CH632509A5 - Process for preparing N-acyl derivatives and phosphorus-containing N-acyl derivatives of the antibiotic thienamycin - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 10 N-Acylderivaten und phosphorhaltigen N-Acylderivaten des Antibiotikums Thienamycin der Formel

SCH^H^RVdx) cooh

20

worin R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, Acyl oder phosphorhaltiges Acyl bedeuten, unter der Massnahme dass R1 und R2 nicht beide Wasserstoff sind und dass, wenn R1 oder R2 Acetyl bedeutet, R2 oder R1 verschieden von Wasserstoff ist, und deren nicht-toxische, pharmazeutisch annehmbaren Salze.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel

30

sch2ch2nh2

cooh

(I)

35

mit einem entsprechenden Acylierungsmittel behandelt und erhaltene Verbindungen der Formel (II) gegebenenfalls in die entsprechenden Salze überführt.

Die erfindungsgemäss erhaltenen Verbindungen sowie deren pharmazeutisch annehmbaren Salze sind als Antibiotika geeignet. 45

Durch den weiter oben angeführten Disclaimer werden bereits bekannte Verbindungen ausgeklammert.

Thienamycin ist das Ausgangsmaterial, das zur Herstellung der beschriebenen Verbindungen benötigt wird und es ist in der US-PS 3 950 357 beschrieben. Thienamycin hat die weiter oben 50 angegebene Formel I.

Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen können einfacher durch die folgende Formel dargestellt werden:

Th

"OH

1 2 NR R

• COOM

(ii)

worin «Th» den bicyclischen Kern des Thienamycins wiedergibt und die OH-, Amino- und Carboxygruppen des Thienamycins angegeben sind.

M bedeutet Wasserstoff oder ein Salzkation, aus -Alkali-oder Erdalkalimetallen, wie Natrium, Kalium oder Calcium oder ein Aminsalz, wie NH3, N(R')3, worin R' Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, und dergleichen.

Rl und R2 sind weiter oben definiert. Bevorzugte erfindungsgemässe Verbindungen sind solche, in denen Rl Wasserstoff und R2 Acyl ist. Der Ausdruck «Acyl» schliesst durch Definition die Alkanoyle, einschliesslich Derivate und Analoge davon, ein, wie z. B. die Thioanalogen, bei denen der Carbonyl-sauerstoff durch Schwefel ersetzt ist, sowie auch Diacylreste, bei denen R1 und R2 miteinander verbunden sind. Eingeschlossen sind auch Schwefel- und Phosphor-Acylanaloge, wie substituierte Sulfonyl-, Sulfinyl- und Sulfenyl-Reste und substituierte P(III)- und P(V)-Reste, wie die substituierten Phosphor-, phosphorig-, phosphonig- und phosphinig-Reste. Solche bevorzugte Acylreste werden nachfolgend näher definiert.

Es besteht ein ständiger Bedarf an neuen Antibiotika, denn es gibt bisher keine statische Wirksamkeit für ein gegebenes Antibiotikum, weil die fortwährende Anwendung im breiten Umfang eines solchen Antibiotikums selektiv die Bildung von resistenten Stämmen von Pathogenen erhöht. Darüber hinaus haben die bekannten Antibiotika den Nachteil, dass sie nur gegen gewisse Typen von Mikroorganismen wirksam sind. Deshalb wird immer noch nach neuen Antibiotika geforscht.

Unerwarteterweise wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen der Formel II Antibiotika mit breitem Spektrum darstellen, die sowohl für Tiere und für die Humantherapie und in unbeseelten Systemen nützlich sind.

Es ist daher ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Klasse von Antibiotika zur Verfügung zu stellen, welche die grundlegende Kernstruktur des Thienamycins (I) haben, die jedoch N-Acylderivate davon darstellen. Diese Antibiotika sind in einem breiten Bereich von Pathogenen, für welche sowohl gram-positive Bakterien repräsentativ sind, wie S. aureus, Strep. pyogenes und B. subtilis, und gram-negative Bakterien, wie E. coli, Proteus morganii, Serratia und Klebsiella, wirksam.

Bevorzugte Acylreste R1 oder R2 sind unter z. B. substituierte oder unsubstituierte aliphatische, aromatische oder hete-rocyclische, araliphatische oder heterocyclylaliphatische Car-boxylsäurereste, ein substituierter oder unsubstituierter Carba-mylrest oder ein Carbothiosäurerest.

Eine bevorzugte Gruppe von Acylresten weist z. B. die folgende Formel auf

X

II

-C-R"

worin X Sauerstoff oder Schwefel bedeutet und R" die folgende Bedeutung hat: Wasserstoff, Amino; substituiertes Amino, wie Alkyl- und Dialkylamino, worin der Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; substituierte oder unsubstituierte Reste, wie geradkettige oder verzweigtkettige Alkylreste, worin der Alkylrest 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; Mercapto, wie Alkylthio, typischerweise umfassend 1 bis 6 Kohlenstoffatome; Arylthio, typischerweise umfassend 6 bis 10 Koh-lenstoffatome; Hydroxy, wie Alkoxy, typischerweise umfassend 1 bis 6 Kohlenstoffatome; Aryloxy, welches typischerweise 6 bis 10 Kohlenstoffatome umfasst; Alkenyl- oder Alkynylgrup-pen, die typischerweise 2 bis 6 Kohlenstoffatome umfassen; Aryl wie Phenyl; Aralkyl, wie Benzyl; Cycloalkyl, welches typischerweise 3 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst; oder eine Heteroaryl- oder Heteroaralkylgruppe (mono- oder bicyclische), worin die Alkylgruppe typischerweise 1 bis 3 Kohlenstoffatome umfasst und der heterocyclische Ring typischerweise 4 bis 10 Atome enthält und das Heteroatom oder die Hetero-atome ausgewählt sind aus O, N und S; die vorgenannten Gruppierungen können unsubstituiert sein oder sie können substituiert sein durch Reste, wie OH, SH, SR (R ist Niedrigalkyl oder

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Aryl, wie Phenyl), Alkyl oder Alkoxygruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Halogen, Cyano, Carboxy, Sulfamino, Carba-moyl, Sulfonyl, Azido, Amino, substituiertes Amino, wie Alkylamino einschliesslich quaternäres Ammonium, worin die Alkyl-gruppen 1 bis 6 Kohlenstoffatome haben, Halogenalkyl, wie Trifluormethyl, Carboxyalkyl, Carbamoylalkyl, N-substituiertes Carbamoylalkyl, worin die Alkylgruppe der vorgenannten vier Reste 1 bis 6 Kohlenstoffatome umfasst, Amidino, Guanidino, N-substituiertes Guanidino, Guanidinoniedrigalkyl und dergleichen. Typische Beispiele für solche Acylgruppen, die hier erwähnt werden können, sind solche, bei denen R" die folgende Bedeutung aufweist: Benzyl, p-Hydroxybenzyl, 4-Amino4-car-boxybutyl, Methyl, Cyanomethyl, 2-Pentenyl, n-Amyl, n-Heptyl, Äthyl, 3- oder 4-Nitrobenzyl, Phenäthyl, ß,ß-Diphenyläthyl, Me-thyldiphenylmethyl, Triphenylmethyl, 2-Methoxyphenyl, 2,6-Dimethoxyphenyl, 2,4,6-Trimethoxyphenyl, 3,5-Dimethyl4-isoxazolyl, 3-Butyl-5-methyl4-isoxazolyl, 5-Methyl-3-phenyl4-isoxazolyl, 3-(2-Chlorphenyl)-5-methyl4-isoxazolyl, 3-(2,6-Di-chlorphenyl)-5-methyl-4-isoxyzolyl, D4-Amino4-carboxybutyl, D4-N-Benzoylamino4-carboxy-n-butyl, p-Aminobenzyl, o-Ami-nobenzyl, m-Aminobenzyl, p-Dimethylaminobenzyl, (3-Pyridyl)-methyl, 2-Äthoxy-l-naphthyl, 3-Carboxy-2-chinoxalinyl, 3-(2,6-Dichlorphenyl)-5-(2-furyl)4-isoxazolyl,3-Phenyl4-isoxazolyl, 5-Methyl-3-<4-guanidinophenyl)4-isoxazolyl,4-Guanidino-methylphenyl, 4-Guanidinomethylbenzyl, 4-Guanidinobenzyl,

4-Guanidinophenyl, 2,6-Dimethoxy4-guanidino, o-Sulfobenzyl, p-Carboxymethylbenzyl, p-Carbamoylmethylbenzyl, m-Fluoro-benzyl, m-Brombenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Methoxybenzyl,

1-Naphthylmethyl, 3-Isothiazolylmethyl, 4-Isothiazolylmethyl,

5-IsothiazolylmethyI, Guanylthiomethyl, 4-Pyridylmethyl, 5-Iso-xazolylmethyl, 4-Methoxy-5-isoxazolylmethyl, 4-Methyl-5-isoxa-zolylmethyl, 1-Imidazolylmethyl, 2-Benzofuranylmethyl, 2-Indo-lylmethyl, 2-Phenylvinyl, 2-Phenyläthynyl, 1-Aminocyclohexyl,

2- und 3-Thienylaminomethyl, 2-(5-Nitrofuranyl)-vinyl, Phenyl, o-Methoxyphenyl, o-Chlorphenyl, o-Phenylphenyl, p-Amino-methylbenzyl, 1 -{5-Cyanotriazolyl)-methyl, Difluormethyl, Di-chlormethyl, Dibrommethyl, l-(3-Methylimidazolyl)-methyl, 2-oder 3-(5-Carboxymethylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(4-Carba-moylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Methylthienyl)-methyl, 2- oder 2-(Methoxythienyl)-methyl, 2- oder 3-(4-Chlorthienyl)-methyl, 2-oder 3-{5-Sulfothienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Carboxythienyl)-methyl, 3-( 1,2,5-Thiadiazolyl)-methyl, 3-(4-Methoxy-l ,2,5-thiadi-azolyl)-methyI, 2-Furylmethyl, 2-(5-Nitrofuryl)-methyl, 3-Furyl-methyl, 2-Thienylmethyl, 3-Thienylmethyl, Tetrazolylmethyl, Benzamidinomethyl und Cyclohexylamidinomethyl.

Ein derartiger bevorzugter Acylrest weist z. B. die folgende Formel auf

X

II

-c-r worin X O oder S bedeutet und R Wasserstoff, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl ist.

Ein weiterer bevorzugter Acylrest besitzt die folgende Formel

X

-£(ch2)nzr3

worin X O oder S bedeutet; Z die Bedeutung hat von Carbonyl, wobei R3 die Bedeutung hat: Amino, Mercapto, Hydroxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl oder dem weiter oben definierten Rest R" entspricht und n null oder 1 bis 4 ist.

Derartige Reste sind z. B. Allylthiomethyl, Phenylthiome-thyl, Butylmercaptomethyl, a-Chlorocrotylmercaptomethyl, Phenoxymethyl, Phenoxyäthyl, Phenoxybutyl, Phenoxybenzyl, Diphenoxymethyl, Dimethylmethoxymethyl, Dimethylbutoxy-methyl, Dimethylphenoxymethyl, 4-Guanidinophenoxymethyl, 4-Pyridylthiomethyl,p-(Carboxymethyl)-phenoxymethyl, p-(Carboxymethyl)-phenylthiomethyl,2-Thiazolylthiomethyl, p-(Sulfo)-phenoxymethyl,p-(Carboxymethyl)-phenylthiomethyl, 2-Pyrimidinylthiomethyl, Phenäthylthiomethyl, 1-(5,6,7,8-Tetra-hydronaphthyl)-oxomethyl, N-Methyl4-pyridylthio, Benzyloxy, Methoxy, Äthoxy, Phenoxy, Phenylthio, Amino, Methylamino, Dimethylamino, Pyridiniummethyl, Trimethylammonium-methyl, Cyanomethylthiomethyl, Trifluormethylthiomethyl, 4-Pyridyläthyl, 4-Pyridylpropyl, 4-Pyridylbutyl, 3-Imidazolyl-äthyl, 3-Imidazolylpropyl, 3-Imidazolylbutyl, 1-Pyrroloäthyl, 1-Pyrrolopropyl und 1-Pyrrolobutyl.

Insbesondere sind Acylreste der Formel

X

-c(ch2)nzr4

worin X O oder S bedeutet; Z Sauerstoff ist, wobei R4 die Bedeutung hat: Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Äralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; und n 0 oder 1 bis 4 ist, besonders bevorzugt.

Ein weiterer bevorzugter Acylrest besitzt die folgende Formel

X

-C(CH0) ZR5 2 n worin X O oder S bedeutet; Z Schwefel ist, wobei R5 die Bedeutung hat: Mercapto, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; und n null oder 1 bis 4 ist.

Ebenfalls sind Acylreste der Formel X

-C(CH-) ZR6 2 n worin X O oder S bedeutet; Z NH ist, wobei R6 die Bedeutung hat: Amino, Hydroxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; und n null oder 1 bis 4 ist, bevorzugt.

Zu den bevorzugten Acylresten gehören auch eine Gruppe der Formel

X

.< y

-CCHR R1

worin X O oder S bedeutet; R7 die Bedeutung hat H, Amino, Mercapto, Hydroxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; R' die Bedeutung hat Amino, Hydroxy, Azido, Carbamoyl, Guanidino, Acyloxy, Halogen, Sulfamino, Tetrazolyl, Sulfo, Carboxy, Carbalkoxy, Phosphono, Alkoxy oder Arylthio mit der Ausnahme, dass R' und R gleichzeitig nicht die Bedeutung Hydroxy, Amino oder Mercapto haben können.

In besonders bevorzugten erfindungsgemäss erhältlichen Verbindungen weisen die Acylreste die folgenden Formeln auf

6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

(0)m oder (X)n

» »

-S-Y -P-Y'

h »

(O)n Y"

1 2

worin X O oder S bedeutet; m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 sind; Y = OeM®, -N(R8)2 oder R8, worin M+ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkali- und Erdalkalikationen oder einer organischen Base; R8 Wasserstoff, Amino, Mercapto, Hydroxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aralkoxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl ist, Y' und Y" unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus OeM®, -N(R8)2 und R8; und Y' und Y" zusammen verbunden sein können mit dem Phosphoratom, an welches sie gebunden sind, unter Ausbildung eines cyclischen Esters oder Amids.

Typische Beispiele für 1 sind N-(MethylsulfonyI)-thienamy-cin, N-(o-Nitrophenylsulfonyl)-thienamycin, N-(p-Chlorphenyl-sulfinyl)-thienamycin,N-(o-Nitrophenylsulfenyl)-thienamycin, N-Sulfamoylthienamycin,N-Dimethylsulfamoylthienamycin und das Natriumsalz von Thienamycin-N-sulfonsäure. Typische Beispiele für 2 sind N-(Dimethoxyphosphino)-thienamycin, N-Dibenzyloxyphosphino)-thienamycin,N-(Dihydroxypho-sphino)-thienamycindinatriumsalz,N-(Dimethoxyphosphinyl)-thienamycin, N-(Dimethoxyphosphinothioyl)-thienamycin, N-{Dibenzyloxyphosphinyl)-thienamycin und N-(Dihydroxy-phosphinyl)-thienamycindinatriumsalz.

Weitere bevorzugte Acylreste besitzen die Formel

0

-C(CH„) -A-(CH ) -Y 2. m 2. n worin m und n 0 oder ganze Zahlen von 1 bis 5 sind; A die Bedeutung hat: O, NR' (R = Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), S, oder A eine Einfachbindung bedeutet und Y aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

1.) Amino oder substituiertes Amino:

-N(R9)2 und -N®(R9)3

worin die Werte für R9 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: Wasserstoff; N(R')2 (R' ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Niedrig-alkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Niedrigalkoxylniedrig-alkyl, worin die Alkoxylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält und die Alkylgruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält; Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin die Cycloalkylgruppe 3 bis 6 Kohlenstoffatome und die Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoff atome enthält; und zwei R9-Gruppen miteinander verbunden sein können mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Kohlehstoffatomen;

2.) Amidino und substituiertes Amidino:

-N=C-N(R9)2

R

worin die Werte für R9 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: Wasserstoff; N(R' )2 (R' ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Niedrigalkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Niedrigalkoxyniedrigalkyl, worin die Alkoxylgruppe 1 bis

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6 Kohlenstoffatome und die Alkylgruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält (und wenn der Niedrigalkoxyniedrigalkylrest an das Kohlenstoffatom der Alkylgruppe gebunden ist, diese 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthält); Cycloalkyl und Acyloalkylalkyl, worin der Alkylrest 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält und zwei Ro-Gruppen miteinander verbunden sein können mit dem Atom, an welches sie gebunden sind unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen;

3.) Guanidino und substituiertes Guanidino:

-NH-C-N (R%

NR

worin R die unter 2.) angegebene Bedeutung hat:

4.) Guanyl und substituiertes Guanyl:

-C=NR9 ,

n(R^

worin R9 die unter 2.) angegebene Bedeutung hat;

5.) Stickstoff enthaltend emono- und bicyclische Heterocyclen (aromatisch und nicht-aromatisch) mit 4 bis 10 Kernkohlenstoffatomen, worin das Heteroatom oder die Heteroatome, zusätzlich zu dem Stickstoffatom ausgewählt sind aus der Gruppe Sauerstoff und Schwefel.

Ein bevorzugter Acylrest R2 besitzt die folgende Formel

X

worin bedeuten: R10 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Benzyl, p-Hydroxybenzyl, 4-Amino4-carboxybutyl, Methyl, Cyanomethyl, 2-Pentenyl, n-Amyl, n-Heptyl, Äthyl, 3- und

4-Nitrobenzyl, Phenäthyl, ß,ß-Diphenyläthyl, Methyldiphenyl-methyl, Triphenylmethyl, 2-Methoxyphenyl, 2,6-Dimethoxyphe-nyl, 2,4,6-Trimethoxyphenyl, 3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl, 3-Butyl-

5-methyl4-isoxazolyl, 5-Methyl-3-phenyl4-isoxyzolyl, 3-(2-Chlorphenyl>5-methyl4-isoxazolyl,3-(2,6-di-chlorphenyl)-5-methyl4-isoxazolyl, D-4-Amino-4-carboxybutyl, D4-N-Benzoy-lamino4-carboxy-n-butyl, p-Aminobenzyl, o-Aminobenzyl, m-Aminobenzyl, p-Dimethylaminobenzyl, (3-Pyridyl)-methyl,

2-Äthoxy-l-naphthyl, 3-Carboxy-2-chinoxalinyl, 3-(2,6-Dichlor-phenyl>5-(2-furyl)4-isoxazolyl, 3-Phenyl4-isoxazolyl, 5-Methyl-

3-(4-guanidinophenyl)4-isoxazolyl, 4-Guanidinomethylphenyl,

4-Guanidinomethylbenzyl, 4-Guanidinobenzyl, 4-Guanidino-phenyl, 2,6-Dimethoxy4-guanidinophenyl, o-SuIfobenzyl, p-Car-boxymethylbenzyl, p-Carbamoylmethylbenzyl, m-Fluorbenzyl, m-Brombenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Methoxybenzyl, 1-Naphthyl-methyl, 3-Isothiazolylmethyl, 4-Isothiazolylmethyl, 5-Isothiazo-lylmethyl, Guanylthiomethyl, 4-Pyridylmethyl, 5-Isoxazolylme-thyl, 4-Methoxy-5-isoxazolylmethyl, 4-Methyl-5-isoxazolylme-thyl, 1-Imidazolylmethyl, 2-Benzofuranylmethyl, 2-Indolylme-thyl, 2-Phenylvinyl, 2-Phenyläthynyl, 1-Aminocyclohexyl, 2- und 3-Thienylaminomethyl, 2-(5-Nitrofuranyl)-vinyl, Phenyl, o-Me-thoxyphenyl, o-Chlorphenyl, o-Phenylphenyl, p-Aminomethyl-benzyl, l-{5-Cyanotriazolyl)-methyl, Difluormethyl, Dichlorme-thyl, Dibrommethyl, l-(3-Methylimidazolyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Carboxymethylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(4-Carbamoylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Methylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Metho-xythienyl)-methyl, 2- oder 3-(4-Chlorthienyl)-methyl, 2- oder 3{5-Sulfothienyl>methyl, 2- oder 3-(5-Carboxythienyl)-methyl,

3-( 1,2,5-Thiadiazolyl>-methyl, 3-(4-Methoxy-1,2,5-thiadiazolyl)-methyl, 2-Furylmethyl, 2-(5-Nitrofuryl)-methyl, 3-Furylmethyl,

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

632509 8

2-Thienylmethyl,3-Thienylmethyl,Tetrazolylmethyl, Benzami- O NH

dinomethyl und Cyclohexylamidinomethyl, sind ebenfalls n |{

bevorzugt. ""CCH^CH^NHC^H

Für den Acylrest R2 steht insbesondere ein Rest der Formel

X

10

mei auf o nh

-C(CH2)nZR , |i J

-cch,ch,nhc-nh,

worin der Rest-(CH2)nZR10 des Acylrestes ausgewählt ist aus 'o £.£./.

der Gruppe bestehend aus: Allylthiomethyl, Phenylthiomethyl,

Butylmercaptomethyl, a-Chlorcrotylmercaptomethyl, Pheno- O

xymethyl, Phenoxyäthyl, Phenoxybutyl, Phenoxybenzyl, Diphe- H

noxymethyl, Dimethylmethoxymethyl,Dimethylbutoxymethyl, —cchpch_n (ch^ ) _

Dimethylphenoxymethyl, 4-Guanidinophenoxymethyl, 4-Pyri- is ■** J 2

dylthiomethyl, p-(Carboxymethyl)-phenoxymethyl, p-Carboxy-methyl)-phenylthiomethyl, 2-Thiazolylthiomethyl, p-(Sulfo)-phe- 0

noxymethyl, p-(Carboxymethyl)-phenylthiomethyl, 2-Pyrimidi- Ar»« nxi \itnu \

nylthiomethyl, Phenoäthylthiomethyl, l-(5,6,7,8-Tetrahydro- —cch^ch2n (ch_ } ^

naphthyl>oxymethyl, N-Methyl4-pyridiniumthio, Benzyloxy, 20 Methoxy, Äthoxy, Phenoxy, Phenylthio, Amino, Methylamino,

Dimethylamin, Pyridiniummethyl,Trimethylammoniummethyl, 0 nh

Cyanomethylthiomethyl,Trifluormethylthiomethyl,4-Pyridy- Mou PIr ' „

läthyl, 4-Pyridylpropyl, 4-Pyridylbutyl, 3-Imidazolyläthyl, 3-Imi- — cch^ch^c-nh 2

dazolylpropyl, 3-Imidazolylbutyl, 1-Pyrroloäthyl, 1-Pyrrolopro- 25 pyl und 1-Pyrrolobutyl.

Weitere bevorzugte Acylreste R2 weisen die folgende For- q jj

11 11

x 30 -cch0ch_ch0nhc-ch-

11 12 2 2 2 3

0

II ©

-C CH R R worin die Gruppe -CHRnR12 des Acylrestes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a-Aminobenzyl, a-Amino-(2-thienyl)- *~cch_ ch _ ch _ n ( ch ^ ) _

methyl, a-(Methylamino)-benzyl, a-Amino-methylmercaptopro-pyl, a-Amino-3- oder 4-chlorbenzyl, a-Amino-3- oder 4-Hydro-xybenzyl, a-Amino-2,4-dichlorbenzyl, a-Amino-3,4-dichlorben-zyl, D-(->a-Hydroxybenzyl, a-Carboxybenzyl, a-Amino-(3-thie-nyD-methyl, D-(-)-a-Amino-3-chlor4-hydroxybenzyl, a-Amino-

;cyclohexyl)-methyl, a-(5-Tetrazolyl)-benzyl, 2-Thienylcarboxy- —cch _ ch _ ck ^ n ( ch -^ )

methyl, 3-Thienylcarboxymethyl, 2-FuryIcarboxymethyl, /. z. z.

