt. Die vereinten Eluate werden auf pH 7 eingestellt, unter vermindertem Druck auf 5 ml abgedampft und gefriergetrocknet, wobei man das Natriumsalz von N-Bromacetylthienämycin in öOjSiger Ausbeute erhält. UV^_raax 302 mu.

Beispiel 9

Th-

-OTMS

-NHTMS = Th(TMS)

-—COOTMS

[TMS=T_rimethylsilyl]

Herstellung von silyliertem Thienamycin

Thienamycin (80,0 mg) werden in 40 ml Tetrahydrofuran (THP) suspendiert unter einer N_?-Atmosphäre und dann s 10 ml konzentriert; dazu gibt man Hexamethyldisilazan

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(1,0 ml) und Trimethylchlorsilan (300 pi). Die Mischung wird 20 Minuten bei 25°C unter heftigem Rühren reagieren gelassen. Die Suspension wird dann zur Entfernung von Ammoniumchlorid zentrifugiert. Das überstehende wird zu einem öl eingedampft unter einem Stickstoffstrom für die weitere Umsetzung. .

Beispiel 10

Herstellung von N-(0-Nitrobenzyloxycarbonyl)-tnienamycin aus Th(TMS)₃

Zu Th(TMS), (24 mg) in 0,8 ml trockenem THP werden 23 mg o-Nitrocarbobenzyloxychlorid gegeben und anschliessend daran 0,015 ml Triäthylamin. Nach 30-minütigem Vibriermischen bei 25°C wird die Mischung in einem trockenen Stickstoffstrom getrocknet und konzentriert. Der pastöse Rückstand wird dreimal mit Petrolather gewaschen. Der Rückstand wird mit einer Mischung aus 1,5 ml THF und 10 ml eines pH 7 Phosphatpuffers 20 Minuten gerührt und dann auf eine Säule von 30 ml Dowex 50 (Na )-Harz gegeben. Die Säule wird mit Wasser eluiert und das Abfliessende wird durch UV-Absorption bei 302 nm kontrolliert. Die Fraktionen, enthaltenddas Produkt, werden vereint und gefriergetrocknet.

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Beispiel 11

Herstellung des Natriumsalzes (I) und Lithiumsalzes (II) von N-(p-Methoxybenzyloxycarbonyl)-thienaniycin

Zu Thienamycin (20 mg in 5 ml Wasser bei O⁰C) gibt man 105 mg NaHCO, (20 Äquivalente), 5 ml Dioxan und dann unter Rühren tropfenweise während einer Minute 10 Äquivalente p-Methoxybenzylchlorformat. Nach 15 Minuten wird der pH mit Im H^POj. auf 7,5 eingestellt und die Lösung wird dreimal mit Äther extrahiert. Der wässrige Anteil wird dann bei 0 C auf pH 2,2 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wird schnell mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und mit einigen ml Wasser, ent haltend 6,3. mg NaHCO.-, extrahiert. Der erste Extrakt wird gefriergetrocknet und enthält 172 ODUbei 30.3 mn mittels UV-Analyse in H₃O bei pH 7,0, welche zu 95 % nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht werden. Die Ausbeute von I beträgt l6 mg. Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7 Phosphatpuffer) zeigt mittels Bioautographie einen Punkt 4 cm in Pachtung der Anode. KMR (c/, D₂O): 1,49 (d, J = 6 Hz, CH₃CH)- 2,8 - 3,7 (m, CH₂) 3,99 (s, OMe); H₃O - H_y6 (m, ß-Lactam CH); 4,92 (s, HCO); 5,20 (s, OCH₂);-7,13"'Cd, J = 8 Hz, CgH^).

Extrahiert man die Äthylacetat lösung mit 0,In-. LiOH bis zum pH 7,8 und gefriertrocknet dann, so erhält man das Lithiumsalz II. Die Spektral- und elektrophoretischen Eigenschaften von II sind die gleichen wie von I.

- 38. 709822/1028

'SO-

Beispiel 12

Herstellung des Natrium(I)- und Lithium(II)-Salzes von N-Azidoacety !thienamycin

J-OH
0

It

Th --NHCCH₂N₃

_co₂ ^Q#'

M=Na₇ Li

Thienamycin (48 mg, 0,l8 mmol) wird in 10 ml kaltem Wasser gelöst und bei O C gehalten. Zu der Lösung wird Matriumbicarbonat (147 mg, 17,6 mMol) und Dioxan (10 ml) gegeben. Azidoacetylchlorid (60 mg, 0,05 mMol) wird zu der Lösung während eines Zeitraumes von 2 Minuten gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten gerührt und dann mit 30 #iger Phosphorsäure auf pH 7,0 neutralisiert und wird dann in einen Scheidetrichter überführt. Die Lösung wird mit zweimal 50 ml Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird auf 5 nl konzentriert und dann auf eine Ionenaustauschharz-Säule aus Dowex AG-5Ox8 (Natrium-Form) gegeben. Die gewünschten Fraktionen, gemessen durch UV, werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man 21 mg des Produktes (I) erhält. Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten in pH 7 Phosphatpuffer) des Produktes zeigt ein einzelnes bio-aktives Band, das sieh 4 cm in Richtung zur Anode bewegt.

UV/^ 2 300 nm;

max

KMR (100 Mz, D₂O): 1,26 (d, CH₃CH), 2,93 - 3,43 (m, 3CH₂ und Cg-H), 4,01 (s, CH₂N ) und 4,20 ppm (m, C₅-H und C₇-H).

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Thienamycin (76,2 mg, 0,28 mMol) wird in 10 ml kaltem Wasser gelöst und bei O C gehalten. Zu der Lösung gibt man 0,6 ml 1,On Lithiumhydroxidlösung und 10 ml Dioxan zu. Nach einminütigem Rühren gibt man innerhalb von 2 Minuten Azidoacetylchlorid (33_S6 mg, 0,28 mMol) hinzu. Das Reaktionsgemisch wird eine weitere Minute gerührt und sodann mit 30$iger Phosphorsäure auf pH 7,0 neutralisiert. Nach Extraktion mit Äther wird die wässrige Lösung auf 5 ml konzentriert und wird auf eine Ionenaustauschsäule (Lithium-Form) von Dowex AG-5Ox8 gegeben. Die gewünschten Fraktionen, gemessen durch UV, werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man 38 mg des Produktes (II) erhält.

^H2° 300 nm. max

Beispiel

13

Th-

-OH

NHCCH₂N₃

-OH

Il

ι—co.

Herstellung von N-Glycy!-Thienamycin

Platinoxid (60 mg) und 2 ml Wasser werden in einen Hydrierkolben gegeben und unter 1 Atmosphäre Wasserstoff 20 Minuten bei 25 C gerührt. Zu dem Kolben wird N-Azidoacetylthienamycin-Natriumsalz (6,0 mg, 0,02 mMol in 4 ml Wasser) gegeben. Das Re akti ons gemisch vrird bei 25°C unter 1 Atmo-

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Sphäre Wasserstoff 30 Minuten gerührt. Die erhaltene Mischung ( pH 8,7) wird auf pH 7,0 mit 30 £iger Phosphorsäure eingestellt und vom Katalysator, ab filtriert. Die wässrige Lösung wird auf 2 ml konzentriert und dann auf eine Ionenaustauschsäule von Dowex AG-5Owx8 (Natrium-Form) gegeben. Die gewünschten Fraktionen, gemessen durch UV, werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man 3_S8 mg des Produktes erhält. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten) des Produktes in pH 7,0 Phosphatpuffer zeigt am Anfang ein einziges bio-aktives Band. UVAJJ|° 300 nm; KMR (100 MHz, DgO) :<? 1,27 (d, CH₃CH), 2,96 - 3,37 (m, 3CH₂ und Cg-H), 3,70 (s, COCH₂NH₂), und 4,20 ppm (m, C^-H und C₇-H).

Beispiel Ik

Herstellung von N-Benzyloxycarbony!thienamycin

Eine Lösung aus 1*1 mg Thienamycin in 4 ml 0,05 m pH 7 Phosphatpuffer und 2 ml Dioxan in einem Dreihals-Kolben, der mit einem Rührer, einem Thermometer, einer pH-Elektrode und der Einlaufspitze eines automatischen Titrators ausgerüstet ist, wird in einem Methanol-Eis-Bad auf -8 C gekühlt. Der pH wird durch Zugabe von 0,2n Natriumhydroxid in 50$igem wässrigem Diocan auf 8,2 eingestellt und dazu wird eine Lösung von 0,015 ml Carbobenzyloxychlorid in 2 ml Dioxan gegeben. Die Mischung wird gerührt bei -6⁰C und pH 8,2 für 10 Minuten, dann wird mit Äther überschichtet und der pH wird durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 7 eingestellt. Die Schichten werden durch

-Ul-709822/1028

Zentrifugieren getrennt und die wässrige Phase wird zweimal mit Äther extrahiert. Die wässrige Phase wird mit Äthylacetat überschichtet und auf pH 2 eingestellt. Das. Äthylaeetat wird abgetrennt und die wässrige Schicht wird wiederum mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatschichten werden mit gesättigter Natriumsehloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Die Filtrate werden mit Wasser gerührt und der pH wird auf 7 durch Zugabe von verdünnter Natriumbicarbonatlösung eingestellt. Die wässrige Phase wird abgetrennt und gefriergetrocknet, wobei man das Natriumsalz von N-Benzyloxycarbony!thienamycin in einer Menge von 10 mg (46 %) erhält. Das UV-Spektrum,^_x 303 mp, EJi 147 (£6290) _zeigt etwa 80#ige Reinheit an. Elektrophorese bei 50 V/cm während 20 Minuten bei pH 7 und anschliessende Bioautographie an S. aureus zeigt eine Inhibierungszone bei +2,5 cm an.

Beispiel 15

Herstellung von N-(Brom-tert.-butoxycarbonyl)-thienamycin Stufe A

Herstellung von N- (Brom- tert. -but oxy carbonyl) -0-1 rime thy 1-silyl-thienamycin-trimethylsilylester ^

t-OTMS

Th-

-NHC-O-C-CH₉Br

«ι ι *■

O CH₃

LCOOTMS

- 42 -

70982 2/1028

15775Y

- (16 mg), erhalten wie vorher angegeben, wird in 0,4 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst und dazu werden 20 jtil (28 mg, 0,13 mMol) Brom-tert.-buty!chlorformat (Kp 35°/O,9 mm) und 8 pi (5,67 mg, 0,057 mMol) Triäthylamin (rückdestilliert aus BaO) gegeben. Die Mischung wird 20 Minuten bei 25°C geschüttelt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels und der überschüssigen Reagentien erhält man das gewünschte Produkt.

320 nm (£9000).

Stufe B

Herstellung von N-(Brom-tert.-butoxycarbonyl)-thienamycin

N-Brom-tert.-butoxycarbonyl-O-trimethylsilyl-thienamycintrimethylsilylester (3 mg) wird in 0,1 ml Tetrahydrofuran, zu dem 0,5 ml eines 0,1m pH 7₉0 Phosphatpuffers gegeben worden sind, gelöst. Die Lösung lässt man 20 Minuten bei 25°C stehen und gibt sie dann über eine Säule (5 ml) von Dowex 50x8 (Na⁺-Form), wobei das Eluat durch UV überwacht wird. Die korrekten Fraktionen werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhält. _m^ Puffer _{3Qi| nm} (ggooo). Elektrophorese bei 50 V/cm

ΙΏ3. Λ

während 20 Minuten in pH 7_s0 Puffer zeigt eine einzige bio-aktive Zone, die sich 31»5 mm in Richtung zur- Anode bewegt.

- 43 -709822/1028

15775Y

Beispiel 16

Th-

OH

NHCONHCH

COOH

N- (Methy Icarbamyp-thienamycin

OjN-Bistrimethylsilylthienamycin-trimethylsilylester /"Th(TMS),, hergestellt nach Beispiel §7 aus 66 mg (0,24 mMol) Thienamycin werden in 5 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird bei 25 C gerührt und dazu werden 80 mg (1,1 mMol) von frischdestilliertem Methylisocyanat gegeben. Nach einer Stunde zeigt das IR-Spektrum der Tetrahydro furan lösung Banden bei 6,0 u (-NH-CO-NH-) und 6,5 |u (-NH-). Die Reaktionslösung wird zur Trockne eingedampft zur Entfernung des überschüssigen Methylisocyanats; der Rückstand wird in 5 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst und nochmals zur Trockne eingedampft. Der Rückstand xfird in 5 ml Ο,ίη pH 7,0 Natriumphosphatpuffer gelöst und über eine Säule von 80 ml Dowex 50x8 (Na ) chromatographiert unter Verwendung von entionisiertem Wasser als Eluierungsmittel. Fraktionen von 8 ml werden in einer Menge von 8 ml/ 5 Minuten genommen und das Abfliessende aus der Kolonne wird durch UV-Absorption und durch den Refraktionsindex überwacht. Das Produkt wird in den Fraktionen 4 bis 9 festgestellt, die vereint werden und auf ein Volumen von 12 ml konzentriert werden. Das Konzentrat wird über eine Säule von 80 ml XAD-2 Harz chromatographiert unter Verwendung von entionisiertem wasser als Eluierungsmittel. Fraktionen von 8 ml werden alle 5 Minuten entnommen und die Kolonne

709822/1028

wird überwacht durch UV-Absorption und den Refraktionsindex. Aliquote (Menge hängt von der UV-Absorption ab) der Fraktionen 11, 15, 17, 20, 22, 25 und 30 werden einer Papierelektrophorese unterworfen bei 50 V/cm während 15 Minuten unter Verwendung eines 0,5n pH 7_s0 Phosphatpuffers. Die Papierstreifen werden ausgewertet unter Verwendung von Agarplatten, enthaltend S. aureus. Charakteristische Zonen des Ausgangsmaterials Thienamycin, welche praktisch keine elektrophoretische Beweglichkeit bei pH 7_s0 aufweisen, sind in keiner der geprüften Fraktionen vorhanden, während man Zonen für N-(Methylcarbamyl)-thienamycin in den Fraktionen 11, 15, 17» 20, 22, 25 und 30 etwa 3,5 cm vom Ausgangspunkt in Richtung der Anode beobachtet. Fraktionen 14 bis 35 werden vereint (158 ml) und auf ein Volumen von etwa 20 ml konzentriert. Eine Probe von 158 ml der Lösung, verdünnt 1:4 mit Wasser, ergibt ein UV-Maximum bei 303 nm; A = 1,38. Die Lösung wird gefriergetrocknet, wobei man das gewünschte Derivat in einer Menge von 29,8 mg erhält imax 303 nm E% - 285.

Das KMR-Spektrum (DpO) von N-(Methylcarbamyl)-thienamycin zeigt, zusätzlich zu den für die anderen Funktionen erwarteten Resonanzen, ein Singulett bei (/2,88 für die CONHCH,-Gruppe.

Beispiel 17

Th

f—OH

■ NH-COCH-.

^N3 COOH

-H₅-709822/1Ö2Ö'

N-QsC-AzidophenylacetyD-thienamycin

Eine Lösung aus 39 mg (0,1*1 mMol) Thienamycin in 10 ml Dioxan-Wasser (1:1) tfird mit 176 mg (2,1 mMol) NaHCO, behandelt und auf 0⁰C gekühlt. Eine 100-jul-Portion einer Lösung aus 295 mg oC-Azidophenylacetylehlorid in Dioxan (Gesamtvolumen 0,5 ml) wird unter schnellem Rühren zugegeben. Mach 15 Minuten werden zwei weitere 50-ul-Portionen zu der o^-Azidophenylacetylchlorid-Lösung in 15minütigen Intervallen gegeben. 15 Minuten nach der letzten Zugabe des Säurechlorids wird das Reaktionsgemisch mit zwei 5-ml-Portionen Äther extrahiert; 15 ml Äthylacetat werden zugegeben und die wässrige Phase wird schnell gerührt und mit Phosphorsäure auf den pH 2,2 bis 2,5 angesäuert.

Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt und die. wässrige Phase wird mit 5 ml Äthylacetat gewaschen. Die vereinte Äthylacetatlösung wird getrocknet (MgSO^) und nach Ent- . fernung des Trocknungsmittels werden 20 ml Wasser zugegeben. Das N-iO^AzidophenylacetyD-thienamycin wird in die wässrige Lösung durch Zugabe von 103 mg NaHCO, bei 0 C unter Rühren extrahiert. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und der pH wird durch Zugabe einer geringen Menge NaHCO, auf 7,2 eingestellt.

Eine 0,5 ml Probe wird mit 2,5 ml D₃O verdünnt und für die KMR-Spektralanalyse gefriergetrocknet. Resonanzen bei e/5,0 und 7,^8 sind charakteristisch für die -CH- und C^H₅ Gruppen. N, ■ .

- 46. -7 09822/102Ö

15775Y

Beispiel l8 *

Th

"OH

NHCOCH-NHo

L.C00H

-(oC-Arninopheny !acetyl)-thienamycin

Eine wässrige Lösung (6 ml) von 6 mg von N-Co^ phenylacetyD-thienamycin wird mit 60 mg eines 10$ Pd/C-Katalysators bei 25°C 30 Minuten bei einer Atmosphäre Wasserstoffdruck gerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch Supercel filtriert und dann mit neun 1-ml-Anteilen Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereint (15 ml) und 4-pl-Proben werden einer Papierelektrophorese unterworfen in einem pH 7 Puffer bei 50 V/cm während 15 Minuten. Die Elektrophorese wird ausgewertet durch Bioautographie über MB-108 Agar-Platten und zeigt bioaktive Zonen bei +0,5 cm (Durchmesser 32 mm) für N-(OC-AminophenylacetyD-thienamycin; + 3_s0 cm (Durchmesser 16 mm) für N-(o£-Azidopheny!acetyl)-thienamycin und 4,5 cm (Durchmesser 22 mm) für ein Nebenprodukt.

