JP2021137001A - 高蛋白質菜種ミールの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】産業的に価値のあるエタノールを産生し、栄養特性に優れた高蛋白質菜種ミールを同時に製造する高蛋白質菜種ミールを製造方法において、エタノールの産生能を高め、蛋白質比率を改善することである。【解決手段】菜種ミールと水を混合し、得られた混合物に糖化処理とアルコール発酵処理を行い、前記糖化処理のために繊維質分解酵素を添加し、前記アルコール発酵処理のために微生物を添加する、高蛋白質菜種ミールの製造方法において、前記繊維質分解酵素としてアクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼを用いる。【選択図】図１

Description

本発明は、高蛋白質菜種ミールの製造方法に関する。

菜種や大豆等の油糧種子から油分を取り除いた後に残った搾り粕は、蛋白質供給源として主に飼料用に利用されている。しかし、菜種の搾り粕である菜種ミールは、大豆ミールと比べて蛋白質含量が少なく、繊維質を多く含むため家畜に対するエネルギー価が低いという欠点を有している。

かかる欠点を解決する方法として、菜種ミール中の蛋白質含量を増加させる方法がいくつか提案されている。例えば、菜種ミールを篩で分別して蛋白質含量の多い画分と少ない画分に分画する方法が開示されているが、低蛋白質画分は飼料価値が低く、利用範囲が限られる（特許文献１）。また、菜種を脱皮した後に搾油し菜種ミールを回収する方法が開示されているが、粒径の小さい菜種を脱皮するこの方法は高コストになり現実的でない（非特許文献１）。さらに、菜種ミールと水を混合し、糖化処理および／又はアルコール発酵処理した物を固液分離、乾燥する、高蛋白質低グルコシノレート菜種ミールの製造方法も開示されているが（特許文献２）、エタノール産生能などにおいてはさらなる改良が望まれていた。

特許第３９７０９１７号公報 特許第５６０１７６３号公報 Ｗ. Ｇｒａｌａ, ｅｔ ａｌ.，Ｉｌｅａｌ ａｐｐａｒｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｄｉｇｅｓｔｉｂｉｌｉｔｉｅｓ ａｎｄ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｌｏｓｓｅｓ ｉｎ ｐｉｇｓ ｆｅｄ ｓｏｙｂｅａｎ ａｎｄ ｒａｐｅｓｅｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ ｓｃｉｅｎｃｅ, ７６， ｐ．７６９−ｐ．５７７ （１９９８）

本発明の課題は、産業的に価値のあるエタノールを産生するとともに、栄養特性に優れた高蛋白質菜種ミールを同時に製造することのできる高蛋白質菜種ミールを製造方法において、エタノールの産生能を改善することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために、鋭意検討を重ねた結果、糖化処理に使用する繊維質分解酵素として、アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼを用いることにより、エタノールの産生能を高められることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、具体的には、本発明は以下の態様を含み得る。
〔１〕菜種ミールと水を混合し、得られた混合物に糖化処理とアルコール発酵処理を行い、前記糖化処理のために繊維質分解酵素を添加し、前記アルコール発酵処理のために微生物を添加する、高蛋白質菜種ミールの製造方法において、前記繊維質分解酵素としてアクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼを用いることを特徴とする、高蛋白質菜種ミールの製造方法。
〔２〕前記アルコール発酵処理において、菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりから得られるエタノール産生量が３．５ｇ以上であることを特徴とする、〔１〕に記載の方法。
〔３〕前記菜種ミール４０〜６０重量部と水６０〜４０重量部を混合することを特徴とする、〔１〕または〔２〕に記載の製造方法。
〔４〕前記糖化処理とアルコール発酵処理を同一工程で行うことを特徴とする、〔１〕ないし〔３〕のいずれか１項に記載の製造方法。
〔５〕前記同一工程を２５〜４５℃で行うことを特徴とする、〔４〕に記載の製造方法。
〔６〕前記糖化処理とアルコール発酵処理を別々の工程で行うことを特徴とする、〔１〕ないし〔３〕のいずれか１項に記載の製造方法。
〔７〕前記糖化処理を４０〜６０℃で行い、前記アルコール発酵処理を２０〜４０℃で行うことを特徴とする、〔６〕に記載の製造方法。
〔８〕前記糖化処理及び／又はアルコール発酵処理を行う前に、菜種ミールと水の混合物を滅菌処理しないことを特徴とする、〔１〕ないし〔７〕のいずれか１項に記載の製造方法。
〔９〕前記アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼが、アクレモニウム・セルロティカス（Acremonium cellulotycus）が産生するセルラーゼであることを特徴とする、〔１〕ないし〔８〕のいずれか１項に記載の製造方法。
〔１０〕前記〔１〕〜〔９〕のいずれか1つに記載の製造方法で製造された高蛋白質菜種ミールを含有する飼料。