3-Furylcarboxymethyl, a-Sulfaminobenzyl, 3-Thienylsulfamino-

methyl, a-(N-Methylsulfamino)-benzyl, D-(-)-2-Thienylguanidi- 0 ■ nh nomethyl, D-(-)-a-guanidinobenzyl, a-Guanylureidobenzyl, 45 II &

a-Hydroxybenzyl, a-Azidobenzyl, a-Fluorbenzyl, 4-(5-Methoxy- 2 n.

l,3-oxadiazolyl)-aminomethyl, 4-(5-Methoxy-l,3-oxadiazolyl)- ^^2

hydroxymethyl, 4-(5-Methoxy-l ,3-sulf adiazolyl)-hydroxymethyl,

4-(5-Chlorthienyl)-aminomethyl, 2-(5-Chlorthienyl)-hydroxyme-thyl, 2-(5-Chlorthienyl)-carboxymethyl, 3-( 1,2 Thiazolyl)-amino-

methyl,3-(l,2-Thiazolyl)-hydroxymethyl,3-(l,2-Thiazolyl)-carbo- „ „ __

xymethyl, 2-Thiazolylaminomethyl, 2-Thiazolylhydroxymethyl, 2~"

2-Thiazolylcarboxymethyl,2-Benzothienylcarboxymethyl, 2-Benzothienylhydroxymethyl,2-Benzothienylcarboxymethyl,

a-Sulfobenzyl, a-Phosphonobenzyl, a-Diäthylphosphono und 55 a-Monoäthylphosphono.

Ebenfalls sind erfindungsgemäss erhaltene Verbindungen, oder in welchen R1 Wasserstoff ist und R2 einen Acylrest der folgenden Formel bedeutet Q

R ^NH

—cch -, s—ch -, -c

^NH.

II

,nh

-CCH-5-0-CH-.C 2 2 \

nh2

o nh

|{ P besonders bevorzugt.

•"cch ch nhc—ch In einer weiteren bevorzugten Gruppe von erfindungsge-

2 2 3 mäss herstellbaren Verbindungen bedeuten R1 Wasserstoff und

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R2 ist Formyl, Propionyl, Butyryl, Chloracetyl, Methoxyacetyl, Aminoacetyl, Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Methylcar-bamoyl, Äthylcarbamoyl, Phenylthiocarbonyl, 3-Aminopropio-nyl, 4-Aminobutyryl, N-Methylaminoacetyl, N,N-Dimethylami-noacetyl, N,N,N-Trimethylaminoacetyl, 3-(N,N-dimethyl)-ami-nopropionyl, 3-{N,N,N-Trimethyl)-aminopropionyl, N,N,N-Triäthylaminoacetyl, Pyridiniumacetyl, Guanylthioacetyl, Gua-nidinoacetyl, 3-Guanidinopropionyl, N3-Methylguanidinopro-pionyl, Hydroxyacetyl, 3-Hydroxypropionyl, Acryloyl, Propionyl, Malonyl, Phenoxycarbonyl, Amidinoacetyl, Acetamidino-acetyl, Amidinopropionyl, Acetamidinopropionyl, Guanylurei-doacetyl, Guanylcarbamoyl, Carboxymethylaminoacetyl, Sul-foacetylaminoacetyl, Phosphonoacetylaminoacetyl, N3-Dime-thylaminoacetamidinopropionyl, Ureidocarbonyl, Dimethyla-minoguanylthioacetyl, 3-( 1 -Methyl4-pyridinium)-propionyl, 3-{5-Aminoimidazol-l-yl)-propionyl,3-Methyl-l-imidazoliuma-cetyl, 3-Sydnonylacetyl o-Aminomethylbenzoyl, o-Aminoben-zoyl,

Sulfoacetylaminoacetyl, Phosphonoacetylaminoacetyl, N3-Dimethylaminoacetamidinopropionyl, Ureidocarbonyl, Dimethylaminoguanylthioacetyl, 3-{l-Methyl4-pyridinium)-propionyl, 3-(5-Aminoimidazol-l-yl)-propionyl, 3-Methyl-l-Imi-5 dazoliumacetyl, 3-Sydnonylacetyl, o-Aminomethylbenzoyl, o-Aminobenzoyl, Guanylthioacetyl.

Beispiele für die weiter oben genannten Stickstoff enthaltende mono- und bicyclischen Heterocyclen (aromatisch und nicht aromatisch) mit 4 bis 10 Kernatomen, worin das Hetero-io atom oder die Heteroatome ausser Stickstoff ausgewählt sind aus Sauerstoff und Schwefel:

CR')

\=/

1°

-P (OCH3) 2

1

20

-p COCH3)2

Ì? °

II OCH3 H

^nona ' în (ch^) 2 *

«

s

1!

25

30

-G*-' -O

~p-n(ch3î2 / -p[n(ck3) 23 2/

^ONa

S

II

»p-n(ch3)2

ONa

Eine Acylklasse von besonderem Interesse sind solche Acylreste, R1 und R2 in der Formel II, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus üblichen bekannten N-Acyl-Blockie-rungs- oder Schutzgruppen, wie Carbobenzyloxy, ringsubstituiertes Carbobenzyloxy, wie o- und p-Nitrocarbobenzyloxy, p-Methoxycarbobenzyloxy, Chloracetyl, Bromacetyl, Phenyla-cetyl, tert.-Butoxycarbonyl, Trifluoracetyl, Bromäthoxycarbo-nyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Dichloracetyl, o-Nitrophe-nylsulfenyl, 2,2,2-Trichloräthoxycarbonyl, Brom-tert.-butoxy-carbonyl, Phenoxyacetyl; nicht-acylierte Schutzgruppen, wie Triniedrigalkylsilyl, beispielsweise Trimethylsilyl und tert.-Butyldimethylsilyl sind auch von Interesse.

Die folgenden Reste sind, in Übereinstimmung mit der vorgenannten Definition von Acyl, besonders bevorzugt für R1 und R2 in der Formel II: Formyl, Propionyl, Butyryl, Chloracetyl, Methoxyacetyl, Aminoacetyl, Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Methylcarbamoyl, Äthylcarbamoyl, Phenylthiocarbonyl, 3-Aminopropionyl, 4-Aminobutyryl, N-Methylaminoacetyl, N,N-Dimethylaminoacetyl,N,N,N-Trimethylaminoacetyl, 3-(N,N-Dimethyl)-aminopropionyl, 3-{N,N,N-T rimethyl)-amino-propionyl, N,N,N-Triäthylaminoacetyl, Pyridiniumacetyl, Gua-nidinoacetyl, 3-Guanidinopropionyl, N3-Methylguanidinopro-pionyl, Hydroxyacetyl, 3-Hydroxypropionyl, Acryloyl, Propy-noyl, Malonyl, Phenoxycarbonyl, Amidinoacetyl, Acetamidi-noacetyl, Amidinopropionyl, Acetamidinopropionyl, Guanyl-ureidoacetyl, Guanylcarbamoyl, Carboxymethylaminoacetyl,

35

o

■+

o

-o

KZ/ä'

45

50

55 Selbstverständlich kann jeder beliebige Acylrest in den erfindungsgemäss erhaltenen Verbindungen der Formel II enthalten sein.

Das im erfindungsgemässen Verfahren verwendete Acylie-rungsmittel ist beispielsweise ein Acylhalogenid oder einem 60 Acylanhydrid, wie ein aliphatisches, aromatisches, heterocycli-sches, araliphatisches oder heterocyclisches aliphatisches Car-bonsäurehalogenid oder -anhydrid. Andere Acylierungsmittel, die auch verwendet werden können, sind beispielsweise gemischte Carbonsäureanhydride und insbesondere Niedrigal-65 kylester von gemischten Carboxyl-Carbonsäureanhydriden; auch Carboxylsäuren in Gegenwart eines Carbodiimids, wie 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid, und ein aktivierter Ester von Carboxylsäuren, wie p-Nitrophenylester, sind geeignet.

632509

10

Die Acylierungsreaktion kann durchgeführt werden bei Temperaturen im Bereich von -20 bis +100 °C, aber vorzugsweise wendet man Temperaturen an im Bereich von -8 °C bis 25 °C. Jedes Lösungsmittel, in dem die Reaktanten löslich sind und das im wesentlichen inert ist, kann verwendet werden, beispielsweise polare Lösungsmittel, wie Wasser, Alkohole und polare organische Lösungsmittel im allgemeinen, wie Dime-thylformamid (DMF), Hexamethylphosphoramid (HMPA), Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran (THF), Acetonitril, heterocy-clische Amine, wie Pyridin, Äthylacetat, wässrige Mischungen der vorgenannten, sowie auch halogenierte Lösungsmittel, wie

Methylenchlorid und Chloroform. Die Umsetzung wird üblicherweise während einer Zeitspanne durchgeführt, die im Bereich von etwa 5 Minuten bis zu einem Maximum von 3 Stunden liegt, aber im allgemeinen recht eine Reaktionszeit von 5 etwa 0,5 bis etwa 1 Stunde aus. Die folgende Bleichung kann dieses Verfahren unter Verwendung eines Carbonsäurehaloge-nids beschreiben; es ist jedoch selbstverständlich, dass man durch Verwendung eines Carbonsäureanhydrids oder eines anderen funktionellen äquivalenten Acylierungsmittels gleiche io Produkte erhalten kann:

OH

e

.TL

sch2ch2nh2

.cooh

Acylhalogenid ch2ch2kr-

cooh

R

20

pholin, Chinin, Lysin, Protamin, Arginin, Procain, Äthanolamin, Morphin, Benzylamin, Äthylendiamin, N,N'-Dibenzyläthylen-diamin, Diäthanolamin, Piperazin, Dimethylaminoäthanol, 2-Amino-2-methyl-l-propanol, Theophyllin, N-Methylglucamin 25 und dergleichen. Säureadditionssalze, beispielsweise solche mit Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefel-, Salpeter-, p-Toluolsulfon- und Methansulfonsäure können auch verwendet werden und zwar in den Fällen, in denen der Acylrest eine basische Gruppe enthält.

Die Salze können Monosalze sein, wie das Mononatrium-salz, welches man vorzugsweise erhält, wenn man 1 Äquivalent Natriumhydroxid mit einem Äquivalent des Produktes (II) umsetzt, ebenso können es gemischte Di-Salze sein. Solche Salze erhält man, indem man beispielsweise 1 Äquivalent einer Lösungsmittelsystem vorzunehmen. Triorganosilyl (oder Zinn)- 35 Base mit einem zweiwertigen Kation, wie Calciumhydroxid, Derivate des Thienamycins ergeben schnell die Tris-Triorgano- mit einem Äquivalent des Produktes (II) umsetzt. Diese Salze silylderivate, beispielsweise Tris-Trimethylsilylthienamycin Th sind pharmakologisch annehmbare nicht-toxische Derivate, die (TMS)ä : als aktive Bestandteile in geeigneten pharmazeutischen Einzel dosierungsformen verwendet werden können; sie können auch 40 mit anderen Arzneimitteln kombiniert werden zur Herstellung von Zusammensetzungen mit einem breiteren Aktivitätsspek-Th_i_ NHTMS trum.

Die erfindungsgemäss herstellbaren Thienamycinderivate . _ COOTHS sind wertvolle antimikrobe Substanzen, die aktiv sind gegen

45 verschiedene gram-positive und gram-negative Pathogene, wie Bacillus subtilis, Salmonella schottmuelleri und Proteus vulga-Diese Derivate, die leicht löslich in organischen Lösungsmit- ris. Die freien Säuren und insbesondere deren Salze, wie Amin-teln sind, können auf einfache Weise hergestellt werden, indem und Metallsalze, insbesondere die Alkali- und Erdalkalisalze, man Thienamycin mit einem Überschuss an Hexamethyldisila- sind brauchbare Bacterizide und können verwendet werden, zan und einer stöchiometrischen Menge von Trimethylchlorsi- 50 um beeinflussbare Pathogene von zahnärztlichen und medizini-

Im allgemeinen, wenn bei der oben beschriebenen Acylierungsreaktion ein Säurehalogenid (geeignete Halogenide sind z. B. Chloride, Jodide oder Bromide) oder ein Säureanhydrid verwendet wird, wird die Umsetzung in Wasser oder einer wässrigen Mischung eines polaren organischen Lösungsmittels, wie Aceton, Dioxan, THF, DMF, Acetonitril und dergleichen in Gegenwart eines geeigneten basischen Akzeptors, wie NaHC03, MgO, NaOH, K2HPO4 und dergleichen vorgenommen.

Beim Durchführen der hier beschriebenen Umsetzung ist es im allgemeinen nicht notwendig, die 2-Carboxygruppe oder die 1 '-Hydroxygruppe zu schützen; in den Fällen, in denen das Acylierungsmittel ausserordentlich wasserempfindlich ist, ist es manchmal vorteilhaft, die Acylierung in einem nicht-wässrigen r~ OTMS

lan bei 25 °C unter kräftigem Rühren unter einer N2-Atmosphäre umsetzt.

Die erfindungsgemäss herstellbaren Produkte (II) können eine Vielzahl von pharmakologisch annehmbaren Salzen mit anorganischen und organischen Basen bilden; eingeschlossen sind beispielsweise Metallsalze aus Alkali- und Erdalkalihydro-xiden, -carbonaten oder -bicarbonaten und Salze, die sich ableiten von primären, sekundären oder tertiären Aminen, wie Monoalkylaminen, Dialkylaminen, Trialkylaminen, Niedrigal-kanolaminen, Diniedrigalkanolaminen, Niedrigalkylendiami-nen, N,N-Diarylalkyl-niedrigalkylendiaminen, Aralkylaminen, aminosubstituierten Niedrigalkanolen, N,N-di-niedrigalkylami-nosubstituierte Niedrigalkanole, Amino-, Polyamine- und guani-dinosubstituierte Niedrigalkansäuren und stickstoffenthaltenden heterocyclischen Aminen. Typische Beispiele schliessen Salze ein, die sich ableiten von Natriumhydroxid, Natriumcar-bonat, Natriumbicarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydroxid, Calciumcarbonat, Trimethylamin.Triäthylamin, Piperidin, Morschen Ausrüstungsgegenständen zu entfernen, um Mikroorganismen abzutrennen und für therapeutische Behandlungen bei Menschen und Tieren. Für den letzteren Anwendungszweck können pharmakologisch annehmbare Salze mit anorgani-55 sehen Basen, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind und wie sie bei der Anwendung von Penicillinen und Cephalosporinen verabreicht werden, verwendet werden. Beispielsweise können für diesen Zweck die Alkali- und Erdalkalisalze und primäre, sekundäre und tertiäre Aminsalze verwendet wer-60 den. Diese Salze können kombiniert werden mit pharmazeutisch annehmbaren Flüssigkeiten und festen Trägerstoffen, um geeignete Einzeldosierungsformen, wie Pillen, Tabletten, Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Elixiere und dergleichen zuzubereiten nach Verfahren, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt 65 sind.

Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen sind neue wertvolle Antibiotika, die aktiv sind gegen verschiedene gram-positive und gram-negative Bakterien und die deshalb in

11 632509

der Human- und Veterinärmedizin Verwendung finden können. Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen können Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen können des- auch in geeigneten Formen für die Absorption zubereitet wer-halb als antibakterielle Arzneimittel für die Behandlung von den durch die Schleimhäute der Nase und das Hals- und Bron-Infektionen verwendet werden, die durch gram-positive und chialgewebe und sie können in einfacher Weise auch in Form gram-negative Bakterien verursacht werden, beispielsweise 5 von pulvrigen oder flüssigen Sprays für Inhalationen zubereitet gegen Staphylococcus aureus, Escherischia coli, Strep. pyoge- werden oder in Form von Pastillen oder Zubereitungen für nes, Klebsiella pneumoniae, Bacillus subtilis, Salmonella Halspinselung. Für die medizinische Anwendung an den Augen typhosa, Pseudomonas und Bacterium proteus. Die erfindungs- oder Ohren können die Zubereitungen als besondere Kapseln gemäss herstellbaren Verbindungen können weiter verwendet in flüssiger oder halbflüssiger Form vorliegen oder sie können werden als Additive für Futtermittel und zum Konservieren io als Tropfen und dergleichen verwendet werden. Für topische von Nahrungsmitteln und als Desinfektionsmittel. Sie können Anwendungen kann man hydrophobe oder hydrophile Basen beispielsweise in wässrigen Zusammensetzungen in Konzen- als Salben, Cremes, Lotionen, Salbungsmittel oder Pulver formu-trationen im Bereich von 0,1 bis 100 Teile des Antibiotikums lieren.

pro Million Teile Lösung verwendet werden, um beispielsweise Ausser einem Trägermaterial können die genannten das Wachstum von schädlichen Bakterien auf medizinischen 15 Zusammensetzungen auch weitere Bestandteile, wie Stabilisa-und dental-technischen Ausrüstungen zu zerstören oder zu toren, Bindemittel, Antioxidantien, Konservierungsmittel, inhibieren und auch als Bakterizide bei industriellen Anwen- Schmiermittel, Suspensionsmittel, Viskositätsmittel oder düngen, beispielsweise bei auf Wasser aufgebauten Anstrich- Geschmacksstoffe und dergleichen enthalten. Darüber hinaus mittein, beim Weisswasser von Papiermühlen, um das Wachs- können in den Zusammensetzungen auch andere aktive tum von schädlichen Bakterien zu inhibieren. 20 Bestandteile vorhanden sein, um ein breiteres Spektrum der

Die erfindungsgemäss herstellbaren Produkte können antibiotischen Aktivität zu bewirken.

allein verwendet werden oder in Kombination mit aktiven Für die Veterinärmedizin können diese Zusammensetzun-

Bestandteilen in einer Vielzahl von pharmazeutischen Zuberei- gen beispielsweise als innerhalb der Brust einlegbare Zubereitungen. Diese Antibiotika und ihre entsprechenden Salze kön- tungen mit einer entweder schnellen oder langsamen Abgabe-nen in Form von Kapseln oder als Tabletten, als Pulver oder als 25 Wirkung formuliert werden.

flüssige Lösungen oder als Suspensionen und Elixiere verwen- Die zu verabreichenden Dosierungen hängen zu einem det werden. Sie können oral, intravenös oder intramuskulär erheblichen Teil von dem Zustand des behandelten Patienten verabreicht werden. ab und von dem Gewicht des Patienten, der Verabreichungs-

Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen können route und der Häufigkeit der Verabreichung, wobei die paren-in einer solchen Form zubereitet werden, dass sie im Magen- 30 terale Route für allgemeine Infektionen bevorzugt wird und die Darm-Kanal absorbiert werden. Tabletten und Kapseln für eine orale Route für Infektionen der Eingeweide. Im allgemeinen orale Verabreichung können in Einzeldosierungsform vorlie- kann eine tägliche orale Dosierung etwa 15 bis etwa 600 mg gen und können übliche Excipientien, wie Bindemittel, enthal- aktiven Bestandteil pro kg Körpergewicht des Patienten bei ten, beispielsweise Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbose, einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag enthalten. Eine Traganth oder Polyvinylpyrrolidon; Füllstoffe, beispielsweise 35 bevorzugte tägliche Dosierung für Erwachsene liegt im Lactose, Zucker, Maisstärke, Calciumphosphat, Sorbose oder Bereich von etwa 80 bis 120 mg an aktivem Bestandteil pro kg Glycerin; Schmiermittel, beispielsweise Magnesiumstearat, Körpergewicht.

Talkum, Polyäthylenglykol, Siliciumdioxid; Zerfallmittel, bei- Die beschriebenen Zusammensetzungen können in ver-

spielsweise Kartoffelstärke oder geeignete Befeuchtungsmit- schiedenen Einzeldosierungsformen verabreicht werden, bei-tel, wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können in bekannter 40 spielsweise in festen oder in flüssigen oral aufnehmbaren Weise beschichtet werden. Orale flüssige Präparationen kön- Dosierungsformen. Die Zusammensetzungen pro Einzeldosie-nen in Form von wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösun- rung, ob sie flüssig oder fest ist, kann etwa 0,1% bis 99% an aktigen, Emulsionen, Sirupen, Elixieren und dergleichen vorliegen vem Material enthalten, wobei der bevorzugte Bereich zwi-oder können als trockenes Produkt hergestellt werden, damit sehen etwa 10 und 60% liegt. Die Zusammensetzungen können sie dann mit Wasser oder einem anderen geeigneten Trägerma- 45 im allgemeinen etwa 15 mg bis etwa 1500 mg an aktivem terial vor ihrer Verwendung angemacht werden können. Bestandteil enthalten ; im allgemeinen ist es j edoch bevorzugt,

Solche flüssigen Zubereitungen können übliche Additive, wie eine Dosierungsmenge im Bereich von etwa 250 bis 1000 mg zu Suspensionsmittel, beispielsweise Sorbose, Sirup, Methylcellu- verwenden. Bei einer parenteralen Verabreichnung ist die Einzellose, Glukose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyäthylcellulose, dosierung im allgemeinen die reine Verbindung in einer leicht Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearatgel oder hydrierte 50 angesäuerten wässrigen sterilen Lösung oder in Form eines lös-essbare öle enthalten, beispielsweise Mandelöl, fraktioniertes liehen Pulvers, das zum Auflösen bestimmt ist.

Kokosnussöl, ölester, Propylenglykol oder Äthylalkohol ent- In den folgenden Beispielen, welche die Erfindung beschrei-

halten; Konservierungsmittel, beispielsweise Methyl- oder Pro- ben, ohne diese jedoch zu beschränken, werden die erfindungs-pyl-p-hydroxybenzoat oder Sorbinsäure. Suppositorien können gemäss herstellbaren Verbindungen durch das nachstehende die üblichen hierfür geeigneten Substanzen, beispielsweise 55 Symbol gekennzeichnet:

Kakaobutter oder andere Glyceride, enthalten.

Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen können für Injektionen in Einzeldosierungen in Form von Ampullen hergestellt werden oder in Behältern mit zugesetzten Konservierungsmitteln für Mehrfachdosierungen. Die Zusammensetzun- 60 gen können in Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öl oder wässrigen Trägermaterialien und sie können Formulierungsmittel, wie Suspensionsmittel, Stabilisierungsmittel und/oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ können die aktiven Bestandteile in Form von Pulver vorliegen, damit 65 sie mit einem geeigneten Trägermaterial, beispielsweise sterilem, keimfreien Wasser vor der Anwendung angemacht werden können. worin die drei funktionellen Gruppen dargestellt sind.

—OH

Th.

X 2 RR

l—COOM

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12

Beispiel 1

r— OH

O

nhÜ

COON-

Herstellung des Natriumsalzes von N-(0-Formyl)-D-mande-loylthienamycin

Zu Thienamycin (40 mg) in 10 ml Wasser werden nach und nach bei 0 °C 124 mg NaHCCh, 8 ml Dioxan und dann unter Rühren 1,2 Äquivalente N-(0-Formyl)-l-mandeloylchlorid während eines Zeitraumes von einer Minute zugegeben. Nach 6minütiger Gesamtreaktionszeit wird die Mischung dreimal mit kaltem Äthyläther extrahiert. Die Elektrophorese eines wässrigen Anteils (0,05m, pH 7, wässriger Phosphatpuffer, 50 V/cm, 20 Minuten) zeigt eine 67%ige Umwandlung zu dem gewünschten Produkt an. Der pH wird mit Im H3P04-Lösung auf 2,2 eingestellt und die Lösung wird dreimal extrahiert mit Äthylacetat. Die Äthylacetat (EtOAc)-Lösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet und zweimal mit zwei Äquivalenten einer NaHCCh-Lösung extrahiert. Der wässrige, gefriergetrocknete Extrakt enthält 164 optische Dichteeinheiten (ODU) bei 302 nm bei einer UV-Analyse bei pH 7,0, von denen 95% nach Behandlung mit Hydroxylamin während einer Stunde ausgelöscht werden. Die Ausbeute beträgt 53%. Eine Elektropho-res, wie zuvor durchgeführt, zeigt einen Punkt mittels Bioauto-graphie 4 cm in Richtung der Anode an. KMR ( SD2O) 1,30 (d, J = 6 Hz), CH3CH ; 2,8-3,7 (m, CH2) 4,0-4,5 (m, CH ß-Lactam), 4,73, HDO; 5,97 (s, CoHsCHCHO), 7,53 (s, CsHs), 8,30 (s, CsHsCHOCHO).

25

30

Beispiel 2 —OH

H

Th-J— NC-CH-

O OH

40

_COONa

Herstellung des Natriumsalzes von N-D-Mandeloylthienamy- 45 ein

Die in der Überschrift beschriebene Verbindung wird nach der Verfahrensweise des Beispiels 1 hergestellt, aber vor der EtOAc-Extraktion lässt man den wässrigen Extrakt eine Stunde bei 25 °C stehen. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 50 7, wässriges Phosphat, 0,05m) zeigt einen Punkt bei der Bio-autographie,4 cm in Richtung zur Anode; KMR( 8, D2O) 1,50 (d, J = 6 Hz), CHsCH; 2,8-3,8 (m, CH2), 4,2-4,6 (m, CH ß-Lactam),

OH

4,96 (s, HDO); 5,40 (s, CsHsCH).

