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Verfahren zur Anreicherung von Proteinen in Mais,
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Maniok und anderen stärkehaltigen Produkten durch direkte Fermentation
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von Proteinen durch direkte
und kontinuierliche Fermentation von Produkten, die reich an Stärke und arm an Proteinen
sind.
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Diese Produkte können Getreidekörner sein, wie z.B. Weizen,
Mais,
Gerste, Sorghum, Hirse, Reis oder Hafer, oder Wurzeln von Maniok (Mandioka, Kassava),
Kartoffelknollen, Yamswurzeln usw..
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Ziel der Erfindung ist es, diese Produkte mit Proteinen anzureichern,
damit sie als ein ausgeglichenes Nahrungsmittel direkt für die menschliche und tierische
Ernährung verwendet werden können.
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Insbesondere betrifft die Erfindung die Anreicherung von Proteinen
in Maispulver und Maniokpulver durch direkte Fermentation unter der Wirkung von
ausgewählten Stämmen von Levures Candida Tropicalis, ohne daß es notwendig ist,
diese kohlenstoffhaltigenSubstrate einer vorherigen chemischen oder enzymatischen,
exogenen Hydrolyse zu unterwerfen.
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In zahlreichen Veröffentlichungen sind Verfahren zur Anreicherung
von Proteinen in stärkehaltigen Produkten oder Abfallprodukten, wie Mais oder Kartoffeln
durch Fermentation unter der Wirkung bestimmter Hefepilze, wie CANDIDA UTILIS, TORULA,
PENICILLIUM, FLUSARIUM beschrieben. Diese verschiedenen Verfahren gehen von Produkten
oder Abfällen aus, die Stärke enthalten, und umfassen stets entweder eine saure
Hydrolyse bei einem pH-Wert von etwa 1,8 oder eine enzymatische Hydrolyse, die hervorgerufen
wird durch Amylasen oder ausgewählte
Mikroorganismen welche Amylasen
erzeugen, wie z.B. ASPERGILLUS NIGER, RHIZOPUS, ENDOMYCES, ENDOMYCOPSIS FIBULIGER,SACCHAROMYCES
DIASTATIUS, wie die folgenden Literaturstellen beweisen: 1. E.R. KOOI and F.C. Armbruster,
Production and Use of Dextrose (Gewinnung und Verwendung von Dextrose), STARCH:
Chemistry and Technology, Bd. II, S. 553, Academic Press 1967 (Stärke: Chemie und
Technologie, Bd. 2).
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2. Kurl JARL, Utilisation of Waste materials by fermentation (Nutzung
von Abfällen durch Fermentation).
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71 Socker-Handlingar, Bd. 25 (1971) No. 2, S. 4-11.
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3. Anna IKONOMOVA, Use of waste products from the Starch and Glucose
Industry for the production for feed purposes (Verwendung von Abfällen der Stärke-
und Glukoseindustrie in der Ernährung).
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ZKIVOTNOVUDNI NAUK 9 (7) 21 28 (1972).
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4. F. DESCHIMPS et F. MEYER (Institut National de Recherche Chimique
Applique).
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FR-PS 74 315 89, 18 September 1974.
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5. K. JAROSZ and al. Fermentation de matieres premieres amidonnees.
PRACE INSTITUT: IAB. BAD. PRZEM. SPOZ (1974) 24, 1 S. 7-16.
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Andererseits ist die Fermentation von Maniok, einem anderen stärkehaltigen
Produkt, bisher diskontinuierlich durchgeführt worden, sei es mit Maniok in Form
eines feuchten Feststoffs, sei es mit Maniok in Suspension, unter der Wirkung nicht
von Hefen, sondern von Pilzen vom Typ RHIZOPUS, NEUROSPORA, ASPERGILLUS, MUCOR,
wie die folgenden Literaturstellen beweisen: 6. W.R. STANZEN and A J. WALLBRIDGE
(the SECRETARY of STATE for DEFENSE), GB-PS 1 277 002.
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7. W.E. TREVELYAN, Trop. Sci. 16,4 (1974): The enrichment of CASSAVA
with proteins by moist solid fermentation (Anreicherung von Proteinen in Maniok
durch Fermantation des feuchten, festen Produkts).
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8. A.E. READE and K.F. GREGORY. Appl. Microb. Bd. 30, N. 6 897, Dez.