本発明を実施することで、エタノールと同時に高蛋白質菜種ミールを製造することができる。これにより、家畜に対するエネルギー価を高くすることができる。さらにエタノールも高い収率で回収することができる。このようにして得られたエタノールはバイオエタノールとして様々な用途に使用される。さらに、糖化処理とアルコール発酵処理を同一行程で行ってもそれぞれ別々に行っても、高温またはアルコールによる静菌効果が働いて、これまで必要であった滅菌処理（オートクレーブ処理等）を省略できるので、従来よりも簡便な方法で高蛋白質菜種ミールを製造することができる。また、本発明で固体発酵法を用いると、廃液を出さずに済むので、環境にやさしい、高蛋白質菜種ミールの製造方法とすることができる。

菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりのエタノール産生量（中規模試験）を示す図（７日目ないし１３日目）である。 菜種ミールの各成分（タンパク質、総炭水化物、セルロース）とタンパク質／炭水化物比の変化（中規模試験）を示す図（発酵前〜１０日目ないし１３日目）である。 高濃度である種々の繊維質分解酵素を用いた場合における、菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりのエタノール産生量（小規模試験）を示す図である。高蛋白質低グルコシノレート菜種ミールの製造 糖化処理と発酵処理とを分けた場合における、糖化処理の至適温度（小規模試験）を示す図である。 糖化処理と発酵処理とを分けた場合における、アルコール発酵処理の至適温度（小規模試験）を示す図である。 種々の酵母を用いた場合における、菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりのエタノール産生量（小規模試験）を示す図である。高蛋白質低グルコシノレート菜種ミールの製造高蛋白質低グルコシノレート菜種ミールの製造高蛋白質低グルコシノレート菜種ミールの製造高蛋白質低グルコシノレート菜種ミールの製造

（菜種ミール）
菜種ミールとは、菜種を圧搾機により抽出し、続いて、圧搾粕に残された油分をｎ−ヘキサンなどの有機溶剤を用いて抽出する搾油工程を経た後、有機溶剤を蒸発させてできた菜種粕のことであり、水分を８〜１５質量％含むものである。

（水、その他の添加物）
本発明における水とは特に限定されるものではなく、例えば蒸留水、純水、水道水いずれであっても構わない。糖化処理又はアルコール発酵処理前に、菜種ミールと水を混合する場合、菜種ミール４０〜６０重量部と水６０〜４０重量部、好ましくは、菜種ミール４５〜５５重量部と水５５〜４５重量部、さらに好ましくは菜種ミール４８〜５２重量部、水５２〜４８重量部の割合で混合すればよい。このような水分量であれば、固体発酵法になるので好ましい。ここで、「固体発酵法」とは、液体発酵法よりも水分が低く設定され、発酵期間中のみならず発酵終了後も廃液がほとんど排出されない発酵方法をいう。