55

Beispiel 3

Natriumsalz von N-Propionylthienamycin

Zu Thienamycin (25 mg in 6 ml Wasser bei 0 °C) werden 6o nacheinander gegeben 38,6 mg NaHC03,5 ml Dioxan und dann unter Rühren ein Äquivalent von Propionsäureanhydrid während eines Zeitraumes von 3 Minuten. Nach 10 Minuten wird die Mischung dreimal mit kaltem Äthyläther extrahiert. Die Elektrophorese des wässrigen Extraktes (0,05m, pH 7, Phos- 65 phatpuffer, 50 V/cm, 20 Minuten) zeigt an, dass kein freies Thienamycin vorhanden ist. Der wässrige Extrakt wird auf pH 6,8 eingestellt und enthält 600 ODU bei 302 nm mittels UV-Analyse, welche zu 95% nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht wird. KMR( 5, D2O) 1,42 (m CH2CH3, CH3CH); 2,48 (q, CH2CH3); 2,86-2,90 (m, CH2), 4,30-4,70 (m, CH ß-Lactam), 4,86 (HDO).

Beispiel 4

Natriumsalz von N-(Methoxyacetyl)-thienamycin

Zu Thienamycin (55 mg in 6 ml Wasser bei 0 °C) werden nach und nach 68 mg NaHCOi, 6 ml Dioxan und unter Rühren ' während eines Zeitraumes von 1,5 Minuten 1,1 Äquivalente Me-thoxyacetyichlorid gegeben. Die Mischung wird weitere 10 Minuten gerührt. Die Mischung wird dreimal mit kaltem Äthyläther extrahiert. Die Elektrophorese eines wässrigen Extraktes (0,05m, pH 7, Phosphatpuffer, 50 V/cm, 20 Minuten) zeigt an, ' dass kein freies Thienamycin vorhanden ist. Der wässrige Extrakt wird auf pH 6,8 eingestellt und enthält 105 ODU bei 302 nm mittels UV-Analyse, welche zu 95% nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht wird. KMR ( S, D2O) 1,56 (m, CHCH3), 2,84-3,60 (CH2), 3,72 (s, OCH3), 4,29 (s, 'OCH2), 4,98 (s, HDO).

Beispiel 5

Lithiumsalz von N-(p-Nitrobenzoyloxycarbonyl)-thienamycin Zu Thienamycin (220 mg in 60 ml Wasser bei 0 °C) werden nach und nach 679 mg NaHŒh, 60 ml Dioxan und dann unter Rühren 1,1 Äquivalente p-Nitrobenzylchlorformat während eines Zeitraumes von 1,5 Minuten zugegeben. Man lässt die Mischung 10 Minuten reagieren und extrahiert sie dann dreimal mit kaltem Äthyläther. Die Elektrophorese (0,05m, pH 7, Phosphatpuffer, 50 V/cm, 20 Minuten) zeigt, dass kein freies Thienamycin vorhanden ist. Der wässrige Extrakt wird mit Im H3P04-Lösung auf pH 2,2 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und mit 0,ln LiOH nochmals extrahiert bis zu einem pH von 8,2. Der endgültige pH wird auf 7,0 mit Im H3PO4 eingestellt und die Probe wird gefriergetrocknet. Die Ausbeute beträgt 205 mg (54%).

Beispiel 6

Herstellung des Natriumsalzes von N-(o-Nitrobenzyloxycarbo-nyl)-thienamycin

Zu Thienamycin (43 mg bei 0 °C) wird eine 1:1-Mischung von Tetrahydrofuran-H20 (10 ml) gegeben. Die Mischung wird schnell gerührt während 132 mg NaHCOs (10 Äquivalente) zugegeben werden und dann werden unter Rühren während 2 Minuten tropfenweise 4 Äquivalente o-Nitrobenzylchlorformt zugegeben. Nach 30 Minuten wird der pH mit 25%iger H3PO4-Lösung auf 7 eingestellt und die Lösung wird dreimal mit Äther extrahiert. Der wässrige Anteil wird im Vakuum bei 25 °C verdampft und dann auf den pH 2,2 bei 0 °C gebracht. Man gibt festes NaCl hinzu und die kalte saure Lösung wird dreimal mit Calciumäthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden kombiniert und schnell rückgewaschen mit kalter Salzlösung und dann getrocknet über Magnesiumsulfat, filtriert und rückextrahiert mit 10 ml Wasser, enthaltend 1,7 Äquivalente festes NaHC03. Der Extrakt wird im Vakuum gefriergetrocknet bei Umgebungstemperatur und enthält 366 ODU bei 303 nm mittel UV-Analyse in H2O bei pH 7,0, welche zu 95% nach l,5stündiger Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht werden. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7,0,05m Phosphatpuffer) zeigt einen Punkt mittel Bioautographie (MB-108 Staph. aureus), 3,7 cm in Richtung zur Anode. IR (|i, Film) 5,62 (ß-Lactam); 5,78 breit (Urethan). Das KMR stimmt mit der Struktur überein.

Beispiel 7

Herstellung des Lithiumsalzes von N-(TrichIoräthoxycarbo-nyl)-thienamycin

13

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Th-

■OH

NHÇ-0-CH,CCl,

Il A Ó

O

.COOLi

Zu Thienamcyin (40 mg in 18 ml 1:1 THF-H2O bei 0 °C) werden unter Rühren 225 mg (15,2 Äquivalente) NaHCOî gegeben und dann gibt man während 2 Minuten tropfenweise unter Rühren 1,8 Äquivalente Trichloräthylchlorformat, gelöst in 0,6 ml THF, hinzu. Nach 6 Minuten wird der pH auf 7,2 mit 25%iger H3PO4 eingestellt und die Lösung wird mit Äther extrahiert. Der wässrige Anteil wird nach Entfernung von jeglichen Mengen anhaftendem Äther im Vakuum dann bei 0 °C auf pH 2,5 gebracht und mit kaltem Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereint und schnell mit kalter Salzlösung rückgewaschen, getrocknet mit wasserfreiem MgSÛ4, filtriert und rückextrahiert mit 0,01 m LiOH bis zum pH 6,8. Der wässrige Extrakt wird von jeglichem Äthylacetat im Vakuum befreit und gefriergetrocknet. Der restliche Rückstand enthält 936 ODU (39,7%) gemessen durch UV-Analyse bei 302 nm welche nach Behandlung mit Hydroxylamin während einer Stunde in 0,05m Phosphatpuffer (pH 7) zu 90% ausgelöscht werden. Die Ausbeute beträgt 32 mg. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7,0,05m Phosphat) zeigt eine Zone mittels Bioautographie (MB 108, Staph. aureus), 2,4 cm in Richtung zur Anode. Flüssigchromatographie auf C18 Bondapak (Waters Assoc.) in wäss-rigem 10%igem THF zeigt einen Hauptpeak, frei von jeglichem unreagiertem Thienamycin.

Beispiel 8

Herstellung von N-Bromacetylthienamycin

Zu einer gekühlten Lösung von Thienamycin (28,8 mg) und Natriumbicarbonat (0,3 g) in 10 ml Wasser und 8 ml Dioxan wird unter Rühren eine Lösung aus 0,25 g Bromessigsäureanhydrid in 2 ml Dioxan während eines Zeitraumes von 20 Minuten gegeben. Der pH wird auf 8 bis 8,3 aufrechterhalten. Die Mischung wird weitere 10 Minuten gerührt, mit Äther überschichtet und durch Zugabe von 8%iger Salpetersäure bis zum pH 7 neutralisiert. Die ätherische Schicht wird abgetrennt und die wässrige Schicht wird zweimal mit Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird unter vermindertem Druck auf 0,5 ml eingedampft, mit 2 ml Wasser verdünnt und auf 50 ml XAD-2 Harz gegeben. Die Säule wird mit Wasser eluiert. Die ersten 80 ml werden verworfen und die nächsten 100 ml werden gesammelt. Das Lösungsmittel wird dann ausgetauscht gegen 10%iges THF und weitere 100 ml werden gesammelt. Die vereinten Eluate werden auf pH 7 eingestellt, unter vermindertem Druck auf 5 ml abgedampft und gefriergetrocknet, wobei man das Natriumsalz von N-Bromacetylthienamycin in 60%iger Ausbeute erhält. UV Ä,max 302 mp..

Beispiel 9

—OTMS

Th NHTMS = Th (TMS) 3

—COOTMS

[TMS=Trimethylsilyl]

ml konzentriert; dazu gibt man Hexamethyldisilazan (1,0 ml) und Trimethylchlorsilan (300 jj.1). Die Mischung wird 20 Minuten bei 25 °C unter heftigem Rühren reagieren gelassen. Die Suspension wird dann zur Entfernung von Ammoniumchlorid 5 zentrifugiert. Das Überstehende wird zu einem Öl eingedampft unter einem Stickstoffstrom für die weitere Umsetzung.

Beispiel 10

Herstellung von N-(0-Nitrobenzyloxycarbonyl)-thienamycin 10 aus Th(TMS)3

Zu Th(TMS)3 (24 mg) in 0,8 ml trockenem THF werden 23 mg o-Nitrocarbobenzyloxychlorid gegeben und anschliessend daran 0,015 ml Triäthylamin. Nach 30minütigem Vibriermischen bei 25 °C wird die Mischung in einem trockenen Stick-15 stoffstrom getrocknet und konzentriert. Der pastose Rückstand wird dreimal mit Petroläther gewaschen. Der Rückstand wird mit einer Mischung aus 1,5 ml THF und 10 ml eines pH 7 Phosphatpuffers 20 Minuten gerührt und dann auf eine Säule von 30 ml Dowex 50 (Na+)-Harz gegeben. Die Säule wird mit 20 Wasser eluiert und das Abfliessende wird durch UV-Absorption bei 302 nm kontrolliert. Die Fraktionen, enthaltend das Produkt, werden vereint und gefriergetrocknet.

Beispiel 11

25 Herstellung des Natriumsalzes (I) und Lithiumsalzes (II) von N-(p-Methoxybenzyloxycarbonyl)-thienamycin

Zu Thienamycin (20 mg in 5 ml Wasser bei 0 °C) gibt man 105 mg NaHCÜ3 (20 Äquivalente), 5 ml Dioxan und dann unter Rühren tropfenwise während einer Minute 10 Äquivalente 30 p-Methoxybenzylchlorformat. Nach 15 Minuten wird der pH mit Im H3PO4 auf 7,5 eingestellt und die Lösung wird dreimal mit Äther extrahiert. Der wässrige Anteil wird dann bei 0 °C auf pH 2,2 eingestellt und dreimal mit Äthylacetat extrahiert. Das Äthylacetat wird schnell mit Magnesiumsulfat getrocknet, 35 filtriert und mit einigen ml Wasser, enthaltend 6,3 mg NaHCXIh, extrahiert. Der erste Extrakt wird gefriergetrocknet und enthält 172 ODU bei 303 nm mittels UV-Analyse in H2O bei pH 7,0, welche zu 95% nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin ausgelöscht werden. Die Ausbeute von I beträgt 16 mg. 40 Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7 Phosphatpuffer) zeigt mittels Bioautographie einen Punkt 4 cm in Richtung der Anode.

KMR ( 5, D2O): 1,49 (d, J = 6 Hz, CHsCH); 2,8-3,7 (m, CH2); 3,99 (s, OMe); 4,0-4,6 (m, ß-Lactam CH); 4,92 (s, HCO); 5,20 (s, 45 OCH2); 7,13 (d, J = 8 Hz, C6H4).

Extrahiert man die Äthylacetatlösung mit 0,ln LiOH bis zum pH 7,8 und gefriertrocknet dann, so erhält man das Lithiumsalz II. Die Spektral- und elektrophoretischen Eigenschaften von II sind die gleichen wie von I.

50

Beispiel 12

Herstellung des Natrium(I)- und Lithium(II>Salzes von N-Azi-doacetylthienamycin

55

Th-

—OH

O

11

-NHCCH2N3 L^CO®#

M=Na, Li

65 Thienamycin (48 mg, 0,18 mMol) wird in 10 ml kaltem Wasser gelöst und bei 0 °C gehalten. Zu der Lösung wird Natriumbicarbonat (147 mg, 17,6 mMol) und Dioxan (10 ml) gegeben. Acido-

Herstellung von silyliertem Thienamycin

Thienamycin (80,0 mg) werden in 40 ml Tetrahydrofuran (THF) suspendiert unter einer ^-Atmosphäre und dann auf 10 acetylchlorid (60 mg, 0,05 mMol) wird zu der Lösung während

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14

eines Zeitraumes von 2 Minuten gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten gerührt und dann mit 30%iger Phosphorsäure auf pH 7,0 neutralisiert und wird dann in einen Scheidetrichter überführt. Die Lösung wird mit zweimal 50 ml Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird auf 5 ml konzentriert und dann auf eine Ionenaustauschharz-Säule aus Dowex AG-50X8 (Natrium-Form) gegeben. Die gewünschten Fraktionen, gemessen durch UV, wurden vereint und gefriergetrocknet, wobei man 21 mg des Produktes (I) erhält. Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten in pH 7 Phosphatpuffer) des Produktes zeigt ein einzelnes bio-aktives Band, das sich 4 cm in Richtung zur Anode bewegt.

UV 300 nm;

KMR(100 mHz, DzO): 1,26 (d, CHsCH), 2,93-3,43 (m, 3CHz und Ce-H), 4,01 (s, CH2N3) und 4,20 ppm (m, Cs-H und C7-H).

-OH

o

II

NHCCH2N3

C02®Na®

Thienamycin (76,2 mg, 0,28 mMol) wird in 10 ml kaltem Wasser gelöst und bei 0 °C gehalten. Zu der Lösung gibt man 0,6 ml l,0n Lithiumhydroxidlösung und 10 ml Dioxan zu. Nach einminütigem Rühren gibt man innerhalb von 2 Minuten Azi-5 doacetylchlorid (33,6 mg, 0,28 mMol) hinzu. Das Reaktionsgemisch wird eine weitere Minute gerührt und sodann mit 30%iger Phosphorsäure auf pH 7,0 neutralisiert. Nach Extraktion mit Äther wird die wässrige Lösung auf 5 ml konzentriert und wird auf eine Ionenaustauschsäule (Lithium-Form) von 10 Dowex AG-50X8 gegeben. Die gewünschten Fraktionen, gemessen durch UV, werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man 38 mg des Produktes (II) erhält. UV 300 nm.

Beispiel 13

Th-

^ TÌ

"OH

o

II

©

-NHCCH2NH3

CO

©

Herstellung von N-Glycyl-Thienamycin

Platinoxid (60 mg) und 2 ml Wasser werden in einen Hydrierkolben gegeben und unter 1 Atmosphäre Wasserstoff 20 Minuten bei 25 °C gerührt. Zu dem Kolben wird N-Azido-acetylthienamycin-Natriumsalz (6,0 mg, 0,02 mMol in 4 ml Wasser) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird bei 25 °C unter 1 Atmosphäre Wasserstoff 30 Minuten gerührt. Die erhaltene Mischung (pH 8,7) wird auf pH 7,0 mit 30%iger Phosphorsäure eingestellt und vom Katalysator abfiltriert. Die wässrige Lösung wird auf 2 ml konzentriert und dann auf eine Ionenaustauschsäule von Dowex AG-50X 8 (Natrium-Form) gegeben. Die gewünschten Fraktionen, gemessen durch UV, werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man 3,8 mg des Produktes erhält. Die Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten) des Produkte sind pH 7,0 Phosphatpuffer zeigt am Anfang ein einziges bioaktives Band.

UV 300 nm; KMR (100 MHz, D2O); 8 1,27 (d, CHaCH), 2,96-3,37 (m, 3CH2 und Ce-H), 3,70 (s, COCH2NH2), und 4,20 ppm (m, C5-H und C?-H).

Beispiel 14

Herstellung von N-Benzyloxycarbonylthienamcyin

Eine Lösung aus 14 mg Thienamycin in 4 ml 0,05 m pH 7 Phosphatpuffer und 2 ml Dioxan in einem Dreihals-Kolben, der mit einem Rührer, einem Thermometer, einer pH-Elektrode und der Einlaufspitze eines automatischen Titrators ausgerüstet ist, wird in einem Methanol-Eis-Bad auf -8 °C gekühlt. Der pH wird durch Zugabe von 0,2n Natriumyhdroxid in 50%igem wässrigem Dioxan auf 8,2 eingestellt und dazu wird eine Lösung von 0,015 ml Carbobenzyloxychlorid in 2 ml Dioxan gegeben. Die Mischung wird gerührt bei -6 °C und pH 8,2 für 10 Minuten, dann wird mit Äther überschichtet und der pH wird durch Zugabe von Chlorwasserstoffsäure auf pH 7 eingestellt. Die Schichten werden durch Zentrifugieren getrennt und die wässrige Phase wird zweimal mit Äther extrahiert. Die wässrige Phase wird mit Äthylacetat überschichtet und auf pH 2 eingestellt. Das Äthylacetat wird abgetrennt und die wässrige Schicht wird wiederum mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatschichten werden mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Die Filtrate weden mit Wasser gerührt und der pH wird auf 7 durch Zugabe von verdünnter Natriumbicarbonatlösung eingestellt. Die wässrige Phase wird abgetrennt und gefriergetrocknet, wobei man das Natriumsalz von N-Benzyl-

25 oxycarbonylthienamycin in einer Menge von 10 mg (46%) erhält. Das UV-Spektrum Ä,max 303 mji, E% 147 ( e 6290) zeigt etwa 80%ige Reinheit an. Elektrophorese bei 50 V/cm während 20 Minuten bei pH 7 und anschliessende Bioautographie an S. aureus zeigt eine Inhibierungszone bei +2,5 cm an.

30

Beispiel 15

Herstellung von N-(Brom-tert.-Butoxycarbonyl)-0-trimethylsi-Stufe A

Herstellung von N-(Brom-tert.-butoxycarbvonyl>0-trimethylsi-35 lyl-thienamycin-trimethylsilylester r-OTMS

Th-

CH.

-NHC-O-C-CH-Br n 1 ^

o

CH.

-COOTMS

■tj

Th(TMS)3 (16 mg), erhalten wie vorher angegeben, wird in 0,4 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst und dazu werden 20 [xl (28 mg, 0,13 mMol) Brom-tert.-butylchlorformat (Kp 3570,9 mm) und 8 jil (5,67 mg, 0,057 mMol) Triäthylamin (rückdestil-50 liert aus BaO) gegeben. Die Mischung wird 20 Minuten bei 25 °C geschüttelt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels und der überschüssigen Reagentien erhält man das gewünschte Produkt.

UV X*°Ac 320 nm ( e 9000).

55

Stufe B

Herstellung von N-(Brom-tert.-butoxycarbonyl)-thienamycin

N-Brom-tert.-butoxycarbonyl-0-trimethylsilyl-thienamycin-trimethylsilylester (3 mg) wird in 0,1 ml Tetrahydrofuran, zu 60 dem 0,5 ml eines 0,1m pH 7,0 Phosphatpuffers gegeben worden sind, gelöst. Die Lösung lässt man 20 Minuten bei 25 °C stehen und gibt sie dann über eine Säule (5 ml) von Dowex 50 x 8 (Na+-Form), woei das Eluat durch UV überwacht wird. Die korrekten Fraktionen werden vereint und gefriergetrocknet, wobei 65 man das gewünschte Produkt erhält. UV >Cuafxfer 304 nm ( e 9000); Elektrophorese bei 50 V/cm während 20 Minuten in pH 7,0 Puffer zeigt eine einzige bio-aktive Zone, die sich 31,5 mm in Richtung zur Anode bewegt.

15

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Beispiel 16

~ OH

Th—1 NHCONHCH.

_ COOH

15

20

N-(Methylcarbamyl)-thienamycin

0,N-Bistrimethylsilylthienamycin-trimethylsilylester [Th(TMS)3, hergestellt nach Beispiel 9] aus 66 mg (0,24 mMol) Thienamycin werden in 5 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird bei 25 °C gerührt und dazu werden 80 mg (1,1 mMol) von frischdestilliertem Methylisocyanat gegeben. Nach einer Stunde zeigt das IR-Spektrum der Tetrahydro-furanlösung Banden bei 6,0 n (-NH-CO-NH-) und 6,5 jj, (-NH-). Die Reaktionslösung wird zur Trockne eingedampft zur Entfernung des überschüssigen Methylisocyanats; der Rückstand wird in 5 ml trockenem Tetrahydrofuran gelöst und nochmals zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 5 ml 0,1 n pH 7,0 Natriumphosphatpuffer gelöst und über eine Säule von 80 ml Dowex 50x8 (Na+) chromatographiert unter Verwendung von entionisiertem Wasser als Eluierungsmittel. Fraktionen von 8 ml werden in einer Menge von 8 ml/5 Minu- 25 ten genommen und das Abfliessende aus der Kolonne wird durch UV-Absorption und durch den Refraktionsindex überwacht. Das Produkt wird in den Fraktionen 4 bis 9 festgestellt, die vereint werden und auf ein Volumen von 12 ml konzentriert werden. Das Konzentrat wird über eine Säule von 80 ml XAD-2 30 Harz chromatographiert unter Verwendung von entionisiertem Wasser als Eluierungsmittel. Fraktionen von 8 ml werden alle 5 Minuten entnommen und die Kolonne wird überwaacht durch UV-Absorption und den Refraktionsindex. Aliquote (Menge hängt von der UV-Absorption ab) der Fraktionen 11, 35 15,17,20,22,25 und 30 werden einer Papierelektrophorese unterworfen bei 50 V/cm während 15 Minuten unter Verwendung eines 0,5n pH 7,0 Phosphatpuffers. Die Papierstreifen werden ausgewertet unter Verwendung von Agarplatten, enthaltend S. aureus. Charakteristische Zonen des Ausgangsmate- 40 rials Thienamycin, welche praktisch keine elektrophoretische Beweglichkeit bei pH 7,0 aufweisen, sind in keiner der geprüften Fraktionen vorhanden, während man Zonen für N-(Methyl-carbamyl)-thienamycin in den Fraktionen 11,15,17,20,22,25 und 30 etwa 3,5 cm vom Ausgangspunkt in Richtung der Anode 45 beobachtet. Fraktionen 14 bis 35 werden vereint (158 ml) und auf ein Volumen von etwa 20 ml konzentriert. Eine Probe von 158 ml der Lösung, verdünnt 1:4 mit Wasser, ergibt ein UV-Maximum bei 303 nm; A = 1,38. Die Lösung wird gefriergetrocknet, wobei man das gewünschte Derivat in einer Menge 50 von 29,8 mg erhält Xmax 303 nm E% = 285.

Das KMR-Spektrum (D2O) von N-(Methylcarbamyl)-thie-namycin zeigt, zusätzlich zu den für die anderen Funktionen erwarteten Resonanzen, ein Singulett bei ô 2,88 für die CONHCHs-Gruppe. 55

Eine Lösung aus 39 mg (0,14 mMol) Thienamycin in 10 ml Dioxan-Wasser (1:1) wird mit 176 mg(2,l mMol)NaHC03 behandelt und auf 0 °C gekühlt. Eine 100-p.l-Portion einer Lösung aus 295 mg a-Azidophenylacetylchlorid in Dioxan (Gesamtvolumen 0,5 ml) Wird unter schnellem Rühren zugegeben. Nach 15 Minuten werden zwei weitere 50-p.l-Portionen zu der a-Azidophenylacetylchlorid-Lösung in 15minütigen Intervallen gegeben. 15 Minuten nach der letzten Zugabe des Säurechlorids wird das Reaktionsgemisch mit zwei 5-ml-Portionen Äther extrahiert; 15 ml Äthylacetat werden zugegeben und die wässrige Phase wird schnell gerührt und mit Phosphorsäure auf den pH 2,2 bis 2,5 angesäuert. Die Äthylacetatschicht wird abgetrennt und die wässrige Phase wird mit 5 ml Äthylacetat gewaschen. Die vereinte Äthylacetatlösung wird getrocknet (MgS04) und nach Entfernung des Trocknungsmittels werden 20 ml Wasser zugegeben. Das N-a-Azidophenylacetyl)-thien-amycin wird in die wässrige Lösung durch Zugabe von 103 mg NaHC03 bei 0 °C unter Rühren extrahiert. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und der pH wird durch Zugabe einer geringen Menge NaHC03 auf 7,2 eingestellt.

Eine 0,5 ml Probe wird mit 2,5 ml D2O verdünnt und für die KMR-Spektralanalyse gefriergetrocknet. Resonanzen bei 8 5,0 und 7,48 sind charakteristisch für die -CH- und CóHs Gruppen.

Na

Beispiel 18

Th

"OH

NHCOCH-/^

NH.