Beispiel 19

L—COOH

.709822/1020

N-(Thi ob enζoy1)-thienamyein

Eine Lösung aus 55,8 mg (0,2 mMol) Thienamycin in 18 ml Dioxan-Wasser (1:1) wird mit 263 mg (3,1 mMol) NaHCO, behandelt und auf 0°C gekühlt. Zwei 200-ul-Anteile einer Lösung von 100 mg Thiobenzoylchlorid in 0,6 ml trockenem Dioxan werden zu der schnell, gerührten Reaktions lösung in 15-minütigen Abständen zugegeben. Jeder Anteil der Säurechloridlösung enthält 0,2 mMol Thiobenzoylchlorid. 15 Minuten nach der zweiten Zugabe wird die Reaktionslösung mit zwei 8-ml-Anteilen Äther gewaschen. Zu der wässrigen Phase, die auf pH 2,2 bei 0 C eingestellt worden ist, wird Äthylacetat (8 ml) unter schnellen Rühren unter Verwendung von 20 % H^POjj gegeben. Die Schichten werden getrennt und die wässrige Schicht wird mit 3 ml Äthylacetat gewaschen. Die vereinten Äthylacetatschichten werden getrocknet (MgSO^). Nach Abtrennen des Trocknungsmittels werden 10 ml Wasser zu der Äthylacetatlösung gegeben und das Produkt wird in eine wässrige Phase durch Zugabe von 50 mg (0,62 mMol} NaHCO₅ unter Rühren bei 0⁰C (pH 7,¹J) extrahiert. Die Schichter werden getrennt und die wässrige Phase, enthaltend N-(ThiobenzoyD-thienamycin-Natriumsalz wird erhalten und gefriergetrocknet. KMR in D₃O: (/7,3-7,9, was charakteristisch

ist für die ^

CgH₁-C -Gruppe

Beispiel 20

Th-

r— OH

- KHCOCH₂Cl -COOH

709822/1028

N-(Chloracetyl)-thienamycin

Eine Lösung aus 94 mg (0,34 mMol) Thienamycin in 15_a75 ml Wasser und 6,75 ml destilliertes Tetrahydrofuran wird mit 420 mg (5,2 mMol) NaHCO₃ behandelt und auf 0⁰C gekühlt. Drei 100-ul-Anteile einer Lösung aus 390 mg Chloracetylchlorid in 1 ml Tetrahydrofuran werden in 15-miriütigen Intervallen zu der Reaktionslösung gegeben. Jede Portion des Säurechlorids enthält 0,34 mMol Chloracetylchlorid. 15 Minuten nach der dritten Zugabe wird die Reaktionslösung mit drei 10-ml-Portionen Äther gewaschen. Die wässrige Schicht wird auf ein Volumen von etwa 10 ml konzentriert, um die letzten Spuren an organischen Lösungsmitteln zu entfernen. Die restliche Lösung wird über 75 ml eines XAD-2 Harzes unter Verwendung von Wasser als Eluierungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 8 ml/5 Minuten chromatographiert. Die Elektrophorese einer Probe aus ausgewählten Fraktionen und eine anschliessende Bioautographie zeigt, dass das Produkt in Fraktionen 16 bis 47 enthalten ist. Die gleichen Fraktionen enthalten zusätzlich verschiedene Mengen an nicht umgesetztem Thienamycin. Fraktionen 16 bis 47 werden vereint (250 ml) und auf ein Volumen von 20 ml konzentriert. Das Konzentrat wird chromatographiert über 150 ml eines Ag 50x2 (Na )-Harzes unter Verwendung von entionisiertem Wasser als Eluierungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 8 ml/4 min. Proben der ausgewählten Fraktionen werden e'.ner Papierelektrophorese unterworfen und anschliessend einer Bioautographie gegen S. aureus MB IO8 Organismus. In den Fraktionen 9 bis 12 wird das Produkt, ohne Verunreinigung durch das Ausgangs-Thienamycin, lokalisiert. Diese Fraktionen werden vereint, wobei man 37 ml einer wässrigen Lösung von N-(Chloracetyl)-thienamycin erhält.

-H₉-709822/1028

15775Y

Eine 2-ml-Probe wird auf 1 ml konzentriert, verdünnt mit 5 ml D₂O und gefriergetrocknet zur Bestimmung des KMR-Spektrums. Eine Resonanz bei 4,2
für die CICH^CO-Gruppe.

charakteristisch

Beispiel

21

Th.

OH

-NHCSNHCH.
-COOH

N-(Methylthi ocarb amy1)-thienamycin

OjN-Bistrimethylsilylthienamycin-trimethylsilylester* /"Th(TMS)-T₅, hergestellt nach Beispiel <?7 aus 66 mg (0,28 mMol) Thienamycin werden in 5 ml trockenem Tetrahydrofuran aufgelöst und zur Lösung gibt man 30 mg Bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid und anschliessend daran 50 mg (0,68 mMol) Methylisothiocyanat. Proben (10 ul) der Reaktionslösung werden zu einem pH 7,0 Phosphatpuffer (90 ul, 0,ln) in Abständen gegeben für die Auswertung der Elektrophorese (bei 50 V/cm für 15 Minuten und pH 7 Phosphatpuffer und die Streifen v/erden bewertet durch Bioautographie unter Verwendung von S. aureus-Agarplatten).

Die bei 4,2 cm in Richtung zur Anode beobachteten Zonen sind charakteristisch für N-(MethylthiocarbamyD-thienamycin. Das Produkt wird erhalten, indem man die Reaktionslösung zur Trocfcne eindampft und den Rückstand in 5 ml 0,ln Phosphat

7098 22/1023

^15775Ϊ 2Θ52675

-«ν

(pH 7jO)-Puffer auflöst, v/elcher die restlichen SiIy 1-blockierungsgruppen entfernt und dann wird es durch übliche chromatograpyische Methoden isoliert.

Beispiel 22

Herstellung von N-TrimethylammoniumacetyIthienamyein

Th-

r—OH 0

-CCK2

N-BromacetyIthienamycin-Natriumsalz (20 mg) wird in Wasser (2 ml), enthaltend Trimethylaminhydrochlorid, gelöst. Dazu wird Dikaliumhydrogenphosphat gegeben, um die Lösung auf den pH 8 zu bringen und die Mischung wird 20 Stunden bei 4°C gehalten. Die Mischung wird im Vakuum bis zur Halbfestigkeit eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser wieder gelöst und der pH wird auf 8 durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung eingestellt. Das Verfahren zum Verdampfen, welches der Entfernung von überschüssigem Trimethylamin dient, wird wiederholt. Die Lösung wird auf eine Säule gegeben, welche 25 ml eines sulfonierten Polystyrolharzes (Dowex 50) enthält in der Natrium-Form und die Säule wird mit Wasser eluiert. Die ersten 20 ml des Eluats werden verworfen und die nächsten 100 ml werden konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 5 mg eines leichten Pulvers, bestehend aus N-Trimethylammoniumthienamycin, erhält. UV X 301 nm (E% 117)·

* IUcLiC

- 51 -709822/10 2 8

15775Y

il.

Elektrophorese bei 50 V/cm, pH 7₉ 20 Minuten, anschliessend Bioautographie, zeigt eine grössere Inhibierungszone, die sich 1 cm in Richtung zur Kathode bewegt.

Beispiel 23

Herstellung von N-iNatriumthiosulfatoacetyD-thienamycin

OH

N-C-CH-Br +

HO

COOH

r-OH

NaS₂O₃

Th-

-N-C-CH₉-S-S-O-Na

COCH

Eine Lösung aus Natrium-N-bromacety!thienamycin (84 mg) in 20 ml Wasser wird mit 20 ml 0,ln Natriumthiosulfat behandelt und die Mischung wird 18 Stünden bei 4 C stehengelassen. Die Lösung wird auf 10 ml konzentriert und auf eine Säule von 230 ml XAD-2 Harz gegeben. Die Säule wird mit Wasser eluiert und die Fraktionen werden überwacht durch UV-Absorption und Messung des Refraktionsindexes. Die korrekten Fraktionen werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhält: (75 mg. UV^ _max 302 nm E% 89).

Die Elektrophorese einer Probe (bei 50 V/cm, pH 7_S 20 Mi-nuten) zeigt eine bio-aktive Zone, die sich 9 cm in Richtung zur Anode bewegt. '"

- 52 -

709822/1028

15775Y

Beispiel Herstellung von N-o-Nitrobenzolsulfeny!thienamycin

Th-

OH

KKS

L- CO₂H

NO

Zu einer gekühlten Lösung von Thienamycin (2,4 mg) in 1,5 ml 0,05m, pH 7» Phosphatpuffer und 0,75 ml Dioxan wird eine Lösung aus o-Nitrobenzolsulfenylchlorid (10 mg) in 0,75 ml Dioxan gegeben. Der pH wird durch Zugabe von 0,ln Natriumhydroxid auf 8,2 gehalten. Nach 10 Minuten wird die Lösung mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 7 eingestellt und dreimal mit Äther extrahiert. Die wässrige Lösung wird gefriergetrocknet, wobei man das Natriumsalz von N-o-Nitrobenzolsulfeny!thienamycin erhält.

Elektrophorese bei 50 V/cm, pH 7, während 20 Minuten und anschliessende Bioautographie zeigt eine einzelne Inhibierungszone bei 2,5 cm in Richtung zur Anode.

Beispiel 25

Herstellung von p-Brombenzoylthienamycin

Thienamycin O5,6 mg) wird in einer Mischung aus 0,05m pH 7 Phosphatpuffer (H ml) und Dioxan (2 ml) gelöst und die

- 53 -709822/1028

15775Y

Lösung wird mit 0,2n MaOH in 1:1 Dioxan-Wasser auf den pH 8,2 gebracht. Die Lösung wird auf -8 C gekühlt und während 3 Minuten wird p-Brombenzoylehlorid (45 mg) in Dioxan (2 ml) gegeben. Durch Zugabe von 0,2n NaOH wird der pH zwischen 7,6 und 8,¹I für weitere 10 Minuten gehalten. Die Lösung wird auf pH 7 neutralisiert und dreimal mit 8-ml-Anteilen Äther extrahiert. Die wässrige Phase wird gefriergetrocknet, wobei man das Natriumsalz von N-p-Brombenzoy!thienamycin UV/ 303 nra, 866 ODU, erhält. Elektrophorese bei 50 V/cm_s pH 7» während 20 Minuten und anschliessende Bioautographie zeigt eine Inhibierungszone von 22 mm Durchmesser bei -0,5 cm entsprechend Thienamycin und von kl mm Durchmesser bei +2,5 cm entsprechend der in der Überschrift genannten Verbindung.

Beispiel 26

Herstellung von N-p-Guanidinophenylacety!thienamycin

r-OH .

O ■ H

^C=NH

Thienamycin (60 mg) wird in einem pH 7,0 Phosphatpuffer (0,05n, 6 ml) gelöst und gründlich auf einem Eisbad gekühlt. Die Lösung wird dann auf den pH 8,3 unter Vervrendung einer Ausgabe-Autoburette mit 1,On NaOH eingestellt. Zu der gerührten Lösung wird in verschiedenen Anteilen p-Guanidinophenylacetylchlorid-hydrochlorid (64 mg, 259 wMol) gegeben, wobei durch die Autoburette der pH nahe 8,3 gehalten wird.

7Q9822/1028

15775Y

Nach wenigen Minuten wird die Reaktionslösung angesäuert (10 #ige H₃PO^-Lösung) auf pH 7,0 und auf 60 g XAD-2 Harz chromatographiert. Die Säule wird mit Wasser eluiert und dann mit einer 10&igen wässrigen Tetrahydrofuranlösung, welche das Produkt eluiert. Die Produktfraktionen werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man einen weissenj lockeren Peststoff erhält (45 mg, A max. 301 nm (£7020). Das Produkt hat eine elektrophoretische Mobilität von 2₃5 cm in Richtung zur Anode bei 50 V/cm für 25 Minuten. Das KMR stimmt überein mit dem für das Produkt erwarteten. Das IR (Nujol muli) zeigt eine Bande bei 1775 cm" (ß-Lactam).

Beispiel 27

Herstellung von N-Pyridiniumacety!thienamycin

Eine Mischung von 10 mg N-Bromacetylthienamycin-Natriumsalz und 0,5 ml Pyridin in 1 ml HMPA wird bei 25°C k Stunden gerührt. Das überschüssige Pyridin wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird in 3 ml Wasser aufgenommen und auf eine Säule von 20 ml eines XAD-2 Harzes gegeben. Nach dem Eluieren mit Wasser wird das Produkt mit lO^igem xrässrigem THF eluiert. Die Lösung hat eine optische Dichte von 93 bd/yinax 261 nm und 71 bei^max 297 nm. Elektrophorese und Bioautographie zeigen eine grössere Inhibierungszone bei -1 cm, entsprechend dem gewünschten Produkt N-Pyridiniumacety!thienamycin.

- 55 -709822/1028

Beispiel 28

Herstellung von N-Carbomethoxythienamycin

Thienamycin (49 mg) wird in 0,05m pH T₉O Phosphatpuffer (14 ml) gelöst und auf einem Eisbad gekühlt. Unter Rühren wird der pH unter Verwendung einer automatischen Burette auf 8,2 eingestellt. Eine Lösung von Methylchlorformat (46 |ul), 600 pMol) in p-Dioxan (580 jul) wird aufeinmal hinzugegeben, wobei man eine homogene Lösung erhält. Anschliessend wird der pH unter Verwendung einer automatischen Burette auf 8,2 gehalten. Nach 10 Minuten wird die Lösung auf einen pH von 7,0 eingestellt unter Verwendung von verdünnter Phosphorsäurelösung und man wäscht dreimal mit gleichen Volumina Diäthylather. Die wässrige Lösung wird dann auf 4,5 ml konzentriert und auf einer XAD-2 Harzsäule chromatographiert. Das mit einer wässrigen 5$igen Tetrahydrofuranlösung (nach einer Wassser-Eluierung) eluierte Produkt wird gefriergetrocknet, wobei man 28,9 mg des Produkte erhält.

UV (pH 7,0 Phosphatpuffer 0,ln)^ max 303 nm (£6450) Elektrophorese (20 Minuten, 0,ln pH 7,0 Phosphatpuffer 50V/cm) Mobilität 3,5 cm in Richtung zur Kathode.

Beispiel 29

Herstellung von N-Benzolsulfony!thienamycin

- 56 -709822/1020

15775Y

Th

r oh

NHS0_C_cH

- COOH

Thienamycin (52 mg) wird in pH 7,0In Phosphatpuffer (25 ml) gelöst und auf einem Eisbad magnetisch gerührt. Der pH wird auf 8,2 mit 2,5n NaOH eingestellt unter Verwendung einer automatischen Ausgabeburette und dazu wird auf einmal Benzolsulfonylchlorid (227 pl, 226juMol) in 500 ml p-Dioxan gegeben. Der pH wird unter Vervrendung der automatischen Burette 30 Minuten auf 8,2 gehalten und dann unter Verwendung von wässriger, verdünnter Phosphorsäure auf den pH 7,0 eingestellt. Die Reaktionslösung wird auf 15 ml konzentriert und über einem XAD-2 Harz (50 cm ) chromatographiert. Die Säule wird mit Wasser eluiert und anschliessend wird das Produkt mit _:10#igem wässrigem Tetrahydrofuran eluiert. Das lO^ige wässrige Tetrahydrofuraneluat wird auf ein Drittel seines Volumens konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 28 mg erhält. Die elektrophoretische Mobilität des Produktes (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7, 0,05n Phosphatpuffer) beträgt 3,5 cm in Richtung zur Kathode. J^ max 303 (<*~365O) in pH 7 O₃In Phosphatpuffer.

Beispiel 30

Herstellung von N-Guanylthioacety!thienamycin

709822/ 1028

- 57 -

&3

Eine Lösung aus 90 mg Natrium-N-bromacetylthienamycin in 40 ml Wasser xd.rd auf pH 6 eingestellt und dazu werden 36 mg Thioharnstoff gegeben. Die Lösung wird 5 Tage auf 4°C gehalten. Die Lösung wird über 80 ml eines XAD-2 Harzes chromatographierfc. Durch Eluieren mit 400 ml Wasser wird der Thioharnstoff entfernt und eine geringe Menge des Ausgan gs -Br omace ty lderi vat s und Thienamycins. Beim Eluieren mit 120 ml 10/Jigem Tetrahydrofuran erhält man eine Lösung, welche das N-Guanylthioaeety!derivat des Thienamycins enthält. Durch eine Hochdruckflüssigkeits-chromatographische Analyse über Bondapak C18 Porasil mit 10 tigern THF Lösungsmittel stellt ran einen grösseren Peak von mehr als 90 #iger Reinheit fest. Die Lösung wird auf 15 ml eingedampft (pH 5,5) und gefriergetrocknet. Ausbeute: 40 mg eines weissen Pulvers. UVA> max 299 E% 173-

Beispiel 31

Herstellung des Natriumsalzes von Thienamycin-N-(S-phenylcarbothioat).