1975= High temperature production of proteins enriched feed of CASSAVA by Fungi
( Hochtemperaturgewinnung von Nahrungsmitteln aus Maniok, das durch Pilze mit Proteinen
angereichert ist).
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9. K.F. GREGORY and al. FOOD TECHNOLOGY, Bd. 30, N. 3, 30.
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März 1976' Conversion of CARBOHYDRATES to PROTEINS by HIGH TEMPERATURE
FUNGI (Umwandlung von Kohlehydraten in Proteine durch thermophile Pilze).
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Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich von bekannten Verfahren
dadurch: - Das Ausgangsmaterial ist ein Pulver oder Mehl, das reich an Stärke ist
und als Suspension vorliegt, - die Fermentation verwendet anstelle von fasrigen
Pilzen Hefen, von denen man weiß, daß ihr Proteingehalt höher und ihre Wachstumszeit
kürzer ist, insbesondere Hefen vom Typ TROPICALIS, die sehr lebenskräftig sind,
sich auf zahlreichen kohlenstoffhaltigen Substraten entwickeln'und deren Ungefährlichkeit
sich in zahlreichen Lebensmitteltests erwiesen hat (Arch. Mikrobiol. 72 . 135 -
139: 1970), - die Hefe wird direkt in dem Nährmedium angewandt, welches das Pulver
als homogene Suspension enthält, ohne vorherige Hydrolyse,
- die
Fermentation wird in einer kontinuierlichen Kultur bei kontrolliertem Verdünnungsgrad
durchgeführt, welcher bei kontrollierten Temperatur- und pH-Werten die Entwicklung
der Hefe und die Anreicherung des Produkts derart beeinflußt, daß die Ausbeute bei
diesem Verfahren derjenigen von bekannten Fermentationen, die diskontinuierlich
durchgeführt werden, überlegen ist, - die Fermentation wird nicht bis zur Erschöpfung
des kohlenstoffhaltigen Substrats getrieben, sondern so durchgeführt, daß ein Gemisch
aus trockenem Substratrückstand und Hefen erhalten wird, welches einen Proteingehalt
von über 15% aufweist, - das gewonnene Produkt ist nach dem Trocknen ein angereichertes
Mehl, welches>15% Proteine enthält und für den menschlichen oder tierischen Verzehr
geeignet ist.
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Gemäß einer ersten Ausführungsform der Erfindung besteht das Verfahren
zur Anreicherung von Proteinen in dem Pulver aus 4 wesentlichen Stufen: 1. Auswahl
von Stämmen von CANDIDA TROPICALIS zur Verwendung in dem Gärbehälter.
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2. Zerkleinerung der Maiskörner, Maniokschnitzel oder anderen stärkehaltgn
Produkte und Suspendierung derselben.
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3. Direkte und kontinuierliche Fermentation.
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4. Abtrennung und Trocknung des Produkts, das aus der Biomasse und
dem restlichen Mais, Maniok oder anderen Ausgangsmaterial besteht.
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Auswahl der Stämme Ein wesentliches Merkmal der Erfindung besteht
in der Auswahl der für die Fermentation erforderlichen Mikroorganismenkultur, in
deren Verwendung bei dem Verfahren und in deren Wiedergewinnung.
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Ausgehend von Stämmen von CANDIDA TROPICALIS (CT 101) hat man Klone
aus Nährmedien isoliert, die als einzige Kohlenstoffquelle lösliche Stärke enthalten.
Sie wurden unter den Nummern CT 1001 - CT 101/1 - CT 101/9 und CT 101/AR registriert.
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Außer löslicher Stärke enthält das Nährmedium Mineralsalze, Oligoelemente,
Wachstumsfaktoren in Form von Hefeextrakten und eine ammoniakalische Stickstoffquelle
in folgenden Mengenverhältnissen:
S04Mg, 7 H20 2 g NaCl 1g WH4Cl
25 g KH2P04 70 g Lösung von Oligoelementen 100 ml (Fe - Ni - Co - Cu) Hefeextraktmit
der Bezeichnung DIFCO 1 g.
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Es wurde gefunden, daß der Stamm CT 1001 sich auf löslicher Stärke
in einer diskontinuierlichen Kultur mit einer Gewich:tsausbeute von 46 g Zellen
(Trockengewicht) auf 100 g verwendeter Stärke entwickelt, was einer Ausbeute von
46% und einem Wachstumsgrad von 0,75 pro Stunde entspricht.