糖化処理およびアルコール発酵処理前の菜種ミールと水の混合物１００重量部に対しミネラル、糖、アミノ酸、培地成分、酵素、微生物等の添加物を０〜１０重量部加えても良い。ミネラルの具体例としては、リン、マグネシウム、ナトリウム、カリウム、鉄等が挙げられる。糖の具体例としては、ショ糖、ブドウ糖、麦芽糖、オリゴ糖等が挙げられる。アミノ酸の具体例としては、グルタミン酸、リジン等が挙げられ、蛋白質の構成アミノ酸やＧＡＢＡ等非構成アミノ酸、蛋白質の加水分解物でも良い。培地成分の具体例としては、酵母エキス、麦芽エキス、ペプトン等が挙げられる。
糖化処理のための酵素の具体例としては、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、グルコシダーゼ又はこれらの混合物が挙げられる。本発明の糖化処理においては、前記セルラーゼ（繊維質分解酵素）の１種として、アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼ、特に、アクレモニウム・セルロティカス（Acremonium cellulotycus）が産生するセルラーゼＦ（製品名：明治アクレモニウムセルラーゼF、Meiji Seikaファルマ株式会社製）、アクレモニウム・セルロティカス（Acremonium cellulotycus）が産生するセルラーゼKM（製品名：アクレモニウムセルラーゼKM、協和化成株式会社製）が用いられる。本発明においては、アクレモニウム・セルロティカス（Acremonium cellulotycus）が産生するセルラーゼを用いることが好ましい。後述するように、これらアクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼを用いることにより、エタノール産生能が改善されることが本発明ではじめて見い出された。
アルコール発酵処理のための微生物の具体例としては、糸状菌、Saccharomyces cerevisiae、Shizosaccharomyces pombe、Pichia stipitis等の酵母、Zymomonas mobilis等が挙げられる。本発明のアルコール発酵処理には、Saccharomyces cerevisiae等の酵母を用いることが好ましく、特に固体発酵法に用いることができる酵母が好ましい。
なお、以下、水もしくは水とこれらの添加物を併せて「水等」と言う。これら添加物のうち水溶性のものは前記水に可溶化して加えても良い。

（混合）
本発明における菜種ミールと水等との混合とは、菜種ミールと水等を手動もしくは装置で混ぜ合わせることを言う。混合後の固形分中の水分の分布は均一であるほど糖化処理あるいはアルコール発酵処理の効率が良いので望ましいが、固形分中の水分分布に偏りがあっても糖化あるいはアルコール発酵の目的は達成される。一般的には、菜種ミールと水等を加えた混合物は、糖化処理中又はアルコール発酵中、所望の微生物以外の微生物の繁殖を防ぐため、オートクレーブにて滅菌することが望ましいと考えてきたが、本発明により、糖化処理やアルコール発酵処理の前の滅菌処理が省略できることがわかった。

（糖化処理）
本発明における糖化処理とは、菜種ミールに含まれる繊維質（セルロース等）に繊維質分解酵素を、菜種ミールと水等を加えた混合物に対して０．０１〜１．０重量％添加し、菜種ミールに含まれる繊維質をグルコースへと分解することを指す。糖化処理に使用する繊維質分解酵素は、セルラーゼ単独若しくは、セルラーゼにヘミセルラーゼやグルコシダーゼなどの酵素を組み合わせて使用することができるが、本発明においては、アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼを使用することが必須である。前記セルラーゼの使用量は、菜種ミールと水等を加えた混合物に対して０．０１〜１．０重量％添加することが好ましい。また、０．０５〜１．０重量％添加することがより好ましく、０．１〜１．０重量％添加することがさらに好ましい。それ以外に糖化処理に用いる酵素は繊維質を分解できるものであれば良く、市販品であっても、糸状菌を培養した培養液やそれを更に精製したものであっても、糸状菌そのものであっても良い。