COOH

N-(a-Aminophenylacetyl)-thienamycin

Eine wässrige Lösung (6 ml) von 6 mg von N-(a-Azidophe-nylacetyl)-thienamycin wird mit 60 mg eines 10% Pd/C-Kataly-sators bei 25 °C 30 Minuten bei einer Atmosphäre Wasserstoffdruck gerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch Supercel filtriert und dann mit neun 1-ml-Anteilen Wasser gewaschen. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereint (15 ml) und 4-jxl-Proben werden einer Papierelektrophorese unterworfen in einem pH 7 Puffer bei 50 V/cm während 15 Minuten. Die Elektrophorese wird ausgewertet durch Bioautographie über MB-108-Agar-Platten und zeigt bioaktive Zonen bei +0,5 cm (Durchmesser 32 mm) für N-{a-Aminophenylacetyl)-thienamy-cin; + 3,0 cm (Durchmesser 16 mm) für N-(a-Azidophenylace-tyl)-thienamycin und 4,5 cm (Durchmesser 22 mm) für ein Nebenprodukt.

Beispiel 19

Beispiel 17

[—OH

Th

Th

-NH-COCH-<^> N3

.COOH

60

-OH

•NHÖ-^

•COOH

N-(a-Azidophenylacetyl)-thienamycin

N-{Thiobenzoyl)-thienamycin

Eine Lösung aus 55,8 mg (0,2 mMol) Thienamycin in 18 ml 65 Dioxan-Wasser (1:1) wird mit 263 mg (3,1 mMol) NaHCOa behandelt und auf 0 °C gekühlt. Zwei 200-jxl-Anteile einer Lösung von 100 mg Thiobenzoylchlorid in 0,6 ml trockenem Dioxan werden zu der schnell gerührten Reaktionslösung in

632509

16

15minütigen Abständen zugegeben. Jeder Anteil der Säurechloridlösung enthält 0,2 mMol Thiobenzoylchlorid. 15 Minuten nach der zweiten Zugabe wird die Reaktionslösung mit zwei 8-ml-Anteilen Äther gewaschen. Zu der wässrigen Phase, die auf pH 2,2 bei 9 °C eingestellt worden ist, wird Äthylacetat (8 ml) unter schnellen Rühren unter Verwendung von 20% H3PO4 gegeben. Die Schichten werden getrennt und die wässrige Schicht wird mit 3 ml Äthylacetat gewaschen. Die vereinten Äthylacetatschichten werden etrocknet (MgSCk). Nach Abtrennen des Trocknungsmittels werden 10 ml Wasser zu der Äthylacetatlösung gegeben und das Produkt wird in eine wässrige Phase durch Zugabe von 50 mg (0,62 mMol) NaHC03 unter Rühren bei 0 °C (pH 7,4) extrahiert. Die Schichten werden getrennt und die wässrige Phase, enthaltend N-(Thioben-zoyl)-thienamycin-Natriumsalz wird erhalten und gefriergetrocknet. KMR in D20:8 7,3-7,9, was charakteristisch ist für die

CöHsC-Gruppe

Beispiel 21

Th-

"OH

—NHCSNHCH, -COOH

Beispiel 20

Th-

r—OH

NHCOCH-2Cl

-COOH N-(Chloracetyl>thienamycin

Eine Lösung aus 94 mg (0,34 mMol) Thienamycin in 15,75 ml Wasser und 6,75 ml destilliertes Tetrahydrofuran wird mit 420 mg (5,2 mMol) NaHCOî behandelt und auf 0 °C gekühlt. Drei 100-|i.l-Anteile einer Lösung aus 390 mg Chloracetylchlorid in 1 ml Tetrahydrofuran werden in 15minütigen Intervallen zu der Reaktionslösung gegeben. Jede Portion des Säurechlorids enthält 0,34 mMol Chloracetylchlorid. 15 Minuten nach der dritten Zugabe wird die Reaktionslösung mit drei 10-ml-Portionen Äther gewaschen. Die wässrige Schicht wird auf ein Volumen von etwa 10 ml konzentriert, um die letzten Spuren an organischen Lösungsmitteln zu entfernen. Die restliche Lösung wird über 75 ml eines XAD-2 Harzes unter Verwendung von Wasser als Eluierungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 8 ml/5 Minuten chromatographiert. Die Elektrophorese einer Probe aus ausgewählten Fraktionen und eine anschliessende Bioautographie zeigt, dass das Produkt in Fraktionen 16 bis 47 enthalten ist. Die gleichen Fraktionen enthalten zusätzlich verschiedene Mengen an nicht umgesetztem Thienamycin. Fraktionen 16 bis 47 werden vereint (250 ml) und auf ein Volumen von 20 ml konzentriert. Das Konzentrat wird chromatographiert über 150 ml eines Ag 50x2 (Na+)-Harzes unter Verwendung von entionisiertem Wasser als Eluierungsmittel mit einer Geschwindigkeit von 8 ml/4 min. Proben der ausgewählten Fraktionen werden einer Papierelektrophorese unterworfen und anschliessend einer Bioautographie gegen S. aureus MB 108 Organismus. In den Fraktionen 9 bis 12 wird das Produkt, ohne Verunreinigung durch das Ausgangs-Thienamycin, lokalisiert. Diese Fraktionen werden vereint, wobei man 37 ml einer wässrigen Lösung von N-(Chloracetyl)-thienamycin erhält.

Eine 2-ml-Probe wird auf 1 ml konzentriert, verdünnt mit 5 ml D2O und gefriergetrocknet zur Bestimmung des KMR-Spek-trums. Eine Resonanz bei 4,22 8 ist charakteristisch für die CICHîCO-Gruppe.

N-(Methylthiocarbamyl)-thienamycin 10 0,N-Bistrimethylsilylthienamycin-trimethylsilylester, [Th(TMS)3, hergestellt nach Beispiel 9] aus 66 mg (0,28 mMol) Thienamycin werden in 5 ml trockenem Tetrahydrofuran aufgelöst und zur Lösung gibt man 30 mg Bis-Trimethylsilyltrifluor-acetamid und anschliessend daran 50 mg (0,68 mMol) Methyl-15 isothiocyanat. Proben (10 jxl) der Reaktionslösung werden zu einem pH 7,0 Phosphatpuffer (90 jxl, 0,ln) in Abständen gegeben für die Auswertung der Elektrophorese (bei 50 V/cm für 15 Minuten und pH 7 Phosphatpuffer und die Streifen werden bewertet durch Bioautographie unter Verwendung von S.-20 aureus-Agarplatten).

Die bei 4,2 cm in Richtung zur Anode beobachteten Zonen sind charakteristisch für N-(Methylthiocarbamyl)-thienamycin. Das Produkt wird erhalten, indem man die Reaktionslösung zur Trockene eindampft und den Rückstand in 5 ml 0,ln Phosphat 25 (pH 7,0>Puffer auflöst, welcher die restlichen Silylblockierungs-gruppen entfernt und dann wird es durch übliche chromatographische Methoden isoliert.

Beispiel 22

3o Herstellung von N-Trimethylammoniumacetylthienamycin r~ OH O

Th-f-NH&CH CH , ) -

35 z J J

.co®2

40 N-Bromacetylthienamycin-Natriumsalz (20 mg) wird in Wasser (2 ml), enthaltend Trimethylaminhydrochlorid, gelöst. Dazu wird Dikaliumhydrogenphosphat gegeben, um die Lösung auf den pH 8 zu bringen und die Mischung wird 20 Stunden bei 4 °C gehalten. Die Mischung wird im Vakuum bis zur Halbfestigkeit 45 eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser wieder gelöst und der pH wird auf 8 durch Zugabe von Natriumhydroxidlösung eingestellt. Das Verfahren zum Verdampfen, welches der Entfernung von überschüssigem Trimethylamin dient, wird wiederholt. Die Lösung wird auf eine Säule gegeben, welche 25 50 ml eines sulfonierten Polystyrolharzes (Dowex 50) enthält in der Natrium-Form und die Säule wird mit Wasser eluiert. Die ersten 20 ml des Eluats werden verworfen und die nächsten 100 ml werden konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 5 mg eines leichten Pulvers, bestehend aus N-Trimethylammoni-55 umthienamycin, erhält. UV lmax 301 nm (E% 117). Elektrophorese bei 50 V/cm, pH 7,20 Minuten, anschliessend Bioautographie, zeigt eine grössere Inhibierungszone, die sich 1 cm in Richtung zur Kathode bewegt.

60 Beispiel 23

Herstellung von N-(Natriumthiosulfatoacetyl)-thienamycin

Th

OH

N-g-CH2Br +

COOH

NaS203

Th-

-OH

-N-g-CH2-S-$-0-Na

— COOH

17

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Eine Lösung aus Natrium-N-bromacetylthienamycin (84 mg) in 20 ml Wasser wird mit 20 ml 0,ln Natriumthiosulfat behandelt und die Mischung wird 18 Stunden bei 4 °C stehengelassen. Die Lösung wird auf 10 ml konzentriert und auf eine Säule von 230 ml XAD-2 Harz gegeben. Die Säule wird mit Wasser eluiert und die Fraktionen werden überwacht durch UV-Absorption und Messung des Refraktionsindexes. Die korrekten Fraktionen werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man das gewünschte Produkt erhält: (75 mg, UV /.raax 302 nm E% 89).

Die Elektrophorese einer Probe (bei 50 V/cm, pH 7,20 Minuten) zeigt eine bio-aktive Zone, die sich 9 cm in Richtung zur Anode bewegt.

Beispiel 24

Herstellung von N-o-Nitrobenzolsulfenylthienamycin

Zu einer gekühlen Lösung von Thienamycin (2,4 mg) in 1,5 ml 0,05m, pH 7, Phosphatpuffer und 0,75 ml Dioxan wird eine Lösung aus o-Nitrobenzolsulfenylchlorid (10 mg) in 0,75 ml Dioxan gegeben. Der pH wird durch Zugabe von 0,ln Natriumhydroxid au 8,2 gehalten. Nach 10 Minuten wird die Lösung mit verdünnter Chlorwasserstoffsäure auf pH 7 eingestellt und dreimal mit Äther extrahiert. Die wässrige Lösung wird gefriergetrocknet, wobei man das Natriumsalz von N-o-Nitrobenzol-5 sulfenylthienamycin erhält.

Elektrophorese bei 50 V/cm, pH 7, während 20 Minuten und anschliessende Bioautographie zeigt eine einzelne Inhibie-rungszone bei 2,5 cm in Richtung zur Anode.

io Beispiel 25 Herstellung von p-Brombenzoylthienamycin

Thienamycin (45,6 mg) wird in einer Mischung aus 0,05m pH 7 Phosphatpuffer (4 ml) und Dioxan (2 ml) gelöst und die Lösung wird mit 0,2n NaOH in 1:1 Dioxan-Wasser auf den pH 15 8,2 gebracht. Die Lösun wird auf -8 °C gekühlt und während 3 Minuten wird p-Brombenzoylchlorid (45 mg) in Dioxan (2 ml) gegeben. Durch Zugabe von 0,2n NaOH wird der pH zwischen 7,6 und 8,4 für weitere 10 Minuten gehalten. Die Lösung wird auf pH 7 neutralisiert und dreimal mit 8-ml-Anteilen Äther 20 extrahiert. Die wässrige Phase wird gefriergetrocknet, wobei man das Natriumsalz von N-p-Brombenzoylthienamycin UV Xmax 303 nm, 866 ODU, erhält. Elektrophorese bei 50 V/cm, pH 7, während 20 Minuten und anschliessende Bioautographie zeigt eine Inhibierungszone von 22 mm Durchmesser bei -0,5 25 cm entsprechend Thienamycin und von 41 mm Durchmesser bei +2,5 cm entsprechend der in der Überschrift genannten Verbindung.

Beispiel 26

30 Herstellung von N-p-Guanidinophenylacetylthienamycin

Th-

COOH

40

Thienamycin (60 mg) wird in einem pH 7,0 Phosphatpuffer (0,05n, 6 ml) gelöst und gründlich auf einem Eisbad gekühlt. Die Lösung wird dann auf den pH 8,3 unter Verwendung einer Aus-gabe-Autoburette mit l,0n NaOH eingestellt. Zu der gerührten Lösung wird in verschiedenen Anteilen p-Guanidinophenylace- 45 tylchlorid-hydrochlorid (64 mg, 259 jxMol) gegeben, wobei durch die Autoburette der pH nahe 8,3 gehalten wird. Nach wenigen Minuten wird die Reaktionslösung angesäuert (10%ige H3P04-Lösung) auf pH 7,0 und auf 60 g XAD-2 Harz chromatographiert. Die Säule wird mit Wasser eluiert und dann mit einer 50 10%igen wässrigen Tetrahydrofuranlösung, welche das Produkt eluiert. Die Produktfraktionen werden vereint und gefriergetrocknet, wobei man einen weissen, lockeren Feststoff erhält (45 mg, X.max 301 nm ( e 7020). Das Produkt hat eine elektropho-retische Mobilität von 2,5 cm in Richtung zur Anode bei 50 55 V/cm für 25 Minuten. Das KMR stimmt überein mit dem für das Produkt erwarteten. Das IR (Nujol muH) zeigt eine Bande bei 1775 cm-1 (ß-Lactam).

Beispiel 27 60

Herstellung von N-Pyridiniumacetylthienamycin

Eine Mischung von 10 mg N-Bromacetylthienamycin-Natriumsalz und 0,5 ml Pyridin in 1 ml HMPA wird bei 25 °C 4 Stunden gerührt. Das überschüssige Pyridin wird unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird in 3 ml Wasser auf- 65 genommen und auf eine Säule von 20 ml eines XAD-2 Harzes gegeben. Nach dem Eluieren mit Wasser wird das Produkt mit 10%igem wässrigem THF eluiert. Die Lösung hat eine optische

Dichte von 93 bei Xmax 261 nm und 71 bei Xmax 297 nm. Elektrophorese und Bioautographie zeigen eine grössere Inhibierungszone bei -1 cm, entsprechend dem gewünschten Produkt N-Pyridiniumacetylthienamycin.

Beispiel 28

Herstellung von N-Carbomethoxythienamycin

Thienamycin (49 mg) wird in 0,05m pH 7,0 Phosphatpuffer (14 ml) gelöst und au einem Eisbad gekühlt. Unter Rühren wird der pH unter Verwendung einer automatischen Burette auf 8,2 eingestellt. Eine Lösung von Methylchlorformat (46 nl), 600 H,Mol) in p-Dioxan (580 n.1) wird auf einmal hinzugegeben,

wobei man eine homogene Lösung erhält. Anschliessend wird der pH unter Verwendung einer automatischen Burette auf 8,2 gehalten. Nach 10 Minuten wird die Lösung auf einen pH von 7,0 eingestellt unter Verwendung von verdünnter Phosphorsäurelösung und man wäscht dreimal mit gleichen Volumina Di-äthyläther. Die wässrige Lösung wird dann auf 4,5 ml konzentriert und auf einer XAD-2 Harzsäule chromatographiert. Das mit einer wässrigen 5%igen Tetrahydrofuranlösung (nach einer Wasser-Eluierung) eluierte Produkt wird gefriergetrocknet, wobei man 28,9 mg des Produkts erhält.

UV (pH 7,0 Phosphatpuffer 0,ln) >.max 303 nm ( e 6450) Elektrophorese (20 Minuten, 0,1 n pH 7,0 Phosphatpuffer 50 V/cm) Mobilität 3,5 cm in Richtung zur Kathode.

Beispiel 29

Herstellung von N-Benzolsulfonylthienamycin

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18

Th r oh

NHS0oCcHc 2 6 5

COOH

Thienamycin (52 mg) wird in pH 7,01 n Phosphatpuffer (25 ml) gelöst und auf einem Eisbad magnetisch gerührt. Der pH wird auf 8,2 mit 2,5n NaOH eingestellt unter Verwendung einer automatischen Ausgabeburette un dazu wird auf einmal Ben-zolsulfonylchlorid (227 p.1,226 jiMol) in 500 ml p-Dioxan gegeben. Der pH wird unter Verwendung der automatischen Burette 30 Minuten auf 8,2 gehalten und dann unter Verwendung von wässriger, verdünnter Phosphorsäure auf den pH 7,0 eingestellt. Die Reaktionslösung wird auf 15 ml konzentriert und über einem XAD-2 Harz (50 cm3) chromatographiert. Die Säule wird mit Wasser eluiert und anschliessend wird das Produkt mit 10%igem wässrigem Tetrahydrofuran eluiert. Das 10%ige wässrige Tetrahydrofuraneluat wird auf ein Drittel seines Volumens konzentriert und gefriergetrocknet, wobei man 28 mg erhält. Die elektrophoretische Mobilität des Produktes (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7,0,05n Phosphatpuffer) beträgt 3,5 cm in Richtung zur Kathode. Xmax 303 ( e 3650) in pH 7 0,1 n Phosphatpuffer.

Beispiel 30

Herstellung von N-Guanylthioacetylthienamycin

+

Eine Lösung aus 90 mg Natrium-N-bromacetylthienamycin in 40 ml Wasser wird auf pH 6 eingestellt und dazu werden 36 mg Thioharnstoff gegeben. Die Lösung wird 5 Tage auf 4 °C gehalten. Die Lösung wird über 80 ml eines XAD-2 Harzes chromatographiert. Durch Eluieren mit 400 ml Wasser wird der Thioharnstoff entfernt und eine geringe Menge des Ausgangs-Brom acetylderivats und Thienamycins. Beim Eluieren mit 120 ml 10%igem Tetrahydrofuran erhält man eine Lösung, welche das N-Guanylthioacetylderivat des Thienamycins enthält. Durch eine hochdruckflüssigkeits-chromatographische Analyse über Bondapak C18 Porasil mit 10%igem THF Lösungsmittel stellt man einen grösseren Peak von mehr als 90%iger Reinheit fest. Die Lösung wird auf 15 ml eingedampft (pH 5,5) und gefriergetrocknet. Ausbeute: 40 mg eines weissen Pulvers. UVXmax 299 E% 173.

Beispiel 31

Herstellung des Natriumsalzes von Thienamycin-N-(S-phenyl-carbothioat

Th-

wässriger 25%iger H3PO4 auf 5,9 eingestellt und die Lösung wird mit Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird nach Entfernung von jeglichem eingeschlossenen Äther im Vakuum auf den pH 2,5 bei 0 °C gebracht und mit Äthylacetat extrahiert. 5 Die Äthylextrakte werden vereint und schnell mit kalter Salzlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und mit Wasser zurückextrahiert, enthaltend 1,5 Äquivalente NaOH bis zu einem End-pH von 6,8. Die wässrige Schicht wird im Vakuum von jeglichem Äthylacetat befreit und 10 gefriergetrocknet. Die wässrige Lösung enthält 486 ODU bei 302 nm (UV-Analyse in H2O bei pH 7,0), welche nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin zu 95% ausgelöscht werden. Die Ausbeute beträgt 17,7 mg (29%). Elektrophorese (50 V/cm während 18 Minuten, pH 7,0 wässriges Phosphat, 0,05 m) zeigt 15 einen Spot durch Bioautographie 3,6 cm in Richtung zur Anode.

Beispiel 32

Herstellung des Natriumsalzes von Thienamycin-N-(0-phenyl-20 carbothioat

Zu Thienamycin (46,5 mg, 0,17 mMol) in 26 ml 1:1 Dio-xan-HìO bei 0 °C werden unter Rühren 220 mg (2,62 mMol, 15 Äquivalente) NaHC03 gegeben und dann während 4 Minuten tropfenweise 1,5 Äquivalente Phenoxythiocarbonylchlorid in 25 0,6 ml Dioxan. Nach 8 Minuten wird der pH auf 7,0 eingestellt und dann wird die Lösung mit Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird nach Entfernung jeglichen anhaftenden Äthers im Vakuum auf den pH 2,5 bis 0 °C gebracht und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereint, schnell mit 30 kaltem Salzwasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und zurückextrahiert mit Wasser, enthaltend 1,5 Äquivalente 0,1m NaOH bis zu einem pH von 6,8. Die wässrige Schicht wird von jeglichem Äthylacetat im Vakuum befreit und gefriergetrocknet. Die wässrige Lösung enthält 572 ODU bei 35 302 nm (UV-Analyse in H2O bei pH 7,0), welche nach einstündiger Behandlung mit Hydroxylamin zu 95% ausgelöscht werden. Die Ausbeute beträgt 19 mg (26% der Theorie). Elektrophorese (50 V/cm während 18 Minuten; pH 7 wässriges Phosphat, 0,05m) zeigt einen Spot durch Bioautographie 3,3 cm in Rich-40 tung zur Anode.

■ Beispiel 33

Herstellung des Natriumsalzes von N-(Dimethoxyphosphino-thioyl)-thienamycin

45

50

Thon nh?(och3)2

COONa

COONa

Zu Thienamycin (37 mg, 0,14 mMol) in 24 ml 1:1 Dioxan-HzO bei 0 °C gibt man unter Rühren 150 mg (1,78 mMol, 12 Äquivalente) NaHCXh und dann tropfenweise unter Rühren während 4 Minuten 1,5 Äquivalente (39 mg, 0,22 mMol) Phenylchlorthio-format in 0,6 ml Dioxan. Nach 15 Minuten wird der pH mit

Zu dem Trimethylsilylderivat Th(TMS)3, hergestellt aus 214 mg 55 Thienamycin in 25 ml trockenem THF, werden 227 mg Dime-thylphosphorchloridthionat in 2 ml THF gegeben und anschliessend 0,18 ml (130 mg) Triäthylamin. Nach Rühren unter Stickstoff für annähernd 2 Stunden wird der Inhalt zu einem viskosen Rückstand im Vakuum konzentriert. Der pastose 60 Rückstand wird in 40 ml Äthylacetat, enthaltend 5 ml enioni-siertes Wasser, suspendiert und mit verdünnter wässriger Phosphorsäure auf den pH 3,5 gebracht und 10 Minuten gerührt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und mit zweimal 20 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereint, es schnell getrocknet mit wasserfreiem Magnesiumsulfat und filtriert. Zu dem kalten Äthylacetatextrakt werden 20 ml Wasser gegeben und der pH wird mit verdünnter NaOH auf 7 eingestellt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und im Vakuum auf

19

632509

ein kleineres Volumen (7 ml) konzentriert und auf eine 35x4 cm Säule, enthaltend 500 ml XAD-2 Harz, gegeben. Die Säule wird mit Wasser eluiert und anschliessend mit 6%igem wässrigen THF und schliesslich mit 10%igem wässrigem THF. Die mit 10%igemTHF eluierte Fraktion (Röhrchen 99-150,14 ml/Röhr- 5 chen) hat ein Xmax 304 nm und enthält das gewünschte Produkt. Elektrophorese (50 V/cm, 16 Minuten bei pH 7, wässriges Phosphat, 0,05m) zeigt nur durch Bioautographie eine Zone (MB-108 Staph. aureus) 3 cm in Richtung zur Anode. Gefriertrocknung ergibt 39 mg (10,5% Ausbeute) des Natriumsalzes von io

N<Dimethoxyphosphinothioyl>thienamycin. KMR( 8 D20),4,0 (d, J = 10 Hz« P-OCH3).

Beispiel 34

Herstellung des Natriumsalzes von N-(Dimethoxyphosphinyl> 15 thienamycin rOH

Th-fNHÎ(OCH3) 2 .COONa

20

Zu dem Trimethylsilylderivat Th(TMS)3, hergestellt aus 93 mg 25 Thienamycin in 2 ml trockenem THF, werden 88 mg Dimethyl-phosphorchloridat in zwei Portionen gegeben und anschliessend 45 g (0,06 ml) Triäthylamin. Nach heftigem Rühren während einer Stunde wird der Inhalt zu einem viskosen Rückstand im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in 10 ml Äthyl- 30 acetat suspendiert und 3 ml eines pH 3 Phosphatpuffers werden zugegeben und das Ganze wird 10 Minuten geführt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und mit zweimal 3 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden vereint, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Zu dem 35 kalten Äthylacetatextrakt gibt man 6 ml H2O und bringt den pH mit verdünnter NaOH auf 7. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und im Vakuum konzentriert, wobei man 18 mg (13%ige Ausbeute) des Natriumsalzes von N-(Dimethoxyphos-phinoyl)-thienamycin erhält; Xmax 303 nm; Elektrophorese (50 40 V/cm, 20 Minuten, pH 7 wässriges Phosphat, 0,05m) zeigt eine Zone 3,2 in Richtung zur Anode (Bioautographie MB-108 Staph. aureus). KMR ( 8 D2O) ~ 4,0 (d 5 = 10 Hz POCH3)

Beispiel 35 45

Herstellung des Natriumsalzes von N-(Bis-(methylthio)-phos-

phinothioyl>thienamycin

Rühren uner trockenem Stickstoff wird der Inhalt im Vakuum zu einem viskosen Rückstand konzentriert. Der pastose Rückstand wird in 25 ml Äthylacetat, enthaltend 5 ml H2O, suspendiert und der pH wird mit verdünnter wässriger Phosphorsäure auf 3,5 gebracht und das Ganze wird 10 Minuten gerührt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und mit zweimal 10 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden zusammen mit wasserfreiem MgS04 getrocknet und filtriert. Zu dem kalten Äthylacetatextrakt gibt man 5 ml H2O und bringt den pH mit verdünnter NaOH auf 7. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und im Vakuum auf ein kleineres Volumen (7 ml konzentriert und auf eine 30x3 cm Säule, enthaltend 150 ml XAD-2 Harz, gegeben. Die Säule wird mit H2O gewaschen und anschliessend mit wässrigem 9%igem THF, welches das Produkt, nämlich das Natriumsalz von N-(Bis-(methylthio)-phosphi-nothioyl)-thienamycin entfernt ( Xmax 306 nm), das gefriergetrocknet wird, wobei man 69 mg eines gelb-hell-orangen Feststoffes (19,6%) erhält. Bei der Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7 wässriges Phosphat, 0,05m) stellt man nur eine Zone fest 3 cm in Richtung zur Anode (Bioautographie MB 108 Staph. aureus).