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Die optimalen Entwicklungstemperaturen liegen zwischen 30 und 390C;
oberhalb von 4OOC ist ein Wachstum nicht möglich.
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Unter diesen Bedingungen stellt der Ammoniak oder das NH4-Ion die
Stickstoffquelle dar. Das pH-Gebiet, welches die beste Entwicklung ermöglicht, liegt
zwischen 4 und 6 und vorzugsweise zwischen 4,5 und 5,5. Die beiden Wachstumsparameter,
Ausbeute und Wachstumsgrad, variieren nur wenig in Abhängigkeit von der Substratkonzentration
in dem Kulturmedium, wenn die Belüftungsbedingungen vollkommen sind, und dies bis
zu einer Stärkekonzentration von 8 g /1.
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Unter experimentellen Bedingungen, welche die Entwicklung auf Stärke
ermöglichen, wurde gefunden, daß das Kohlenstoffmillieu nur eine sehr geringe Menge
an Glucose enthält, die durch Hydrolyse der Stärke freigesetzt worden ist und etwa
1% ausmacht. Man darf hieraus schließen, daß dieser Hefestamm sich direkt auf Stärke
entwickelt und nicht auf den vorher freigesetzten Hydrolyseprodukten.
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Die 3 anderen Stämme von CANDIDA TROPICALISadie mit dem Stamm CT 101
als Ausgangsmaterial ausgewählt wurden, verhalten sich wie der Stamm CT 1001.
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Im Vergleich hierzu liegt bei Glucose als einziger Kohlenstoffquelle
die Wachstumsausbeute von CANDIDA TROPICALIS zwischen 50 und 55% mit einem Wachstumsgrad
von 0,80 pro Stunde.
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Zerkleinerung und Suspendierung Die Maiskörner oder Maniokschnitzel
oder anderen stärkehaltigen Produkte werden in einem gewöhnlichen Zerkleinerer,
z.B. einem Zerhacker derart zerkleinert, daß ein Pulver oder Mehl erhalten wird,
dessen Korngröße 1 mm nicht übersteigt und unter 100 Mikron liegen kann.
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Die zerkleinerten Maiskörner werden in einer 1 N Schwefelsäurelösung
suspendiert. In dieser Stärke verursacht die
Säure nur eine vernachlässigbar
geringe Hydrolyse der in dem Maispuder enthaltenen Stärke. Der Gärbehälter wird
mit der homogenisierten Suspension so beschickt, daß die Konzentration des Maispulvers
zwischen 2 und 200 g pro Liter liegt.
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Die zerkleinerten Maniokschnitzel können direkt in den Gärbehälter
gegeben werden, ohne vorher suspendiert worden zu sein.
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Fermentationsbeispiel Die Züchtung erfolgt in einem kontinuierlichen
Gärbehälter mit einer nutzbaren Kapazität von 4 1, wobei die folgenden Parameter
eingehalten werden: - Temperatur: 32 0C - Rührbewegung: Lebhaft - Belüftung: 30
V/V h (Volumen Luft pro Volumen Medium pro Stunde) - pH-Wert: eingestellt auf 5,1
durch kontinuierliche und kontrollierte Zugabe von # O NaOH - Durchsatz F am Eingang
und am Ausgang des Reaktors zugleich kontrolliert und auf folgende Werte eingestellt:
Im Falle von Mais 0,2 1 pro Stunde und 0,4 pro Stunde äe nach der Versuchsart. Im
Falle von Maniok 1 1 pro Stunde und 1,5 1 pro Stunde.
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- Verdünnungsgrad demnach=0,05 pro Stunde bis 0,1 pro Stunde für Mais
und 0,25 pro Stunde bis 0,37 pro Stunde für Maniok (nutzbares Volumen des GärbehBters:
4 1).
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Das Nährmedium wird, bevor es in den Gärbehälter eingegeben wird,
eine Stunde bei 1100C sterilisiert.
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Das Inokulum besteht aus 1 1 Kulturmedium, welches lösliche Stärke
enthält, die zuvor mitiem Stamme von CANDIDA TROPICALIS CT 1001 beimpft worden ist,
der in der Mehrzahl der beschriebenen Versuche verwendet wurde, und wird 24 Stunden
so inkubiert, daß es vor seiner Verwendung eine optische Dichte von 1,2 Zellkonzentrationseinheiten
aufweist (bestimmt durch Nephelometrie bei 450 nm und berechnet mit Hilfe von Vergleichskurven).