-OH
Th 4-NHCS —Jf V

-COONa

Zu Thienamycin (37 mg, 0,14 mMol). in 24 ml 1:1 Dioxan-H_?0

bei 0⁰C gibt man unter Rühren 150 mg (1,78 mMol, 12 Äquivalente) NaHCO und dann tropfenweise unter Rühren während·4 Minuten 1,5 Äquivalente (39 mg, 0,22 mMol) Phenylchlorthioformat in 0,6 ml Dioxan. Nach 15 Minuten wird der pH mit wässriger 25#iger H,POj, auf 5,9 eingestellt und die Lösung wird mit

7 0 9 8 22/1028

- 58 -

Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird nach Entfernung von jeglichem eingeschlossenem Äther im Vakuum auf den pH 2,5 bei 0⁰C gebracht und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylextrakte werden vereint und schnell mit kalter Salzlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und mit Wasser zurückextrahiert, enthaltend 1,5 Äquivalente NaOH bis zu einem End-pH von 6,8. Die wässrige Schicht wird im Vakuum von jeglichem Äthylacetat befreit und gefriergetrocknet. Die wässrige Lösung enthält 486 ODU bei 302 nm (UV-Analyse in H_?0 bei pH 7>0), welche nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin zu 95 % ausgelöscht werden. Die Ausbeute beträgt 17,7 mg (29 %). Elektrophorese (50 V/cm während 18 Minuten, pH 7_a0 wässriges Phosphat, 0,05m) zeigt einen Spot durch Bioautographie 3_S6 cm in Richtung zur Anode.

Beispiel 32

Herstellung des Natriumsalzes von Thienamycin-N-(0-phenylcarbothioat

Zu Thienamycin (46,5 mg, 0,17 mMol) in 26 ml 1:1 Dioxan-H₂0 bei O⁰C werden unter Rühren 220 mg (2,62 mMol, 15 Äquivalente) NaHCO, gegeben und dann während 4 Minuten tropfenweise 1,5 Äquivalente Phenoxythiocarbonylchlorid in 0,6 ml Dioxan. Nach 8 Minuten wird der pH auf 7*0 eingestellt und dann wird die Lösung mit Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird nach Entfernung jeglichen anhaftenden Äthers im Vakuum auf den pH 2,5 bei O⁰C gebracht und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereint, schnell mit kaltem Salzwasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet,

709822/102 8

- 59 -

• V/.

filtriert und zurückextrahiert mit Wasser, enthaltend 1,5 Äquivalente 0,1m NaOH bis zu einem pH von 6,8. Die wässrige Schicht wird von jeglichem Äthylacetat im Vakuum befreit und gefriergetrocknet. Die wässrige Lösung enthält 572 ODU bei 302 nm (UV-Analyse in H₃O bei pH 7,0), welche nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin zu 95 % ausgelöscht werden. Die Ausbeute beträgt 19 mg (26 % der Theorie). Elektrophorese (50 V/cm während 18 Minuten; pH 7 wässriges Phosphat, 0,05m) zeigt einen Spot durch Bioautographie 3,3 cm in Richtung zur Anode.

Beispiel 33

Herstellung des Natriumsalzes von N-(DimethoxyphosphinothioyI)-thienamycin __

Th-

OH
S

NHP(OCH₃) COONa

Zu dem Trimethylsilylderivat Th(TMS),, hergestellt aus 21*} mg Thienamycin in 25 ml trockenem THF, werden 227 Dimethylphosphorchloridthionat in 2 ml THP gegeben und anschliessend 0,18 ml (I30 mg) Triäthylamin. Nach Rühren unter Stickstoff für annähernd 2 Stunden wird der Inhalt zu einem viskosen Rückstand im Vakuum konzentriert. Der pastöse Rückstand wird in ¹JO ml Äthylacetat, enthaltend 5 ml entionisiertes Wasser, suspendiert und mit verdünnter · wässriger Phosphorsäure auf den pH 3,5 gebracht und 10 Minuten

709822/1028

- 60 -

gerührt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und mit zweimal 20 ml Äthylacetat extrahiert. Die fithylacetatextrakte werden vereint, schnell getrocknet mit wasserfreiem Magnesiumsulfat und filtriert. Zu dem kalten A'thylaeetatextrakt werden 20 ml Wasser gegeben und der pH wird mit verdünnter NaOH auf 7 eingestellt. Die wässrige Shicht wird abgetrennt und im Vakuum auf ein kleineres Volumen (7 ml) konzentriert und auf eine 35 x 4 cm Säule_a enthaltend 500 ml XAD-2 Harz,gegeben. Die Säule wird mit Wasser eluiert und anschliessend mit 6#igem wässrigem THP und schliesslich mit 10/5igem wässrigem THF. Die mit lOHgem THP eluierte Fraktion (Röhrchen 99 - 150, 14 ml/Röhrchen) hat ein X max 304 nm und enthält das gewünschte Prldukt. Elektrophorese (50 V/cm, 16 Minuten bei pH 7> wässriges Phosphat, 0,05m) zeigt nur durch Bioautographie eine Zone (MB-108 Staph. aureus) 3 cm in Richtung zur Anode. Gefriertrocknung ergibt 39 mg (10,5 % Ausbeute) des Natriumsalzes von N-(Dimethoxyphosphinothioyl)-thienamycin. KMR (c/D_o0) 4,0 (d, J = 10 Hz-P-OCH..).

Beispiel 34

Herstellung des Natriumsalzes von N-(Dimethoxyphosphinyl)· thienamycin

-OH
0

Th-,

_C00Na

709822/1028

Zu dem Trimethylsilylderivat Th(TMS),, hergestellt aus 93 mg Thienamycin in 2 ml trockenem THP, werden 88 mg Dimethylphosphorchloridat in zwei Portionen gegeben und anschliessend 45 g (0,06 ml) Triäthylamin. Nach heftigem Rühren während einer Stunde wird der Inhalt zu einem viskosen Rückstand im Vakuum konzentriert. Der Rückstand xfird in 10 ml Äthylacetat suspendiert und 3 ml eines pH 3 Phosphatpuffers werden zugegeben und das Ganze wird 10 Minuten gerührt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und mit zweimal 3 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereint, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Zu dem kalten Äthylacetatextrakt gibt man 6 ml HpO und bringt den pH mit verdünnter NaOH auf 7. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und im Vakuum konzentriert, wobei man 18 mg (13#ige Ausbeute) des Natriumsalzes von N-(Dimethoxyphosphinoyl)-thienamycin erhält;^ 303 nm;

Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7 wässriges Phosphat, 0,05m) zeigt eine Zone 3,2 in Richtung zur Anode (BioautographieMB-108 Staph. aureus).
KMR ((/D₀O) ~4,0 (d 5 = 10 Hz POCH,)

B e i s ρ i e 1 35

Herstellung des Natriumsalzes von N-(Bis-(methylthio)-phosphinothioyD-thienamycin '

rOH
S

Th - -NH? (SCH₃)
-COONa

70 9 822/1028 - 62 -

15775Y

Zu dem Trime thylsiIy!derivat Th(TMS),, hergestellt aus 213 mg Thienamycin in 20 ml trockenem THF, werden 300 mg Dimethylphosphorchloridotrithioat in 2 ml THF gegeben und anschliessen O,18 ml (130 mg) Triäthylamin. Nach 3stündigem Rühren unter trockenem Stickstoff wird der Inhalt im Vakuum zu einem viskosen Rückstand konzentriert. Der pastöse Rückstand wird in 25 ml Äthylacetat, enthaltend 5 ml HpO, suspendiert und der pH wird mit verdünnter wässriger Phosphorsäure auf 3,5 gebracht und das Ganze wird 10 Minuten gerührt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und mit zweimal 10 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden zusammen mit wasserfreiem MgSOj, getrocknet und filtriert. Zu dem kalten Äthylacetatextrakt gibt man 5 ml H„0 und bringt den pH mit verdünnter NaOH auf 7. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und im Vakuum auf ein kleineres Volumen (7 ml) konzentriert und auf eine 30 χ 3 cm Säule, enthaltend I50 ml XAD-2 Harz, gegeben. Die Säule wird mit H₂O gewaschen und arschliessend mit wässrigem 9$igem THF, welches das Produkt, nämlich das Natriumsalz von N-(BIs-(methylthio)-phosphinothioyD-thienamycin entfernt (A _m„_v 306" nm), das gefriergetrocknet wird, wobei man 69 mg eines gelb-hell-orangen Feststoffes (19,6 %) erhält. Bei der Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7 wässriges Phosphat, 0,05m) stellt man nur eine Zone fest 3 cm in Richtung zur Anode (Bioautographie MB-IO8 Staph. aureus).

Beispiel J>6

Herstellung des Natriumsalzes von N-Sulfamoyl-thienamycin

709822/1028 - 63 -

Th

OH

■ NHSO₂NH₂

Zu dem Trime thy lsi Iy !derivat Th(TMS).., hergestellt aus 210 mg Thienamycin in 10 ml THP, werden 223 mg Sulfamoylchlorid in 5 ml THP gegeben und anschliessend 0,25 ml (l80 mg) Triäthylamin. Nach Rühren unter trockenem Stickstoff während 2 Stunden wird die Mischung zu einem viskosen Rückstand im Vakuum konzentriert. Der pastöse Rückstand wird in 50 ml Äthylacetat, enthaltend 5 ml HpO, suspendiert und der pH wird auf 3,5 gebracht und das Ganze wird 10 Minuten gerührt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und einmal mit 10 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden zusammen getrocknet mit wasserfreiem MgSO^ und filtriert. Zu dem kalten Äthylacetatextrakt gibt man 18 ml H₂O und stellt den pH mit verdünnter NaOH auf 7,0 ein. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und im Vakuum auf ein kleineres Volumen eingeengt und auf eine 33 x 4 cm Säule, enthaltend 500 ml XAD-2 Harz, gegeben. Die Säule wird mit HpO eluiert, wobei man N-Sulfamoylthienamycin-Natriumsalz erhält. ^ 303 nm. Elektrophorese (50V/cm,

20 Minuten, pH 7 wässriger Phosphatpuffer 0,05m) zeigt eine Zone 3,2 cm in Richtung der Anode (Bioautographie MB-108 Staph. aureus). Gefriertrocknung der obengenannten Lösung ergibt 90 mg (*il %) des Natriumsalzes von N-SuIfamoylthienamycin als gelben Feststoff.

IR Nujol ß-Lactam C=O 1750 Schulter 1770 (5,71 + 5,65 /u) und 1150 cm*"¹ (8,65p) für HN-SO

7 09822/1028

-6H-

Beispiel 37

Herstellung von N-(ß-Azidopropionyl)-thienamycin

"OH

-NH

Th --

"OH

-CO₂Na

Thienamycin (184 rag) wird in 30 ml Wasser gelöst und auf O⁰C gehalten. Zu der Lösung gibt man 0,52 g NaHCO-, 30 ml Dioxan und 163 mg ß-Azidopropionylchlorid. Die Mischung wird 15 Minuten gerührt und dann mit 30#iger HTPO κ neutralisiert und mit Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und auf 5 nil konzentriert. Das rohe Produkt wird chromatographierf über eine Dowex 5OW χ (Natrium-Form) Ionenaustauschsäule (I" χ 10"). Die Kolonne vrird eluiert mit H„0, wobei man 81 mg des gewünschten Pro-

( H O duktes erhält, das eine UV-Absorption bei/\ 2 von 306 nm zeigt. Elektrophorese des Produktes bei 2 KV in 0,1m pH 7₉0 Phosphatpuffer während 2 Stunden zeigt eine einzelne bio-aktive Zone, die sich 30 mm in Richtung der Anode bewegt,

Beispiel 38

Herstellung von N-(ß-Alanyl)-thienamycin

709822/1028

157-75Y.

Γ OH

Th 4-NHCCH₂CH₂N₃ • CO₂Na

Th —

—OH,

-NHCCH₂CH₂NH₃

Die wässrige Lösung von N-(ß-Azidopropionyl)-thienamycin. (4o mg in 20 ml Wasser) wird unter 1 Atmosphäre Wasserstoff und in Gegenwart von 200 mg Palladium 40 Minuten bei 25°C hydriert. Die erhaltene Lösung (pH 9,0) wird mit 30#iger EUPO₁, neutralisiert und vom Katalysator abfiltriert. Die Mischung wird über einer Dowex 5OW χ 8 (Natrium-Form) Ionenaus tausch säule (I" χ 10") chromatographiert und die Säule wird eluiert mit Wasser, wobei man 20 mg des gewünschten Produktes erhält, welches ein UVλ 2 von 302 nm zeigt.

^J ΓΠ3.Χ

Die Elektrophorese des Produktes bei 2 KV in 0,1m pH 7,0 Phosphatpuffer während 20 Minuten zeigt eine einzelne bioaktive Zone, die sich 10 mm in Richtung zur Kathode bewegt.

Beispiel 39

Herstellung von H-(N'-Acetimidoyl-ß-alanyl)-thienamycin

Th-

-OH

γόη

- -NHCCi
-CO

CH₂CH₂NH₃

Th +-NHCCH₀CH-NH₀C
*. £■ e· ν

NH

^LCO.

CH-

Die wässrige Lösung von N-(ß-Alanyl)-thienamycin (125 mg

ο
in 15 ml Wasser) wird bei 0 C gehalten und man hält einen pH von 8,5 aufrecht, indem man 2,5n NaOH zugibt während O-Äthylacetimidat-hydrochlorid (350 mg) während eines

709822/1028

- 66 -

Zeitraumes von 10 Minuten portionsweise zu der Lösung gegeben wird. Die Mischung wird 1 Stunde gerührt und dann mit 2,5n HCl neutralisiert und auf 15 ml konzentriert. Das so erhaltene Rohprodukt wird zweimal über eine Dowex 50W χ 8 (Natrium-Form) Säule (I" χ 10") Chromatographiert, wobei man 25 mg erhält. Das Produkt wird mit Wasser eluiert und die Lösung gefriergetrocknet. Beim Umkristallisieren des Produktes aus Wasser erhält man einen kristallinen Feststoff, welcher ein IR-Spektrum (Mujol muli) wie folgt zeigt:
I769 cm"¹ (ß-Lactam); KMR (D₃O)₃ 100 MHz): 2,20 ppm
(s, Acetimidoyl) CH₃); ^H2°

^^mäx ^{302 nm}* ^Elekfcr°P^{norese des} Produktes bei 2 KV in 0,1m pH 7,0 Phosphatpuffer während 20 Minuten zeigt eine
einzige bio-aktive Zone, die sich 10 mm in Richtung zur
Kathode bewegt.

Beispiel 40

Arbeitet man nach den Verfahren, wie sie in den Beispielen 37j 38 und 39 beschrieben worden sind, mit der Ausnahme,
dass

1.) O-Äthylacetimidathydrochlorid ersetzt wird durch eine äquivalente Menge von O-Methylformimidathydrochlorid in Beispiel 39;

2.) ß-Azidopropionylchlorid ersetzt wird durch eine

äquivalente Menge von Azidoacetylchlorid in Beispiel 37;

3·) N-(ß-Azidopropionyl)-thienamycin ersetzt wird, durch eine äquivalente Menge von N-(Azidoacetyl)-thienamycin in Beispiel 38;

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- 67 -

15775Y

M.) N-(ß-Alanyl)-thienamycin ersetzt wird durch eine äquivalente Menge von N-Glycy!thienamycin in Beispiel 39;

5.) O-Äthylacetimidat-Hydrochlorid ersetzt wird durch eine äquivalente Menge an O-Methylformimidat-Hydrochlorid und N-(ß-Alanyl)-thienamycin ersetzt wird durch N-Glycy!thienamycin in Beispiel 39;

6.) O-Ä'thylacetimidathydrochlorid ersetzt wird durch eine äquivalente Menge von Methylsulfat in Beispiel 39;

7·) O-Ä'thylacetimidathydroohlorid ersetzt wird durch eine äquivalente Menge Methylsulfat und N-(ß-Alanyl)-thienamycin ersetzt wird durch N-Glycy!thienamycin in Beispiel 39 und

8.) N-(ß-Azidopropionyl)-thienamycin ersetzt wird durch eine äquivalente Menge von N-(2-AzidoäthoxylcarbonyI)-thienamycin in Beispiel 38,

so erhält man die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten Verbindungen:

709822/1028

15775Y

Verbindung	m	η	A	y
1.)	1	1	-	Θ ^NH -NH₂C-H
2.)	1	0	-	-N₃
3.)	1	0	-	-NH₃
4.)	1	0	-	© W -NH₂-C-CH₃ .
5.)	1	0	-	Q NH -NH₂-C-H
6.)	1	0	-	-N(CH₃J₃
7.)	1	0	-	© -N(CH₃J₃
8.)	0	2	Sauerstof:	-NH₃

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- 69 -

15775Y

Beispiel 41

Herstellung des Natriumsalzes von N-Phenoxyacetalthienamycin

Zu einem 250-ml-KoIben, enthaltend Thienamycin (190 mg), werden 30 ml Wasser, 0,6 g Natriumbicarbonat und 30 ml Dioxan gegeben. Während man die Mischung rührt und auf O⁰C hält, wird zu dem Kolben während eines Zeitraumes von 10 Minuten Phenoxyacetylchlorid (170 mg) gegeben. Die Lösung wird weitere 10 Minuten gerührt und dann mit 30$iger Phosphorsäure .auf pH 4,5 angesäuert. Die angesäuerte Lösung wird schnell extrahiert mit 50 ml Äther, um überschüssiges Reagenz zu entfernen und dessen hydrolysiertes Produkt Phenoxyessigsäure. Die wässrige Schicht, die so erhalten wurde, wird weiter angesäuert mit 30$iger Phosphorsäure auf pH 2,0- und mit 50 ml Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht, welche die freie Säure von N-Phenoxyacety!thienamycin enthält, wird abgetrennt und rückextrahiert mit 30 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 60 mg Natriumbicarbonat. Die wässrige Schicht wird gefriergetrocknet, wobei man 120 mg des Natriumsalzes von N-Phenoxyacetylthienamycin erhält. Die Elektrophorese (0,5m, pH 7,0, Phosphatpuffer, 2 KV während 20 Minuten): Eine einzelne bio-aktive Zone, die sich 45 mm in Richtung zur Anode bewegt. UV: / ^H2° 302 nm. .
' max

- 70 709822/1028

15775Y

Beispiel H 2

N-ß-Guanidinopropionylthienamycin Stufe A: ß-Guanidinopropionylchlorid-hydrofluorid

ß-Guanidinopropionsäure (130 mg) werden in Portionen zu 1 ml Thionylchlorid in einem zentrifugieren Röhrchen unter Stickstoff gegeben. Die pastöse Reaktionsmischung wird mit einem Gasstab gerieben, bis sie zu kristallisieren beginnt. Das überschüssige Thionylchlorid wird in einem Stickstoffstrom abgedampft, wobei ein fester Rückstand von ß-Guanidinopropionylchlorid-hydrochlorid zurückbleibt.

