DE2619322A1 - Verfahren zur herstellung von fructose durch isomerisierung von glucose - Google Patents

Verfahren zur herstellung von fructose durch isomerisierung von glucose

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DE2619322A1
DE2619322A1 DE19762619322 DE2619322A DE2619322A1 DE 2619322 A1 DE2619322 A1 DE 2619322A1 DE 19762619322 DE19762619322 DE 19762619322 DE 2619322 A DE2619322 A DE 2619322A DE 2619322 A1 DE2619322 A1 DE 2619322A1
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glucose
nrrl
glucose isomerase
fructose
xylose
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DE19762619322
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Peter Dr Weber
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Givaudan SA
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L Givaudan and Co SA
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    • C13—SUGAR INDUSTRY
    • C13K—SACCHARIDES OBTAINED FROM NATURAL SOURCES OR BY HYDROLYSIS OF NATURALLY OCCURRING DISACCHARIDES, OLIGOSACCHARIDES OR POLYSACCHARIDES
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
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Description

L. Givaudan & Cie Sodete Anonyme3 Vernier-Geneve (Schweiz)
- ·♦
betreffend
"Verfahren zur Herstellung von Fructose durch Isomerisierung von Glucose"
Es ist bekannt, dass verschiedene Mikroorganismen, wie ,; beispielsweise Vertreter der genera Streptomyces, Bacillus, Lactobacillus, Aerobacter, Nocardia, Actinoplanes oder Pseudomonas, in der Lage sind ,""mittels einer Glucose-Isomerase Glucose zu Fructose zu isomerisieren. Unter den Streptomyceten sind es vor allem die Species olivochromogenes, wedmorensis, olivaceus, venezuelae, phaechromogenes, albus und rubiginosus, die, nach Induktion mit Xylose, in der Lage sind, eine Glucose-Isomerase zu produzieren.
Neulich wurde gefunden (vgl. deutsche Offenlegungsschrift 2 408 708), dass auch der bekannte Mikroorganismus Streptomyces glaucescens, insbesondere der Stamm NRRL B-29OO (ETH 22794), (beschrieben in "Systematik der Streptomyceten unter besonderer Berücksichtigung der von ihnen gebildeten Antibiotika", R. Hütter, Verlag S. Karger, Basel und New York, Bibl.
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Ur/24.2.1976
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Mikrobiol. 6. (1967), 90-92), in der Lage ist, auf einem geeigneten Mährboden eine Glucose-Isomerase zu synthetisieren, wobei sehr hohe Anteile an extrazellulärer Glucose-Isomerase produziert werden.
Es wurde nun gefunden, dass sich gewisse Mutanten von Streptomyces glaucescens NRRL B-29OO überraschenderweise noch bedeutend besser zur Glucose-Isomerisierung eignen. Bei den in Frage kommenden Mutanten handelt es sich um solche, die über keine oder praktisch keine intrazelluläre Tyrosinaseaktivität verfügen.
Diese Mutanten sind aus folgenden Gründen den bisher zur Glucose-Isomerisierung eingesetzten Mikroorganismen überlegen:
Die daraus gewonnenen Enzympräparate verfügen über sehr hohe spezifische Aktivitäten. Da die Mutanten definitionsgemäss keine oder praktisch keine intrazelluläre Tyrosinaseaktivität aufweisen, bildet der Mikroorganismus während des Wachstums im Nährmedium auch keine Melanine (Pigmente), und damit unterbleiben Verfärbungen während des Wachstums, die beim nachfolgenden Isomerisierungsprozess zu verunreinigten Fructoseprodukten führen würden. Insbesondere aber zeichnen sich die besagten Mutanten dadurch aus, dass sie sehr hohe Anteile an intrazellulärer Glucose-Isomerase produzieren. Dies ist besonders erwünscht, da sich heute das Interesse mehr und mehr fixierten, und zwar vorzugsweise in der Zelle (Mycel) fixierten Enzymen zuwendet. Bei der Isomerisierung von Glucose zu Fructose ergibt sich nämlich dadurch der Vorteil, dass aufwendige zwingende Isolierungen und Reinigungen der Enzyme unterbleiben können. Des weiteren sind die erhaltenen Enzympräparate sehr stabil, d.h. es treten Inaktivierungen, insbesondere irreversible Inaktivierungen
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(Denaturierung) während der Glucose-Isomerisierung kaum ein, sodass die Präparate für mehrere Konversionen eingesetzt werden können, was die Wirtschaftlichkeit erhöht.