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Die Maissuspension wird in ständiger, heftiger Bewegung gehalten und
in den Gärbehälter unter möglichst vollkommenen Homogenitätsbedingungen eingeführt,
damit ein guter Kontakt zwischen Substrat und Mikroorganismus erreicht wird und
ein wirksamer Abbau des verwendeten Kohlenstoffsubstrats erzielt wird.
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Im Falle der Verwendung von Maniok wird das Maniokmehl direkt in den
Gärbehälter gegeben, ohne vorher suspendiert worden zu sein.
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Abtrennung des Produkts Die Gewinnung des Produkts erfolgt durch
Zentrifugieren, Trocknen bei 600C und Umwandeln in ein Pulver, an welchem die Analysen
vorgenommen werden ( C, N, Stärke, Proteine).
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Beispiel für die Proteinanreicherung in Mais Die nachstehenden Beispiele
für die Anreicherung in Mais sollen die Erfindung nicht begrenzen. Vier Versuchsreihen
wurden durchgeführt mit Durchsätzen F von 0,2 und 0,4 1 pro Stunde. Die Ergebnisse
sind in Stabile 1 zusammengefaßt.
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Tabelle 1 Beispiele Zeitpunkt Probe Trockengew. % % Entnahme gewonnene
Stickstoff Prote- zurück-Biomasse ine ge -wonnene Biomasse Nummer 1 Medium enthält
2g/l Maispulver O h 5 ml 10 mg 1,4 8,8 -F:0,2 l/hr 11 h 5 ml 8,5 mg 2,7 17 F: 0,4
l/hr 16 h 5 ml 8,2 mg 3,8 23 20 h 5 ml 7,6 mg 2,7 17 Ende der 10 1 14,8 g 3,4 21
74 Zucht Nummer 2 Medium ent- Ende der hält 2 g/l Züchtung 4 1 4,76 g 3,8 24 60
Maispulver F: 0,2 l/hr Nummer 3 wie oben Ende der Züchtung 5 1 5,93 g 3,7 23 59
Nummer 4 Medium enthält 1 g/l Maispulver Ende der Züchtung 8,5 1 5,42 g 3,2 20 64
Tabelle 1 läßt erkennen, daß ein Teil des Maispulvers in tiefe umgewandelt worden
ist. Der Gehalt der gewonnenen Biomasse an Proteinen wird aus dem Stickstoffgehalt
berechnet, der nach der Methode von Nessler nach Mineralisierung der Zellen bestimmt
wurde.
Er liegt in der Größenordnung von 20%. Zum Vergleich hierzu: Der Proteingehalt von
Hefen (CT 1001), die normal auf Glucose oder löslicher Stärke gezüchtet wurden,
liegt bei 50 - 60% . Die Bilanz der Fermentationsergebnisse weist einen Verlust
an Trockensubstanz in der Größenordnung von 20 - 40%, je nach den Versuchsbedingungen,
und einen Gehalt an Proteinen aus, der von 8 - 9 % beim Ausgangsmais bis zu Werten
zwischen 20 und 24% beim trockenen Endprodukt reicht.
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Bei einem Durchsatz F von 0,4 l pro Stunde entspricht die gewonnene
Biomasse etwa 70 % des eingesetzten Maispulvers bei Proteingehalten zwischen 18
und 20 %. Indem man auf den Verdünnungsgrad einwirkt, kann man die Proteingehalte
des Gemisches ebenso variieren wie den Rückgewinnungsgrad des Gemisches nach der
Umwandlung.
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Die Tabelle 2 gibt eine Vergleichsanalyse zwischen dem Ausgangsmais
und dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren angereicherten Mais.
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Tabelle 2 Zerkleinerter durch Fermentation Ausgangsmais angereicherter
Mais Feuchtigkeit 10,0 fO 10,0 % Stickstoff 1,4 ffi 3,3 % Proteine 8,75 20,6 % Kohlenstoff
42,1 % 40,8 ffi Stärke 66,0 % 44,7 % Lysin 3,3 % 6,8 % Methionin 2,2 % 2,9 % Cystin
1,9 % 2,6 % Beispiel für die Anreicherung in Maniok Die nachstehenden Beispiele
für die Proteinanreicherung in Maniok sollen die Erfindung nicht begrenzen. In der
nachstehenden Tabelle 3 sind die Ergebnisse zusammengefaßt, die bei 2 Fermentationsversuchen
bei Durchsätzen F von 1 und 1,5 1/hr, entsprechend Verdünnungsgraden D (und Wachstumsgraden)
von 0,25 und 0,37 / hr, mit einer Suspension von 10 g Maniok pro Liter in den Gärbehälter
erzielt worden sind.