Beispiel 36

Herstellung des Natriumsalzes von N-Sulfamoyl-thienamycin

Th--

OH

nhso2nh2

LCOONa rOH

50

Th --nhp (sch3)2

•COONa

Zu dem Trimethylsilylderivat Th(TMS)3, hergestellt aus 213 mg Thienamycin in 20 ml trockenem THF, werden 300 mg Dime-thylphosphorchloridotrithioat in 2 ml THF gegeben und anschliessend 0,18 ml (130 mg) Triäthylamin. Nach 3stündigem

55

Zu dem Trimethylsilylderivat Th(TMS)3, hergestellt aus 210 mg Thienamycin in 10 ml THF, werden 223 mg Sulfamoylchlorid in 5 ml THF gegeben und anschliessend 0,25 ml (180 mg) Triäthylamin. Nach Rühren unter trockenem Stickstoff während 2 Stunden wird die Mischung zu einem viskosen Rückstand im Vakuum konzentriert. Der pastóse Rückstand wird in 50 ml Äthylacetat, enthaltend 5 ml H2O, suspendiert und der pH wird auf 3,5 gebracht und das Ganze wird 10 Minuten gerührt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und einmal mit 101 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatextrakte werden zusammen getrocknet mit wasserfreiem MgS04 und filtriert. Zu dem kalten Äthylacetatextrakt gibt man 18 ml H2O und stellt den pH mit verdünnter NaOH auf 7,0 ein. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und im Vakuum auf ein kleineres Volumen eingeengt und auf eine 33x4 cm Säule, enthaltend 500 ml XAD-2 Harz, gegeben. Die Säule wird mit H2O eluiert, wobei man N-Sulfamoylthienamycin-Natriumsalz erhält. A,max 303 nm. Elektrophorese (50 V/cm, 20 Minuten, pH 7 wässriger Phosphatpuffer 0,05m) zeigt eine Zone 3,2 cm in Richtung der Anode (Bioautographie MB-108 Staph. aureus). Gefriertrocknung der obengenannten Lösung ergibt 90 mg (41%) des Natriumsalzes von N-Sulfamoylthienamycin als gelben Feststoff.

IR Nujol ß-Lactam C = 01750 Schulter 1770 (5,61 + 5,65 |i) und 1150 cm-1 (8,65|j.) für HN-SO2NH2.

Beispiel 37

Herstellung von N-(ß-Azidopropionyl)-thienamycin

'OH

Th

-nh

Leo

© ï

e

>

'OH

9

Th 4-NHCCH2CH2N3 © ©

,C02Na

632509

20

Thienamycin (184 mg) wird in 30 ml Wasser gelöst und auf 0 °C gehalten. Zu der Lösung gibt man 0,52 g NaHCCh, 30 ml Dioxan und 163 mg ß-Azidopropionylchlorid. Die Mischung wird 15 Minuten gerührt und dann mit 30%iger H3PO4 neutralisiert und mit Äther extrahiert. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und auf 5 ml konzentriert. Das rohe Produkt wird chromatographiert über eine Dowex 50 Wx8 (Natrium-Form) Ionenaus-tauschsäule (1 " x 10"). Die Kolonne wird eluiert mit h2o,

wobei man 81 mg des gewünschten Produktes erhält, das eine UV-Absorption bei Xml® von 306 nm zeigt. Elektrophorese des Produktes bei 2 KV in 0,1m pH 7,0 Phosphatpuffer während 2 Stunden zeigt eine einzelen bio-aktive Zone, die sich 30 mm in 5 Richtung der Anode bewegt.

Beispiel 38

Herstellung von N-(ß-Alanyl)-thienamycin roh

Th

9

rOH,

•nhcch2ch2n3 G ©

COpïa

Die wässrige Lösung von N-(ß-Azidopropionyl)-thienamycin (40 mg in 20 ml Wasser) wird unter 1 Atmosphäre Wasserstoff und in Gegenwart von 200 mg Palladium 40 Minuten bei 25 °C hydriert. Die erhaltene Lösung (pH 9,0) wird mit 30%iger H3PO4 neutralisiert und vom Katalysator abfiltriert. Die Mischung wird über einer Dowex 50 Wx 8 (Natrium-Form) lonenaustauschsäule (1 " x 10") chromatographiert und die

Th.

-OH - -NH?

©

l-co.

ch0ch„nh ©

2^"2""3

Th

©

■nhcch2ch2nh3

l— CO

©

Säule wird eluiert mit Wasser, wobei man 20 mg des gewünschten Produktes erhält, welches ein UV von 302 nm zeigt. Die Elektrophorese des Produktes bei 2 KV in 0,1m pH 7,0 20 Phosphatpuffer während 20 Minuten zeigt eine einzelne bioaktive Zone, die sich 10 mm in Richtung zur Kathode bewegt.

Beispiel 39

Herstellung von N-(N'-Acetimidoyl-ß-aIanyl)-thienamycin rOH

Th

//

-nhcch0ch0nh_c

/ Z Z

■CO "

nh

©

ch-

Die wässrige Lösung von N-(ß-Alanyl)-thienamycin (125 mg in 15 ml Wasser) wird bei 0 °C gehalten und man hält einen pH von 8,5 aufrecht, indem man 2,5n NaOH zugibt während O-Äthylacetimidat-hydrochlorid (350 mg) während eines Zeitraumes von 10 Minuten portionsweise zu der Lösung gegeben wird. Die Mischung wird 1 Stunde gerührt und dann mit 2,5n HCl neutralisiert und auf 15 ml konzentriert. Das so erhaltene Rohprodukt wird zweimal üer eine Dowex 50W x 8 (Natrium-Form) Säule (1 " x 10") chromatographiert, wobei man 25 mg erhält. Das Produkt wird mit Wasser eluiert und die Lösung gefriergetrocknet. Beim Umkristallisieren des Produktes aus Wasser erhält man einen kristallinen Feststoff, welcher ein IR-Spektrum (Nujol muH) wie folgt zeigt: 1769 cm"1 (ß-Lactam); KMR 0,100 MHz): 2,20 ppm (s, Acetimidoyl) CH3);

UV 302 nm. Elektrophorese des Produktes bei 2 KV in 0,1m pH 7,0 Phosphatpuffer während 20 Minuten zeigt eine einzige bio-aktive Zone, die sich 10 mm in Richtung zur Kathode bewegt.

Beispiel 40

Arbeitet man nach den Verfahren, wie sie in den Beispielen 37,38 und 39 beschrieben worden sind, mit der Ausnahme, dass

1.) O-Äthylacetimidathydrochlorid ersetzt wird durch eine

35

40

äquivalente Menge von O-Methylformimidathydrochlorid in Beispiel 39;

2.) ß-Azidopropionylchlorid ersetzt wird durch eine äquivalente Menge von Azidoacetylchlorid in Beispiel 37 ;

3.) N-(ß-Azidopropionyl)-thienamycin ersetzt wird durch eine äquivalente Menge von N-(Azidoacetyl)-thienamycin in Beispiel 38;

4.) N-<ß-Alanyl>thienamycin ersetzt wird durch eine äquivalente Menge von N-Glycylthienamycin in Beispiel 39;

5.) O-Äthylacetimidat-Hydrochlorid ersetzt wird durch eine äquivalente Menge an O-Methylformimidat-Hydrochlorid und N-(ß-Alanyl)-thienamycin ersetzt wird durch N-Glycylthien-

45 amycin in Beispiel 39;

6.) O-Äthylacetimidathydrochlorid ersetzt wird durch eine äquivalente Menge von Methylsulfat in Beispiel 39;

7.) O-Äthylacetimidathydrochlorid ersetzt wird durch eine äquivalente Menge Methylsulfat und N-(ß-Alanyl)-thienamycin so ersetzt wird durch N-Glycylthienamycin in Beispiel 39 und

8.) N-(ß-Azidopropionyl)-thienamycin ersetzt wird durch eine äquivalente Menge von N-(2-Azidoäthoxycarbonyl)-thie-namycin in Beispiel 38,

so erhält man die in der nachfolgenden Tabelle aufgeführten

55 Verbindungen:

oh

Vrv sch2ch2nhc(.ch2)ma(ch2) n~y

<r

_N LL COOH

21

632509

Verbindung m

n

A

y

1.)

1

1

-

© W

-NH2C-H

2.)

1

0

-

-N3

3.)

1

0

-

©

-NH3

4.)

1

0

-

©

-NH2-C-CH3

5.)

1

0

-

© w

-NH2-C-H

6.)

1

0

-

©

-N(CH3)3

7.)

1

0

-

Q

-N(CH3)3

8.)

0

2

Sauerstof:

€>

-NH3

Beispiel 41

Herstellung des Natriumsalzes von N-Phenoxyacetalthienamy-cin

Zu einem 250-ml-KoIben, enthaltend Thienamycin (190 mg), werden 30 ml Wasser, 0,6 g Natriumbicarbonat und 30 ml Dioxan gegeben. Während man die Mischung rührt und auf 0 °C hält, wir dazu dem Kolben während eines Zeitraumes von 10 Minuten Phenoxyacetylchlorid (170 mg) gegeben. Die Lösung wird weitere 10 Minuten gerührt und dann mit 30%iger Phosphorsäure auf pH 4,5 angesäuert. Die angesäuerte Lösung wird schnell extrahiert mit 50 ml Äther, um überschüssiges Reagenz zu entfernen und dessen hydrolysiertes Produkt Phenoxyessig-säure. Die wässrige Schicht, die so erhalten wurde, wird weiter angesäuert mit 30%iger Phosphorsäure auf pH 2,0 und mit 50 ml Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht, welche die freie Säure von N-Phenoxyacetylthienamycin enthält, wird abgetrennt und rückextrahiert mit 30 ml einer wässrigen Lösung, enthaltend 60 mg Natriumbicarbonat. Die wässrige Schicht wird gefriergetrocknet, wobei man 120 mg des Natriumsalzes von N-Phenoxyacetylthienamycin erhält. Die Elektrophorese (0,5m, pH 7,0, Phosphatpuffer, 2 KV während 20 Minuten): Eine einzelne bio-aktive Zone, die sich 45 mm in Richtung zur Anode bewegt. UV: À,™* 302 nm.

Beispiel 42

N-ß-Guanidinopropionylthienamycin Stufe A:

ß-Guanidinopropionylchlorid-hydrofluorid

ß-Guanidinopropionsäure (130 mg) werden in Portionen zu 1 ml Thionylchlorid in einem zentrifugierten Röhrchen unter Stickstoff gegeben. Die pastose Reaktionsmischung wird mit einem Gasstab gerieben, bis sie zu kristallisieren beginnt. Das

40

überschüssige Thionylchlorid wird in einem Stickstoffstrom abgedampft, wobei ein fester Rückstand von ß-Guanidinopro-pionylchlorid-hydrochlorid zurückbleibt.

O II

IR 5,6 fi (-C=C1); breites Band 6-6,3 jx (Guanidino).

Stufe B:

45 Thienamycin (54 mg) wird in 1 ml wasserfreiem Dimethyl-formamid suspendiert. Die Mischung wird auf 0 °C gekühlt und ß-Guanidionopropionylchlorid-hydrochlorid (37 mg) wird unter Rühren zugegeben und unmittelbar daran eine Lösung aus 25,8 mg Diisopropyläthylamin in 0,1 ml DMF. Nach weiteren 5 so Minuten wird das Produkt mit Äther niedergeschlagen. Der Äther wird dekantiert und der Rückstand wird mit 2 ml Wasser gelöst, mit Natriumbicarbonat auf pH 6,8 eingestellt und über 75 ml eines XAD-2 Harzes chromatographiert. Nach Eluieren mit Wasser wird das Produkt mit 10%igem wässrigem THF 55 eluiert, konzentriert und gefriergetrocknet. UV A.max 303 mp, E% 157. Elektrophorese (1 Stunde, 50 V/cm, pH 7) zeigt einen einzelnen bioaktiven Spot, der sich 4,5 cm in Richtung zur Kathode bewegt und der einen positiven Sakaguchi-Farbtest ergibt.

60

Beispiel 43

Herstellung von N-Guanylcarbamoylthienamycin

Thienamycin (253 mg) wird in 0,ln pH 7 Phosphatpuffer (11 ml) gelöst, auf einem Eisbad gekühlt und unter Verwendung 65 von In NaOH, die aus einer Autoburette ausgegeben wird, auf einen pH von 8,5 eingestellt. Zu dieser Lösung wird eine kalte Lösung (2,5 ml) von 1-Amidino-semicarbaziddihydrochlorid (354 mg) und Natriumnitrit (128 mg) gegeben. Der pH steigt auf

632509

22

9,0 und nach 10 Minuten wird der pH eingestellt und aufrechterhalten auf 8,2. Nach 30 Minuten bildet sich ein Niederschlag und der pH wird unter Verwendung von 1 n HCl auf 7,0 eingestellt. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat chromatographiert über einer Säule eines XAD-2 Harzes (120 ml), die mit Wasser und anschliessend mit wässrigem 10%igem Tetrahydrofuran eluiert wird. Das N-Guanylcarbamoylthienamycin-Derivat eluiert in wässrigem Tetrahydrofuran und wird gefriergetrocknet zu einem Feststoff. UV (pH 7 0,ln Phosphatpuffer) Xmax 298 nm ( e 5500) HPLC Cis Bondapak, wässriges 10%iges

Tetrahydrofuran) Retentionszeit 2,0fache der von Thienamycin. Elektrophoretische Beweglichkeit (40 V/cm, pH 7 0,ln Phosphatpuffer, 20 Minuten) beträgt 2 cm in Richtung zur Anode.

Beispiel 44

Arbeitet man nach den vorhergehenden Beispielen und Beschreibungen, so werden die nachfolgend definierten Verbindungen erhalten:

sch.2ch2nr1r2 ,coom

Verbindung M

R

R'

1.)

Na h

-c-ch=ch0

»t *•

0

2.)

Na h

-c-ch2o-c2h5

3.)

4.)

5.)

6-)

Na h

h

H

h h

h h

-c-nh0

tl

0

h

-c-ch9n-ch,

»I ^ J

-c-ch2n(ch3)2

Ö

H

-c-ch0-n-c-nh0

Il ^ If ^

0 N

h

7.)

Na h

-c-CH«-s-chô

Il ^ J

0

8.)

Na h

-c-ch(-och3>2

ö

9.)

Na h

-c-ch0oh

If ^

23

632509

Verbindung M R1 R2

10.) Na H -C-CsCH

' II

0

11.) H H -C-CH0N-C-N-C-NH9

I« II D II ^

N H

20.) Na H

0 "H Ö H N

12.) Na H -C-CHOHCH

tt

0

3

13.) K H -C-CH(CH3)2

Ö

14.) NH4 H S-CF3

15.) K H -OH

II

0

H

16.) Na H -C-CH,—c^Nl

ö Ì «

N N

A

17.) Na H —CCH0-N N

n Z

o - 11

u n - n

H

9a

18.) Na H -C-CH-C N

-I

N-

19-) Na H -CCH2SCH2CN

-cch cnh2)ch3

21.) Na H -S°2CF3

22.) Na H -C—/"V-SCF

3

632509

24

Bevorzugte Herstellung von alternativen Ausgangsmateria- ration des zuerst identifizierten Ausgangsmaterials (I) 5R 6S 8R lien: ist.

Ausser Thienamycin ist es für den Fachmann ersichtlich,

dass dessen verschiedene Isomere allein oder als Mischungen Herstellung von Thienamycin durch Totalsynthese als Ausgangsstoffe bei der Herstellung der erfindungsgemäss s herstellbaren Verbindungen verwendet werden können. Einige dieser Isomeren sind beispielsweise aus natürlichen Produkten der Fermentation erhältlich (siehe unten). Durch Totalsynthese werden jedoch alle Isomere erhältlich (siehe unten) in Form einer Mischung von 4 Diastereoisomeren, welche bakterizide 10 Aktivität aufweisen und die nach üblichen technischen Verfahren aufgetrennt werden können. Die 4 Diastereoisomere (2 eis,

2 trans) können chromatographisch getrennt werden. Die Auftrennung von jeweils einem gegebenen d/l-Paar mit optisch aktiven Säuren oder Basen läuft z. B. nach üblichen Verfahren is Stufe A:

ab. Dabei soll festgehalten werden, dass die absolute Konfigu- Herstellung von 4-(2-Acetoxyvinyl)-azetidin-2-on h2c=ch-ch=ch0c-ch3 + 0=c=n-s02c1 ^

ö

2ch2nh2

cooh

0

ch=ch0cch-

S

.15! \

4

/

0

ch=ch0cch.

sq2ci

0

/

• nh

Eine Lösung aus 1,0 ml destilliertem Chlorsulfonylisocyanat 35 Die Phasen werden getrennt, wobei ein gelb-oranges Harz in ( 1,65 g, 11,7 mMol) in 2,5 ml wasserfreiem Diäthyläther wird der wässrigen Phase verbleibt. Die Ätherphase wird direkt unter N2 in einem Bad von -20 °C gekühlt. über MgS04 getrocknet. Die wässrige Harzphase wird dreimal

Eine Lösung von 2,5 g L-Acetoxybutadien (22 mMol) in 2,5 mit 50-ml-Anteilen Äther extrahiert, wobei jeder Anteil zu der ml wasserfreiem Äther wird ähnlich gekühlt unter Stickstoff in Ausgangs-Äther/MgS04-Mischung gegeben wird.

einem —20 °C Bad. 40 Die getrockneten Extrakte werden filtriert und unter einem

Die Chlorsulfonylisocyanatlösung wird tropfenweise zu der Na-Strom auf 5 ml konzentriert; ein Teil des Produktes ist kri-Acetoxybutadienlösung hinzugegeben mittels eines in die CSI- stallisiert in diesem Stadium.

Lösung eintauchenden Polytetrafluoräthylenrohres und wird Man stellt eine Säule aus 10 g Baker-Kieselgel, gepackt in mit n2 unter Druck gesetzt. Die Zugabe dauert 10 Minuten. Äther, her und das Ätherkonzentrat wird obenauf gegeben und Wenig oder keine Farbe ist erkennbar und die Reaktion wird 45 durchlaufen gelassen. Der im Kolben enthaltene Rückstand 0,5 Stunden bei -20 °C gerührt. Die Lösung ist klar und hat eine wird dreimal mit 2 ml Äther gespült, jedesmal abpipettiert und hellgelbe Farbe. auf die Säule gegeben. Dann wird mit Äther eluiert. Die ersten

Eine Lösung aus 2 g Natriumsulfit und 5 g K2HPO4 in 20 ml 25 ml sind hauptsächlich Leervolumen. Die nächsten 510-ml-h2o wird hergestellt während der vorerwähnten 0,5 Stunden Fraktionen werden gesammelt und anschliessend daran 3 Reaktionszeit und auf einem Eisbad gekühlt; 20 ml Äther wer- 50 50-ml-Fraktionen und alle werden unter einem n2-Strom im den zu der Mischung unter heftigem Rühren auf einem Eisbad Volumen vermindert. Das Produkt kristallisiert aus den Fraktio-hinzugegeben. Nach Ende der 30minütigen Reaktionszeit wird nen 4 bis 6 mit Spuren in 3 und 7. Die Fraktionen 1 bis 3 enthal-das Reaktionsgemisch, wiederum unter Anwendung von ten ein gelbliches, scharf-riechendes Material, das beim Stehen n2-Druck und einem Polytetrafluoräthylenrohr aus dem Reak- harzförmig wird. Ausbeute: 100 mg als Mischung aus den cis-tionskolben, der in einem Bad von -20 °C gehalten wird, zu der 55 und trans-Isomeren.

heftig gerührten Hydrolysemischung überführt. Die schnelle,

tropfenweise Zugabe ist nach 5 Minuten beendet. Man lässt die Stufe B:

Hydrolyse weitere 5 Minuten stattfinden. Die Hydroylsemi- Herstellung von 4<2-Acetoxyäthyl)-2-acetidinon schung hat einen pH von 6-8, vorzugsweise pH 8.

0

0cch3

/

o

«I

cch,

-nh

■>

.nh

25 632509

Eine Lösung von 4-(2-Acetoxy vinyl>2-azetidinon ( 10,0 g, 3,44 (breites s, 1, NH), 5,82 (m, 2, CH2OCOCH3), 6,29 (m, 1, C-4H, 0,065 Mol) in 200 ml Äthylacetat, enthaltend 100 mg eines 10% 6,87 ( Vi AB Muster wird weiterhin vierfach aufgeteilt durch Palladium/C-Katalysators, wird in einem Parr-Schüttler C-4H und NH, 1, Jgem = 12,8 Hz, J = 4,5 H Hnh = 1.9 Hz, 7,38 (Vi hydriert bei 25 °C unter einem Druck von 2,8 kg/cm2 im Laufe AB Muster wird weiterhin yierfach aufgeteilt durch C-4H und von 15 Minuten. Die Mischung wird durch ein Bett aus Super- 5NH,l,Jgem= 12,8 Hz,J = 2,3Hz,Jnh= 1,0 Hz). 7,93 und 8,02 (s cel filtriert und mit zusätzlichem Äthylacetat gewaschen. Das an m, total 5, OCOCH3 und CH2CH2OCOCH3, entsprechend), vereinte Filtrat wird im Vakuum gewaschen, wobei man als kristallinen Feststoff 4-(2-Acetoxyäthyl)-2-azetidinon ( 10,0 g) Stufe C:

erhält. Beim Umkristallisieren aus Äther erhält man weisse Kri- Herstellung von 4-(2-Hydroxyäthyl>2-azetidinon stalle: F. 44 bis 47 °C; IR (CHCb) |i 5,66,5,74; KMR (CDCb) t 10

Unter Stickstoff bei 0 °C wird eine Lösung aus 4-(2-Acetoxy- 20 NH), 6,24 und 6,28 (m an t, total 3, C-4H und CH2OH entspre-äthyl>2-azetidinon (2,24 g, 0,014 Mol) in 25 ml wasserfreiem Me- chend), 6,90 (breites s an Vi AB Muster spaltet weiter auf in vier thanol mit einer Lösung von Natriummethylat (77 mg, 1,4 durch C-4H und NH, total 2, OH und C-3H entsprechend, Jgem mMol) in 5 ml wasserfreiem Methanol behandelt. Nach einstün- = 13,0 Hz, Jvic = 4,2 Hz, JNH = 1,6 Hz), 7,42 (Vi AB Muster spal-digem Rühren wird die Lösung mit Eisessig neutralisiert. Die tet weiter auf in vier durch C-4H und NH, 1, C-3H, Jgem = 13,0 Entfernung des Methanols im Vakuum ergibt das rohe 4-(2- 25 Hz, Jvic = 2,2 Hz, JNH = 1,1 Hz), 816 (m, 2, CH2CH2OH). Hydroxyäthyl>2-azetidinon als ein Öl. Das Produkt wird chromatographisch über Kieselgel gereinigt, indem man es mit 10% Stufe D :

Methanol/CHCh eluiert, wobei man 1,55 g des Alkohols erhält: Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-F. 50 °C; IR (CHCI3)|x 5,67; KMR (CDCh) x 3,20 (breites s, 1, octan

30

Eine Lösung aus 4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon (1,87 g, 6,02-6,28, m, 2H, C-4 Methylen 0,016 Mol) und 2,2-Dimethoxypropan (1,69 g, 0,016 Mol) in 25 40 6,22-6,62, m, IH, C-6 Methin ml wasserfreiem Methylenchlorid wird mit Bortrifluoridätherat 6,90, dd, 1H, J7,7 = 14 Hz, J6i7 = 4,5 Hz (0,201 ml, 0,002 Mol) bei 25 °C behandelt. Die erhaltene Lösung C-7 Proton eis bis C-6H wird 10 Minuten gerührt. Beim Entfernen des Lösungsmittels 7,47, dd, 1H, J7-7 = 14 Hz, J6i7 = 2 Hz unter vermindertem Druck erhält man ein öl (2,5 g). Die Chro- C-7 Proton trans bis D-6H matographie des Rohproduktes über einer Kieselgelsäule unter 45 7,82-8,68, m, 2H, C-5 Methylen Verwendung von 2:1 Äthylacetat/Benzol als Eluierungsmittel 8,23, s,3H ergibt 8-öxo-2,2-di-methyI-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan (1,59 8,57, s, 3H C-2 Methyle g) als kristallinen Feststoff. Beim Umkristallisieren aus Äther/

Hexan erhält man ein Produkt mit dem F. 60 bis 61 °C. Stufe E:

IR (CHCh) n,: 5,73 (ß-Lactam) 50 Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-7a- und ß-(l-hydroxyäthyl>

KMR (CDCh) t: (3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan

Zu einer Lösung aus 1,1 Äquivalenten von frisch hergestelltem zugegeben. Nach 2 Minuten wird das erhaltene Lithiumenolat

Lithiumdiisopropylamid in wasserfreiem Tetrahydrofuran 65 mit überschüssigem Acetaldehyd behandelt. Die Lösung wird unter einer Stickstoffatmosphäre bei - 78 °C wird eine Lösung 30 Minuten bei - 78 °C gerührt und dann in Wasser gegossen,

aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan in was- Die wässrige Phase wird mit Natriumchlorid gesättigt und mit serfreiem Tetrahydrofuran, das auf - 78 °C gekühlt worden ist, Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlösungen

632509

26

werden über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man . das rohe Produkt erhält. Durch Reinigung mittels Chromatographie über Kieselgel unter Verwendung von Äthylacetat/ Benzol erhält man 8-Oxo-2,2-dimethyl-7a- und ß-(l-hydroxy-äthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan.