Ein weiterer Vorteil der oben definierten Mutanten besteht schliesslich darin, dass sie nur wenig lysieren.
Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäss ein Verfahren zur Herstellung von Fructose durch Isomerisierung von Glucose, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man zur Isomerisierung eine keine oder praktisch keine intrazelluläre Tyrosinaseaktivität aufweisende Mutante von Streptomyces glaucescens NRRL B-29OO oder eine daraus isolierte Glucose-Isomerase verwendet. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung -: einer Glucose-Isomerase, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine keine oder praktisch keine intrazelluläre Tyrosinaseaktivität aufweisende Mutante von Streptomyces glaucescens NRRL B-29OO in einem Nährmedium züchtet und die ■ Glucose-Isomerase gegebenenfalls daraus isoliert.
Als "praktisch keine intrazelluläre Tyrosinaseaktivität aufweisende Mutanten" sollen solche verstanden werden, die dieses Enzym mit spezifischer Aktivität 4· 0,01 Einheiten pro mg Protein bilden. Diese Aktivität wird vorzugsweise mittels des Dopachrom-Tests nach L. Lerch und L. Ettlinger bestimmt (vgl. Eur. J. Biochem. 31, 427-437 (1972) : Purification and Characterization of a Tyrosinase from Streptomyces glaucescens)
Erfindungsgemäss bevorzugte Stämme sind Streptomyces glaucescens NRRL 8071, 8072, 8073 und 8074.
Diese 4 Stämme wurden beim Northern Regional Research Laboratory US Department of Agriculture, Peoria, Illinoisp hinterlegt.
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Diese melaninnegativen Mutanten können unter Verwendung üblicher imitagener Agentien, beispielsweise nach R. Baumann et al., beschrieben in "Actinomycetes, The boundary microorganisms" (ed. T. Arai) Toppon. Co. Ltd., Tokyo (1975), in press, durch Acridin-orange-Behandlung [D.H. Bonanchaud et al., J. gen. Microbiol. 54, 417-425 (1969)] oder durch
Ultraviolett- sowie Röntgen-Bestrahlung von Sporen- oder
Myce!suspensionen erzeugt werden. Neben den solcherweise
durch Induktion erzeugten Mutanten kann aber, wie bekannt ist, Mutation auch spontan auftreten. Die melaninnegativen Mutanten lassen sich anhand des Ausbleibens der Melaninbildung auf Tyrosin- oder Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar erkennen und isolieren :
Glaucescens NRRL 8071 Auxotrophie Mutationsaus-7
Glaucescens NRRL 8072 für lösung bezügl.
Melaninbildung
Str. Glaucescens NRRL 8073 spontan
Str. Glaucescens NRRL 8074 Methionin, Lysin induziert
Str. Histidin . induziert
Str. Lysin, Nicotin induziert
säure
Die Züchtung der erfindungsgemäss verwendbaren Mikroorganismen kann in an sich bekannter Weise unter aeroben
Bedingungen erfolgen, vorzugsweise in Submerskulturen, unter Verwendung von Fermentern.