（アルコール発酵処理）
本発明におけるアルコール発酵処理とは、菜種ミールと水等を加えた混合物又は菜種ミールと水等を加えた混合物の糖化処理した物に微生物を接種し、微生物によりエタノールを産生する工程のことをいう。使用する微生物については、酵母ではSaccharomyces cerevisiaeや、Shizosaccharomyces pombeや、Pichia stipitisを用いることができ、酵母以外では、アルコール発酵が可能な細菌であるZymomonas mobilisなど、アルコール発酵が可能な微生物であれば、遺伝子組み換えをされたものも含めて、何でも使用できる。微生物は、スラントや凍結などで保存されているものを使用しても良いが、S. cerevisiaeを用いる場合は市販のパン酵母を用いても良い。スラントや凍結などで保存されているものを用いる場合は、使用する前に液体培地で前培養し、前培養液等を使用することが望ましい。前培養に用いる液体培地は、１質量％酵母エキス、２質量％ペプトン、３質量％グルコースのような、酵母又は細菌の培養に適しているものであれば良い。
本発明において、アルコール発酵処理に用いる微生物としては、Saccharomyces cerevisiae等の酵母を用いることが好ましく、特に固体発酵処理に用いることができる酵母が好ましい。また、前記酵母の使用量は、６６０ｎｍで測定したときの吸光度（以下、ODという。）が０．２となるように調製した酵母懸濁液を、総反応系（酵母（懸濁液）＋ミール＋添加水）における酵母の存在量が、OD＝０．０５〜０．１５となるように添加することが好ましい。また、OD＝０．０５〜０．１となるように添加することがより好ましい。

（同一工程または別々の工程で行う場合）
糖化処理およびアルコール発酵処理は、酵素や微生物を菜種ミールと水等を加えた混合物に加え、糖化と発酵を同一の工程で行う場合（「併行複発酵」という。）、処理温度は、２５〜４５℃で行うことが好ましく、２７〜４３℃で行うことがより好ましく、３０〜４０℃で行うことがさらに好ましい。また、糖化と発酵を別々の工程で行う場合、糖化温度は、４０〜６０℃で行うことが好ましく、４２〜５８℃で行うことがより好ましく、４５〜５５℃で行うことがさらに好ましい。一方、発酵温度は、２０〜４０℃で行うことが好ましく、２２〜３８℃で行うことがより好ましく、２５〜３５℃で行うことがさらに好ましい。
全体の処理時間は、好ましくは４時間〜３３６時間であり、より好ましくは２４〜７２時間であり、さらに好ましくは２４〜７２時間であり、殊更好ましくは２４〜７２時間である。

（固液分離後、乾燥および蒸留）
菜種ミールと水を混合し糖化処理とアルコール発酵処理を行った物を、必要に応じて固液分離し、乾燥する。この結果得られるものを高蛋白質菜種ミールと言う。乾燥は乾熱乾燥、真空乾燥、凍結乾燥、スプレードライ等、該混合物の糖化処理および／又はアルコール発酵処理した物の水分及びエタノールを蒸発させられるものであればよい。乾燥前に、水蒸気蒸留等によりエタノールを回収すれば、回収したエタノールは工業用又は燃料用として利用することができる。
本発明におけるエタノール産生量は、菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりから得られるエタノール産生量が３．５ｇ以上となることが好ましく、３．８ｇ以上となることがより好ましく、４．０ｇ以上となることがさらに好ましい。
前記糖化処理とアルコール発酵処理を固体発酵法で行うことが好ましい。固体発酵法を用いると、上記した固液分離は不要となり、廃液が出ないので好ましい。

（高蛋白質菜種ミール）
本発明における高蛋白質菜種ミールとは、菜種ミールを糖化処理およびアルコール発酵処理して得た高蛋白質菜種粕処理物であり、乾燥重量換算で４４〜６５質量％の蛋白質を含むものであり、好ましくは４７〜６５量％含むものである。
なお、ここでいう蛋白質含有量は、ケルダール法で求めた全窒素に６．２５を乗じた値を指す。
本発明の製造方法により製造された高蛋白質菜種ミールを使用した配合飼料は、雛の発育や健壊状態に悪影響を及ぼす懸念はなく、飼料として問題なく使用することができる。

（飼料）
本発明の製造により得られた高蛋白質菜種ミールは、糖分、蛋白質、アミノ酸、繊維分、ミネラル、油分、抗菌成分等を含んだ飼料原料や飼料添加物と混合して、飼料として使用することができる。
飼料原料や飼料添加物の具体例としては、とうもろこし、ソルガム、コーングルテンフィールド、コーンスターチ、米ぬか、大豆ミール、通常の菜種ミール、フスマ、エンバク、ミルクカゼイン、ホエー、魚粉、各種ビタミン、ビタミンミックス、ミネラルミックス、アミノ酸製剤、炭酸カルシウム、第一リン酸カルシウム、植物性油脂、動物性油脂、食塩等が挙げられる。
飼料全量を１００質量％とした場合、飼料中の高蛋白質菜種ミールの含量は、０．１〜３０質量％であることが好ましく、０．５〜２０質量％であることがより好ましく、０．５〜１０質量％であることがさらに好ましい。
高蛋白質菜種ミールを含有する飼料は、本発明の製造方法により製造した高蛋白質菜種ミールと、上述した各種飼料原料や飼料添加物とを混合することにより製造することができる。混合は、リボンミキサー、Ｖ型混合機、Ｗ型混合機等の混合機を用いて行うことができる。