Daten für 8-Oxo-2,2-dimethyl-7ß-(l-hydroxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan :

IR (CH2CI2) p.:

5,72 p. (ß-Lactam)

KMR (CDCh) t:

5,53-6,43, m, 4H, C-4 Methylen + C-6 Methin + C-9 Methin 6,90, dd auf breitem s, 2H, J7 9 = 9 Hz j6.7 = 5,5 Hz, C-7 Methin + ÒH 7,70-8,83, m, 2H, C-5 Methylen 8,27, s,3H

8,60, s,3H C-2 Methyl

8,78, d, 3H, J9.10 = 6,5 Hz, C-10 Methyl

Daten für 8-Oxo-2,2-dimethyl-7a-(l-hydroxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan :

IR(CHCl3)|j.:

2,9 breites O-H 5 5,73 ß-Lactam

KMR (Aceton - d«) 8:

4,23-3,33, m, C-6 Methin 3,33, breites s, OH 2,83, dd, J = 2 Hz, 6 Hz 10 2,67, dd, J = 2 Hz, 8 Hz C-7 Methin 1,93-1,63, m, C-5 Methylen 1,63,2

1,40, s C-2Methyle

1,23, d, H = 6,5 Hz, C-10 Methyl

15

Stufe F:

Herstellung von 8-Oxo-2,2-dimethyl-7a-(l-p-nitrobenzyl-carbo-nyldioxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan

r pOCH2-0

-N0,

Unter wasserfreien Bedingungen wird eine Lösung aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-7a-(l-hydroxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan (60 mg, 0,302 mMol) in 0,6 ml Äther mit pulverisiertem Kaliumhydroxid (19 mg,0,332 mMol) behandelt. Nach 15 Minuten wird p-Nitrobenzylchlorformat (65 mg, 0,302 mMol) zu der Reaktionsmischung gegeben. Man rührt weitere 15 Stunden bei 25 °C. Die Mischung wird aufgeteilt zwischen 1 m pH 7 Phosphatpuffer und weiterem Äther. Die Ätherphase wird mit Wasser und Salzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Beim Abdampfen des Filtrâtes unter vermindertem Druck erhält man 67 mg eines farblosen Öls. Reinigung durch präparative Dickschicht-Chromatographie über K'eselgel und Entwickeln mit 1:9 Äthylacetat/Benzol ergibt 8-Gxo-2,2-dimethyl-7a-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan (40 mg) als Mischung der Diaste-reomeren.

IR(CH2Cl2)p.:

5,68 (ß-Lactam und Carbonat), 6,19 und 6,54 (Nitro)

35 KMR (CDCh):

l,67,d, 2H,ArH 2,37, d, 2H, ArH 4,67, s, 2H, ArQHk 4,67-5,22, m,CH3CH 4o 5,98-6,25, m, 2H, C-4 Methylen 6,25-6,62, m, 1H, C-6 Methin 7,75-8,83, m, 2H, C-5 Methylen 8,22, s,3H, C-2 Methyl 8,50-8,59, m, 5H, C-2 Methyl + CH3CH 45 Die 7ß-Diastereoisomeren oder die 7a- und 7ß-Mischungen werden in analoger Weise erhalten.

Stufe G:

Herstellung von Cis- und Trans-3-(l-p-Nitrobenzylcarbonyldi-5o oxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon

° X

o

R = -C-O-CH.

8-Oxo-3-oxa-2,2-dimethyl-7a-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxy- und 2 ml Wasser gelöst und 1,25 Stunden auf 65 °C erhitzt. Die äthylM-azabicyclo-[4,2,0]-octan (1,0 g) wird in 8 ml Essigsäure Essigsäure und das Wasser werden unter vermindertem Druck

27

632509

entfernt und der Rückstand wird aufgenommen in Benzol und eingedampft, wobei man Trans-3-(l-p-Nitrobenzylcarbonyldi-oxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon als Mischung der Diastereoisomeren erhält.

IR(CH2Cl2)n:

5,67 (ß-Lactam), 5,72 Schulter, 6,20 und 6,57 (Nitro)

KMR (CDCh):

l,73,d,2H, H = 8,5 Hz, ArH 2,43, d, 2H, J = 8,5 Hz, ArH 3,63, breites s, 1H, NH 4,37-5,13, m.lH.CHsCH 4,72, s,2H,ArCH2

OR

OH

O

1,

6,07-6,53, m, 1H, C-4 Methin 6,23, t, 2H, J = 5,5 Hz, CH2OH 6,73-6,93, m, IH, C-3 Methin 7,63-8,97, m, 3H, CH2CH2OH s 8,53, d, J = 6,5 Hz, CH3CH

Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufen D', E', F' und G' als Alternative zu den Stufen D, E, F 10 und G für die Herstellung von 3-(l-p-Nitrobenzylcarbonyldi-oxyäthyl)-4-(2-hydroxyäthyl)-azetidinon

0

ti

R = -COCH

Stufen D ', E', F' und G'

Herstellung von l-(2-Tetrahydropyranyl)-4-[2-tetrahydropyra-nyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon

„oh

/

.NH

Unter Stickstoff und bei 25 °C wird eine Lösung aus 4-(2-Hydroxyäthyl)-2-azetidinon (62 mg, 0,539 mMol) in 0,5 ml wasserfreiem p-Dioxan mit 2,3-Dihydropyran (0,98 ml, 1,08 mMol) und p-Toluolsulfonsäuremonohydrat (19 mg, 0,10 mMol) behandelt. Die erhaltene Lösung wird während 60 Minuten gerührt und dann zwischen 10 ml eines 0,5m pH 7 Phosphatpuffers und 10 ml Äthylacetat geteilt. Die wässrige Phase wird ein zweites Mal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlö-sungen werden mit Salzwasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man 216 mg des Rohproduktes erhält. Reinigung durch präparative Dickschicht-Chromatographie und Entwickeln mit Äthylacetat ergibt 80 mg l-(2-Tetrahy-dropyranyl)4-[2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon als ein Öl.

45 KMR (CDCh) t:

5,13-5,60, m, OCH 5,83-6,85, m, C4H + OCH2 6,95, dd, J = 5 Hz und 15 Hz 7,35, dd, J = 3 Hz und 15 Hz C-3Methylen 50 7,62-8,95, m,CHCH2CH2CH2CH2 + CHCH2CH2O

Herstellung von Cis- und Trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-hydroxyäthyl)-4-[2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon

632509

Arbeitet man in der für die Herstellung von 8-Oxo-2,2-dime-hyl-7oc- und ß-(l-hydroyäthyl)-3-oxa-l-azabicyclo-[4,2,0]-octan aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-3-oxa-l -azabicyclo-[4,2,0]-octan beschriebenen Weise und verwendet l-(2-Tetrahydropyranyl)-4-[2-<2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2-acetidinon, so erhält man eine diastereomere Mischung von sowohl Cis- und Trans-l-(2-

T etrahydropyranyl)-3-( 1 -hydroxy äthyl-4-[2-(2-tetrahydropyra-nyl>oxyäthyl]-2-azetidinon.

Herstellung von Cis- und Trans-l-{2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-p-5 nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2-(2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon

R = C0CH?-<^ H02

30

Arbeitet man wie bei der Herstellung von 8-Oxo-2,2-dime- Tetrahydropyranyl)-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2-thyl-7a-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-8-oxa-l-azabicyclo- (2-tetrahydropyranyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon. Das Cis-Diaste-[4,2,0]-octan aus 8-Oxo-2,2-dimethyl-7-(l-hydroxyäthyl)-3-oxa-l- reoisomere wird in analoger Weise erhalten. azabicyclo-[4,2,0]-octan und verwendet 35

trans-l-(2-Tetrahydropyranyl)-3-(l-hydroxyäthyl)-4-[2-(2-tetra- Herstellung von Cis- und Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldi-hydropyranyl)-oxyäthyl]-2-azetidinon, so erhält man Trans-l-(2- oxyäthyl>4-(2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon

/

OR

Jx

-/V

Q_l

dr

/s

/

0?

«

.NH

■r - coch2-<^/ NO2

60

Eine Lösung aus Trans-l-(2-tetrahydropyranyl)-3-(l-p-nitro- unter vermindertem Druck eingedampft, wobei man Trans-3-(l-benzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2-(2-tetrahydropyranyloxyäthyl]- p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)4-(2-hydroxyäthyl)2-azetidi-2-azetidinon in Methanol bei 25 °C wird mit einem 0,1 molaren non erhält. Das Cis-Diastereoisomere wird in analoger Weise Äquivalent von p-Toluolsulfonsäuremonhydrat behandelt. Die erhalten.

Lösung wird 2 Stunden gerührt und dann mit 1 m pH 7 Phos- 65 phatpuffer neutralisiert. Das Produkt wird in Äthylacetat extra- Stufe H :

hiert. Die Äthylacetatlösung wird mit Salzwasser gewaschen, Herstellung von Cis- und Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldi-über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Das Filtrat wird oxyäthyl)-4-[2,2-bis-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl]-2-azetidinon

29

632509

OR

r

A

/

OH

/\ /"^CHO

m

NH

•OH

£

m s o

0

R - COCK^-S?

r<q-H02

Unter Stickstoff bei 25 °C wird eine Mischung aus wasser- eingedampft, wobei man 229 mg eines Öles erhält. Das Produkt freiem Pyridin (0,146 ml, 1,81 mMol) und wasserfreiem, gepul- 25 wird durch präparative Dickschichtchromatographie über Kie-

vertem Chromtrioxid (92 mg, 0,916 mMol) in 8 ml wasserfreiem selgel gereinigt und mit Äthylacetat entwickelt, wobei man 118

Acetonitril 30 Minuten gerührt. Zu der erhaltenen dunkelbrau- mg Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2,2-bis-(2-

nen Lösung werden 250 mg trockenes Supercel gegeben und hydroxyäthyl)-thioäthyl]-2-azetidinon als ein farbloses Öl erhält,

anschliessend daran eine Lösung von Trans-3-(l-p-nitrobenzyl- ir (CHhChJn:

carbonyldioxyäthylH<2-hydroxyäthyl)-2-azetidinon (186 mg, 30 5,75 (5,79 Schulter), ß-Lactam und Carbonat 6,20,6,55 Nitro

0,550 mMol) in 1 ml wasserfreiem Acetonitril. Nach einstündi- KMR (Aceton-cU) x:

gern Rühren wird das Reaktionsgemisch durch ein gemischtes 1,70, d, J = 8,5 Hz, 2H, ArH

gepacktes Bett aus 2 g von jeweils Kieselgel und Magnesium- 2,28, d, J = 8,5 Hz, 2H, ArH

sulfat filtriert. Das Bett wird wiederholt gewaschen mit insge- 2,48-2,88, m, 1H, NH

samt 30 ml zusätzlichem Acetonitril. Das Filtrat wird unter ver- 35 4,63, s, ArCHî

mindertem Druck bei 25 °C auf ein Volumen von 3 ml konzen- 4,63-5,12, m, CH3CH 3H

triert. Durch Dünnschicht-Chromatographie (Kieselgel; Äthyl-

acetat/Benzol 2:1) wird festgestellt, dass diese Lösung ein Pro- 5,80, t, J = 7 Hz, CH2CHC^ 1 13 H

dukt enthält (Rf = 0,38), das weniger polar ist als das Ausgangs- S j material (Rf = 0,21). 40 5,80-7,45, m, C-4H + C-3H + SCH2CH2OH

Die Acetonitrillösung von Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbo- 7,63,-8,33, m, 2H, CH2CH

nyldioxyäthyl)-4-(2-oxoäthyl)-2-azetidinon, die wie oben herge- 8,53, d,J = 6,5 Hz 3 H, CH3CH

stellt worden ist, wird unter Stickstoff bei 0 °C mit 2-Mercapto- Die Cis-Diastereoisomeren werden in analoger Weise her-

äthanol (0,386 ml, 5,5 mMol) behandelt und unmittelbar darauf gestellt. Alternativ werden die gemischten Diastereoisomeren mit Bortrifluorid-ätherat (0,176 ml, 1,43 mMol). Nach 15minüti- 45 erhalten, wenn man als Ausgangsmaterial eine Mischung der gern Rühren wird diese Lösung geteilt zwischen wässrigem Diastereoisomeren verwendet.

Dikaliumhydrogenphosphat (1,5 g in 4 ml Wasser) und 12 ml Äthylacetat. Die wässrige Phase wird ein zweites Mal mit Äthyl- Stufe I :

acetat extrahiert. Die vereinten Äthylacetatlösungen werden Herstellung von Trans-3-( l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-

mit Salzlösungen gewaschen, über Magnesiumsulfat getrock- 50 [2,2-bis-(2-azidoäthyl)-thioäthyl]-2-azetidinon net und filtriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck

OCOOPNB

flu

OCOOPNB

632509

30

Zu einer Lösung aus 211 mg (Molgewicht = 474; 0,445 mMol) Trans-3-( 1 -p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2,2-bis-(2-hydroxyäthyl)-thioäthyl]-2-azetidinon in 5 ml Tetrahydrofuran (THF) (destilliert aus Lithiumaluminiumhydrid) bei 0 °C werden 103 mg Mesylchlorid (Molgewicht =114; 0,904 mMol) in 1 ml Tetrahydrofuran gegeben und unmittelbar darauf 134 jxl Triäthylamin (Molgewicht 101 ; e = 0,729; 0,967 mMol). Das Reaktionsgemisch wird 1 Stunde unter N2 gerührt. Das Triäthyl lamin-hydrochlorid wird unter N2 filtriert und mit einigen ml zusätzlichem THF gewaschen. Das klare farblose Filtrat wird unter einem Strom von N2 konzentriert und anschliessend im Hochvakuum 10 Minuten gepumpt. Das Dimesylat wird unmittelbar darauf aufgelöst in 5 ml DMSO (destilliert aus CaH2 bei 8 mm und gelagert über einem 4A Linde Molekularsieb) in Gegenwart von 347 mg NaN3 (Molgewicht = 65; 5,34 mMol).

co2h

Nach Rühren über Nacht und unter N2 werden 10 ml H2O und 20 ml Äthylacetat (EA) zugegeben. Die Schichten werden getrennt und die wässrige Schicht wird dreimal mit 10 ml EA gewaschen, wobei jede organische Schicht noch einmal gewa-5 sehen wird mit 10 ml H2O und 10 ml Salzlösung. Die vereinten Äthylacetatschichten werden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert und unter einem N2-Strom konzentriert, wobei man das rohe Diazid erhält Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man 10 Trans-3-(l-p-nitrobenzylcarbonyldioxyäthyl)-4-[2,2-bis-(2-azido-äthyl)-thioäthyl]-2-azetidinon. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung werden in analoger Weise erhalten.

Stufe J:

c (OH) 0 ■+ 2K0o-/>

I 1 1 V

v^_CHN2 EA/£t20

c02ïï

c0opnb

! 2

c(oh)9 i c02?nb ch2ch2n3

sck2ch2k3

Toi.

sch2ch2n3

sch2OH2N

+ n2o

(c02pnb)2

pnb = ch0_/7

1 X.

v

N0„

Eine frisch zubereitete (H. Davies und M. Schwarz, J.O.C., 30,1242 [1965]) Lösung aus p-Nitrophenyldiazomethan (29 mMol) in 150 ml Äther wird unter Rühren zu einer Lösung aus 1,0 g Oxomalonsäuremonohydrat (Molgewicht = 136; 7,35 mMol) in 50 ml Äthylacetat (EA) bei 0 °C gegeben. Nach 2Vi Stunden wird die gelbe Lösung auf einem Drehverdampfer unter schwachem Erhitzen auf ungefähr das halbe Volumen konzentriert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und wie oben beschrieben, zu einem öl konzentriert. Zu dem rohen p-Nitrobenzylester in 50 ml Toluol (Toi.) gibt man 3,54 mg Trans-3-(l-p-NitrobenzylcarbonyldioxyäthylH-[2,2-bis-(2-azidoäthyl)-thioäthyl]-2-azetidinon (Molgewicht = 524; 6,75 mMol). Das Reaktionsgemisch wird unter Rühren erhitzt auf einem Ölbad, wobei man ungefähr Vi des Toluols abdestillieren lässt. Toluol (getrocknet über einem 3A Vit" Linde Molekularsieb) wird wiederum zugegeben, um das Volumen auf 50 ml auf-45 zufüllen und der Azeo-Trocknungsprozess wird dreimal wiederholt. Die Lösung wird dann unter N2 eine Stunde rück-flussbehandelt und der Azeo-Trocknungsprozess wird ein letztes Mal wiederholt und die Rückflussbehandlung wird eine weitere Stunde fortgesetzt. Beim Konzentrieren der erhaltenen so Lösung unter einem Strom von N2 erhält man rohes 1. Das Rohmaterial wird chromatographiert über Kieselgel, wobei man 1 erhält. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

55 Stufe K:

0c00pnb

,sch2ch2n3 sch2ch2n3

+ soci,

2k ^

"XHF /

(C02PNB)2

1

31

632509

sch0ch0n0 / ZZÒ

sch2ch2n3

(c02?nb)

ocoopnb

/S

O

sch0ch0n-/ 2 2 3

sch2ch2n3

-\/H

(io2TNB)2

+ 03p aq. DMF ^

Zu einer Lösung aus 2,80 g 1 (Molgewicht = 912; 3,07 mMol) in 35 ml THF (destilliert aus Lithiumaluminiumhydrid) bei -20 °C werden 0,3 ml Pyridin (Molgewicht = 79; e = 0,982; 3,73 mMol) (destilliert aus NaH und gelagert über einem 4A Linde Molekularsieb) gegeben. Unter Rühren unter N2 werden tropfenweise 0,438 g Thionylchlorid (Molgewicht =119; 3,68 mMol) in 1 ml (THF zugegeben. Die Reaktionsmischung wird unter N2 5 Minuten bei -20 °C gerührt und dann Vi Stunde bei 0 °C und schliesslich 1 Stunde bei 25 °C. Das Pyridinhydrochlo-rid wird unter N2 abfiltriert und zweimal mit Benzol (getrocknet über einem 3A Vìe" Linde Molekularsieb) gewaschen. Die vereinten Filtrate und Waschlösungen werden unter einem N2-Strom konzentriert, in einem geringen Volumen Benzol mit wasserfreiem MgSOt aufgeschlämmt, unter N2 filtriert und dann unter einem N2-Strom konzentriert. Beim Pumpen unter Hochvakuum während Vi Stunde erhält man ein öl. Zu dieser ocoopnb frisch zubereiteten Chlorverbindung gibt man unter Rühren 0,885 g Triphenylphosphin (Molgewicht = 262; 3,38 mMol) in 30 66 ml 9:1 Dimethylformamid (DMFVH2O und anschliessend 550 mg K2HPO4 (Molgewicht = 174; 3,16 mMol). Das Reaktionsgemisch wird 35 Minuten bei 25 °C gerührt. Nach Verdünnen mit EA und Kochsalzlösung werden die Schichten getrennt und die wässrige Schicht wird dreimal mit EA extrahiert. Die 35 vereinten EA-Schichten werden mit Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem N2-Strom konzentriert, wobei man rohes 2 erhält. Das Material wird über Kieselgel chromatographiert, wobei man 2 erhält. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-40 trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe L:

s-ch2ch2n3

0

.»H

(c0opnb),

S-CH2CH2N3 + Br2

Et20/C^H^2

ocoopnb f

0

&

Br

-+ I

Br

.n h (c02pnb)2

sch2ch2n3 sch2ch2n3

(1)

4

(2) NaH, DMF

632509

OCOOPNB

f

32

SCH2CH2N3

S CH.

(C02PNB)2

+

Zu 7,8 ml Pentan (getrocknet über einem 4A Linde Molekularsieb) werden 0,2 ml Bn (Molgewicht = 160; e = 3,12; 3,9 mMol) gegeben. Zu einer Lösung aus 950 mg 2 (Molgewicht = 896; 1,06 mMol) in 15 ml Diäthyläther (getrocknet über einem 3A '/ls" Linde Molekularsieb) gibt man bei 0 °C und unter N2 unter Rühren tropfenweise 2,3 ml der obigen 0,49m Bn-Lösung (1,13 mMol). Nach 1 Ominütigem Rühren bei 0 °C werden 114 jj.1 Cyclohexen (Molgewicht = 82, e = 0,81; 1,13 mMol) zugegeben. Nach 5 Minuten bei 0 °C werden 53 mg 57%iges NaH (57% von 53 mg = 30,2 mg, Molgewicht 24,1,26 mMol) in Mineralöl zu der gerührten Reaktionsmischung gegeben. Darauf unmittelbar gibt man 14 ml eiskaltes DMF (destilliert aus wasserfreiem CaSOt bei 40 mm und gelagert über einem 4A Linde Molekularsieb). Das Rühren wird unter N2 bei 0 °C 3 Stunden fortgeführt. Das Reaktionsgemisch wird auf eine gerührte eiskalte 15 Mischung aus 2,5 ml Im KH2PO4-4O ml H2O-75 ml EA gegossen. Nach Trennung der Schichten wird die wässrige Schicht mit NaCl gesättigt und nochmals mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Kochsalzlösung extrahiert, über wasserfreiem MgSOt getrocknet, filtriert und 20 unter einem N2-Strom konzentriert und anschliessend in einem Hochvakuum gepumpt, wobei man das rohe 3 erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man 3. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung erhält man in analoger Weise.

25

Stufe M:

OCOOPNB

/Scb2CH2N3

(CO2?NB),

+ Br, Kther /C5H12 s Z ~>

OCOOPNB

Br

! ^Br"

.CHCH,

■SCH2CH2N3

(C02PNB),

4- NaH

DM?