Ein geeignetes Nährmedium, das fest oder flüssig sein kann, enthält eine assimilierbare Kohlenstoff- und eine
assimilierbare Stickstoffquelle, sowie zweckmässigerweise Mineralsalze und Spurenelemente. Als assimilierbare Kohlenstoff quellen eignen sich beispielsweise Malzextrakte,
Stärke, Glucose, Maltose, Saccharose„ soi-?is ander® Zucker,
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Glycerin, Aminosäuren, Peptide, Fettsäuren. Als assimilierbare Stickstoffquellen kommen mikrobielle, pflanzliche, tierische und anorganische Stickstoffverbindungen in Frage, wie Hefeextrakt, Peptone, Bactotrypton, Fleischextrakt, Aminosäuren, pankreatisch- oder Säure-hydrolysiertes Casein, Sojabohnenmehle, Cornsteepliquor, NaNCU und (NH.)„SO.. Schliesslich ist für ein gutes Wachstum die Anwesenheit von Elementen,wie beispielsweise Magnesium, Phosphor, Schwefel, Kobalt, Mangan, vorteilhaft. Nach Bedarf oder Wunsch können noch spezielle Wachstumsfaktoren oder -stimulantien, z.B. Vitamine,wie Biotin oder Pyridoxin, oder Auxine zugesetzt werden.
Ein geeignetes Nährmedium hat z.B. folgende Zusammensetzung :
Hefeextrakt 20,00 g
K2HPO4.3H2O 0,5 g
MgSO..7H2O 0,25 g .-
CoCl2.6H3O 0,25 g
Glucose 10,00 g
Xylose 14,00 g
Sorbit 8,00 g
Die Lösung wird mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt.
Der für die Züchtung der erfindungsgemäss verwendeten Mutanten geeignete pH-Bereich ist etwa 5,5-7,5, vorzugsweise 6-7; die Temperatur sollte zweckmässigerweise 25-40 C, vorzugsweise 29-31°C, betragen.
Durch Zusatz von Xylose zum Nährmedium lässt sich die Bildung von Glucose-Isomerase bei den erfindungsgemäss verwendeten Mutanten von Str. glaucescens NRRL B-2900 induzieren. Anstelle von Xylose können auch Xylane, aus Xylose aufgebaute Polysaccharide, die in der Natur weit verbreitet sind, ebenfalls als Induktoren eingesetzt werden,
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da die erfindungsgemäss verwendeten Mutanten über eine eigene Xylanase verfügen. Xylane sind beispielsweise im Stroh von Getreidearten (15-20%), in Zuckerrohrpressrückständen (30%), in Baumwollsamenhülsen, im Koniferenholz (7-12%) und im Holz von Laubbäumen (20-25%) enthalten. Durch saure Hydrolyse oder enzymatischen Abbau von Xylanen entsteht Xylose, die als bevorzugtes Induktionsmittel anzusehen ist, weil bei der sauren Hydrolyse von Xylanen unerwünschte Nebenprodukte, wie Furfural, Hydroxymethylfurfural und Lävulinsäure, entstehen, die für die Mikroorganismen z.T. toxisch sind und die Isomeraseproduktion beeinträchtigen können. Zur Induktion der Isomerasebildung setzt man dem Nährmedium zweckmässigerweise 0,5-2,0% Xylose zu.
Die Mikroorganismen lassen sich in kurzen Ferment at ions t· zeiten, beispielsweise 18-30 Stunden so züchten, dass Ausbeuten von 17-24 Einheiten intrazellulärer Glucoserisomerase/ml Kulturbrüher erzeugt werden. Eine Einheit (E) ist dabei diejenige Menge Enzym, die bei 70 C, bei pH 7,0 und in einer 10%igen * Glucoselösung in 0,05 M Phosphatpuffer, der bezüglich CoCl_.6H2O und MgSO4^H3O 0,001 M ist, in 1 Minute 1 μ Mol Glucose in 1 μ Mol Fructose umwandelt.
Die von den erfindungsgemäss verwendbaren Mutanten von Streptomyces glaucescens NRRL B-29OO gebildete Glucose-Isomerase liegt intra- und extrazellulär vor, bei einem, wie oben gesagt, ausserordentlich grossen intrazellulären Anteil. Der intrazelluläre Anteil kann nach 30-stündigem Wachstum des Mycels beispielsweise bis zu 95% (bezogen auf die gesamte Isomerase) betragen.
Die allfällige Isolierung der gebildeten Glucose-Isomerase kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Sie kann aus dem Kulturfiltrat in einfacher Weise durch Fällung, vorzugsweise mit Aceton oder Aethanol, und Zentrifugieren erhalten werden.