0
ir
IR 5,6u (-C=Cl); breites Band 6 - 6,3 μ (Guanidino).

Stufe B:

Thienamycin (5** mg) wird in 1 ml wasserfreiem Dimethylformamid suspendiert. Die Mischung wird auf 0⁰C gekühlt und ß-Guanidionopropionylchlorid-hydrochlorid (37 mg) wird unter Rühren zugegeben und unmittelbar daran eine Lösung aus 25,8 mg Diisopropyläthylamin in O₃I ml DMP. Nach weiteren 5 Minuten wird das Produkt mit Äther niedergeschlagen. Der Äther wird dekantiert und der Rückstand wird mit 2 ml Wasser gelöst, mit Natiumbicarbonat auf pH 6,8 eingestellt und über 75 ml eines XAD-2 Harzes chromatographiert. Nach Eluieren mit Wasser- wird das Produkt mit lO^igem wässrigem THF eluiert, konzentriert und gefriergetrocknet. UV,/ _mov 303 mu EJi 157- Elektro-

'\ max ι

phorese (1 Stunde, 50V/cm, pH 7) zeigt einen einzelnen bioaktiven Spot, der sich 4,5.Cm in Richtung zur Kathode bewegt und der einen positiven Sakaguchi-Farbtest ergibt. ■

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- 71 -

^% ei.

Beispiel 43

Herstellung von N-GuanyIcarbamoy!thienamycin

Thienamycin (253 mg) wird in O₅In pH 7 Phosphatpuffer (11 ml) gelöst, auf einem Eisbad gekühlt und unter Verwendung von In NaOH, die aus einer Autoburette ausgegeben wird, auf einen pH von 8,5 eingestellt. Zu dieser Lösung wird eine kalte Lösung (2,5 ml) von 1-Amidino-semicarbaziddihydrochlorid (35*! mg) und Natriumnitrit (128 mg) gegeben. Der pH steigt auf 9>0 und nach 10 Minuten wird der pH eingestellt und aufrechterhalten auf 8,2. Nach 30 Minuten bildet sich ein Niederschlag und der pH wird unter Verwendung von In HGl auf 7,0 eingestellt. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat'chromatographiert über einer Säule eines XAD-2 Harzes (120 ml), die mit Wasser und anschliessend mit wässrigem lO^igem Tetrahydrofuran eluiert wird. Das N-Guanylcarbamoylthienamycin-Derivat eluiert in wässrigem Tetrahydrofuran und wird gefriergetrocknet zu einem Peststoff. UV. (pH 7 0,ln Phosphatpuffer) J. _w^_v 298 nm

C * ΙΠ.3.Χ

(£5500) HPLC C.g Bondapak, wässriges lO^iges Tetrahydrofuran) Retentionszeit 2,0-fache der von Thienamycin. Elektrophoretische Beweglichkeit. (^OV/cm, pH 7 0,ln Phosphatpuffer, 20 Minuten) beträgt 2 cm in Richtung zur Anode.

Beispiel Hk

Arbeitet man nach den vorhergehenden Beispielen und Beschreibungen, so werden die nachfolgend definierten Verbindungen gemäss der Erfindung erhalten:

- 72 -

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15775Y

JLJ

.COOM

Verbindung M R

50
6.)

7.)

8.)

9.0

10.)

Na · H

Na H

H H

Na H

Na- H

-C-CH=CHo	IT	2°~^C2^H5
•ι	0
0	C-NH 11	2
0
	H *
C-CH	oN-CH-5
Il
0
C-CH Il	₂NCCH₃) ₂ .
0
	H
C-CH • ι	0-N-C-NH₀ *- Ii £-
0	N
	H

i\ ί. J

-C-CHC-OCH₀),

Il J -

-C-CH₀OH

Il *·

-C-C=CH

709822/1028

- 73 -

15775Y

Verbindung	M	R¹	R²	2652675
11.)	H	H	-C-CH₀N-C-N-C-NH₀ *ti e-rr* Ii TT it Z** O ■ O ^Ά N • H
12.)	Na	H	-C-CHOHCHo It -J 0
13.)	K	• H	-C-CH(CHo)₀ ti j Z. 0
14.)	NH₄	. H	S-CF₃
15.)	K	H	-C-H Il 0
16.)	Na '	H -	H /N_x -C-CH₀ c ^XN 5 -I Il N N

17.)

Na

-CCH₀-N N

S I Il

18.)

Na · H

-C-CH-C N 0 N-

ι Ii

19.)

Na

-CCH,
0

20.	)	Na	H
21.	)	Na	H
22.	) .	Na	H

-CCHCNH₂)CH₃ -SO₂CF₃

-c

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15775Y

2657675

Beispiel 45

Herstellung von pharmazeutischen Zubereitungen

Eine solche Einzeldosierungsform besteht darin, dass man 120 mg von N-GIycy!thienamycin mit 20 mg Lactose und 5 mg Magnesiumstearat mischt und die l45ng Mischung in eine Gelatinekapseln Nr. 3 füllt. In gleicher Weise kann man durch Verwendung von mehr an aktivem Bestandteil und weniger Lactose andere Dosierungsformen in Gelatinekapseln Kr. 3 füllen. Erforderlichenfalls kann man mehr als 145 mg an Bestandteilen zusammen vermischen und grössere Kapseln oder komprimierte Tabletten und Pillen herstellen. Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen:

Tabletten pro Tablette N-GIycy!thienamycin 125 mg

Maisstärke, U.S.P. 6 mg

Dicalciumphosphat 192 mg

Lactose, U.S.P. 190 mg

Der aktive Bestandteil wird vermischt mit Dicalciumphosphat, Lactose und etwa der Hälfte der Maisstärke. Die Mischung wird dann granuliert mit 15 % der Maisstärkepaste (6 mg) und grob gesiebt. Sie wird dann bei 45°C getrocknet und wiederum durch ein Sieb Nr. 16 gesiebt. Der Rest an Maisstärke und Magnesiumstearat wird zugegeben und die Mischung wird zu Tabletten verpresst, die annähernd 1,2 cm Durchmesser haben und jeweils 800 mg wiegen.

Parenterale Lösung

Ampulle:

N-GIycy!thienamycin 500 mg

steriles Wasser 2 ml

709822/1Ö28 - 75 -

15775Y

Opthalmische Lösung

N-Glycylthienamycin 100 mg

Hydroxypropylmethylcellulose 5 mg .

steriles Wasser bis zu 1 ml

Ohren-Lösung

N-Glycylthienamycin 100 mg

Benzalkoniumchlorid 0,1 mg

steriles Wasser bis. zu 1 ml

Topische Salbe

N-Glycylthienamycin 100 mg

Polyäthylenglykol 4000 U,S.P. 400 mg .

Polyäthylenglykol 400 U.S.P. 1,0 g

Die aktiven Bestandteile der obengenannten Formulierungen können allein oder in Kombination mit anderen biologisch aktiven Bestandteilen verabreicht v/erden, beispielsweise mit anderen antibakteriellen Mitteln, wie Lincomycin, einem Penicillin, Streptomycin, Novobiocin, Gentamicin, Neomycin, Colistin und Kanamycin oder mit anderen therapeutischen Mitteln, wie Probeneeid.

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- 76

Herstellung von alternativen Ausgangsmaterialien

Ausser Thienamycin ist es für den Fachmann ersichtlich₃ dass dessen verschiedene Isomere allein oder als Mischungen als Ausgangsstoffe bei der Herstellung der erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden können. Einige dieser Isomeren sind aus natürlichen Produkten der Fermentation erhältlich (siehe unten). Durch Totalsynthese werden jedoch alle Isomere erhältlich (siehe unten) in Form einer Mischung von H Diastereoisomeren, welche bacterizide Aktivität aufweisen und die nach üblichen technischen Verfahren aufgetrennt werden können. Die 4 Diastereoisomere (2 eis ₃ 2 trans) können chromatographisch getrennt werden. Die Auftrennung von jeweils einem gegebenen d/1 Paar mit optisch aktiven Säuren oder Basen läuft nach üblichen Verfahren ab. Dabei soll festgehalten v/erden, dass die absolute Konfiguration des zuerst identifizierten Ausgangsmaterials (I) 5R öS 8R ist.

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- 77 -

Herstellung von Thienamycin durch Totalsynthese

OH

COOH

Stufe A:

Herstellung von *<-(2-Acetoxyvinyl)-azetidin-2-on

H₀C=CH-CH=CHOC-CHo + O=C=N-SO₀Cl

Λ !

CH=CHOCCH.

SO₂Cl

CH=CHOCCH.

Eine Lösung aus 1,0 ml destilliertem Chlorsulfonylisocyanat (1,65 g_s 11^7 mMol) in 2,5 ml vzasserfreiem Diäthyläther wird unter N₂ in einem Bad von -20⁰C gekühlt. '

Eine Lösung von 2,5 g L-Acetoxybutadien (22 rtiMol) in 2,5 ml wasserfreiem Äther wird ähnlich gekühlt unter Stickstoff in einem -20⁰C Bad.

Die Chlorsulfonylisocyanatlösung wird .tropfenweise zu der Acetoxybutadienlosung hinzugegeben mittels eines in die CSI-Lösung eintauchenden Polytetrafluoräthylenrohres und

709822/1028

- 78 -

So-

wird mit N₂ unter Druck gesetzt. Die Zugabe dauert 10 Minuten. Wenig oder keine Farbe ist erkennbar und die Reaktion wird 0,5 Stunden bei -20°C gerührt. Die Lösung, ist klar und hat eine hellgelbe Farbe.

Eine Lösung aus 2 g Natriumsulfit und 5 g KpHPO₁, in 20 ml H₂O wird hergestellt vrährend der vorerwähnten 0,5 Stunden Reaktionszeit und auf einem Eisbad gekühlt; 20 ml Äther werden zu der Mischung unter heftigem Rühren auf einem Eis bad hinzugegeben. Nach Ende der 30-minütigen Reaktionszeit wird das Reaktionsgemische wiederum unter Anwendung von und einem Polytetrafluoräthylenrohr aus dem Reaktionskolben, der in einem Bad von -20⁰C gehalten wird, zu der heftig gerührten Hydrolysemischung überführt. Die schnelle, tropfenweise Zugabe ist nach 5 Minuten beendet. Man lässt die Hydrolyse weitere 5 Minuten stattfinden. Die Hydrolyseniis cnung hat einen pH von 6-8, vorzugsweise pK 8.

Die Phasenwerden getrennt, wobei ein gelb-orange Harz in der wässrigen Phase verbleibt. Die Ätherphase wird direkt über MgSOj, getrocknet. Die wässrige/Harzphase wird dreimal mit 50 ml-Anteilen Äther extrahiert, wobei jeder Anteil zu der Ausgangs-Äther/MgSOj.-Mischung gegeben wird.

Die getrockneten Extrakte werden filtriert und unter einem Np-Strom auf 5 ml konzentriert; ein Teil des Produktes -ist kristallisiert in diesem Stadium.

Man stellt eine Säule aus 10 g Baker-Knselgel, gepackt in Äther, her und das Ätherkonzentrat wird obenauf gegeben und durchlaufen gelassen. Der im Kolben enthaltene Rückstand wird dreimal mit 2 ml Äther gespült, jedesmal abpipettiert und auf die Säule gegeben. Dann wird mit Äther eluiert.

709822/1028 - 79 -

Die ersten 25 ml sind hauptsächlich Leervolumen. Die nächsten 5 10-ml-Fraktionen v/erden gesammelt und anschliessend daran 3 50-ral-Fraktionen und alle werden unter einem Np-Strom im Volumen vermindert. Das Produkt kristallisiert aus den Fraktionen H bis 6mit Spuren in 3 und 7. Die Fraktionen 1 bis 3 enthalten ein gelbliches, scharf-riechendes Material, das beim Stehen harzförmig wird. Ausbeute: 100 mg als Mischung aus den eis- und transisomeren.

Stufe B:

Herstellung von 4-(2-Acetoxyäthyl)-2-acetidinon

	O ^DCCH₃	N





T<\|TT

OCCH₃

Eine Lösung von 4-(2-Acetoxyvinyl)-2-azetidinon (10,0 g, 0,065 Mol) in 200 ml.Äthylacetat, enthaltend 100 mg eines 10 % Palladium/C-Katalysators, wird in einem Parr-Sehütt- , 'ler hydriert bei 25 C unter einem Druck von 2₃8 kg/cm im Laufe von 15 Minuten. Die Mischung wird durch ein Bett aus Super eel" filtriert und mit zusätzlichem Äthylacetat gewaschen. Das vereinte Filtrat wird im Vakuum gewaschen, wobei "man als kristallinen Feststoff ⁱl-(2-Acetoxyäthyl)-2-azetidinon (10,0 g) erhält. Beim Umkristallisieren aus Äther erhält man weisse Kristalle: F. HH bis 47⁰C; IR (CHCl₃) 5,66, 5,7^; KMR (CDCl₃)T3,HH

(breites s, 1, NH), 5,82 (m, 2, CH₀OCOCK,), 6,29 (m,

—<- j

1, C-4H, 6,87 (1/2 AB Muster wird weiterhin vierfach

709822/1028 _ 80 -

aufgeteilt durch C-4H und NH, 1, J = 12,8Hz,

gem

J = 4,5 H H_NH =1,9 Hz, 7,38 (1/2 AB Muster wird weiterhin vierfach aufgeteilt durch C-4H und NH, l_s J _em = 12,8Hz, J = 2,3Hz, J_MH = 1,0Hz). 7,93 und 8,02 (s an m, total 5, OCOCH, und CH₀CH₀OCOCH,, entsprechend).

Stufe C:

Herstellung von *i-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon

Unter Stickstoff bei 0⁰C wird eine Lösung aus U-(2-Acetoxyä"thyl)~2-azetidinon (2,2U g, 0,014 Mol) in 25 ml wasserfreiem Methanol mit einer Lösung von Natriummethylat (77 mg, l,k mMol) in 5 ml wasserfreiem Methanol behandelt. Nach einstündigem Rühren wird die Lösung mit Eisessig neutralisiert. Die Entfernung des Methanols im Vakuum ergibt das rohe U-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon als ein öl. Das Produkt wird chromatographisch über Kieselgel gereinigt, indem man es mit 10 % Methanol/CHCl-. eluiert,

wobei man 1,55 g des Alkohols erhält: F. 50 C; IR (CHOI,)/! 5,67; KMR (CDCI^57^,20 (breites s, 1, NH), 6,24 und 6,28 (m an t, total 3, -C-IlH und CH₃OH entsprechend), 6,90 (breites s an 1/2 AB Muster spaltet weiter auf in vier durch C-4H und NH, total 2, OH und C-3H entsprechend, ^Jgem = !3.0Hz, J_vic = 11,2Hz, J^_H = 1,6H₂), 7,^2 (1/2 AB Muster spaltet weiter auf in vier durch C-^H und NH, 1, C-3H, ^Jgem ^{= 1}^OHs, J_yic = 2,2Hz, J_NH= 1,1Hz), 8I6 (m, 2, CH₂CH₀OH)

- 81 -

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Stufe D:

Herstellung von 8-Oxo-2_J2-diTnethyl-3-oxa-l-azabicyclo-M, 2, o7- oc tan

Eine Lösung aus ¹4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon (1,87 g, 0,016 Mol) und 2,2-Dimethoxypropan (1,69 g, 0_s0l6 Mol) in 25"ml wasserfreiem Methylenchlorid wird mit Bortrifluoridätherat (0,201 ml, 0,002 Mol) bei 25°C behandelt. Die erhaltene Lösung wird 10 Minuten gerührt. Bein Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck erhält man ein Öl (2,5 g). Die Chromatographie des Rohproduktes über einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 2:1 Äthylacetat/Benzol als. Eluierungsmittel ergibt 8-Oxo~2,2-di~ methyl-3-oxa-l~azabicycloyi,2,o7-octan (1,59 g) als kristallinen Peststoff. Beim Umkristallisieren aus Äther/ Hexan erhält man ein Produkt mit dem F. 60 bis 6l°C. IR (CHCl₃^: 5,73 (ß-Lactam)

KMR (CDCl,)7: 6,02 - 6,28, i, 2H, C-k Methylen 6,22 - 6,62, m, IH, C-6 Methin

6,90, dd, IH, J_{7 7}

C-7 Proton eis bis C-6H

7,47₉.dd, IH, J_{7 7} = 14 Hz, J

C-7 Proton trans bis D-6H

7,82 - 8,68, m 8,23, s, 3H 8,57, s, 3H

= 4,5 Hz

1,7

, 2Η, C-5 Methylen C-2 Methyle

- 2Hz

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- 82 -

Stufe E:

Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-7cC- und ß-(l-hydroxyäthy1)-(3-oxa-1-azabicyclo-/4,2_ao7-octan

Zu einer Lösung aus 1,1 Äquivalenten von frisch hergestelltem Lithiumdiisopropylamid in wasserfreiem Tetrahydrofuran unter einer Stickstoffatmosphäre bei -78⁰C wird eine Lösung aus δ-Οχο-2,2-dimethyl-3-oxa-l-azabicyclo-M,2_so7-octan in wasserfreiem Tetrahydrofuran;, das auf -78 C gekühlt worden ist, zugegeben. Nach 2 Minuten wird das erhaltene Lithiumenolat mit überschüssigem Acetaldehyd behandelt. Die Lösung wird 30 Minuten bei -78 C gerührt und dann in Wasser gegossen. Die wässrige Phase wird mit Natriumchlorid gesättigt und mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlösungen werden über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedämpft, wobei man das rohe Produkt erhält. Durch Rei-" nigung mittels Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von Äthylacetat/Benzol erhält man 8-0xo-2,2-dimethyl-7«T- und ß-(l-hydro:<yäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-A,2,07-octan.