以下に本発明をより具体的に説明するために、実施例を示すが本発明はこれに限定されるものではない。

＜実施例１：セルロース糖化による菜種ミールのエタノール固体発酵法（小規模試験）＞
菜種ミール（商品名：菜種油粕、日清オイリオグループ（株）製、以下同じ）（水分含量 １３．３質量％）５０ｇに、水５０ｇを加えて、菜種ミールと水を加えた混合物１００ｇを用意した。オートクレーブ滅菌をせずに、酵母（Saccharomyces cerevisiae）の懸濁液を総反応系がOD=０．１となるように添加した。また、表１に示した各種繊維質分解酵素（セルラーゼ）０．０５質量％を添加して、容器のふたを閉めた状態で、３５℃で１週間固体発酵を行った。なお、酵母（Saccharomyces cerevisiae）としては、東京農業大学醸造科学科醸造微生物学研究室より恵与された、焼酎酵母Ａ３０（以下、「Saccharomyces cerevisiae A30」という）を用いた。
１週間後に固体部分を採取し、重量を測定した後、固体部分に含まれているエタノール濃度を測定した。エタノール濃度の測定の仕方は、固体部分に同量の水を添加し、１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、その上澄みを採取した。さらに、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを採取し、それを４倍に水で希釈して、簡易アルコール分析機器（製品名：アルコメイト、株式会社ウッドソン製）でエタノール濃度を測定した。その結果を表２に示した。

表２では、繊維質分解酵素としてセルラーゼFを用いた場合にのみ、十分なエタノール濃度を検出した。すなわち、菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりから得られるエタノール産生量が４．９ｇとなるようにエタノールを産生していた。セルラーゼFは、アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するエンドグルカナーゼであり、β-グルコシダーゼ活性が高いことがこのような良い結果に影響していると考察する。なお、他の繊維質分解酵素は、菜種ミールの繊維質をほとんど分解することができなかったと推察する。
そこで、繊維質分解酵素をアクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生する、セルラーゼFに絞って、次の実験を行った。

＜実施例２：中規模試験による菜種ミールのエタノール固体発酵物の評価＞
実施例１と同じ菜種ミール２５００ｇに、水２５００ｇを加えて、菜種ミールと水を加えた混合物５０００ｇを用意した。オートクレーブ滅菌をせずに、酵母（Saccharomyces cerevisiae A30）の懸濁液を総反応系がOD=０．１となるように添加した。また、表２に示したセルラーゼFを０．１質量％添加して、容器のふたを閉めた状態で、３５℃で１３日間固体発酵を行った。なお、容器は８リットル容の樹脂ケースを使用した。
中規模試験における菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりから得られるエタノール産生量を図１に、中規模試験における菜種ミールの各成分（タンパク質、総炭水化物、セルロース）と蛋白質／炭水化物比の変化を図２に示した。
なお、蛋白質はケルダール法、粗脂肪はソックスレー法、水分は常圧加熱乾燥法、粗灰分は直接灰化法を用いて測定した（重量）。炭水化物はそれらの合計値を１００から引いた値として算出した。