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Nach Waschen mit 75%igem Aethanol kann sie getrocknet werden; üblicherweise wird sie in einer Pufferlösung, vorzugsweise einem 0,05 M Phosphatpuffer vom pH 5-8, vorzugsweise pH 6,5-7,0, aufgenommen. Die Isolierung des intrazellulären Glucose-Isomeraseanteils erfordert einen vorherigen Aufschluss der Zellen. Dieser kann in an sich bekannter Weise erfolgen, z.B. durch Ultraschallbehandlung, wobei das Mycel zerbrochen wird, oder Druckbehandlung, beispielsweise unter Verwendung einer Frenchpresse. Nach dem Aufschluss zentrifugiert man in einer hochtourigen Zentrifuge (12-151OOO U/min.) bei tiefer Temperatur <0-4 C) und erhält sehr gute Ausbeuten an Isomerase.
Die gebildete Glucose-Isomerase wird jedoch vorteilhafterweise gar nicht isoliert, sondern das Mycel nach beendeter Fermentation von der Kulturbrühe abgetrennt, beispielsweise durch Vakuumfiltration oder insbesondere durch Zentrifugation. Nach Waschen mit 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,0 ist es von beiger bis weisser Farbe.
Es ist zweckmässig, das Mycel einer "Hitzefixierung" zu unterwerfen. Dieser Vorgang dient dazu, das Enzym in der Zelle, die Träger desselben ist, zu fixieren, wodurch das Enzympräparat bedeutend an Stabilität gewinnt. Zu diesem Zweck wird das Mycel beispielsweise in einer Lösung von 0,2 M Maleatpuffer vom pH 7,0, 0,00001 - 0,1 M, insbesondere 0,001 M an CoCl„.6H20, suspendiert. Eine 10%ige Suspension des Mycels wird hierauf 30 Minuten bei einer Temperatur von 7O-75°C gehalten.
Die so in Gegenwart von Kobaltionen hitzebehandelten Zellen können nun erneut zentrifugiert und zum Trocknen auf Siebe gestrichen werden. Der Trocknungsprozess ist beispielsweise bei 50°C unter Frischluftzufuhr nach 15 Stunden abgeschlossen. Solche Präparate weisen hohe Aktivitäten auf, beispielsweise 800-1200 E/g und sind sehr stabil. Sie sind in ihrer Verwendung
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(S)
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seiir wirtschaftlich, da sie sich mehrmals verwenden lassen, beispielsweise durch Zentrifugieren nach den einzelnen Konversionen» Bemerkenswert ist die sehr gute Hitzestabilität des Enzyms, aufgrund derer es sich gut bei Temperaturen bis zu 70 C zur Isomerisierung von Glucose in Fructose verwenden lasst. Bei 65 G kann Glucose,, beispielsweise in 50%iger Lösung, zu 50% und bei 70 C zu 55% in Fructose übergeführt werden.
Die erfindungsgemässe Isomerisierung von Glucose zu Fructose mittels Glucose-Isomerase aus den genannten Mutanten von Streptomyces glaucescens NRRL B-29OO kann im übrigen in an sich bekannter Weise erfolgen» So kann eine Glucoselösung direkt mit einer Kultur des Mikroorganismus behandelt werden, d.h. mit frisch geerntetem oder (getrocknetem und) gelagertem Mycel. Andererseits kann die Behandlung der Glucose mit dem j Kulturfiltrat, das extrazelluläre Isomerase enthält, erfolgen oder mit isoliertem Enzym bzw. mit an einen festen Träger gebundenem Enzym.