\

v

OCOOPNB

SCH2CH2N3

(C02PNB),

33

632509

Zu 9,16 ml Pentan (getrocknet über einem 4A Linde Molekularsieb) gibt man 0,2 ml Brz (Molgewicht = 160; 3,9 mMol). Zu 474 mg 3 (Molgewicht = 793; 0,598 mMol) in 13 ml Diäthyl-äther (getrocknet über einem 3A Vis" Linde Molekularsieb) bei 0 °C unter N2 gibt man tropfenweise unter Rühren 1,52 ml der obengenannten 0,42m Bn-Lösung (0,63 mMol). Nach 15 Minuten bei 0 °C werden 33 mg 57%iges NaH (57% von 33 mg = 18,8 mg; Molgewicht = 24; 0,78 mMol) zugegeben und unmittelbar daran gibt man 6,35 ml eiskaltes DMF (destilliert aus wasserfreiem CaSC>4 bei 40 mm und aufbewahrt über einem 4A Linde Molekularsieb) hinzu. Das Reaktionsgemisch wird 1 'A Stunden bei 0 °C gerührt, dann zu einer gerührten eiskalten Mischung von 1,6 ml Im KH2PO4-2O ml H2O und 20 ml EA gegossen. Die Schichten werden getrennt und die wässrige Schicht wird mit NaCl gesättigt und nochmals mit weiterem EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden einmal mit Salzwas-5 ser gewaschen, getrocknef über wasserfreiem Magnesiumsulfat und filtriert. Das Filtrat wird konzentriert unter einem N2-Strom und dann an ein Hochvakuum gelegt, wobei man das rohe 4 erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel erhält man 4. Die Cis-Diastereoisomeren 10 oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe N:

OCOOPNB Br

^-sch2CH2N3 +

Y

(C02?NB)2

DMSO

OCOOPNB

5

-SCH2CH2N3

(C02PNB)

Zu 210 mg 4 (Molakulargewicht = 871 ; 0,241 mMol), gelöst in 0,5 ml DMSO (destilliert aus CaH2 bei 8 mm und aufbewahrt über einem 4A Linde Molekularsieb) werden bei 25 °C unter Rühren 40 mg l,5-Diazobicyclo-[5,4,0]-undec-5-en (destilliert bei 80 °C/2 mm) (Molekulargewicht =152; 0,263 mMol) in 0,7 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gegeben. Die Lösung wird 4 Stunden unter N2 gerührt und dann zu einer gerührten eiskalten Mischung von 0,48 ml Im KH2PO4,7 ml H2O und 10 ml EA gegeben. Nach Trennung der Schichten wird die wässrige Schicht wiederum mit EA extrahiert. Die vereinten organi-

45 sehen Schichten werden einmal mit Salzwasser gewaschen und dann über wasserfriem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem N2-Strom konzentriert und anschliessend an ein Hochvakuum gelegt, wobei man das rohe 5 erhält. Durch präparative Dünnschichtchromatographie über Kieselgel 50 erhält man 5. Die cis-Diastereoisomeren oder die cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe O:

55

SCH2CH2N3+LiI

s-Collidin

(C02PNB)7

632509

34

OCOOPNB

r

Zu einer Lösung aus 187 mg 5 (Molekulargewicht = 791 ; 0,236 mMol) in 2,5 ml s-Collidin (destilliert aus gepulvertem KOH bei 30 mm Druck) werden 45 mg wasserfreies LiJ (getrocknet für einige Stunden bei 100 °C über P2O5 unter Vakuum) (Molekulargewicht = 134; 0,336 mMol) gegeben. Unter Rühren unter N2 wird das Reaktionsgemisch auf einem Ölbad auf 120 °C erhitzt. Nach insgesamt 25 Minuten wird die Reaktionsmischung auf 25 °C abgekühlt, mit CH2CI2 verdünnt und in einen Rundkolben überführt, um unter einem N2-Strom und im Hochvakuum zu konzentrieren. Der Rückstand wird zwischen 10 ml E A und 1,8 ml IM KH2PO4 in 10 ml H2O geteilt

15 und anschliessend wird die wässrige Schicht zwei weitere Male mit EA extrahiert. Die vereinten organischen Schichten werden mit Salzwasser extrahiert, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter einem Stickstoffstrom konzentriert, wobei man rohes 6 erhält. Durch präparative Dünn-20 schichtchromatographie über Kieselgel erhält man 6. Die Cis-Diastereoisomeren oder die Cis-trans-Mischung wird in analoger Weise erhalten.

Stufe P:

25

0c0pn3

C02?N3

+

DMSO

O

ocopnb

*2CH2N3

co2?nb

Zu einer Lösung der gemischten Diastereoisomeren 6 (34 wird unter Stickstoff 15 Minuten gerührt und zu einem Gesamt-mg; Molekulargewicht = 612; 0,055 mMol) in 0,2 ml DMSO volumen von 1 ml mit CHCh verdünnt und unmittelbar auf 2 bis (destilliert aus CaH2 bei 8 mm und aufbewahrt über einem 4A 1000 [i Kieselgelplatten gegeben. Die Bande des Produktes Linde Molekularsieb) werden unter Rühren zugegeben 9,5 pl zeigt 7 an als Mischung von Cis- und Transdiastereoisomeren. l,5-Diazobicyclo-[5,4,0]-undec-5-en (destilliertbei -80°C/2 mm) 55 (Molekulargewicht = 152; e = 1 ; 0,0625 mMol). Die Lösung Stufe Q:

OCOOPNB

sch9ch2h3

c02PN3

H2/ 2,8 kg/cm'

sch2ch2eh2

35

632509

In Gegenwart von 61 mg PtOî werden 61 mg 7 (Molekulargewicht = 612; 0,1 mMol) in 6 ml Dioxan, 6 ml THF, 3 ml H2O 4 Stunden bei einem Druck von 2,8 kg/cm2 mit Wasserstoff hydriert. Das Reaktionsgemisch wird durch ein Celite-Filter filtriert und mit 2 ml 0,ln pH 7 Phosphatpuffer gewaschen. Nach dem Konzentrieren im Vakuum bis zum Trübungspunkt wird die wässrige Mischung mit Äthylacetat extrahiert. Die wässrige Schicht wird zu einem geringen Volumen konzentriert und auf eine Säule von 100 g XAD-2 Harz gegeben. Beim Eluieren mit H2O und Verwerfen der Anfangsfraktionen werden die Fraktionen, welche das Produkt enthalten, gefriergetrocknet, wobei man 8 als Mischung von Cis- und Trans-Diastereoisomeren erhält.

Die nachfolgend beschriebene Verfahrensweise für die enzymatische N-Deacylierung von Thienamycin ist anwendbar für alle Isomeren des Thienamycins, besonders für die ausgeprägten N-Acetyl-Isomeren 890A und 890A3, die nachfolgend beschrieben sind.

Deacetylierung von N-Acetylthienamycin

Eine l%ige (Gewicht/Volumen) Suspension von fruchtbarer Rasenerde wird hergestellt, indem man 1 g der Rasenerde in 100 ml sterile Phosphatpuffer-Salzlösung gibt, wobei die Phosphatpuffer-Salzlösung die folgende Zusammensetzung hat:

Phosphatpuffer-Salzlösung NaCl

Im Phosphatpuffer, pH 7,5* destilliertes Wasser

8,8 g 10 ml 1000 ml pH : eingestellt auf pH 6 unter Verwendung von NaOH Für feste Medien: gibt man 20 g Agar hinzu.

Eine einzelne Kultur wird ausgewählt und 2 Tage bei 28 °C 5 auf einer Agarkultur des* Mediums B wachsen gelassen. Ein Teil des Wachstums dieser Kultur wird auf die Oberfläche von 6 Kulturen, die aus dem Medium B hergestellt worden sind, ausgebreitet. Diese Kulturen werden 2 Tage bei 28 °C inkubiert. Diese Kultur wurde identifiziert als Protaminobacter ruber und 10 bezeichnet mit MB-3528 in der Kulturkollektion von Merck & Co., Ine, Rahway, N.J., USA und eine Probe wurde hinterlegt beim Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Accession No. NRRL B-8143.

Ein Teil des Wachstums der Agarkultur von Protaminobac-15 ter ruber MB-3528 wird verwendet, um einen 250-ml-Erlen-meyer-Kolben, enthaltend 50 ml des Mediums C, tu beimpfen. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:.

Medium C

20 Dextrose 20 g

Pharmamedia 8 g

Flüssigkeit von eingeweichtem Mais 5 g (Nassbasis)

destilliertes Wasser 1000 ml 25 pH: eingestellt auf 7 mit NaOH oder HCl

N-Acetyläthanolaminlösung* 8,5 ml

*lm Phosphatpuffer, pH 7,5

16 ml Im KH2PO4 werden gemischt mit 84 ml Im K2HPO4. der pH des Phosphatpuffers wird durch Zugabe einer geringen Menge von entweder Im KH2PO4 oder Im K2HPO4 auf 7,5 eingestellt.

Aliquote dieser l%igen Vorratserde-Suspension werden hergestellt zur Zubereitung von 10x-, 100x-und 1000x-Ver-dünnungen.

1-ml-Anteile der Vorratssuspension oder 1-ml-Anteile der lOx-, lOOx- und 1000x-Verdünnungen werden zu 2-ml-Anteilen von sterilen, l,0%igen Agarlösungen bei 48 °C gegeben. Die Mischung wird schnell über die Oberfläche von sterilen Petrischalen von 85 mm Durchmesser, enthaltend 20 ml des Mediums A, gegossen. Medium A hat die folgende Zusammensetzung:

Medium A KH2PO4 K2HPO4 MgS04

destilliertes H2O N-Acetyläthanolaminlösung*

3,0 g 7,0 g 0,1g 1000 ml 8,5 ml

*N-Acetyläthanolaminlösung

N-Acetyläthanolamin wird lOx in H2O verdünnt und membransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavenbehandlung zugegeben.

Für feste Medien: Man gibt 20 g Agar zu.

Die Petrischalen werden 19 Tage bei 28 °C inkubiert. Eine gut isolierte Kolonie wird aufgenommen und auf einer Petrischale, enthaltend Medium B, ausgebreitet. Medium B hat die folgende Zusammensetzung:

Medium B Tomatenpaste gemahlenes Weizenmehl destilliertes Wasser

40 g 15g 1000 ml

*N-Acetyläthanolaminlösung

N-Acetyläthanolamin wird 10x in H2O verdünnt und mem-30 bransterilisiert. Diese Lösung wird nach der Autoklavenbehandlung zugegeben.

Der Kolben wird bei 28 °C und 220 U/min auf einem Rüttler 4 Tage geschüttelt. Eine 25-ml-Portion aus dem Kolben wird 15 35 Minuten mit 8000 U/min zentrifugiert. Das Überstehende wird entfernt und die Zellen an der Oberflächen des festen Mediums werden abgekratzt und zu einem 0,5 ml 0,05m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, gegeben. Die erhaltene Suspension wird einer Ultraschallbehandlung unterworfen unter Verwendung eines 4o Branson Instruments Modell LS-75 Sonifier mit einer V2 Inch Sonde bei einer Einstellung 4 mit vier 15-Sekunden-Intervallen, während die Suspension während und zwischen den Unterbrechungen in Eiswasser gekühlt wird. Ein 10-n.l-Anteil des schallbehandelten Produktes wird mit 25 [il Lösung, enthaltend 840 45 Hg/ml N-Acetylthienamycin in 10 mMol Kaliumphosphatpuffer, pH 7, vermischt und über Nacht bei 28 °C inkubiert. Kontrollen, welche das Antibiotikum und Puffer allein enthalten und beschallte Zellen und Puffer ohne Antibiotikum wurden auch vorgenommen. Nach einer Inkubierung über Nacht bei 28 °C 50 werden 2-(il-Mengen auf cellulosebeschichtete Dünnschicht-chromatographie-Platten gegeben, die entwickelt wurden in Äthanol:H20,70:30. Nach dem Trocknen an der Luft wird die Dünnschichtchromatogrpahie-Platte auf eine mit Staphylococ-cus aureus ATCC 6538P infizierte Platte 5 Minuten gegeben. 55 Die infizierten Platten sind wie folgt hergestellt worden : Das Über-Nacht-Wachstum des für die Infizierung verwendeten Organismus Staphylococcus aureus ATCC 6538P in Fleischbrühe plus 0,2% Hefeextrakt wird mit Fleischbrühe plus 0,2% Hefeextrakt zu einer Suspension verdünnt, die eine 60 60%ige Durchlässigkeit bei einer Wellenlänge von 660 nm hat. Diese Suspension wird zu Difco-Nähragar, ergänzt mit 2,0 g/I Difco-Hefeextrakt, bei 37 bis 48 °C gegeben, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die 33,2 ml der Suspension pro Liter Agar enthält. 40 ml dieser Suspension werden auf Petrischalen, 65 22,5x 22,5 cm gegossen und diese Platten werden gekühlt und bei 4 °C gehalten bis sie verwendet werden (5 Tage Maximum).

Die Dünnschichtchromatographie-Platte wird entfernt und die den Organismus enthaltende Platte wird über Nacht bei 35 °C inkubiert. Ausser dem nicht umgesetzten bio-aktiven

632509

36

N-Acetylthienamycin mit einem Punkt bei Rf 0,7-0,89 wurde ein bio-aktiver Punkt beobachtet bei Rf 0,44-0,47, der dem Thienamycin zugeschrieben wird. Kontrollinkubationsmischungen des Antibiotikums plus Puffer, schallbehandelte Zellen plus Puffer und Antibiotikum plus Puffer, zu denen schallbehandelte Zellen zugegeben worden waren kurz vor der Dünnschicht-chromatografie-Anwendung, zeigten kein bio-aktives Material bei Rf 0,44-0,47.

Herstellung von 890Ai, einem speziellen Isomeren

OH

SCH-CH-NHCCH

COOH

Ein Röhrchen einer gefriergetrockneten Kultur von Strepto-myces flavogriseus MA4434 (NRRL 8139) wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird in ein Röhrchen suspendiert, welches 0,8 ml steriles Davis-Salz der folgenden Zusammensetzung enthält:

Davis-Salz

Natriumeitrat 0,5 g

K2HPO4 7,0 g

KH2PO4 3,0 g

(NH4)2S04 1,0 g

MgS04-7H20 0,1g destilliertes Wasser 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet zum Bebrüten von vier Kulturen des Mediums A mit der folgenden Zusammensetzung:

Medium A

Glycerin 20,0 g primäre Hefe 5,0 g

Fischmehl 15,0g destilliertes Wasser 1000 ml

Agar 20,0 g pH: eingestellt auf 7,2 unter Verwendung von NaOH

Die beimpften Kulturen werden eine Woche bei 27-28 °C bebrütet und dann bis zur Verwendung bei 4-6 °C aufbewahrt. Eine '/3-Portion des Wachstums von drei Kulturen wird verwendet, um 9 mit einem Stopfen versehene Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung, zu beimpfen:

Medium B

Hefeautolysat (*Ardamire) 10,0 g

Glukose 10,0g

Phosphatpuffer** 2,0 ml

MgS04-7H20 50 mg destilliertes Wasser 1000 ml pH : eingestellt auf 6,5 unter Verwendung von HCl oder NaOH *Ardamine: Yeast Products Corporation **Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

Na2HP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

Die die Keime enthaltenden Kolben werden 1 Tag bei 27-28 °C auf einem Rüttler mit 220 U/min geschüttelt. Die Kolben und die Inhalte werden 1 Tag bei 4 °C aufbewahrt. 33 2-1-Erlenmeyer-Kolben, jeder enthaltend 250 ml des

Mediums C, werden mit 8 ml pro Kolben des Wachstums aus dem die Keime enthaltenden Kolben beimpft. Das Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

Medium C

Tomatenpaste 20,0 g primäre Hefe 10,0g

Dextrin (Amidex) 20,0 g

C0CI2.6H2O 5,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml pH: eingestellt auf 7,2-7,4 durch NaOH

Nach der Beimpfung werden die Produktionskolben bei 24 °C bebrütet unter Schütteln auf einem Rüttler, der mit 212 U/min betrieben wird und zwar für 4 Tage. Die Kolben werden dann entleert und der Inhalt auf Aktivität untersucht unter Verwendung von Standard Salmonella gallinarum MB-1287 und Vibrio percolans ATCC-8461-Platten unter Anwendung von 1,25-cm-Scheiben, welche in die zentrifugierten Brüheproben eingetaucht wurden. Die Proben werden mit 0,02m Phosphatpuffer, pH 7,0, nötigenfalls verdünnt. Die Ergebnisse werden nachfolgend angegeben:

Zeitpunkt der Ernste (Harvest Age hours) h 96

pH 7,2

Salmonella gallinarum (mm Zone) 29,5

Vibrio percolans '/îo-Verdûnnung (mm Zone) 31

890 Prüfeinheiten 40

71 der gesamten Fermentationsbrühe werden auf 3 °C abgekühlt und in 200-ml-Anteilen mit 9000 U/min 15 Minuten jeweils zentrifugiert.

Zu den vereinten überstehenden Flüssigkeiten werden 7 ml 0,1m neutrales EDTA gegeben und die ganze Probe wird auf eine Dowex-1 x 2 (Cl~), 50-100 Maschen-Säule gegeben mit Bettdimensionen von 5,1 x 25 cm und einer Fliessgeschwindigkeit von 40 ml/min. Die Säule wird mit 500 ml entionisiertem Wasser, enthaltend5 ml ImTris-HCl-Puffer, pH 7,0,und 25 H-Mol neutrales EDTA, gewaschen. Das Antibiotikum wird mit 1 Liter entionisiertem Wasser, enthaltend 50 g Natriumchlorid, eluiert und die Säule wird dann mit 300 ml entionisiertem Wasser gewaschen. Fraktionen von 100 ml werden gesammelt, ausgehend vom ersten Auftreten des Salzes am Säulenausgang. Die Bio-Aktivität liegt in den Fraktionen 1 bis 10 mit einem Peak bei der Fraktion 2 vor. Die Fraktionen 2 bis 5, welche 17% der angewandten Aktivität enthalten, werden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Fraktionen werden auf 110 ml konzentriert mittels eines Drehverdampfers unter vermindertem Druck und der pH wird auf 5,8 eingestellt durch Zugabe von 4,2 ml Im HCl. Das so eingestellte Konzentrat wird auf eine Säule von XAD-2 gegeben mit einer Bettdimension von 3,8x50 cm, die vorher gewaschen worden war mit 3160%igem wässrigem Aceton (Volumen/Volumen) und anschliessend mit 31 entionisiertem Wasser, 31 von 5%igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid und 1125%igem (Gewicht/Volumen) Natriumchlorid in entionisiertem Wasser. Das angewendete Konzentrat lässt man auf das Niveau des Bettes abfliessen. Das Antibiotikum wird eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 15 ml/min. 22 Fraktionen von jeweils 100 ml werden gesammelt, gerechnet von der ersten Anwendung der Probe. Die Bio-Aktivität erscheint in den Fraktionen 6 bis 22 mit einem Peak bei den Fraktionen 9 und 10. Fraktionen 9 bis 20 werden für die weitere Verarbeitung vereint. Ähnlich hergestellte Fraktionen werden vereint und die vereinten Fraktionen werden auf 70 ml konzentriert mittels eines Drehverdampfers unter vermindertem Druck.

Das Konzentrat wird auf eine Dowex-1 x4 (Cl~) 400

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

37

632509

Maschen Säule mit einer Bettdimension von 2,2x27 cm gegeben. Die Säule wird mit 50 ml entionisiertem Wasser gewaschen und das Antibiotikum eluiert mit 210,070m NaCl + 0,005 m NH4CI + 0,0001m NH3 in entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 2 ml/min. Fraktionen von 9,5 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums wird eluiert in den Fraktionen 142 bis 163. Die Fraktionen 146 bis 157 werden vereint für die weitere Verarbeitung.

Die vereinten Fraktionen 146-157 werden konzentriert auf 3 ml durch Verdampfen unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer und das Konzentrat wird durch Zugabe von 5 jj.1 Im NH3 auf pH 6,5 gebracht. Das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2 x 70 cm) eines Bio-Gel P-2 (200 bis 400 Maschen) gegeben, die vorher gewaschen worden war mit 20 ml 5m NaCl und 500 ml entionisiertem Wasser. Nachdem das Konzentrat auf das Bettniveau abgelaufen war, wurden 2 Spülungen mit jeweils 1 ml entionisiertem Wasser vorgenommen und wiederum bis zum Bettniveau ablaufen gelassen. Die Säule wird dann eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,6 ml/min. Fraktionen von 2,9 ml werden gesammelt.

Der Hauptpeak des Antibiotikums wird eluiert in den Fraktionen 63 bis 70. Fraktionen 64 und 65 werden für die weitere Aufarbeitung zusammengegeben.

Die vereinten Fraktionen 64 und 65 werden auf einem Dünnschichtverdampfer uner vermindertem Druck auf 2 ml konzentriert und dann in einer Umhüllung gefroren und lyophilisiert während 8 Stunden in einem 14 ml mit Schraubverschluss versehenen Gefäss, wobei man 2,25 mg des im wesentlichen reinen Antibiotikums 890Ai erhält. Die N-Acetylgruppe wird abgespalten, wie vorher beschrieben, wobei man die freie Base erhält:

primäre Hefe Fischmehl destilliertes Wasser Agar pH: eingestellt auf 7,2 unter NaOH

5,0 g 15,0 g 1000 ml 20,0 g sch2ch2nh2

cooh

Herstellung von 890A3, einem speziellen Isomeren oh

Die beimpften Kulturen werden 1 Woche bei 27-28 °C bebrütet und dann bei 4-6 °C bis zur Verwendung aufbewahrt 10 (nicht länger als 21 Tage).

Ein '/3-Anteil des Wachstums aus 4 Kulturen wird zum Beimpfen von 12 verstöpselten 250-ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml Medium B der folgenden Zusammensetzung, verwendet:

15

Medium B

Hefeautolysat (*Ardamine) 10,0 g

Glucose 10,0g

Phosphatpuffer** 2,0 ml

20 MgS04- 7H2O 50 mg distilliertes h2o 1000 ml pH: eingestellt auf 6,5 unter HCl oder NaOH * Ardamine: Yeast Products Corporation 25 **Phosphatpufferlösung

KH2PO4 91,0 g

NazHP04 95,0 g destilliertes Wasser 1000 ml

3o Die Flasche mit den Keimen wird 1 Tag bei 27-28 °C auf einer Rüttelmaschine mit 220 U/min geschüttelt. Die Flasche und der Inhalt werden 1 Tag bei 4 °C stationär aufbewahrt.

4^ 2-1-Erlenmeyer-Kolben, jeweils enthaltend 200 ml von Medium, C, werden mit 8 ml pro Kolben des Wachstums aus 35 den beimpften Flaschen versetzt. Medium C hat die folgende Zusammensetzung:

0

ti

-N.

suh2ch2>ìhcch3

i_cc

;ooh

0^

Ein Röhrchen einer lyophilisierten Kultur von Streptomyces flavogriseus MA4434 (NRRL 8139) wird aseptisch geöffnet und der Inhalt wird suspendiert in einem Röhrchen, enthaltend 0,8 ml einer sterilen Davis-Salzlösung der folgenden Zusammensetzung:

Davis-Salz

Natriumeitrat

K2HPO4

KH2PO4

(NH*)2S04

MgS04-7H20

destilliertes Wasser

0,5 g 7,0 g 3,0 g 1,0 g 0,1g 1000 ml

Diese Suspension wird verwendet, um 4 Kulturen des Mediums A der folgenden Zusammensetzung zu beimpfen:

Medium A Glycerin

20,0 g

Medium C

Tomatenpaste 20,0 g

40 primäre Hefe 10,0 g

Dextrin ( Amidex) 20,0 g

CoCh-ôHîO 5,0 mg destilliertes Wasser 1000 ml

45 pH: eingestellt auf 7,2-7,4 mit NaOH

Nach der Beimpfung werden die Produktionskolben bei 24 °C 4 Tage und 5 Stunden auf einer Schüttelmaschine, die mit 212 U/min betrieben wird, gerüttelt. Die Kolben werden dann so entleert und auf Aktivität untersucht unter Verwendung von Standard Salmonella gallinarum MB-1287 und Vibro percolans ATCC-8461-Probeplatten unter Verwendung von 1,25-cm-Pro-bescheiben, die in die zentrifugierten Proben der Brühe eingetaucht wurden. Die Proben werden verdünnt mit 0,2m Phos-55 phatpuffer, pH 7,0, falls erforderlich. Die Ergebnisse werden nachstehend angegeben:

Zeitpunkt der Ernte (Harvest Age hours) h 101 pH 7,2

60 Salmonella gallinarum (mm Zone) 35

Vibrio percolans V10 Verdünnung (mm Zone) 34 890 Probeeinheiten 121

Aus dieser Fermentation werden insgesamt 71 der gesam-65 ten Brühe erhalten und diese werden auf 3 °C abgekühlt und zentrifugiert in 200-ml-Portionen bei 9000 U/min während jeweils 15 Minuten. Zu den vereinten überstehenden Lösungen werden 1,7 ml von 0,1m neutralem EDTA zugegeben und der Ansatz wird auf 3 °C gehalten.