Daten für 8-Oxo-2^-dimethyl-7ß-(1-hydroxyäthyl)-3-oxa-1-azabicyc Ιο-/ ~i\ ₃ 2,0/-octan:

IR (CH₂Cl₂ )μ : 5,72μ (ß-Lactam)

5,53 - 6,43, m, 4H, C-4 Methylen +

C-6 Methin + C-9 Methin

KMR (CDCl ) 7*

709822/1028

- 83 -

lM. I-ezember 1976

¹⁵⁷⁷⁵¹ 2652675

6,90, öd auf breitem s, 2H, ^J ₇ q = J_{6 7} = 5,5Hz₃ C-7 Methin + OH 7j70 - 8,83, m, 2H, C-5 Methylen 8,27, s, 3H)
■ . " . " 8,6O_? s, 3h]^C-² ^neth^

8,78,.d, 3H, J_{g 10} = 6,5Hz₃ C-IO Methyl

Daten für 8-Oxo-2,2~dimethyl-7oG-(l-hydroxyäthyl)-3-oxa-lazabicyclo-/4,2,o7~octan:
IR (CHCl₃)Ji : 2,9. breites 0-H

5,73 ß-Lactam

KMR (Aceton - d/:)e^ ⁴»²3 - 3,33, m, C-9 Methin + C-k

Methylen + C-6 Methin

__{7 Methin}

3,33, breites s, OH

2,83, dd, J=2Hz, 6Hz y

2,67, dd, J=2Hz, 8HzJ

1,93 - 1,63, m, C-5 Methylen

1,63, s j _c__{2 Meth}y_le

1^0, sJ

1,23, d, H=6,5Hz, C-IO Methyl

Stufe F:

Hers te llung von 8- Oxo-2 , 2-dime thy 1-7&Z- (1-p -nit rob enzy 1-carbonyIdioxyäthyI)-3-oxa-1-azabicyclo-/4,2,o7-octan

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2657675

h.

Unter wasserfreien Bedingungen wird eine Lösung aus 8-0x0-2 _s2-dimethyl-7öC-( l-hydroxyäthyl)-3-oxa-l-azabicy clo-/3,2,07-octan (60 mg, 0,302 mMol) in 0,6 ml Äther mit pulverisiertem Kaliumhydroxid (19 mg, 0,332 mMol) behandelt. Nach 15 Minuten wird p-NitrobenzyIchlorformat (65 mg, 0,302 mMol) zu der Reaktionsmischung gegeben. Man rührt weitere 15 Stunden bei 25 C. Die Mischung wird aufgeteilt zwischen Im pH 7 Phosphatpuffer und weiterem Äther. Die Ätherphase wird mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Beim Abdampfen des Filtrates unter vermindertem Druck erhält man 67 mg eines farblosen Öls. Reinigung durch präparative Dickschicht-Chromatographie über Kieselgel und Entwickeln mit 1:9 Äthylacetat/Benzol ergibt 8-Oxo-2,2~dimethyl-7<?C-(l-p~ nitrobenzyIcarbonyldioxyäthyI)-3-oxa-1-azabicyclo-/4,2,07-octan (40 mg) als Mischung der Diastereomeren.

.IR (CH₂Cl₂) μι 5₃68 (ß-Lactam und Carbonat), 6,19 und

6,5¹I (Nitro)
KMR (CDCl₃) : 1,67, d, 2H, ArH

2,37, d, 2H, ArH

4,67, s, 2H, ArCH₂

4,67 - 5,22, m, CH₅CH.

5,98 - 6,25, m, 2H, C-4 Methylen

6,25 - 6,62, m, IH, C-6 Methin

7,75 - 8,83, m, 2H, C-5 Methylen

8,22, s, 3H, C-2 Methyl

8,50 - 6,59, m, 5H, C-2 Methyl + CH,CH .

Die 7ß-Diastereoisomeren oder die Jod- und 7ß-Mischungen werden in analoger VJeise erhalten.

709822/1028

Stufe G:

Herstellung von Cis- und Trans-3-(l-p-Nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-*<-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon __

H = -C-O-CH.

# ^V-NO,

8-Oxo- 3-oxa-2,2-dimethyl-7⁰^- (1-p-nitrobenzy lcarbony 1-dioxyäthyl)-l-azabicyelo-/"*i,2,07-octan (1,0 g) wird in 8 ml Essigsäure und 2 ml Wasser gelöst und I₃ 25 Stunden auf 65 C erhitzt. Die Essigsäure und das Wasser werden unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird aufgenommen in Benzol und eingedampft, wobei man Trans-3-(1-p-NitrobenzylcarbonyIdioxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon als Mischung der Diastereoisomeren erhält. IR (0Η₂01₂)μ : 5,67 (ß-Lactam), 5,72 Schulter, 6_s2O und

6,57 (Nitro)
: 1,73, d, 2H, H=8,5 Hz, ArH

2,43» d, .2H, J = 8,5 Hs, ArH

3,63, breites s, IH, NH

*},37 - 5,13, m, IH, CH₃CH

Ij,72, s, 2H, ArCH₂

6,07 - 6,53, m, IH, C-4 Methin

6,23, t, 2H, J=5_S5 Hz, CH₂OH

6,73 - 6,93, m, IH, C-3 Methin

7,63 - 8,97, m, 3H, CH₂CH₂OH

. 8,53, d, J=6,5 Hz, CH,CH

—j

KMR (CDCl,)

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- 86 -

Die CIs-Diastereoisoneren oder die Cis-trans-Misehung wird in analoger Weise erhalten.

Stufen D¹, E¹, P¹ und G^T als Alternative zu den Stufen D, E, F und G für die Herstellung von 3-(l-p-Nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)-azetidinon

OR

O^

3ϊΗ

OH

O 0

R = -COCH

KO

2.1

Stufen D' , E\ F' und G'

Herstellung von l-(2-Tetrahydropyranyl)-ⁱJ-/2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon

,OH

JäH

Unter Stickstoff und bei 25 C wird eine Lösung aus V(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon (62 mg, 0,539 mMol) in 0,5 ml wasserfreiem p-Dioxan mit 2,3-Dihydropyran

70 98 22/1 Ö 2 8

- 87 -

(0,98 ml, l,08 mMol) und p-Toluolsulf ons äuremonohy drat (19 mg, 0,10 mMol) behandelt. Die erhaltene Lösung wird während 60 Minuten gerührt und dann zwischen 10 ml eines 0,5m pH 7 Phosphatpuffers und 10 ml Äthylacetat geteilt. Die wässrige Phase wird ein zweites Mal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetat lösungen v/erden mit Salzwasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat vrird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man 216 mg des Rohproduktes erhält. Reinigung durch präparat!ve Dickschicht-Chromatographie und Entwickeln mit Xthylacetat ergibt 80 mg !-^-Tetrahydropyranyl)· 4-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl72-azetidinon als ein öl. KMR (CDCl₃) γι 5,13-5,60, m, OCH

5,83-6,85, m, C-itH + OCH₂

6,95, dd, J = 5Hz und 15 Hz

7,35 ₃ dd, J = 3Hz und 15 Hz

7,62-8,95, m, CHCH₀CH₀CH₀CH₀ + CHCH₀CH₀O

—c. ~~c. -~d. c. ~~eL C.

C-3 Methylen

Herstellung von Cis- und Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-hydroxyäthyl)-i{-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-

azetidinon

Arbeitet man in &r für die Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyI-706- und ß-(l-hydroxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-/$,2,p7-octan aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-l-azabicyclo-/4,2,07-oetan beschriebenen Weise und verwendet 1~(2-Tetra-

709 8 22/1028

/Oo.

hydropyranyl)-W2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-acetidinon, so erhält man eine diastereomere Mischung von sowohl Cis- lind Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-hydroxyäthyl)-¹l-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-asetidinon.

Herstellung von Cis- und Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-ⁱJ-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon

R = COCH₉-

Arbeitet man wie bei der Herstellung von 8-Oxo-2,2-

dimethyl-7c<r-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-8-oxa-l- azabicyclo-Ä_a2₃07-octan aus 8-0xo-2₃2-dimethyl-7 -(1-hydroxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-/i,2,07-octan und verv-;endet Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-hydroxyäthyl)-4-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon_i so erhält man Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon. Das Cis-Diastereoisomere wird in analoger Weise erhalten.

709822/10 2 8

- 89 -

Herstellung von Cis- und Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon

κ. — COCH·.·

Eine Lösung aus Trans-l-(2-tetrahydropyranyl)-3-(l-pnitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-i4-/2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl7-2-azetidinon in Methanol bei 25°C wird mit einem 0,1 molaren Äquivalent von p-Toluolsulfonsäuremonohydrat behandelt. Die Lösung wird 2 Stunden gerührt und dann mit Im pH 7 Phosphatpuffer neutralisiert. Das Produkt wird in Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird mit Salzwasser gewaschen₃ über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyI)-^t-(2-hydroxyäthyl)2-azetidinon erhält. Das Cis-Diastereoisomere wird in analoger Weise erhalten.

70982^/102

- 90' -

Stufe H:

Herstellung von Cis- und Trans-3~(l-p-nitrobenzylcarbony 1-dioxyäthyl)-W2,2-bis-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl72-

azetidinon

.KH

Unter Stickstoff bei 25 C wird eine Mischung aus wasserfreiem Pyridin (0,1*16 ml, I₅8l mMol) und wasserfreiem,
gepulvertem Chromtrioxid (92 mg, 0,916 mMol) in 8 ml
wasserfreiem Acetonitril 30 Minuten gerührt. Zu der erhaltenen dunkelbraunen Lösung werden 250 mg trockenes
Supercel gegeben und anschliessend daran eine Lösung von Trans-3-(l-p-nitroben2y lcarbony ldioxyäthy I)-¹I- (2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon (186 mg, 0,550 mMol) in 1 ml wasserfreiem Acetonitril. Nach einstündigem Rühren wird das
Reaktionsgemisch durch ein gemischtes gepacktes Bett aus 2 g von jeweils Kieselgel und Magnesiumsulfat filtriert.

,709822/1028

Das Bett wird wiederholt gewaschen mit insgesamt 30 ml zusätzlichem Acetonitril. Das PiItrat wird unter vermindertem Druck bei 25°C auf ein Volumen von 3 ml konzentriert. Durch Dünnschicht-Chromatographie (Kieselgel; fithyIacetat/Benzöl 2:1) wird festgestellt, dass diese Lösung ein Produkt enthält (R_f = 0,38), das weniger polar ist als das Ausgangsmaterial (R„ = 0,21).

Die Acetonitri!lösung von Trans-3-Cl-p-nitrobenzylearbonyldioxyäthyl)-ⁱ}-(2-oxoäthyl)-2-azetidinon, die wie oben hergestellt worden ist, wird unter Stickstoff bei 0°C mit 2-Mercaptoäthanol (0.386 ml, 5,5 mMol) behandelt und unmittelbar darauf mit Bortrifluorid-ätherat (0,17β ml, 1,43 mMol). Nach 15-minütigem Rühren wird diese Lösung geteilt zwischen wässrigem Dikaliumhydrogenphosphat (1,5 g in 4 ml Wasser) und 12 ml Äthylacetat. Die wässrige Phase wird ein zweites Mal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlösungen werden mit Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Piltrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man 229 mg eines Öles erhält. Das Produkt wird durch präparative DickschichtChromatographie über Kieselgel gereinigt und mit Äthylacetat entwickelt, wobei man 118 mg Trans-3-(l~p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-W2,2-bis-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl7-2-azetidinon als ein farbloses Öl erhält.

IR (CH₂Cl₂)U : 5,75 (5,79 Schalter) ß-Lactam und Carbonat

6,20, 6,55 Nitro

KMR (Aceton-dg)T: 1,70, d. J = 8,5 Hz, 2H, ArH

2,28, d, J = 8,5 Hz, 2H, ArH 2,1*8-2,88, m, IH, NH 1{₅63, s, ArCH₂ ^ _3H

4,63-5,12, m, CH₃CH (

709822/1028 - 92 -

5,80, t, J = 7 Hz, CH₀CH^c.

5,80-7,45, m, C-^H + C-3H + SCH₂CH₂OH^

7,63-8,33, m, 2H, CH₃CH

8,53, d, J = 6,5 Hz 3 H, CH₃CH

Die Cis-Diastereoisomeren werden in analoger Weise .hergestellt. Alternativ werden die gemischten Diastereoisomeren erhalten, wenn man als Ausgangsmaterial eine Mischung der Diastereoisomeren verwendet.

709822/1028 .

- 93

Stufe I: * JOS *

Herstellung von Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-/2_>2-bis-(2-azidoäthyl)-thioäthyl7-2--azetidinon

2CHoSO₉Cl ^{3 2}

OCOOPNB

Zu einer Lösung aus 211 mg (Molgewicht = 474; 0,445 mMol) Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)~4-/2,2-bis-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl7-2-azetidinon in 5 ml Tetrahydrofuran (THF) (destilliert aus Lithiumaluminiumhydrid) bei 0°C werden 103 mg Mesylchlorid (Molgewicht =■ 114; 0₃904
mMol) in 1 ml Tetrahydrofuran gegeben und unmittelbar
darauf 134 ul Triethylamin (Molgewicht 101; S= 0,729;
O,9o7 mMol). Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde unter N₂ gerührt. Das Triäthylamin-hydroehlorid wird unter N_?
filtriert und mit einigen ml zusätzlichem THF gewaschen. Das klare färb lose Filtrat wird unter einem Strom von N_? konzentriert und anschliessend im Hochvakuum 10 Minuten gepumpt. Das Dimesylat wird unmittelbar darauf aufgelöst in 5· ml DMSO (destilliert aus CaH₂ bei 8 mm und gelagert über einem 4A Linde Molekularsieb) in Gegenwart von 347 mg NaN, (Molgewicht = 65; 5₉34 mMol). Nach Rühren über Nacht und unter Np werden 10 ml H₂O und'20 ml Sthylacetat (EA) zugegeben. Die Schichten werden getrennt und die wässrige Schicht wird dreimal mit 10 ml EA gewaschen, wobei jede

709822/10.28

-94 -

/foe.

organische Schicht noch einmal gewaschen wird mit 10 ml H^O und 10 ml Salzlösung. Die vereinten Äthylacetatschichten v/erden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert ⁱ und unter einem Np-Strom konzentriert, wobei man das rohe Diazid erhält. Durch präparat!ve Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man Trans-3-(l-pnitrobenzy learbonyldioxyäthy I)- ^-/l^-bis- (2-azidoäthy I)-thioäthyl7-2-azetidinon. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung werden in analoger Weise erhalten.

Stufe J:

CO₂H C(OH)₀ ■+ 2NO

CO₂H

OCOOPNB

EA./Et₂O

OCOOPNB

SCH₂CH₂N₃

ToI

CO₀PNB

I ^λ

C(OH)₇ !

SCH₂CH₂N₃

_H OH

Y . ^Η

(CO₂PNB)₂

PNB = CH,,-^ vy—NO..

709822/1028

- 95 -

Eine frisch zubereitete (H. Davies und M. Schwarz, J.0.C, 30, 12*12 (1965)) Lösung aus p-Nitrophenyldiazomethan (29 mMol) in 150 ml Äther wird unter Rühren zu einer Lösung aus 1,0 g Oxomalonsäuremonohydrat (Molgewicht = 136; 7,35 mMol) in 50 ml Äthylacetat (EA) bei O⁰C gegeben. Nach 2 1/2 Stunden vrird die gelbe Lösung auf einem Drehverdampfer unter sehwachem Erhitzen auf ungefähr das halbe Volumen konzentriert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet., filtriert und wie oben beschrieben, zu einem öl konzentriert. Zu dem rohen p-Nitrobenzy!ester in 50 ml Toluol (ToI.) gibt man 3,5^ mg Trans-3-(Ι-ρ-Nitrob en zylcarb onyldioxy äthy1)-k-/2,2-b is-(2-azidoäthyl)-thioäthyl7~2-azetidinon (Molgewicht = 524; 6,75 mMol). Das Reaktionsgemisch wird unter Rühren erhitzt auf einem ölbad, wobei man ungefähr 1/3 des Toluols abdestillieren lässt. Toluol (getrocknet über einem 3A l/l6" Linde Molekularsieb) wird wiederum zugegeben, um das Volumen auf 50 ml aufzufüllen und der Azeo-Trocknungsprozess xfird dreimal wiederholt. Die Lösung wird dann unter N_? eine Stunde rückflussbehandelt und<£r Azeo-Trocknungsprozess wird ein letztes Mal vriederholt und die Rücfcflussbehandlung vrird eine weitere Stunde fortgesetzt. Beim Konzentrieren der erhaltenen Lösung unter · einem Strom von H₀ erhält man rohes 1. Das Rohmaterial wird chromatographiert über Kieselgel, wobei man 1 erhält. Die Cis-DiastereoisOmeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

70982 2/10 28 - 96 -

Stufe :K:

OCOOPNB 2S52675

.K OH

SOCl₂

OCOOPNB

ο* V ag. IMF

OCOOPHB

(CO₂PNB)₂

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- 97 -

Zu einer Lösung aus 2,80 g \, (Molgewicht = 912; 3,07 mMol) in 35 ml THP (destilliert aus Lithiumaluminiumhydrid) bei -20°C werden 0,3 ml Pyridin (Molgewicht = 79 ;e = 0,982; 3,73 mMol) (destilliert aus NaH und gelagert über einem HA Linde Molekularsieb) gegeben. Unter Rühren unter Mp werden tropfenweise O_s438 g Thionylchlorid (Molgewicht = 3,68 mMol) in 1 ml THF zugegeben. Die Reaktionsmischung wird unter N„ 5 Minuten bei -20⁰C gerührt und dann 1/2 Stunde bei 0 C und schliesslich .1 Stunde bei 25°C. Das Pyridinhydrochlorid wird unter N₂ abfiltriert und zweimal mit Benzol (getrocknet über einem 3A 1/16" Linde Molekularsieb) gewaschen. Die vereinten Filtrate und V7asch lösungen werden unter einem N₂~Strom konzentriert, in einem geringen Volumen Benzol mit wasserfreiem MgSO₁^ aufgeschlammt, unter Np filtriert und dann unter einem Np-Strom konzentriert. Beim Pumpen unter Hochvakuum während 1/2 Stunde erhält man ein Öl. Zu dieser frisch zubereiteten Chlorverbindung gibt man unter Rühren 0,885 g Tripheny!phosphin (Molgewicht = 262; 3,38 mMol) in 66 ml 9:1 Dimethylformamid (DMF')/H₂O und anschliessend 550 mg K₂HPO₁J (Molgewicht = IJk; 3,16 mMol-). Das Reaktionsgemisch wird 35 Minuten bei 25 C gerührt. Mach Verdünnen mit EA und Kochsalzlösung werden die Schichten getrennt und die wässrige Schicht wird dreimal mit EA extrahiert. *-■ Die vereinten EA-Schichten werden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem Np-Strom konzentriert, wobei man rohes 2 erhält. Das Material wird über Kieselgel .chroma-: tographiert, wobei man 2 erhält. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten. .