図１で明らかであるように、菜種ミール乾燥重量１００gあたりから得られるエタノール産生量が、４．３〜４．６ｇとなるようにエタノールを産生した。この結果は、小規模試験とさほど変わりはないが、従来の方法（約２．７ｇ：特許文献２の表１参照）と比較して、約２倍量のエタノールが産生したことを意味する。すなわち、セルラーゼFを用いることで、エタノール産生能が改善されることがわかった。
また、図２で明らかであるように、発酵前と発酵後の菜種ミールの蛋白質含量は、４４．８％から４７．１％に向上した。これは、発酵により菜種ミールの繊維分がエタノールに変換されたことで、相対的に、菜種ミールに含まれる蛋白質含量が向上したことを示している。
一方、発酵前と発酵後の総炭水化物含量は、４４．３％から４０．０％に低下した。また、発酵前と発酵後のセルロース含量は、１１．４％から９．４％に低下した。これは、発酵により菜種ミールの繊維分がエタノールに変換されたことを示している。
また、発酵１０日目の蛋白質／炭水化物比を発酵前のものと比較すると、１．０１から１．２０に向上している。これは、セルラーゼFを用いることで、繊維分が低下した結果、蛋白質／炭水化物比が改善されたことがわかった。

＜実施例３：高濃度の繊維質分解酵素による菜種ミールのエタノール固体発酵法（小規模試験）＞
菜種ミール（商品名：菜種油粕、日清オイリオグループ（株）製、以下同じ）（水分含量 １３．３質量％）１０ｇに、水１０ｇを加えて、菜種ミールと水を加えた混合物２０ｇを用意した。オートクレーブ滅菌をせずに、酵母（Saccharomyces cerevisiae A30）の懸濁液を総反応系がOD=０．１となるように添加した。また、表３に示した各種セルラーゼを１．０質量％（実施例１の１０倍量）添加して、容器のふたを閉めた状態で、３０℃で３日間固体発酵を行った。
エタノール濃度は実施例１と同様にして測定した。その結果を図３に示した。

図３によると、種々の繊維質分解酵素を高濃度（１．０質量％）で添加した場合、アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼFでは、菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりから得られるエタノール産生量が６．５ｇとなっているため、エタノールの収率が他のセルラーゼに比べて高くなることがわかった。しかし、繊維質分解酵素濃度を０．１質量％から１０倍量の１．０質量％に変えても、エタノールの収率が１．３倍程度（なお、０．１質量％である場合、菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりから得られるエタノール産生量は５．２ｇである。）にしか上がらないため、酵素の使用量は０．１質量％で十分であることが確認された。

＜実施例４：糖化処理とアルコール発酵処理を別々に行う際の糖化処理の至適温度（小規模試験）＞
菜種ミール（商品名：菜種油粕、日清オイリオグループ（株）製、以下同じ）（水分含量 １３．３質量％）１０ｇに、水１０ｇを加えて、菜種ミールと水を加えた混合物２０ｇを用意した。オートクレーブ滅菌をせずに、表４に示した各種繊維質分解酵素０．１質量％を添加して４５℃または５０℃で３日間糖化処理を行った。その後、酵母（Saccharomyces cerevisiae A30）の懸濁液を総反応系がOD=０．１となるように添加し、容器のふたを閉めた状態で、４０℃で３日間固体発酵を行った。エタノール濃度の測定は、上記実施例１と同じ方法で行った。その結果を図４に示した。

図４によると、種々の繊維質分解酵素を０．１質量％で添加した場合、アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼでは、５０℃で糖化処理を行ったものが、４５℃で糖化処理を行ったものに比べて、発酵効率が高かった。したがって、アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼを用いる場合は、雑菌等の汚染による酵母の発酵不足を防ぐために、５０℃で糖化処理を行えることがわかった。

＜実施例５：糖化処理とアルコール発酵処理を別々に行う際のアルコール発酵の至適温度（小規模試験）＞
菜種ミール（商品名：菜種油粕、日清オイリオグループ（株）製、以下同じ）（水分含量 １３．３質量％）１０ｇに、水１０ｇを加えて、菜種ミールと水を加えた混合物２０ｇを用意した。実施例５では、糖化処理とアルコール発酵を別々に行う。オートクレーブ滅菌をせずに、表５に示した各種繊維質分解酵素０．１質量％を添加して５０℃で３日間糖化処理を行った。その後、酵母（Saccharomyces cerevisiae A30）の懸濁液を総反応系がOD=０．１となるように添加し、容器のふたを閉めた状態で、３０℃または４０℃で３日間固体発酵を行った。エタノール濃度の測定は、上記実施例１と同じ方法で行った。その結果を図５に示した。