Die Isomerisierung der Glucose zu Fructose mittels Glucose-Isomerase aus den genannten^Mutanten von Str. glaucescens NRRL B-29OO kann bei Temperaturen von 55°C bis zu 75°C, vorzugsweise 6O-65°C, einem pH-Wert von 6-9, vorzugsweise 6,5-7,0, um alkalische Nebenreaktionen zu vermeiden, gewünschtenfalls in Gegenwart von Co -Ionen (z.B. 0,00001 - 0,1,vorzugsweise 0,0015 Mol/l) und Mg Ionen (z.B. 0,001 - 0,1, vorzugsweise 0,01 Mol/l) vorgenommen werden. Zweckmässigerweise wird mit einer Substratkonzentration von 30-50% gearbeitet. Die gebildete Fructose kann
durch Messung des Drehwertes des Reaktionsgemisches auf
übliche Weise polarometrisch bestimmt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Die
Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben»
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Beispiel la
Streptomyces glaucescens NRRL B-2900 sowie die erfindungsgemäss verwendeten Mutanten dieses Stammes wurden subraers in folgendem Nährmedium gezüchtet:
Hefeextrakt 20 g
K3HPO4.3H2O 0,5 g
MgSO4. 7H2O 0,25 g
CoCl2. 6H2O 0,25 g
Glucose 10 g
Xylose 14 g
Sorbit 8 g
Mittels destilliertem Wasser wurde auf ein Volumen von -. 1 Liter aufgefüllt und der pH-Wert mit verd. NaOH auf 7 eingestellt.
Die beimpften Kulturmedien (je 70 ml) wurden in 250 ml Erlenmeyerkolben mit einer Schikane bei 30 und einer Schüttelfrequenz von 200 Umdrehungen pro Minute 46 Stunden lang inkubiert.
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Tabelle 1 Erhaltene Ausbeuten an Glucose-Isomerase:
O CO OO cn ο OO
Stantribezeichnung Melanin
bildung		 Tyrosin, as e *
intrazellulär, spezi
fische Aktivität
E/mg Protein
(aufgebrochene
Zellen)		 Gluco
intra zellulär
E/ml		 se-Isomerase
extrazelluläj
E/ml		 : total
E/ml		 Anteil extra
zellulärer
Glucose-Isesnerasa
bezogen auf
Totalmenge an
Enzym (%)
Str.glauc. NRRL B-29OO + 1,0 5,4 1,9 7,3 26
Str.glauc. NRRL 8071 - < 0,01 11,8 1,1 12,9 8,5
Str.glauc NRRL 8072 - <0,01 6,4 0,6 7,0 6,8
Str.glauc. NRRL 8073 - < 0,01 8,4 0,2 8,6 2,3
Str.glauc. NRRL 8074 - <0,0l 9,6 . 0,7 10,3 6,8
Ό I
Bestimmung der Tyrosinaseaktivität mit dem Dopachrcm-Test nach Leren : Eur. J. Biochim. 31,427-437 (1972)
CD IO hO
Beispiel Ib
Erzeugung von Glucose-Isomerase mit Streptomyces glaucescens NRRL 8071 unter Verwendung von Xylan.
Das Nährmedium wies folgende Zusammensetzung auf :
Gewichtsteile/Liter
Hefeextrakt MgSO4.7H2O
K2HPO4. Xylan Stärke Sorbit
Das Medium wurde auf pH = 6,5 eingestellt. Die Kulturen.,
20 25 g
0, 24 g
0, 50 g
0, g
10 g
10 g
8 g
je 70 ml pro 250 ml-Er lenmey er kolben, wurden bei einer Schüttelfrequenz von 200 Ui Stunden inkubiert.
frequenz von 200 Umdrehungen pro Minute und 30 während
Es ergeben sich 5 Einheiten intrazelluläre Glucose-Isomerase/ml Kulturmedium.
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Beispiel 2
Ein Fermenter wurde mit 10 1 eines Nährmediums der unten angegebenen Zusammensetzung, enthaltend 10% Impfkultur
bei 30 und 200 Umdrehungen pro Minute gezüchtet wurde,
20 5 g
o, 25 g
o, 25 g
0, g
8 g
6 g
6 g
von Streptomyces glaucescens NRRL 8071, die im Schüttelkolben
bei 30 um beschickt.
Nährmedium . Gewichtsteile/Liter
Hefeextrakt K3HPO4.3H2O MgSO..7H2O CoCl2.6H2O Sorbit Xylose Glucose
Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser auf 10 Litern gebracht und mittels verd. Natronlauge der pH-Wert auf 7 eingestellt. Die Belüftung betrug 1 WM (1 Volumen Luft/ Volumen Medium und Minute).