709822/1028

Stufe L:

OCOOPNB

.HH

(COo

S-CH₂CH₂N₃

S-CH₂CH₂N₃ + Er

OCOOPNB

0'

Br Br J

SCH₂CH₂N₃

(CO₂PNB), (D

(2) KaH, OMF

OCOOPNB

0'

-.SCH₂CH₂N₃

-N

(CO₂PNB), SCH,

Br

709822/102

- 99 -

Zu 7,8 ml Pen tan (getrocknet über einem ¹JA Linde Molekularsieb) werden 0,2 ml Br₂ (Molgewicht = l60; £·= 3₃12; 3₉9 mMol) gegeben. Zu einer Lösung aus 950 mg 2 (Molgewicht = 89δ; Ι,Οδ mMol) in 15 ml Diäthylather (getrocknet über einem 3A l/l6" Linde Molekularsieb) gibt man bei 0⁰C und unter N_? unter Rühren tropfenweise 2,3 ml der obigen 0,*l9i& ^ Lösung (1,13: mMol). Nach lOminütigem Rühren bei 0°C werden ti* jil Cyclohexen (Molgewicht = 82, €- O₃Sl; 1,13 zugegeben. Nach 5 Hinuten bei 0 G werden 53 mg 57$iges NaH (57 % von 53 mg = 30,2 mg, Molgewicht 24, 1,26 in Mineralöl zu der gerührten Reaktionsmischung gegeben. Darauf unmittelbar gibt man I¹J ml eiskaltes DMP (destilliert aus wasserfreiem CaSO₁, bei HQ mm und gelagert über einem ¹JA Linde Molekularsieb). Das Rühren wird unter Hp bei 0°C 3 Stunden fortgeführt. Das Reaktionsgemisch wird auf eine gerührte eiskalte Mischung aus 2,5 ml Im KELPOjj-JfO ml HpO-75 ml EA gegossen. Nach Trennung der Schichten vilrd die wässrige Schicht mit NaCl -gesättigt vsiä nochmals mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Kochsalzlösung extrahiert, über wasserfreiem MgSO₁, getrocknet, filtriert und unter einem Np-Strom konzentriert und anschliessend in einem Hochvakuum gepumpt, wobei man das rohe 3 erhält. Durch präparative Dünnschicht Chromatographie über Kieselgel erhält man 3· Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung erhält man in analoger Weise,

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- 100 -

Stufe M:

OCOOPNB

(CO₀T

PNB)

OCOOPNB

3r

hch;

-SCH₂CH₂N₃

(CO₉PNB) ₀

+ NaH · DMF \

PCOOPNB Br

SCH₂CH₂N₃

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- 101 -

Zu 9,l6 ml Pentan (getrocknet über einem HA Linde Molekularsieb) gibt man 0,2 ml Br₃ (Molgewicht = I6O; 3,9 mMol). Zu mn mg 2 (Molgewicht = 793; 0,598 mMol) in 13 ml Diäthyläther (getrocknet über einem 3A I/I6" Linde Molekularsieb) bei 0 C unter Np gibt man tropfenweise unter Rühren 1,52 ml der obengenannten 0,42m Brp-Lösung (0,63 mMol). Nach 15 Minuten bei 0⁰C werden 33 mg 57J£iges NaH (57 % von 33 mg = 18,8 mg; Molgewicht = 2¹J; 0,78 mMol) zugegeben und unmittelbar daran gibt man 6,35 ml eiskaltes DMF (destilliert aus wasserfreiem CaSO₁, bei 40 mm und aufbewahrt über einem 4A Linde Molekularsieb) hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 1 1/2 Stunden bei 0⁰C gerührt, dann zu einer gerührten eiskalten Mischung von 1,6 ml Im KHpPO^-20 ml H_0 und 20 ml EA gegossen. Die Schichten werden getrennt und die wässrige Schicht wird mit NaCl gesättigt und nochmals mit weiterem EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Salzwasser gewaschen, getrocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und filtriert. Das Filtrat wird konzentriert unter einem Np-Strom und dann an ein Hochvakuum gelegt, wobei man das rohe J^ erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man H. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

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^f - 102 -

Stufe H:

OGOOPNB

(CO₂PNB)₂

OCOOPNB

DMSO

.N

* (CO₂PNB)

Zu 210 mg 4 (Molekulargewicht = 87I; O,24l mMol), gelöst in 0,5 ml DMSO (destilliert aus CaH„ bei 8 mm und aufbewahrt über einem 4A Linde Molekularsieb) werden bei 25°C * unfer Rühren 40 mg l,5-Diazobicyclo-/5_J4,0/-undec-5-en (destilliert bei 8O°C/2 mm) (Molekulargewicht = 152; 0,263 mMol) in 0,7 ml DimethyIsulfoxid (DMSO) gegeben. Die Lösung wird 4 Stunden unter N„ gerührt und dann zu einer gerührten eiskalten Mischung von 0,48 ml Im KH₂POk, 7 ml H₂O und 10 ml EA gegeben. Nach Trennung der Schichten wird die wässrige Schicht wiederum mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Salzwasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem N_?-Strom

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- 103 -

A/S

konzentriert und anschliessend an ein Hochvakuum gelegt, wobei man das rohe 5 erhält. Durch präparative Dünnschicht-Chromatographie über Kieselgel erhält man 5* Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe 0:

s-ColIidin

- 5

CO₂PNB

Zu einer Lösung aus 187 mg 5 (Molekulargewicht = 791;

/•si

0,236 mMol) in 2,5 ml's-Collidin (destilliert aus gepulvertem KOH bei 30 mm Druck) werden M5 mg wasserfreies-LiJ (getrocknet für einige Stunden bei 100⁰C über Pp°5 unter Vakuum) (Molekulargewicht = 13^; 0,336 mMol) gegeben. Unter Rühren unter N₀ vrird. das Re ak ti ons gemisch auf einem ölbad auf 120°C erhitzt. Nach insgesamt 25 Minuten wird die Reaktionsmischung auf 25°C abgekühlt, mit CHpCl₀ verdünnt und in einen Rundkolben überführt, um unter einem Np-Strom und im Hochvakuum zu konzentrieren. Der Rückstand

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wird zwischen 10 ml EA und 1,8 ml Im KH₂PO₁₁ in 10 ml H₃O geteilt und anschliessend wird die wässrige Schicht zwei weitere Male mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden mit Salzwasser extrahiert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem Stickstoffstrom konzentriert, wobei man rohes ^6 erhält. Durch präparative Dünnschicht chromat ographie über Kieselgel erhält man 6. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe P:

OGOPNB

OCOPNB

DMSO

Zu einer Lösung der gemischten Diastereoisomeren 6 (3*f mg; Molekulargewicht = 612; 0,055 mMol) in 0.2 ml DMSO (destilliert aus CaH₂ bei 8 mm und aufbewahrt über einem lJA Linde Molekularsieb) werden unter Rühren zugegeben 9,5 ul 1,5-Diazobicyclo-/5, *l,p7-undec-5-en (destilliert bei -8O°C/2miP.) (Molekulargleicht = 152; C = 1; 0,0625 mMol). Die Lösung

709822/1028 ·

- 105 -

wird unter Stickstoff 15 Minuten gerührt und zu einem Gesamtvolumen von 1 ml mit CHCl, verdünnt und unmittelbar auf 2 bis ΙΟΟΟμ Kieselgelplatten gegeben. Die Bande des Produktes zeigt 7 an als Mischung von Cis- und diastereoisomeren.

Stufe Q:

OCO0PN3

-N-

O'

. OH

_C0₂PN3

H₂/ 2,8 kg/cm²

UCO₂H

In Gegenwart von 6l mg PtOp werden.61 mg 7 (Molekulargewicht 612; 0,1 ml'Iol) in 6 ml Dioxan, 6 ml THF, 3 ml H₉O h Stunden bei einem Druck von 2,8 kg/cm mit Wasserstoff hydriert. Das Reaktionsgemisch wird durch ein Celite-Pilter filtriert und mit 2 ml 0,In pH 7 Phosphatpuffer gewaschen. Nach dem Konzentrieren im Vakuum bis zum Trübungspunkt wird die wässrige Mischung mit Äthylacetat extrahiert. Die wässrige Schicht vrird zu einem geringen Volumen konzentriert und auf eine Säule von 100 g XAD-2 Harz gegeben. Beim Eluieren mit HpO und Verwerfen der Anfangsfraktionen werden.die Fraktionen, welche das Produkt enthalten, gefriergetrocknet, wobei man 8 als Mischung von Cis.~ und Trans-Diastereoisomeren erhält.

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- ιοβ -

Die nachfolgend beschriebene Verfahrensweise für die enzymatische N-Deacylierung von Thienamycin ist anwendbar für alle Isomeren des Thienamycins, besonders für die ausgeprägten N-Acetyl-Isomeren 89OA und 89OA,, die nachfolgend beschrieben sind.

Deacetylierung von N-Acety!thienamycin

Eine l#ige (Gevricht/Volumen) Suspension von fruchtbarer Rasenerde wird hergestellt, indem man 1 g der Rasenerde in 100 ml sterile Phosphatpuffer-Salzlösung gibt, wobei die Phosphatpuffer-Salzlösung die folgende Zusammensetzung hat:

Phosphatpuffer-Salzlösung
NaCl 8,8 g

Im Phosphatpuffer, pH 7,5⁺ 10 ml

destilliertes Wasser "* 1000 ml

*lm PhQ3phatpuffer, pH 7,5

l6 ml Im KH₂PO₂^ werden gemischt mit 84 ml Im KpHPO₂₁. der pH des Phosphatpuffers wird durch Zugabe einer geringen Menge von entweder Im KHpPO₂, oder Im KpHPO₂, auf 7j5 eingestellt.

Aliquote dieser l^igen Vorratserde-Suspension werden hergestellt zur Zubereitung von 1Ox, lOOx und lOOOx-Verdünnungen.

1-ml-Anteile der Vorratssuspension oder 1-ml-Anteile der 1Ox, lOOx und lOOOx-Verdünnungen werden zu 2-ml-Anteilen von sterilen, !,Obigen Agarlösungen bei 48⁰C gegeben. Die Mischung wird schnell über die Oberfläche von sterilen Petrischalen-von 85 mm Durchmesser, enthaltend 20 ml des Mediums A, gegossen. Medium A hat die folgende Zusammensetzung:

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- 107 -

Me dx um A	3,0	g
KH₂POj₁	7,0	ε
K₂HPO₄	ο,ι	g
MgSO₄	1000	ml
destilliertes H~Ö

N-AcetyläthäTjiol-

aminlösung 8,5 ml

N-Acetyläthanolaminlösung

N-Acetyläthanolamin wird lox in HpO verdünnt und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavenbehandlung zugegeben.
Für feste'Medien: Man gibt 20 g Agar zu.

Die Petrischalen werden 18 Tage bei 2 8°C inkubiert. Eine gut isolierte Kolonie wird aufgenommen und auf einer Petrischale, enthaltend Medium B, ausgebreitet. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B

Tomatenpaste - HO g

gemahlenes Weizenmehl 15 g

ölest. Wasser 1000 ml

pH: eingestellt auf pH 6 unter Verwendung von NaOH

Für feste Medien: gibt man 20 g Agar hinzu.

Eine einzelne Kultur wird ausgewählt und 2 Tage bei 28 C auf einer Agarkultur des Mediums B wachsen gelassen. Ein Teil des Wachstums dieser Kultur wird auf die Oberfläche von 6 Kulturen, die aus dem Medium B hergestellt worden . sind, ausgebreitet. Diese Kulturen werden 2 Tage bei 28 C inkubiert. Diese Kultur wurde identifiziert als Protaminobacter ruber und bezeichnet mit MB-3528 in der Kulturkollektion von Merck & Co., Inc., Rahway, N.J., USA und eine Probe wurde hinterlegt beim Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Accession No. NRRL B-143. -

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- 108 -

Ein Teil des Wachstums der Agarkultur von Protaminobacter ruber MB-3528 wird verwendet, um einen 250-ml-Erlenmsyer-Kolben, enthaltend 50 ml des Mediums C, zu beimpfen. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Dextrose 20 g

Pharmamedia 8 g

Flüssigkeit von eingeweichtem Mais (Nassbasis) 5 g

destilliertes Wasser 1000 ml

pH: eingestellt auf 7 mit NaOH oder HCl N-Acetyläthanolaminlösung 8,5 ml

N-Acetyläthanolaminlösung

N-Acetyläthanolamin wird 1Ox in HpO verdünnt

und meiribransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavenbehandlung zugegeben.

Der Kolben wird bei 28°C und 220 ü/Hin auf einem Rüttler 4 Tage geschüttelt. Eine 25-ml-Portion aus dem Kolben wird 15 Minuten mit 8000 U/Min zentrifugiert. Das Überstehende wird entfernt und die Zellen an der Oberflächen des festen Mediums werden abgekratzt und zu einem 0₃5 ml 0,05m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, gegeben. Die erhaltene Suspension wird einer Ultraschallbehandlung unterworfen unter Verwendung eines Branson Instruments Modell LS-75 Sonifier mit einer 1/2 Inch Sonde bei einer Einstellung H mit vier 15-Sekunden-Intervallen, während die Suspension während und zwischen den Unterbrechungen in Eiswasser gekühlt wird. Ein 10-ul~AnteLl des schallbehandelten Produktes wird mit 25 ul Lösung, enthaltend 840 fig/ml N-Acety!thienamycin in 10 mMol Kaliumphosphatpuffer, pH 7, vermischt und über Nacht bei 28°C inkubiert. Kontrollen, welche das Antibiotikum und Puffer allein enthalten und beschallte Zellen und Puffer

709822/102 8

- 109 -

ohne Antibiotikum wurden auch vorgenommen. Nach einer Inkubierung über Nacht bei 28⁰C werden 2-pl-Mengen auf cellulosebeschichtete Dünnschichtchroraatographie-Platten gegeben, die entwickelt xvurden in Äthanol:HpO, 70:30. Nach dem Trocknen an der Luft wird die Dünnschi cht ehr oir.atographie-Platte auf eine mit Staphylococcus aureus ATCC 6538P infizierte Platte 5 Minuten gegeben.

Die infizierten Platten sind wie folgt hergestellt worden: Das über-Macht-Wachstum des für die Infizierung-verwendeten Organismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P in Fleischbrühe plus 0,2 % Hefeextrakt wird mit Fleischbrühe plus 0,2 % Hefeextrakt zu einer Suspension verdünnt, die eine 60#ige Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 nm hat. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar, ergänzt mit 2,0 g/l Difco-Hefeextrakt, bei 37 bis 48 C gegeben, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die 33>2 ml der Suspension pro Liter Agar enthält. 40 ml dieser Suspension werden auf Petrischalen, 22,5 cm χ 22,5 cm, gegossen und diese Platten werden gekühlt und bei 4°C gehalten bis sie verwendet werden (5 Tage Maximum).

Die Dünnschichtchromatographie-Platte wird entfernt und die den Organismus enthaltende Platte wird über Nacht bei 35 C inkubiert. Ausser dem nicht umgesetzten bio-aktiven N-Acety!thienamycin mit einem Punkt bei R„ 0,7-O₃89 wurde ein bio-aktiver Punkt-beobachtet bei R- 0,44-0,Hj₃ der dem Thienamycin zugeschrieben wird. Kontrollinkubationsmischungen des Antibiotikums plus Puffer, schallbehandelte Zellen plus Puffer und Antibiotikum plus Puffer, zu denen schallbehandelte Zellen zugegeben worden waren kurz vor der Dünnschi cht chromatografie- Anwendung, zeigten kein bio-aktives Material bei R- 0,44-0,47.

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- 110 -

Herstellung von 89OA., einem speziellen Isomeren

J.