632509

38

Die obengenannte Fermentation wird unter identischen Bedingungen wiederholt mit der Ausnahme, dass die 44 2-1-Erlenmeyer-Kolben mit 7 ml pro Flasche des Wachstums aus den die Kulturen enthaltenden Flaschen beimpft werden; der pH und die erhaltenen Prüfergebnisse werden nachfolgend 5 angegeben:

Zeitpunkt der Ernte (Harvest Age hours) h 101 pH 7,3

Salmonella gallinarum (mm Zone) 38

Vibrio percolans Yw Verdünnung (mm Zone) 39 890 Probeeinheiten 92,8

Insgesamt 7,41 der gesamten Brühe, die aus dieser Fermentation erhalten worden sind, werden auf 3 °C abgekühlt und 15 jeweils 15 Minuten in 200-ml-Portionen bei 9000 U/min zentrifu-giert. Zu den vereinten überstehenden Lösungen gibt man 1,8 ml 0,1m neutrales EDTA.

Das Überstehende von den zentrifugierten Brühen, wie es aus den beiden obengenannten Fermentationen in diesem Bei- 20 spiel erhalten wurde, wird vereint, wobei man ein Gesamtvolumen von 131 erhält.

Die vereinten überstehenden Lösungen werden durch eine Säule aus Dowex-1 x 2 (Cl~), 50-100 Maschen mit einer Bettdimension von 4,7 x 50 cm und einer Fliessgeschwindigkeit von 60 25 ml/min gegeben. Die Säule wird gewaschen mit 11 entionisiertem Wasser und das Antibiotikum wird mit 51 einer 5%igen (Gewicht/Volumen) NaCl-Lösung, enthaltend 0,01m Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, und 25 (iMol EDTA eluiert. Fraktionen von 220 ml werden gesammelt mit einer Fliessgeschwindigkeit von 50 30 ml/min und die Fraktionen werden geprüft gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287-Platten.

Antibiotische Aktivität liegt vor in den Fraktionen 3 bis 26 mit einem Peak bei den Fraktionen 5 und 6. Die Fraktionen 5 bis 9 werden vereint für die weitere Verarbeitung. Der pH der 35 zusammengegebenen Fraktionen ist 10,8 und die zusammengegebenen Fraktionen enthalten 24% der Anfangs-Bioaktivität, gemessen gegenüber Salmonella gallinarum MB-1287-Platten.

Die vereinten Fraktionen 5 bis 9 werden auf 150 ml mittels eines Drehverdampfers unter vermindertem Druck konzen- « triert und auf eine Säule (4,9x47 cm) von XAD-2 gegeben, die vorher gewaschen worden war mit 5160%igem (Volumen/ Volumen) wässrigem Aceton und anschliessend mit 51 entionisiertem Wasser und 5150 g/1 NaCl in entionisiertem Wasser. Die Probe wird in 20-ml-Anteilen angewendet, wobei die Säule 45 auf das Bettniveau jedesmal getränkt wird. Wenn die Anwendung beendet ist, werden drei 20-ml-Portionen von entionisiertem Wasser zugegeben und jedesmal auf das Bettniveau flies-sen gelassen. Die Probe wird eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 20 ml/min. Alle Massnah- 50 men, bei denen die XAD-Säule verwendet wird, werden durchgeführt bei Raumtemperatur (24 °C) und die eluierten Fraktionen werden schnell abgekühlt in einem Eisbad unmittelbar nach dem Sammeln. Fraktionen von 95 bis 230 ml werden gesammelt. 55

Die antibiotische Aktivität erscheint in Fraktionen 2 bis 21, wie aus einer Probe von Salmonella gallinarum MB 1287-Plat-ten gemessen wurde, mit einem Peak bei Fraktionen 5 bis 7 (die 510 bis 895 ml an eluiertem Volumen ausmachen, gerechnet von der ersten Anwendung des entionisierten Wassers). Frak- 60 tionen 6 bis 21 werden zusammengegeben.

Die zusammengegebenen Fraktionen 6 bis 21 werden unter vermindertem Druck auf einem Drehverdampfer auf 68 ml konzentriert und dann durch Zugabe von entionisiertem Wasser auf 112ml verdünnt. Das Konzentrat wird auf eine Säule 65 (2,2x21 cm) von Dowex-1 x4 (Cl~) 400 Maschen gegeben. Die Säule wird mit 20 ml entionisiertem Wasser gewaschen und das Antibiotikum wird eluiert mit 210,07m NaCl + 0,005m NH4CI + 0,0001m NH3 in entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 1,6 ml/min. Es werden Fraktionen von jeweils 8 ml gesammelt. Fraktionen 157 bis 179 haben die grösste Aktivität und werden zusammengegeben.

Diese zusammengegebenen Fraktionen werden konzentriert auf einem Drehverdampfer unter vermindertem Druck auf 7 ml, der pH wird auf 7,5 durch Zugabe von 20 jj.1 Im NaOH eingestellt. Die Lösung wird weiter konzentriert auf 5 ml und auf eine Säule gegeben (2,2 x 75 cm) von Bio-Gel P-2,200 bis 400 Maschen. Die Probe wird in dem Säulenbett mit zwei Waschungen von jeweils 1 ml entionisiertem Wasser gewaschen und eluiert mit entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,6 ml/min. Zehn Fraktionen von 3,3 ml und anschliessend 60 Fraktionen von 2,65 ml und zehn Fraktionen von 2,0 ml werden gesammelt.

Die Fraktionen werden auf den pH-Bereich zwischen 7,5 und 8,0 durch Zugabe von 1,5 bis 2,5 p.10,1m NaOH eingestellt. Die Fraktionen 62,63,64 und 65 werden gefroren und einzeln in 14-ml-Glasröhrchen lyophilisiert und bei -20 °C unter Vakuum aufbewahrt.

Zur Isolierung des Antibiotikums 890Aî aus 890Ai macht man von dem Vorteil Gebrauch der relativ höheren Beständigkeit des Antibiotikums 890A3 gegen Abbau durch Penicillinase in der folgenden Weise:

Bio-Gel Fraktion 63 wird kombiniert mit Fraktionen 61,66 und 67 aus der Bio-Gel-Säule. Zu diesen vier vereinten Fraktionen werden 0,2 ml Im Tris-HCl-Puffer, pH, 7,5, und 0,2 ml Penicillinase (Difco «Bacto-Penase») gegeben. Nach 113 Minuten bei 23 °C werden weitere 0,2 ml Penicillinase hinzugefügt. Nach weiteren 7 Stunden bei Raumtemperatur werden weitere 0,2 ml Penicillinase zugegeben, und nach weiteren 2 Stunden bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch auf einem Eisbad abgekühlt. Das fertige Reaktionsgemisch wird auf 15 ml durch Zugabe von 5 ml entionisiertem Wasser verdünnt.

Das Reaktionsgemisch wird adsorbiert an einer Dowex-1 x 4 (Cl~) 400 Maschen-Säule, Bettdimension 2,15x40 cm. Das Antibiotikum 890A3 wird eluiert mit 0,07m NaCl + 0,005m NH4CI + 0,0001m NH3 in entionisiertem Wasser mit einer Fliessgeschwindigkeit von 3 ml/min. Fraktionen von 13,8 ml werden jeweils gesammelt. Fraktionen 187 bis 200 werden zusammengegeben.

Die vereinigten Fraktionen werden konzentriert auf 4 ml mittels eines Drehverdampfers unter vermindertem Druck und das Konzentrat wird auf eine Säule (2,2x70 cm) Bio-Gel P-2, 200-400 Maschen, aufgegeben. Das Antibiotikum 890A3 wird mit entionisiertem Wasser eluiert mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,6 ml/min. 30 Fraktionen von 3,3 ml und anschliessend 50 Fraktionen von 2,65 ml werden gesammelt.

Fraktionen 66 bis 70 werden vereint und die vereinten Proben werden auf 1,5 ml unter vermindertem Druck mittels eines Drehverdampfers konzentriert und das Konzentrat wird gefroren und gefriergetrocknet, wobei man 5,4 mg eines Feststoffes erhält, der das Antibiotikum 890A3 und restliches Salz enthält. Die N-Acetylgruppe ist abgespalten, wie vorher beschrieben, so dass man die freie Base erhält:

OH

A

I

_N_

\_sch2CH2KH2

IL

cooh

0

Das Antibioticum Thienamycin und seine Herstellung sind beschrieben in DT-OS 25 52 638. Es ist erhältlich durch Züchten des Mikroorganismus Streptomyces cattleya (MA4297), von dem eine Kultur bei der Kultursammlung der Northern Regional Research Laboratories, Northern Utilization Research and Development Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, V.St.A. hinterlegt und mit NRRL 8057 bezeichnet ist.

Claims (5)

632509 PATENTANSPRÜCHE 1. Verfahren zur Herstellung von N-Acylderivaten und phosphorhaltigen N-Acylderivaten des Antibiotikums Thien-amycin der Formel (II) Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; und n null oder 1 bis 4 ist. 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest die folgende Formel aufweist X II SCH2CH2NR1R2 (ii) COOH -C(CH2)nZR~ worin R1 und R2 unabhängig voneinander Wasserstoff, Acyl oder phosphorhaltiges Acyl bedeuten, unter der Massnahme dass R1 oder R2 nicht beide Wasserstoff sind und dass, wenn R1 oder R2 Acetyl bedeutet, R2 oder R1 verschieden von Wasserstoff ist, und deren nicht-toxische, pharmazeutisch annehmbare Salze, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Verbindung der Formel SCH2CH2NH2 COOH (I) worin X O oder S bedeutet; Z Schwefel ist, wobei R5 die Bedeutung hat: Mercapto, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkyl-thio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; und n null oder 1 15 bis 4 ist. 6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest die folgende Formel aufweist X " 6 -C(CH„) ZR 2 n worin X O oder S bedeutet; Z NH ist, wobei R6 die Bedeutung 25 hat: Amino, Hydroxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkyl-thio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; und n null oder 1 bis 4 ist. 7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, 30 dass der Acylrest die folgende Formel aufweist mit einem entsprechenden Acylierungsmittel behandelt und erhaltene Verbindungen der Formel (II) gegebenenfalls in deren nicht-toxische, pharmazeutisch annehmbare Salze überführt.

1 ( s

-P-N(CII3î2 , -PtN(CH3)2]2,

ONa

1.) Amino oder substituiertes Amino:

-N(R")2 und -N©(R9)3

worin die Werte für R9 unabhängig voneinander ausgewählt ■ 5 sind aus: Wasserstoff; N(R'MR' ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); Niedrigalkyl und Nied-rigalkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Niedrigalkoxylnied-rigalkyl, worin die Alkoxylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome-enthält und die Alkylgruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält; 20 Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin die Cycloalkylgruppe 3 bis 6 Kohlenstoffatome und die Alkylgruppe 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält; und zwei R9-Gruppen miteinander verbunden sein können mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Kohlentoffato- 25 men;

2. n

10

50

55

NR

worin R9 die unter 2.) angegebene Bedeutung hat; 4.) Guanyl und substituiertes Guanyl:

-C=NR9 ,

I

N(R9)-

worin R' die unter 2.) (oben) angegebene Bedeutung hat; 60

5.) Stickstoff enthaltende mono- und bicyclische Heterocyc-len (aromatisch und nicht-aromatisch) mit 4 bis 10 Kernkohlenstoffatomen, worin das Heteroatom oder die Heteroatome, zusätzlich zu dem Stickstoffatom ausgewählt sind aus der Gruppe Sauerstoff und Schwefel. 65

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet,

dass R1 Wasserstoff ist und R2 einen Acylrest der folgenden Formel bedeutet worin der Rest -(CH2)„ ZR10 des Acylrestes ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Allylthiomethyl, Phenylthiomethyl, Butylmercaptomethyl, a-Chlorcrotylmercaptomethyl, Pheno-xymethyl, Phenoxyäthyl, Phenoxybutyl, Phenoxybenzyl, Diphe-noxymethyl, Dimethylmethoxymethyl, Dimethylbutoxymethyl, Dimethylphenoxymethyl, 4-Guanidinophenoxymethyl, 4-Pyri-dylthiomethyl, p-(Carboxymethyl)-phenoxymethyl, p-Carboxy-methyl)-phenyIthiomethyl, 2-Thiazolylthiomethyl, p-(Sulfo)-phe-noxymethyl, p-<Carboxymethyl)-phenylthiomethyl, 2-Pyrimidi-nylthiomethyl, Phenäthylthiomethyl, 1-(5,6,7,8-Tetrahydronaph-thyl)-oxymethyl, N-Methyl4-pyridiniumthio, Benzyloxy, Me-thoxy, Äthoxy, Phenoxy, Phenylthio, Amino, Methylamino, Dimethylamin, Pyridiniummethyl, Trimethylammoniummethyl, Cyanomethylthiomethyl, Trifluormethylthiomethyl, 4-Pyridyl-äthyl, 4-PyridyIpropyl, 4-Pyridylbutyl, 3-Imidazolyläthyl, 3-Imi-dazolylpropyl,3-Imidazolylbutyl, 1-Pyrroloäthyl, 1-Pyrrolopro-pyl und 1-Pyrrolobutyl.

12. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass R1 Wasserstoff ist und R2 einen Acylrest der folgenden Formel bedeutet

632509 4

X

" 11 12 —CCHR R

worin die Gruppe -CHR"R12 des Acylrestes ausgewält ist aus s der Gruppe bestehend aus: a-Aminobenzyl, a-Amino-(2-thie-nyl>methyl, a-<Methylamino)-benzyI, a-Amino-methylmercap-topropyl, a-Amino-3- oder 4-chlorbenzyl, a-Amino-3- oder 4-Hydroxybenzyl, a-Amino-2,4-dichlorbenzyl, a-Amino-3,4-di-chlorbenzyl, D(-)-a-Hydroxybenzyl, a-Carboxybenzyl, io a-Amino-(3-thienyl)-methyl, D-(->a-Amino-3-chlor-4-hydroxy-benzyl, a-Amino-<cyclohexyl>methyl, a-(5-Tetrazolyl)-benzyl, 2-Thienylcarboxymethyl, 3-Thienylcarboxymethyl, 2-Furylcar-boxymethyl, 3-Furylcarboxymethyl, a-Sulfaminobenzyl, 3-Thie-nylsulfaminomethyl, a-{N-Methylsulfamino)-benzyl, D-(-)-2- 15 Thienylguanidinomethyl, D-(-)-a-guanidinobenzyl, a-Guanylu-reidobenzyl, a-Hydroxybenzyl, a-Azidobenzyl, a-FIuorbenzyl, 4-(5-Methoxy-l ,3-oxadiazolyl)-aniinomethyl, 4-(5-Methoxy-l ,3-oxadiazolyl)-hydroxymethyl, 4-(5-Methoxy-l,3-sulfadiazolyl)-hydroxymethyl, 4-{5-Chlorthienyl)-aminomethyl, 2-(5-Chlorthie- 20 nyl>hydroxymethyl, 2-{5-Chlorthienyl)-carboxymethyl, 3-( 1,2-Thiazolyl>aminomethyl, 3-(l,2-ThiazoIyl)-hydroxymethyl, 3-(l,2-Thiazolyl)-carboxymethyl, 2-ThiazolylaminomethyI, 2-Thiazo-lylhydroxymethyl, 2-Thiazolylcarboxymethyl, 2-Benzothienyl-carboxymethyl, 2-Benzothienylhydroxymethyl, 2-Benzothienyl- 25 carboxymethyl, a-Sulfobenzyl, a-Phosphonobenzyl, a-Diäthyl-phosphono und a-Monoäthylphosphono.

13. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,

dass R1 Wasserstoff ist und R2 ein Acylrest der folgenden Formel ist 30

oder

O

II

-cch2ch2ch2n (ch3 ) 3

fi

-cch2ch2ch2n(ch3}2

-cch-s-c 2 N

NH.

ch2s-ch2-c

^NH

II //

-cch2-0-ch2Cn

NH

NH,

o nh

Il Ii

■CCH2ch2nhc-ch3

nh I!

Cch2ch2uhc-h o NH

H I

-cch2ch2nhc-nh2

o -!

ch2ch2n(ch3)2

I ®

ch0ch0n(ch_)_ 2 2 y 3

X

NH h ch2ch2c-nh2

o

Ii

NH

Ii

•cch2ch2ch2nhc-ch3

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass R1 Wasserstoff ist und R2 ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Formyl, Propionyl, Butyryl, Chloracetyl, Metho-35 xyacetyl, Aminoacetyl, Methoxycarbonyl, Äthoxycarbonyl, Methylcarbamoyl, Äthylcarbamoyl, Phenylthiocarbonyl, 3-Aminopropionyl, 4-Aminobutyryl, N-Methylaminoacetyl, N,N-Dimethylaminoacetyl, N,N,N-T rimethylaminoacetyl, 3-(N,N-Dimethyl)-aminopropionyl, 3-(N,N,N-T rimethyl)-amino-4o propionyl, N,N,N-Triäthylaminoacetyl, Pyridiniumacetyl, Gua-nylthioacetyl, Guanidinoacetyl, 3-Guanidinopropionyl, N3-Me-thylguanidinopropionyl, Hydroxyacetyl, 3-Hydroxypropionyl, Acryloyl, Propinoyl, Malonyl, Phenoxycarbonyl, Amidinoace-tyl, Acetamidinoacetyl, Amidinopropionyl, Acetamidinopro-45 pionyl, Guanylureidoacetyl, Guanylcarbamoyl, Carboxy-methylaminoacetyl, Sulfoacetylaminoacetyl, Phosphonoacety-laminoacetyl, N3-Dimethylaminoacetamidinopropionyl, Ur-eidocarbonyl, Dimethylaminoguanylthioacetyl, 3-(l-Methyl-4-pyridinium>propionyl, 3<5-Aminoimidazol-l-yl)-propionyl, 50 3-Methyl-l-imidazoliumacetyl, 3-Syndonylacetyl, o-Aminome-thylbenzoyl, o-Aminobenzoyl,

55

fi

~p{och3)2 , -p(och3)2.,

s ii och

~PM)Na ' IN (CH3) 2] 21

2-Äthoxy-l-naphthyl, 3-Carboxy-2-chinoxalinyI, 3-(2,6-Dichlor-phenyl)-5-(2-furyl)4-isoxazolyl, 3-Phenyl-4-isoxazolyl, 5-Methyl-

2.) Amidino und substituiertes Amidino:

-N=C-N(R )

R

30

worin die Werte für R9 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus: Wassertoff; N(R')z (R' ist Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen); 35 Niedrigalkyl und Niedrigalkoxyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen; Niedrigalkoxyniedrigalkyl, worin die Alkoxylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome und die Alkylgruppe 2 bis 6 Kohlenstoffatome enthält (und wenn der Niedrigalkoxyniedrigalkylrest an das Kohlenstoffatom der Alkylgruppe gebunden ist, diese 1 bis 40 6 Kohlenstoffatome enthält); Cycloalkyl und Cycloalkylalkyl, worin der Alkylrest 1 bis 3 Kohlenstoffatome enthält und zwei R9-Gruppen miteinander verbunden sein können mit dem Atom, an welches sie gebunden sind unter Ausbildung eines Ringes mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen; 45

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der N-Acylrest die folgende Formel aufweist

X

II

-C-R ,

worin X O oder S bedeutet und R Wasserstoff, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl ist.

3-(4-guanidinophenyl)-4-isoxazolyl,4-Guanidinomethylphenyl,

3.) Guanidino und substituiertes Guanidino:

-NH-C-N(R9)„

worin bedeuten: R10 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Benzyl, p-Hydroxybenzyl, 4-Amino-4-carboxybutyl, Methyl, Cyanomethyl, 2-Pentenyl, n-Amyl, n-Heptyl, Äthyl, 3- und

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest die folgende Formel aufweist

X

II

-CCHI&*

worin X O oder S bedeutet; R7 die Bedeutung hat H, Amino, Mercapto, Hydroxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, 40 Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; R' die Bedeutung hat Amino, Hydroxy, Azido, Carbamoyl, Guanidino, Acyloxy, Halogen, Sulfamino, Tetrazolyl, Sulfo, Carboxy, Carbalkoxy, Phosphono, Alkoxy oder Arylthio mit der Ausnahme, dass R' und R7 gleichzeitig nicht die Bedeutung Hydroxy, Amino oder 45 Mercapto haben können.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest ausgewählt ist aus den Gruppen, bestehend aus:

50

-C(CH„) ZR 2 n worin X O oder S bedeutet; Z die Bedeutung hat von Carbonyl, wobei R3 die Bedeutung hat: Amino, Mercapto, Hydroxy, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl; und n null oder 1 bis 4 ist.

4-Guanidinomethylbenzyl, 4-Guanidinobenzyl, 4-Guanidino-phenyl, 2,6-Dimethoxy-4-guanidinophenyl, o-Sulfobenzyl, p-Car-boxymethylbenzyl, p-Carbamoylmethylbenzyl, m-Fluorbenzyl, m-Brombenzyl, p-Chlorbenzyl, p-Methoxybenzyl, 1-Naphthyl-methyl, 3-Isothiazolylmethyl, 4-Isothiazolylmethyl, 5-Isothiazo-lylmethyl, Guanylthiomethyl, 4-PyridyImethyl, 5-Isoxazolylme-thyl, 4-Methoxy-5-isoxazolylmethyl, 4-Methyl-5-isoxazolylme-thyl, 1-Imidazolylmethyl, 2-Benzofuranylmethyl, 2-Indolylme-thyl, 2-Phenylvinyl, 2-Phenyläthynyl, 1-Aminocyclohexyl, 2- und 3-Thienylaminomethyl, 2-(5-Nitrofuranyl)-vinyl, Phenyl, o-Me-thoxyphenyl, o-Chlorphenyl, o-Phenylphenyl, p-Aminomethyl-benzyl, l-(5-Cyanotriazolyl)-methyl, Difluormethyl, Dichlorme-thyl, Dibrommethyl, l-(3-Methylimidazolyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Carboxymethylthienyl)-methyl, 2- oder 3<4-Carbamoylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Methylthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Metho-xythienyl>methyl, 2- oder 3-(4-Chlorthienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Sulfothienyl)-methyl, 2- oder 3-(5-Carboxythienyl)-methyl, 3-(l,2,5-Thiadiazolyl)-methyI,3-(4-Methoxy-l,2,5-thiadiazolyl)-methyl, 2-Furylmethyl, 2-(5-Nitrofuryl)-methyl, 3-Furylmethyl, 2-ThienylmethyI, 3-Thienylmethyl, Tetrazolylmethyl, Benzami-dinomethyl und Cyclohexylamidinomethyl.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass R1 Wassertoff bedeutet und R2 einen Acylrest der folgenden Formel darstellt

X

-C (CH

9)ZR

4-Nitrobenzyl, Phenäthyl, ß,ß-Diphenyläthyl, Methyldiphenyl-methyl, Triphenylmethyl, 2-Methoxyphenyl, 2,6-Dimethoxyphe-nyl, 2,4,6-Trimethoxyphenyl, 3,5-Dimethyl-4-isoxazolyl, 3-Butyl-

5-methyl-4-isoxazolyl, 5-Methyl-3-phenyI-4-isoxyzolyl, 3<2-Chlorphenyl)-5-methyl-4-isoxazolyl,3-(2,6-dichlorphenyl)-5-me-thyl-4-isoxazolyl, D-4-Amino-4-carboxybutyl, D-4-N-Benzoyl-amino-4-carboxy-n-butyl, p-Aminobenzyl, o-Aminobenzyl, m-Aminobenzyl, p-Dimethylaminobenzyl, (3-Pyridyl)-methyl,

" 4

-C(CH2)nZR

worin X O oder S bedeutet; Z Sauerstoff ist, wobei R4 die Bedeutung hat: Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aryloxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl,

(O) m

II

-S-Y (Ö)n und

(X) n

II

—P—Y1

II

Y"

55

worin X O oder S bedeutet; m und n unabhängig voneinander 0 oder 1 sind; Y = OeM®. -N(R8)2 oder R8, worin M+ ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkali- und Erdalkalikationen oder einer organischen Base; R8 Wasserstoff, Amino, Mercapto, Hydroxy, 60 Alkylamino, Dialkylamino, Alkyl, Alkylthio, Arylthio, Alkoxy, Aralkoxy, Alkenyl, Alkinyl, Aryl, Aralkyl, Cycloalkyl, Heteroaryl oder Heteroaralkyl ist, Y' und Y" unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus OeM®, -N(R8)2 und R8; und Y' und Y" zusammen verbunden sein kön-65 nen mit dem Phosphoratom, an welches sie gebunden sind, unter Ausbildung eines cyclischen Esters oder Amids.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest die folgende Formel aufweist

632509

O

-c(CH2'm-A-(CH2>n-Y

X

It

-C-R

10

worin m und n 0 oder ganze Zahlen von 1 bis 5 sind; A die Bedeutung hat: O, NR' (R' = Wasserstoff oder Niedrigalkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen), S oder A eine Einfachbindung bedeutet und Y aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist: ">

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Acylrest die folgende Formel aufweist

X

5

632509

S

II

•P-n(cH3)2

ONa