Das Medium für die Impfkultur wies dieselbe Zusammensetzung auf.
Die Züchtung erfolgte unter stetigem Rühren mit 2 Scheibenrührern bei 30 . Im Verlaufe der Fermentation wurden .kontinuierlich kleine Mengen an Glucose zugegeben. Nach 22 Stunden erreichte die Enzymsynthese ihr Maximum mit 17 Einheiten/ml Kulturbrühe.
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Das Mycel wurde nach beendeter Fermentation durch Zentrifugieren vom Nährmedium abgetrennt, gewaschen und tiefgefroren.
Beispiel 3
Die Herstellung des Enzyms erfolgte mit einem Nährmedium der folgenden Zusammensetzung:
Feststoffe ex Maxsquellwasser 20 g
Hefeextrakt 5 g
K2HPO4.3H2O 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,25 g
CoCl2.6H2O 0,24 g
Sorbit 8 g
Glucose 6 g
Xylose 14 g
Magnesiumhydroxidcarbonat 2,5 g
Das Volumen wurde mit destilliertem Wasser auf 1 Liter gebracht und mittels verd. Natronlauge der pH-Wert auf 7 eingestellt.
Die Impfkultur (10%) stammte vom Fermenterversuch, der im Beispiel 2 beschrieben wurde. Die Versuchsbedingungen waren dieselben wie im vorhergehenden Beispiel. Zwecks Neutralisierung der gebildeten Säure wurde Magnesiumhydroxidcarbonat zugegeben. Nach 18 Stunden wurden bei einem pH-Wert von 7,3 20 E/ml Kulturbrühe oder 250 E/g Mycel (Nassgewicht) gemessen.
Beispiel 4
In einen 50 1 Fermenter wurden 30 1 Nährmedium sowie eine Impfkultur von Streptomyces glaucescens NRRL 8071 (10%) eingebracht.
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Die Zusammensetzung des Mediums war die folgende:
Hefeextrakt 20 g
K2HPO4.3H2O 0,5 g
MgSO4.7H2O 0,25 g
CoCl2.6H3O 0,25 g
Glucose 10 g
Xylose . 14 g
Sorbit 8 g
Mit destilliertem Wasser wurde auf 1 Liter gebracht. pH
Der Fermenter war mit 2 Scheibenrührern ausgerüstet. Durch die Nährlösung wurden pro Minute 30 1 Luft durchgeblasen. Die Temperatur wurde bei 3O gehalten und der Inhalt mit 750 Umdrehungen pro Minute umgewälzt. Zur Schaumbekämpfung wurde Silicon-Entschäumer (Merck) zugegeben.
Nach 46-stündiger Fermentation wurde eine Biomasse von 2,85O kg erhalten. Der pH-Wert betrug 8,5. Pro ml Fermentationsbrühe ergaben sich 24 Einheiten Glucose-Isomerase. Ein g Zellmasse (Nassgewicht) enthielt demnach 252 E. Das Mycel wurde teils direkt im Fermenter einer 30-minütigen Hitzebehandlung bei 70 in Gegenwart von Kobaltchlorid, 0,0Ol Mol/l, unterzogen, teils gewaschen und in 0,2 M Maleatpuffer vom pH 7,0, 0,001 molar an CoCl2-6H3O, hitzebehandelt (70°).
Die zentrifugierten Zellen wurden bei 50 unter Frisch luftzufuhr getrocknet. Es wurde ein Präparat von 12OO E/g Trockensubstanz erhalten.
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Das Präparat wies auch nach einem'Jahr Lagerung bei Raumtemperatur keinen Äktivitätsverlust auf.