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Tabelle 3 Beispiele Zeitpunkt Probe Trockengewicht % der Ent- d. gewonnenen
Stick- Proteine rückgenabme Biomasse stoff wonnene Biomasse Nummer 1 F: 1,51/hr
Ende der 10 g/l Züchtung 5 1 5,6 g 2,7 16,9 56 Mani ok 5 51 5,6 g 2,7 16,9 16,9
56 Nummer 2 F: 1 1/hr 10 g/l Ende der Maniok Züchtung 5 l 4,2 g 3 18,8 42 Wie diese
Tabelle erkennen läßt, wird das Maniokpulver vollkommener umgewandelt als das Maispulver.
Der Prozentsatz der rückgewonnenen Biomasse ist geringfügig kleiner bei einem Proteingehalt,
der etwa 3-18 ffi übersteigt, wobei die Menge der Zelle zwischen io10 und 1011 pro
Liter Kultur liegt.
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Die Tabelle 4 gibt eine Vergleichsanalyse zwischen dem Ausgangsmaniok
und dem nach dem erfindungsgemäßen Verfahren angereicherten Maniok.
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Tabelle 4 Aus gangsmaniok angereichertes Maniok Stickstoff 0,5 % 3
% Proteine 3,1 % 18 % Lysin 1,1 % 7,7 % Methionin 0,7 % 2,7 ffi Cystin 0,5 % 2 ffi
Das Verfahren In der Zeichnung ist die Vorrichtung für die kontinuierliche Fermentation
schematisch dargestellt.
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Die Maiskörner gelangen in den Zerkleinerer 1, um zu einem feinen
Pulver zerkleinert zu werden, welches mittels der Förderschnecke 2 in den Behälter
3 gelangt, in welchem die Suspension zubereitet wird. Dieser Behälter 3 wird ebenso
wie der Gärbehälter 4 über die Leitung 5 mit Wasser beschickt.
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Die Suspension wird in den Gärbehälter 4 transportiert, der mit einem
kräftigen mechanischen Rührer 6 ausgerüstet ist.
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Der Gärbehälter wird aus dem Behälter 7 über die Leitung 8 mit einem
mineralischen Medium beschickt. Er kann durch Zirkulation einer Kühlflüssigkeit
in seinem Doppelmantel gekühlt werden. Das Fermentationsprodukt wird bei 9 abgezogen,
bei 10 zentrifugiert und bei 11 getrocknet. Das an Proteinen angereicherte Maismehl
wird bei 12 gelagert.
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Das aus der Zentrifuge austretende Wasser wird über 13 in den Gärbehälter
zurückgeleitet. Die für die Fermentation erforderliche Luft wird mittels eines Kompressors
14 und über ein Filter 15 eingeführt.
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Im Falle der Verwendung von Maniok kann der Behälter 3 für die Zubereitung
der Suspension weggelassen und das Maniokpulver direkt in dem Gärbehälter eingeführt
werden.
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Das Produkt Die Erfindung umfaßt auch das Produkt, das nach dem vorstehend
beschriebenen Verfahren erhalten wird, sowie seine Verwendung als Mais- oder Maniokmehl,
welches an Proteinen angereichert ist und direkt in der menschlichen und tierischen
Ernährung verwendet werden kann.
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Das angereicherte Maismehl enthält mehr als 15 % Proteine, genauer:
Von 15 - 30 Gew.% Proteine. Dieses Mehl besteht aus einem Gemisch, welches 70 -
90 Gew.% Mais, der an Stärke verarmt und aus diesem Grunde an Proteinen angereichert
ist, und 10 - 30 Ges.% Hefen enthält, welche an Proteinen angereichert sind, die
aus der Fermentation der Stärke stammen.
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Desgleichen enthält das angereicherte Maniokmehl mindestens 15 % Proteine;
genauer: 15 - 30 Gew.% Proteine. Dieses Mehl
besteht aus einem
Gemisch, welches 60 - 80 Gew.% Maniok, das an Stärke verarmt und infolgedessen an
Proteinen leicht angereichert ist, und 20 - 40 Gew.% Hefen enthält, welche an Proteinen
angereichert sind, die aus der Fermentation der Stärke stammen.