図５によると、種々の繊維質分解酵素を５０℃で糖化処理を行った場合、４０℃よりも３０℃にアルコール発酵処理の温度を下げることで、エタノールの収率を上げることができた。また、アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼでは、アクレモニウムセルラーゼFよりもセルラーゼKMの方がエタノールの収率が高いことがわかった。しかしながら、糖化処理とアルコール発酵を別々に行う場合は、最大でも菜種ミール乾燥重量１００gあたり、４．４ｇしか、エタノールが産生されないので、併行複発酵で行う場合よりも、エタノールの収率がそれほど高くない。したがって、糖化処理とアルコール発酵を別々に行うよりも、併行複発酵で行う方が望ましいことも確認できた。

＜実施例６：種々の酵母による菜種ミールのエタノール固体発酵法（小規模試験）＞
菜種ミール（商品名：菜種油粕、日清オイリオグループ（株）製、以下同じ）（水分含量 １３．３質量％）１０ｇに、水１０ｇを加えて、菜種ミールと水を加えた混合物２０ｇを用意した。オートクレーブ滅菌をせずに、表５に示した各種酵母の懸濁液を総反応系がOD=０．１となるように添加し、アクレモニウムセルラーゼF ０．１質量％を添加して、容器のふたを閉めた状態で、３７℃で３日間固体発酵を行った。その後、エタノール濃度の測定は、上記実施例３と同じ方法で行った。その結果を図６に示した。

図６によると、種々の酵母を用いた場合であっても、Saccharomyces cerevisiae A30を用いた場合と同様、アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼを用いたときは、どれも同程度に十分な量のエタノールを産生した。したがって、酵母は任意のものでよく、酵母の種類によって産生するエタノールの産生量は大きく変わらないと思われる。

＜高蛋白質菜種ミールを配合した配合飼料の給与試験＞
・飼料の安全性確認試験
菜種ミール４０００ｇに、水４０００ｇを加えて、菜種ミールと水を加えた混合物８０００ｇとした以外は、実施例２と同様の方法により、発酵菜種ミールを製造した。得られた発酵菜種ミールを、８時間、減圧加熱処理（７２℃、−０．１ＭＰａ）した。その後、乾燥した発酵菜種ミールを粉砕機（大阪ケミカル株式会社製、装置「Ａｂｓｏｌｕｔｅ ｍｉｌｌ ＡＢＳ−Ｗ」）で飼料原料に適したサイズに粉砕し、高蛋白菜種ミール（タンパク質含量：４９．４％（乾物換算））を製造した。
得られた高蛋白質菜種ミールを配合した配合飼料について、「飼料の安全性評価基準及び評価手続の制定について（平成２０年５月１９日付け２０消安第５９７号、農林水産省消費・安全局長通知）」による「鶏ひなの成長試験」に準じて安全性を確認することで、本発明の高蛋白質菜種ミールが、飼料に問題なく使用できることを確認した。
１）供試雛
表７に示す基本飼料（菜種ミール（商品名：菜種油粕、日清オイリオグループ（株）製）２０．００質量％配合）、を、餌付時に１羽あたり１０ｇを３日分として給与し、４日目以後は１日１羽あたり３．５ｇを給与して育成した８日齢の産卵鶏（ジュリアライト）雄雛から体重が４２〜４６ｇの個体を選抜して供試した。
なお、使用した基本飼料は、代謝エネルギーや、タンパク質等の一般成分、各種ミネラル、アミノ酸等の含量が、日本飼養標準・家禽（２０１１年版）における卵用鶏幼雛の養分要求量を充足するように設計をした。
２）試験区の設定
表７に示す配合飼料１（菜種ミール（商品名：菜種油粕、日清オイリオグループ（株）製）１０．００質量％、及び高蛋白質菜種ミール１０．００質量％配合）、及び配合飼料２（高蛋白質菜種ミール２０．００質量％配合）を給与する２試験区を設定した。
なお、配合飼料１及び２は、代謝エネルギーや、タンパク質等の一般成分、各種ミネラル、アミノ酸等の含量が、日本飼養標準・家禽（２０１１年版）における卵用鶏幼雛の養分要求量を充足するように設計をした。
なお、配合飼料に使用したビタミンＢ群プレミックス中の各成分の含量は、硝酸チアミン２．０ｇ／ｋｇ、リボフラビン１０．０ｇ／ｋｇ、塩酸ピリドキシン２．０ｇ／ｋｇ、ニコチン酸アミド２．０ｇ／ｋｇ、Ｄ−パントテン酸カルシウム４．３５ｇ／ｋｇ、塩化コリン１３８．０ｇ／ｋｇ、葉酸１．０ｇ／ｋｇ、シアノコバラミン１０ｍｇ／ｋｇである。
また、ビタミンＡＤＥプレミックス中の各成分の含量は、ビタミンＡ油１００００ＩＵ／ｋｇ、ビタミンＤ₃油２０００ＩＵ／ｋｇ、酢酸ｄｌ−α−トコフェロール２０ｍｇ／ｋｇである。
また、ミネラルプレミックス中の各成分の含量は、Ｍｎ８０ｇ／ｋｇ、Ｚｎ５０ｇ／ｋｇ、Ｆｅ６ｇ／ｋｇ、Ｉ１ｇ／ｋｇ、Ｃｕ０．６ｇ／ｋｇである。