Beispiel 5
Mit Schliffstopfen versehene 12,5 ml-Glasfläschchen wurden mit 5 ml eines Reaktionsgemisches, enthaltend die Substratlösung der folgenden Zusammensetzung :
Glucose 50 g
CoCl2-OH2O 0,024 g
MgSO4.7H2O 0,025 g
0,2 M Maleatpuffer pH 7 .ad 100 ml
und 25 mg Trockensubstanz eines Enzympräparates beschickt und 19 Stunden bei 65 im Wasserbad geschüttelt. Nach beendeter Konversion wurden die Zellen abzentrifugiert und mit Hilfe der optischen Drehung der Gehalt an Fructose bestimmt.
Die Zellen wurden erneut in 5 ml frische Substratlösung aufgenommen und die weiteren Konversionen durchgeführt.
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Das Ergebnis war das folgende:
Tabelle 2
Enzympräparat von
Str. glauc. NRRL 8071 *		 % Einbusse be
zogen auf vor
hergehende Kon
version
Anzahl Zyklen
ä 19 Stunden		 % Umwandlung 0
1. Konversion 40 5
2. Konversion 38 2,7
3. Konversion 37 30
4. Konversion 26 , 23
5. Konversion 20
Der pH-Wert nahm pro Zyklus um 0,45.Einheiten ab»
* Aktivität Estreptomyces glauc. NRRL 8071]: 1200 E/g Trockensubstanz
Beispiel 6
Die (nur langsam absinkende) Aktivität von Streptomyces glaucescens NRRL 8071 bei mehrmaliger Verwendung unter nichtoxydierenden·. Bedingungen wurde wie folgt eruiert:
Ein entsprechendes Reaktionsgemisch wurde jeweils während 19 Stunden bei 65 unter Argon gerührt. Die Zusammensetzung der Substratlösung und die Enzymdosierung sind dieselben wie in Beispiel 5.
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Tabelle 3
Streptomyces glaucescens
NRRL 8071		 % Abnahme be
zogen auf vor
hergehende Kon
version
Anzahl Zyklen
(je 19 Stunden)		 % Umwandlung
1. Konversion 48 0
2., Konversion 48 0
3. Konversion 48 0
4. Konversion 48 10
5. Konversion 43 12
6. Konversion 38 3
7. Konversion 37 r 16
8. Konversion 31 10
9. Konversion 28 7
LO. Konversion 26 4
Ll. Konversion 25 8
L2. Konversion 23
Der pH-Wert nahm pro Zyklus lediglich von 7,0 auf 6,8 ab,
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Claims (7)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Fructose durch Isomerisierung von Glucose, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Isomerisierung eine keine oder praktisch keine intrazelluläre Tyrosinaseaktivität aufweisende Mutante von Streptomyces glaucescens NRRL B-290O oder eine daraus isolierte Glucose-Isomerase verwendet.
2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Mikroorganismus verwendet, in dem durch Züchtung in einem Xylose oder ein durch den Mikroorganismus zu Xylose abbaubares Polysaccharid enthaltenden Nährmedium die Bildung von Glucose-Isomerase induziert wurde.
3. Verfahren gemäss Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces glaucescens NRRL 8071, 8072, 8073 oder 8074 oder eine daraus isolierte Glucose-Isomerase verwendet.
4. Verfahren zur Herstellung einer Glucose-Isomerase, dadurch gekennzeichnet, dass man eine keine oder praktisch keine intrazelluläre Tyrosinaseaktivität aufweisende Mutante von Streptomyces glaucescens NRRL B-2900 in einem Nährmedium züchtet und die Glucose-Isomerase gegebenenfalls daraus isoliert.
5. Verfahren gemäss Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Nährmedium als Induktionsmittel Xylose oder ein durch den Mikroorganismus zu Xylose abbaubares Polysaccharid
enthält.
6. Verfahren gemäss Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass man als Mikroorganismus Streptomyces glaucescens
LTFiEL 8071, 8072, 8073 oder 8074 verwendet.
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7. Verwendung einer gemäss den Ansprüchen 4-6 erhaltenen Glucose-Isomerase zur Herstellung von Fructose aus Glucose.
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DE19762619322 1975-05-03 1976-04-30 Verfahren zur herstellung von fructose durch isomerisierung von glucose Withdrawn DE2619322A1 (de)

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