SCH₂CK₂IiHCCH₃ COOH

Ein Röhrchen einer gefriergetrockneten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA-M34 (NRRL 8139) wird aseptisch geöffnet und der Inhalt x?ird in ein Röhrchen suspendiert, welches 0,8 ml steriles Davis-Salz der folgenden Zusammensetzung enthält:

Davis-SaIs Nat ri urne i t rat

KH₂PO₄

0,5	ε
7,0	ε
3,0	ε
1,0	g
0,1	g
1000	ml

destilliertes Wasser

Diese Suspension wird verwendet zum Bebrüten von vier Kulturen des Mediums A mit der folgenden Zusammensetzung:

Medium A	20,0 g
Glycerin	5,0 g
primäre Hefe	15,0 g
Fischmehl	1000 ml
destilliertes Wasser	20,0 g
Agar

pH: eingestellt auf 7,2 unter Verwendung von NaOH

Die beimpften Kulturen werden eine Woche bei 27-28°C bebrütet und dann bis zur Verwendung bei 4-6 C aufbewahrt.

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- 111 -

Eine 1/3-Portion des Wachstums von drei Kulturen wird verwendet, um 9 mit einem Stopfen versehene Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung, zu beimpfen:
Medium B

HeTe.au.tolysat ( Ardamirs) 10,Og

Glukose 10,0 g

Phosphatpuffer'¹"⁵" 2,0 ml

MgSO₄-TH₂O 50 mg '

destilliertes Wasser . 1000 ml

pH: eingestellt auf 6,5 unter Verwendung von HCl oder NaOH

Ardamine: Yeast Products Corporation

Phosphatpufferlösung

91,0 g

₂₄ 95₅0 g

destilliertes "Wasser" 1000 ml

Die die Keime enthaltenden Kolben werden 1 Tag bei 27-28°C auf einem-Rüttler mit 220 U/Min geschüttelt. Die Kolben und die Inhalte werden 1 Tag bei k°C aufbewahrt.

2-1-Erlenmeyer-Kolben, jeder enthaltend 250 ml des Mediums C, werden mit 8 ml pro Kolben des Wachstums aus dem die Keime enthaltenden Kolben beimpft. Das .Medium C hat die folgende Zusammensetzung: Medium C

Tomatenpaste ' 2O₃O g

primäre Hefe 10,0 g

Dextrin (Amideχ) 20,0 g

CoCl₂-OH₂O ' 5,0 mg

destilliertes Wasser 1000 ml

pH: eingestellt auf 7,2-7,¹I durch NaOH

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- 112 -

Nach der Beimpfung werden die Produktionskolben bei
2k°Q bebrütet unter Schütteln auf einem Rüttler, der
mit 212 U/Min betrieben wird und zwar für k Tage- Die
Kolben werden dann entleert und der Inhalt auf Aktivität untersucht unter Verwendung von Standard Salmonella
gallinarum ΓΊ31287 und Vibrio percolans ATCC SMöl-Platten unter Anwendung von l,25"-cm-Scheiben_s welche in die zentrifugierten Brüheproben eingetaucht wurden. Die Proben
werden mit 0,02m Phosphatpuffer, pH 7,0, nötigenfalls verdünnt. Die Ergebnisse werden nachfolgend angegeben:

Zeitpunkt der Ernte (Harvest Age

hours )h	pH	96	,2
Salmonella gallinarum (mm Zone)	7	,5
Vibrio percolans 1/10-Verdünnung	29
(mm Zone)
890 Prüfeinheiten	31
40

7 1 der gesamten Fermentationsbrühe werden auf 3 C abgekühlt und in 200-ml-Anteilen mit 9000 U/Min 15 Minuten
jeweils zentrifugiert.

Zu den vereinten überstehenden Flüssigkeiten werden 7
0,1m neutrales EDTA gegeben und die ganze Probe wird auf eine Dowex-1 χ 2 (Cl"), 50-100 Maschen-Säule gegeben mit Bettdimensionen von 5,1 x 25 cm und einer Fliessgeschwindigkeit von HO ml/Min. Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem Wasser, enthaltend 5 ml Im Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und
25 juMol neutrales EDTA, gewaschen. Das Antibiotikum wird mit 1 Liter entionisiertem Wasser, enthaltend 50 g Natriumchlorid, eluiert und die Säule wird dann mit 300 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Fraktionen von 100 ml werden gesammelt, ausgehend vom ersten Auftreten des Salzes am
Säulenausgang. Die Bio-Aktivität liegt in den Fraktionen

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bis 10 mit einem Peak bei der Fraktion 2 vor. Die Fraktionen 2 bis 5, Vielehe 17 % der angewandten Aktivität enthalten, werden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Fraktionen werden auf 110 ml konzentriert mittels eines DrehVerdampfers unter vermindertem Druck und der pH wird auf 5,8 eingestellt durch Zugabe von h_}2 ml Im HCl. Das so eingestellte Konzentrat wird auf eine Säule von XAD-2 gegeben mit einer Bettdimension von 3,8 χ 50 cm, die vorher gewaschen worden war mit 3 1. 60%igem wässrigen Aceton (Volumen/Volumen) und anschliessend mit 3 1 entionisiertem Wasser, 3 1 von 5$igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid und 1 1 25£igsm (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser. Das angewendete Konsentrat lässt man auf das Niveau des Bettes abfliessen. Das Antibiotikum wird eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 15 ml/Min. 22 Fraktionen von jeweils 100 ml werden gesammelt, gerechnet von der ersten Anwendung der Probe. Die Bio-Aktivität erscheint in den Fraktionen 6 bis 22 mit einem Peak bei den Fraktionen 9 und 10. Fraktionen 9 bis 20 werden für die weitere Verarbeitung vereint. Ähnlich hergestellte Fraktionen vrerden vereint und die vereinten Fraktionen werden auf 70 ml konzentriert mittels eines DrehVerdampfers unter vermindertem Druck..

Das Konzentrat wird auf eine Dowex-1 χ k (Cl") 400 Maschen ' Säule mit einer Bettdimension von 2,2 χ 27 cm gegeben. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gewaschen und · das Antibiotikum eluiert mit 2 1 0,070m MaCl + 0,005m NHjjCl + 0,0001m NH, in entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ml/Min. Fraktionen von .' 9,5 ml werden gesammelt.

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- Uli -

Der Hauptpeak des Antibiotikums wird eluiert in den Fraktionen 1*12 bis 163. Die Fraktionen 146 bis 157 werden vereint für die weitere Verarbeitung.

Die vereinten Fraktionen 1^6-157 v/erden konzentriert auf 3 ml durch Verdampfen unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer und das Konzentrat wird durch Zugabe von 5 ul Im NH-, auf pH 6,5 gebracht. Das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2 χ 70 cm) eines Bio-Gel P-2 (200 bis 400 Maschen) gegeben, die vorher gewaschen worden war mit 20 ml 5m NaCl und 500 ml entionisiertem Wasser. Nachdem das'Konzentrat auf das Bettniveau abgelaufen war, wurden 2 Spülungen mit jeweils 1ml entionisiertem Wasser vorgenommen und wiederum bis zum Bettniveau ablaufen gelassen. Die Säule wird dann eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von ο,β ml/Min. Fraktionen von 2,9 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums wird eluiert in den Fraktionen 63 bis 70. Fraktionen 6*1 und 65 werden für die weitere Aufarbeitung zusammengegeben.

Die vereinten Fraktionen 6¹J und 65 werden auf einem Dünnschichtverdampfer unter vermindertem Druck auf 2 ml konzentriert und dann in einer Umhüllung gefroren und lyophilisiert während 8 Stunden in einem I^ ml mit Schraubvershlus3 versehenen Gefäss, wobei man 2,25 mg des im wesentlichen reinen Antibiotikums 89OA₁ erhält. Die N-Acetylgruppe wird abgespalten, wie vorher beschrieben, wobei man die freie Base erhält:

XV-/

.N LcOOH

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- 115 -

Herstellung von 89OA-., einem speziellen Isomeren

OH

lLjjooh

Ein Röhrchen einer lyophilisierten Kultur von Sfcreptomyces flavogriseus KA-¹Jl^¹J (NRRL 8139) wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird suspendiert in einem Röhrchen, enthaltend 0,8 ml einer sterilen Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung:

Davis-Salz

Natriumcirrat 0,5 g

K₂HFO₁J 7,0 g

KH₂PO₁. 3,0 g

(NH^)₂SO₁₁ 1,0 g

MgSO_r7H₂O ' 0,1 g

destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet, um h Kulturen des Mediums. A der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:

Medium A

Glycerin 20,0 g

primäre Hefe " 5,0 g

Fischmehl 15,0 g

destilliertes Wasser 1000 ml ·

Agar 20,0 g

pH: eingestellt auf 7,2 unter NaOH

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- 116 -

Die beimpften Kulturen werden 1 Woche bei 27-23°C bebrütet und dann bei H-6°C bis zur .Verwendung aufbewahrt (nicht länger als 21 Tage).

Ein 1/3-Anteil des Wachstums aus 4 Kulturen wird zum Beimpfen von 12 verstöpselten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung, verwendet:

Medium B

Hefeautolysat (⁺Ardamine) 10,0 g Glucose 10,0 g

Phosphatpuffer⁺⁺ 2,0 ml

MgSO₄.7H₂O 50 mg

distilliertes H₃O 1000 ml

pH: eingestellt auf 6,5 unter HCl oder MaOH

Ardamine:·Yeast Products Corporation

"'"Phosphatpufferlösung

KH₂PO₄ 91,0 g

Na₂HPO₄ 95,0 g

destilliertes Wasser 1000 nl

Die Flasche mit den Keimen wird 1 Tag bei 27~28 C auf einer Rüttelmaschine mit 220 U/Min geschüttelt. Die Flasche und ' der Inhalt werden 1 Tag bei 4 C stationär aufbewahrt.

Hk 2-1-Erlenmeyer-Kolben, jeweils enthaltend 200 ml von Medium C, werden mit 8 ml pro Kolben des Wachstums aus den beimpften Flaschen versetzt. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Tomatenpaste 20,0 g

primäre Hefe 10,0 g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

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- 117 -

COCl₂.6H₂O WS . 5,0 mg

destilliertes Wasser " " " 1000 ml

pH: eingestellt auf 7,2-7,¹J mit MaOH

Nach der Beimpfung werden die Produktionskolben bei 24 C H Tage" und 5 Stunden auf einer Schüttelmas chine, die mit 212U/Min betrieben wird, gerüttelt. Die Kolben werden dann entleert und auf Aktivität untersucht unter Verwendung.von Standard Salmonella gallinarum M31287 und Vibro percolans ATCC 8461-PrObeplatten unter Verwendung von 1,25 cm-Probescheiben, die in die zentrifugxercen Proben der Brühe eingetaucht wurden. Die Proben werden verdünnt mit 0₂2πι Phosphatpuff er₃ pH 7,0, falls erforderlich. Die Ergebnisse werden nachstehend angegeben:

Zeitpunkt der Ernte (Harvest

Age hours) h 101

pH 7,2

Salmonella gallinarum (mm Zone) 35 Vibrio percolans 1/10 Verdünnung

(mm Zone) J>k

890 Probeeinheiten 121 . .

Aus dieser Fermentation werden insgesamt 7 1 der gesamten Brühe erhalten und diese werden auf 3 C abgekühlt und zentrifugiert in 200-ml-Portionen bei 9OOO U/Min während je- weils 15 Minuten-, Zu den vereinten überstehenden Lösungen werden 1,7 ml von 0,1m neutralem EDTA zugegeben und der Ansatz wird auf 3°C gehalten. '

Die obengenannte Fermentation wird unter identischen Bedingungen wiederholt mit der Ausnahme, dass die Hk 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit 7 ml pro Flasche des Wachstums aus den die Kulturen enthaltenden Flaschen beimpft werden; der pH und die erhaltenen Prüfergebnisse werden nachfolgend angegeben:

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- 118 -

Zeitpunkt der Ernte (Harvest

Age hours) h " ' "'· 101

pH 7,3

Salmonella gallinarum .(nun· Zone) 38

Vibrio percolahs 1/10 Verdünnung ·. '..

+ .(nun Zone) . 39 \ ...

890 Probeeinheiten 92,8 .

Insgesamt 7s¹) 1 der gesamten Brühe, die aus dieser Per- ' mentation erhalten worden sind, werden auf 3 C abgekühlt und jeweils 15 Minuten in 200 ml-Portionen bei 9000 U/Min zentrifugiert. Zu den vereinten überstehenden Lösungen gibt man 1,8 ml 0,1m neutrales EDTA.

Das überstehende von den zentrifugierten Brühen, vrie es aus den beiden obengenannten Fermentationen in diesem Beispiel erhalten wurde, wird vereint, wobei man .iin Gesamtvolumen von 13 1 erhält.

Die vereinten überstehenden Lösungen werden durch eine Säule aus Dowex-1 χ 2 (Gl ), 50-100 Maschen mit einer Bettdimension von 4,7 cm χ 50 cm und einer Fliessgeschwindigkeit von 60 ml/Min gegeben. Die Säule wird gewaschen mit 1 1 entionisiertem Wasser und das Antibiotikum wird mit 5 1 einer 5$igen (Gewicht/Volumen) NaCl-Lösung, enthaltend 0,01m Tris-HCl-Puffer, pH 7>-0,...und 25 juMol EDTA eluiert. Fraktionen von 220 ml werden gesammelt mit einer Fliessgeschwindigkeit von 50 ml/Min unÖ die Fraktionen werden geprüft gegenüber Salmonella gallinarum MB 1287-Platten.

Antibiotische Aktivität.liegt vor in den Fraktionen 3 bis 26 mit einem Peak bei den Fraktionen 5 und 6. Die Fraktionen 5 bis 9 v/erden vereint für die weitere Verarbeitung. Der pH der zusammengegebenen Fraktionen ist 10,8 und die zusammengegebenen Fraktionen enthalten 24 % der Anfangs-Bioaktivität, gemessen gegenüber Salmonella gallinarum MB1287-Platten.

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- 119 - ·

Die vereinten Fraktionen 5 bis 9 werden auf 150 ml mittels eines DrehVerdampfers unter vermindertem Druck konzentriert und auf eine Säule (4,9 cm χ 47 cm) von XAD-2 gegeben., die vorher gewaschen worcleh war mit 5 1 öO^igem (Volumen/Volumen) wässrigem Aceton und anschliessend'mit 51 entionisierfcem ¥asser und 5 1 50 g/l NaCl in entionisiertem Wasser. Die Probe wird in 20-ml-Anteilen angewendet, wobei die Säule auf das Bettniveau jedesmal getränkt wird. Wenn die An-wendung beendet ist, werden drei 20-ml-Portionen von entionisiertem Wasser zugegeben und jedesmal auf das Bettniveau fliessen gelassen. Die Probe wird eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 20 ml/Min. Alle Massnahmen, bei denen die XAD-Säule verwendet wird, werden durchgeführt bei .Raumtemperatur (24 C) und die eluierten Fraktionen werden schnell abgekühlt in einem Eisbad unmittelbar nach dem Sammeln. Fraktionen von 95 bis 230 ml werden gesammelt.

Die. antibiotische Aktivität erscheint in Fraktionen 2 bis 2I₃ wie aus einer Probe von Salmonella gallinarum M31287-Platten gemessen wurde, mit einem Peak bei·Fraktionen 5 bis 7 (die 510 bis 895 ml an eluiertem Volumen ausmachen, gerechnet von der ersten Anwendung des entionisierten Wassers). Fraktionen 6 bis 21 werden zusammengegeben.

Die ζ us amine η ge geben en Fraktionen "6 bis 21 werden unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer auf 68 ml konzentriert und dann durch Zugabe von entionisiertem Wasser auf 112 ml verdünnt. Das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2 cm χ 21 cm) von Dowex-1 χ 4 (Cl") 400 Maschen gegeben. Die Säule wird mit 20 ml entionisiertem Wasser gewaschen und das Antibiotikum wird eluiert mit 2 1 0,07m NaCl + 0,005m NHjI-Cl- + 0,0001m NH, in entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1,6 ml/Min. Es werden Fraktionen

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- 120 -

von jeweils 8 ml gesammelt.'Fraktionen 157 bis 179 haben die grösste Aktivität und werden zusammen ge geben.

Diese zusammengegebenen Fraktionen werden konzentriert auf einem⁴"Drehverdampfer unter vermindertem Druck''auf 7 ml, der pH wird auf 7,5 durch Zugabe von 20 ul Im NaOH eingestellt. Die Lösung wird weiter konzentriert auf 5 nil und auf eine Säule gegeben (2,2 χ 75 cm) von Bio-Gel P-2, 200 bis 400 Maschen. Die Probe wird in dem Säulenbett mit zwei Waschungen von jeweils 1 ml entionisiertem V/asser gewaschen und eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,6 ml/Min. Zehn Fraktionen von 3₃3 ml und anschliessend 60 Fraktionen von 2,65 ml und zehn Fraktionen von 2jO ml werden gesammelt.

Die Fraktionen werden auf den pH-Bereich zwischen 7,5 und 8,0 durch Zugabe von 1,5 bis 2,5 /il O₅Im NaOH eingestellt. Die Fraktionen 62, 63, 6¹I und 65 werden gefroren und einzeln in 14-ml-Glasröhrchen lyophilisiert und bei -20⁰C unter Vakuum aufbewahrt.

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- 121 -

Zur Isolierung des Antibiotikums 89OA, aus 89OA. macht man von dem Vorteil Gebrauch der relativ höheren Beständigkeit des Antibiotikums 89OA-. gegen Abbau durch Penicillinase in dei>"folgenden Weise:

Bio-Gel Fraktion 63 wird kombiniert mit Fraktionen 6l, 66 und 67 aus der Bio-Gel Säule. Zu diesen vier vereinten Fraktionen werden 0,2 ml Im Tris-HCl-Puffer, pH, 7»5', und O₃2 ml Penicillinase (Difco "Bacto-Penase") gegeben. Nach 113 Minuten bei 23°C werden weitere 0,2 ml Penicillinase hinzugefügt. Nach weiteren 7 Stunden bei Raumtemperatur werden weitere 0,2 ml Penicillinase zugegeben, und nach weiteren 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch auf einem Eisbad abgekühlt. Das fertige Reaktionsgemisch wird auf 15 ml durch Zugabe von 5 ml . entionisiertem Wasser verdünnt.