３）試験区の設定及び飼養管理
供試雛を体重の分布がほぼ均等となるように６羽ずつ割り付けた６群に区分し、各区に３反復群ずつ割り付けて６日間飼育した。
供試雛は、電熱給温式の育雛器で群毎に飼育し、各種配合飼料および飲水は不断給与した。また、環境条件による影響を防ぐため、各群の収容位置を毎日移動した。
４）供試雛の増体量、飼料摂取量及び飼料要求率
参考データとして、試験開始時および試験終了時に、供試雛個体別体重を測定し、試験期間中の増体量（ｇ／羽）を算出した。
また、参考データとして、試験期間中の飼料摂取量を群毎に測定し、１羽あたりの飼料摂取量（ｇ／羽）および飼料要求率を算出した。
これらの測定結果（各３群の平均値±標準偏差）を表８に示す。

給与試験の結果、両試験区のいずれの個体においても健康状態には異常が観察されなかった。このことから、本発明の高蛋白質菜種ミールを配合した配合飼料は、雛の発育や健壊状態に悪影響を及ぼす懸念はなく、飼料として問題なく使用できるということが確認された。

Claims (10)

1. 菜種ミールと水を混合し、得られた混合物に糖化処理とアルコール発酵処理を行い、前記糖化処理のために繊維質分解酵素を添加し、前記アルコール発酵処理のために微生物を添加する、高蛋白質菜種ミールの製造方法において、前記繊維質分解酵素としてアクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼを用いることを特徴とする、高蛋白質菜種ミールの製造方法。
2. 前記アルコール発酵処理において、菜種ミール乾燥重量１００ｇあたりから得られるエタノール産生量が３．５ｇ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記菜種ミール４０〜６０重量部と水６０〜４０重量部を混合することを特徴とする、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記糖化処理とアルコール発酵処理を同一工程で行うことを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 前記同一工程を２５〜４５℃で行うことを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
6. 前記糖化処理とアルコール発酵処理を別々の工程で行うことを特徴とする、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の製造方法。
7. 前記糖化処理を４０〜６０℃で行い、前記アルコール発酵処理を２０〜４０℃で行うことを特徴とする、請求項６に記載の製造方法。
8. 前記糖化処理及び／又はアルコール発酵処理を行う前に、菜種ミールと水の混合物を滅菌処理しないことを特徴とする、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の製造方法。
9. 前記アクレモニウム（Acremonium）属微生物が産生するセルラーゼが、アクレモニウム・セルロティカス（Acremonium cellulotycus）が産生するセルラーゼであることを特徴とする、請求項１ないし８のいずれか１項に記載の製造方法。
10. 請求項１〜９のいずれか1項に記載の製造方法で製造された高蛋白質菜種ミールを含有する飼料。

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