Das Reakbionsgemisch wird adsorbiert an einer Dowex χ k (Cl") 400 Maschen-Säule, Bettdimension 2,15 x ¹JO cm. Das Antibiotikum 89OA₇. wird eluiert mit 0,07m NaCl + 0,005m NH^Cl + 0,0001m NH, in entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 3 ml/Min. Fraktionen von 13,8 ml werden jeweils gesammelt. Fraktionen 187'bis 200 werden zusammengegeben.

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- 122 -

Die vereinigten Fraktionen werden konzentriert auf ¹I ml mittels eines Dreh verdampfe rs unter vermindertem Druck und das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2 χ 70 cm) Bio-Gel P-2, 200-^00 Maschen, aufgegeben. Das Antibiotikum 89OA, wird mit enticnisiertem Wasser eluiert mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,6 ml/Min. 30 Fraktionen von 3,3 ml und anschliessend 50 Fraktionen von 2,65 ml werden gesammelt.

Fraktionen 66 bis 70 werden vereint und die vereinten Proben werden auf 1,5 ml unter vermindertem Druck mittels eines Drehverdampfers konzentriert und das Konzentrat wird gefroren und gefriergetrocknet, wobei man 5,^ mg eines Feststoffes erhält, der das Antibiotikum 89OÄ, und restliches Salz enthält. Die N-Acety!gruppe ist abgespalten, wie vorher beschrieben, so dass man die freie Base erhält:

Das Antibioticum Thienamycin und seine Herstellung sind beschrieben in DT-OS 25 52 638. Es ist erhältlich durch Züchten des Mikroorganismus Streptomyces cattleya (MA-4297), von dein eine Kultur bei der Kultursammlung der Northern ^f Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und mit NRRL 8057 bezeichnet ist.

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. - 123 -

Claims

15775Y Patentansprüche Λ.' Eine Verbindung der allgemeinen Formel OH COOH und deren nicht-toxische, pharmazeutisch annehmbaren 1 2 Salze, worin R und R unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff und Acyl mit der Einschränkung, dass 12 1 R und R nicht beide Wasserstoff sind und dass, wenn R 2 2 1 oder R Acetyl bedeutetj R oder R anders als Wasserstoff ist. 2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus X -C-R , worin X 0 oder S bedeutet, R die Bedeutung H, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl hat. 3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -C(CH2)nZR - 124 - 7 0 9 8 2 2/1028 15775Y worin X 0 oder S bedeutet und R die Bedeutung hat: Amino, Mercapto, Hydroxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; η eine ganze Zahl bedeutet, nämlich 0, 1, 2, 3 oder 4; Z die Bedeutung hat 0,· S, N oder Carbonyl, wobei jedoch für die Bedeutung Z = Sauerstoff R nicht Mercapto oder Hydroxy ist und für die Bedeutung Z = Schwefel R nicht Amino oder Hydroxy ist und für die Bedeutung Z = Stickstoff, R nicht Mercapto ist. 4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: -L, worin X 0 oder S bedeutet; R die Bedeutung hat H, Amino, Mercapto, Hydroxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; R* die Bedeutung hat Amino, Hydroxy, Azido, Carbamoyl, Guanidino, Acyloxy, Halogen, Sulfamino, Tetrazolyl, Sulfo, Carboxy, Carbalkoxy, Phosphono, Alkoxy oder Arylthio mit der Ausnahme, dass R' und R gleichzeitig nicht die Bedeutung Hydroxy, Amino oder Mercapto haben können. 5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest ausgewählt ist aus den Gruppen, bestehend aus: - 125 - 709822/1028 (PJm · (χ) η 11 i -S-Y -ρ-γ' ' ■ Ii Y" JL worin X 0 oder S bedeutet; R die Bedeutung H, Amino, Mercapto, Hydroxy, Alky!amino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aralkoxy, Alkenyl, Alkynyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; m und η ganze Zahlen sind, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus 0 oder 1; Y = 0 IYK, -NRp oder R, worin M ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkali- oder Erdalkalikationen oder einer organischen Base; Yf und Y" unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus CPlvP, -NRp oder R; und Y' und Y" zusammen verbunden sein kö nen mit dem Phosphoratom, an welches sie gebunden sind, unter Ausbildung eines cyclischen Esters oder Amids. 6. Verbindung nach Anspruch 1, worin der Acylrest ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus O -C(CH2)m-A-(CH2)n-Y worin m und η ganze Zahlen zwischen 0 und 5 sind; A die Bedeutung hat 0, NRf (R1 = Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), S oder A eine Einfachbindung bedeutet und Y ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: " 12β " 709822/1028

1.) Amino oder substituiertes Amino:
-N(R)_n und -N(R),

worin die Werte für R unabhängig voneinander ausgewählt
sind aus:

Wasserstoff; N(R¹)₂ (^Rl ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Miedrigalkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Niedrigalkoxylniedrigalkyl, worin die Alkoxylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und die Alkylgruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält; Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin die Cycloalkylgruppe 3 bis 6 Kohlenstoffatome und die Alkylgruppe
1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält; und zwei R-Gruppen miteinander verbunden sein können mit dem Stickstoffatom,
an welches sie gebunden sind, unter Ausbildung eines
Ringes mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen;

2.) Amidino und substituiertes Amidino:

-N=C-N(R)₀

t *

worin die Werte für R unabhängig voneinander ausgewählt
sind aus der Gruppe, bestehend aus:

Wasserstoff; N(R^f)₂ (R' ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Niedrigalkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Niedrigalkoxyniedrigalkyl, worin die Alkoxylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome und die Alkylgruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält (und wenn der Niedrigalkoxyniedrigalkylrest an das Kohlenstoff-

¹²⁷ " 709822/1028

15775Y

atom der Alkylgruppe gebunden ist, diese 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält); Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin der Alkylrest 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält und zwei R-Gruppen miteinander verbunden sein können mit dem Atom, an welches sie gebunden sind unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen;

3.) Guanidino und substituiertes Guanidino:

-NH-C-N(R)₀
Il ²

NR

worin R die unter 2.) angegebene Bedeutung hat;

h.) Guanyl und substituiertes Guanyl:

-C=NR ,

worin R die unter 2.) (oben) angegebene Bedeutung hat;

5.) Stickstoff enthaltende mono- und bicyclische Heterocyclen (aromatisch und nicht-aromatisch) mit 4 bis 10 Kernkohlenstoffatomen, worin das Heteroatom oder die Heteroatome, zusätzlich zu dem Stickstoffatom ausgewählt sind aus der Gruppe Sauerstoff und Schwefel.

7. Verbindung nach Anspruch 2, worin R Wasserstoff ist und

2
R der Aeylrest:

Il

-C-R ,

worin bedeuten:

R ist ausgewählt uas der Gruppe, bestehend aus Benzyl, p-Hydroxybenzyl, il-Amino-Jl-carboxybutyl, Methyl, CyanomethyI₉

- 128 -

'709822/1028

2-Pentenyl, n-Amyl, n-Heptyl, Äthyl, 3- und 4-Nitrobenzyl, Phenäthyl, ß₃ß-DiphenyläthyI₃ Kethyldiphenylmethyl, Triphenylmethyl, 2-Methoxyphenyl₃ 2,6-Dimethoxyphenyl, 2,4,6-Trimethoxyphenyl₃ 3_i5-Dimethyl-4-isoxazolyl, 3-Butyl-5-m8thy 1-¹I-Xsoxaaolyl, 5-Methyl-3-phenyl-4-isoxyzolyl, 3-(2-Chorphenyl)-5-methyl-4-isoxazolyl_J 3-(2,6-dichlorphenyD-S-methyl-^-isoxazolyl, D-4-Amino-4-carboxybutyl, D-ü-N-Benzoylaraino-^-carboxy-n-butyl, p-Aminobensyl, o-Aminobenzyl, m-Aminobenzyl, p-Dimethylaniinobsnzyl, (3-PyridyD-methyl, 2-Äthoxy-l-naphthyl, 3~Carboxy-2-chinoxalinyl, 3-(2,6-Dichlorphenyl)-5-(2-furyl)-4-isoxazolyl, 3-Phenyl-ⁱl-isOxazolyl_J 5-Methyl-3-(^-guanidinophenylj-it-isoxazolyl, 4-Guanidinoraethylphenyl, 4-Guanidinomethylbenzyl, 4-Guanidinobenzyl, ii-Guanidinophenyl, 2₅6-Dimethoxy-4-guanidinophenyl, o-Sulfobenzyl, p-Carboxymethylbenzyl, p-Carbamoylmethylbenzyl, m-Fluorbenzyl., m-Brombenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Methoxybenzyl₅ 1-Naphthylmethyl, 3-Isothiazolylmethyl, ^-Isothiazolylmethyl, 5~Isothiazolylmethyl, Guanylthiomethyl, 4-Pyridylraethyl, 5-Isoxazolylmethylj ii-Methoxy-S-isoxazolylrcethyl, 4-Methyl-5-Isoxazolylmethyl_s 1-Imidazolylmethyl, 2-Benzofuranylmethyl, 2-Indolylmethyl, 2-Phenylvinyl, 2-Phenyläthynyl_a l-Arainocyclohexyl, 2- und 3-Thienylaminomethyl, 2-(5-Mtrofuranyl)-vinyl, Phenyl₃ o-Methoxyphenyl, o-Chlorphenyl, o-Phenylphenyl_a p-Aminoinethylbenzyl, 1~(5-Cyanotriazolyl)-methyl, Di fluorine thy 1, Dichlormethyl₃ Dibrommethyl, l-(3-Methylimidazolyl)-methyl_J 2- oder 3-(5-Carboxyraethylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(4-Carbamoylthienyl)-methyl, 2- oder 3~(5~Methylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Methoxythienyl)-methyl, 2- oder 3-(4-Chlorthienyl)-methyl₃ 2- oder 3-(5-Sulfothienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-^carboxythienyl)-methyl, 3-(l,2,5-Thiadiazolyl)-methyl, 3-(4-Methoxy-

- 129 -

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15775Y

1,2,5-thiadiazolyD-methyl, 2-Furylmethyl, 2-(5-Nitrofuryl)-methyl, 3-Furylmethyl, 2-Thienylmethyl, 3-Thienylmethyl, TetrazoIy!methyl, Benzamidinomethyl und Cyclohexylamidinomethyl.

8. Eine Verbindung nach Anspruch 3, worin R Wasserstoff be-

P
deutet und R den Acylrest

-C(CH₂)_nZR

worin der Rest -(CHp) ZR des Acylrestes ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

Allylthiomethyl, Phenylthiomethyl, Butylmercaptomethyl, oC^Chlorerotylmercaptomethyl, Phenoxymethyl, Phenoxyäthyl, Phenoxybutyl, Phenoxybenzyl, Diphenoxymethyl, Dimethylmet hoxyme thy I, Dimethylbutoxymethyl, Dimethylphenoxymethyl, ^-Guanidinophenoxymethyl, 4-Pyridylthiomethyl, p-(Carboxymethyl)-phenoxymethyl, p-CarboxymethyD-phenylthiomethyl, 2-Thiazolylthioinethyl, p-(SuIfo)-phenoxymethyl, p-iCarboxymethyD-phenylthiomethyl, 2-Pyrimidinylthiomethyl, Phenäthylthiomethyl, 1-(5,6,7,8-Tetrahydronaphthyl)-oxymethyl, N-Methyl-4-pyridiniumthio, Benzyloxy, Methoxy, Äthoxy, Phenoxy, Phenylthio, Amino, Methylamino, Dimethylamin, Pyridiniummethyl, Trimethylammoniummethyl, Cyanomethylthiomethyl, Trifluormethylthiomethyl, 4-Pyridyläthyl, 4-Pyridylpropyl, il-Pyridylbutyl, 3-Imidazolyläthyl, 3-Imidazolylpropyl, 3-Imidazolylbutyl, 1-Pyrroloäthyl, 1-Pyrrolopropy1 und 1-Pyrrolobutyl.

9. Verbindung nach Anspruch 4, worin R Wasserstoff ist und..

2
R der Acylrest ;

I!

-CCHRR¹ ,
- 130 -

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15775Y

ist, worin die Gruppe -CHRR¹ des Acylrestes ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

o£-Aminobenzyl,oC-Amino-(2-thienyl)-nethyl, c£-(Methylamino)-benzyl₃oC^:-Amino-methylniercaptopropyl_J c<r-Amino-3- oder 4-chlorbenzyl, oC~Amino-3- oder 4-Hydroxybenzyl, <X¹Amino-2,4-dichlorbenzyl, oGAmino-^»^- dichlorbenzyl, D(-)-0C-Hydroxybenzyl, (XrCarboxybenzyl, a*-Amino-(3-thienyl)-methyl, D-(-)-Οί^Amino-3-chlor-dihydroxy benzyl, o^-Ainino-(cyclohexyl)-methyl, oCrCS-Tetrazolyl)-benzyl, 2-Thienylcarboxyinethyl, 3-Thienylcarboxymethyl, 2-Furylcarboxymethyl, 3-Furylcarboxymethyl_a cxr-Sulfaminobenzyl, 3-Thienylsulfaminomethyl, o£(N-Methylsulfamino)-benzyl, D-(-)-2-Thienylguanidinomethylj D-(-)-oirguanidinobenzylj^Guanylureidobenzyljo^Hydroxybenzyl, oC-Azidobenzyl, oC^Fluorbenzyl, 4-(5-Methoxy-l,3-oxadiazolyl)-aminomethyl, 4-(5-Methoxy-l,3-oxadiazolyl)-hydroxymethyl₃ 4-(5-Methoxy-l,3-sulfadiazolyl)-hydroxymethyl, 4-(5-Chlorthienyl)-aminomethyl, 2-(5-Chlorthienyl)-hydroxymethyl, 2-(5-Chlorthienyl)-carboxymethyl, 3-(l,2-Thiazolyl)-aminomethyl_a 3-(l,2-Thiazolyl)-hydroxymethyl_s 3-(l,2-Thiazolyl)-carboxymethyl, 2-Thiazolylaminomethyl, 2-Thiazolylhydroxymethyl, 2-Thiazolylcarboxymethyl, 2-Benzothienylcarboxymethyl, 2-Benzothienylhydroxymethyl, 2-Benzothieny!carboxymethyl, C^¹SuIfobenzyl, oG-Pnosphonobenzyl, o<?-Diäthylphosphono und oC-Monoäthylphosphono.

10. Verbindung nach Anspruch 6_S worin R Wasserstoff ist und

2
R der Acylres

bestehend aus:

2
R der Acylrest, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe,"

- 131 -

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15775T ₀ < ,

J · f

-CCH₂CH₂NHC-H-O NH

Il ί

--CCH₂CH₂NHC-NH₂

. .0

-CCH..

-CCH₂CH₂N(CH₃)

NH

O ■ . NH

Ü Ii

[I ■ ■ .©

CCH(

(CH₃)

CCH-S-C

CH-S-CH₀-C

-CCiI₂-O-CH₂C

- 132 -

709 8 22/1028

⁴ AO-

11. Eine Verbindung nach Anspruch I₅ worin R Wässerstoff

2
ist und R ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

Pormyl, Propionyl, Butyryl, Chloracetyl, Methoxyacetyl, Aminoacetyl, Methoxycarbonyl, Xthoxycarbonyl, Methylcarbamoyl, Äthylcarbamoyl, Phenylthiocarbonyl, 3-Aminopropionyl, 4-Aminobutyryl, N-Methylaminoacetyl, Ν,Ν-Dimethylaminoacetyl, Ν,Ν,Ν-Trimethylaininoacetyl, 3~(Ν,Ν-DimethyD-aminopropionyl, 3- (NjNjN-Trimethyl)-aminopropionyl, Ν,Ν,Ν-Triäthylaminoacetyl, Pyridiniumacetyl, Guanylthioacetyl, Guanidinoacetyl_s 3-Guanidinopropxonyl, N'-Methylguanidinopropionyl, Hydroxyacetyl₃ 3-Hydroxypropionyl, Acryloyl, Propynoyl, Malonyl, Phenoxycarbonyl, Amidinoacetyl, Acetamidinoacetyl, Amidinopropionylj Acetamidinopropionyl, Guanylureidoacetyl, Guanylcarbamoyl, Carboxymethylaminoacetyl, Sulfoacetylaminoacetyl, Phcsphonoacetylaminoacetyl, N -Dimethylaminoacetamidxnopro-

Ureidocarbonyl, Dimethylaminoguanylthioacetyl, 3-(l-Methyl-4-pyridinium)-propionyl, 3-(5~Aminoimidazol-1-yl)-propionyl, 3-Methyl-l-imidazoliumacetyl, 3-Sydnony!acetyl o-Aminomethylbenzoyl, o-Aminobenzoyl,

ρ s so

^(OHJ₂ , -P (OCH₃) ₂ , -P<;_0Na -, . -PLN(CH₃)₂]_2f

S S

11 . Il ·

P-N(CH₃) ₂ , -P [N(CH₃) ₂1₂, -P-N(CH₃J₂

ONa ONa

- 133 -

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12. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach Anspruch I₃ dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbin dung der Formel

OH

COOH

mit einem Acylierungsmittel, welches N-substituierte

1 2
R - und R -Reste bildet, behandelt.

13· Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Verbindung gemäss Anspruch 1 und einen pharmazeutischen Träger hierfür enthält.

m. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass es in Einzeldosierungsform eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung nach Anspruch 1 und einen pharmazeutischen Träger hierfür enthält.

13** -

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