DE2607680C2

DE2607680C2 -

Info

Publication number: DE2607680C2
Application number: DE19762607680
Authority: DE
Inventors: Geb. Stute Annette 4330 Muelheim De Chen-Stute
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1976-02-25
Filing date: 1976-02-25
Publication date: 1989-01-05
Also published as: DE2607680A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von ¹³¹J- oder ¹²⁵J-Radio-Toluidinblau unter Verwendung von o-Toluidinblau, Radiojod und Kaliumjodid/Kaliumjodat in salzsaurer Lösung im Verlauf einer Inkubationsbehandlung.

Ein solches Verfahren ist aus der Publikation von Czerniak und Mitarbeitern in "Medical Radioisotope Scintigraphy, IAEA-SM 164/49, 75-93, (1973)" bekannt. Bei dem bekannten Verfahren wird das o-Toluidinblau durch Austausch von Wasserstoff gegen das radioaktive ¹³¹Jod radioaktiv markiert. Eine Aussage über die Position des radioaktiven Jods im Radio-Toluidinblau (RTB) ist dieser Publikation nicht zu entnehmen.

Das bekannte Verfahren hat insbesondere die folgenden Nachteile:

1. Die Ausbeute an RTB ist sehr gering.
2. Die Volumenmenge ist so groß, daß die Injektion von 300 µCi RTB meistens über 1,5 ml liegt, was nicht im Sinne der Bolustechnik ist.
3. Es befinden sich in der endgültigen RTB-Lösung nicht nur radioaktiv markiertes Toluidinblau, sondern auch deren Isomere.
4. Die radioaktiv markierten Endprodukte weisen nicht die erforderliche Reinheit auf.
5. Die chemisch-physikalischen Eigenschaften des Toluidinblau haben sich in den verschiedenen Markierungsverfahren geändert.
6. Die erhaltenen Produkte weisen eine niedrige Stabilität "in vitro" und "in vivo" auf.
7. Die erhaltenen Produkte haben eine geringe spezifische Aktivität.

Über die experimentelle Durchführung des Markierungsverfahrens, insbesondere über die Reihenfolge der einzelnen Reaktions- und Arbeitsschritte, werden in der Publikation keine ausreichenden Angaben gemacht.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Herstellung von ¹³¹J-RTB und ¹²⁵J-RTB zu schaffen, das die vorstehenden Nachteile nicht aufweist, insbesondere also zu hohen Ausbeuten führt, geringe Volumenmengen im Sinne der Bolustechnik ergibt, zu Produkten mit hoher Reinheit, hoher Stabilität und hoher spezifischer Aktivität führt und eine sehr hohe radiochemische Reinheit aufweist.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Kombination der Verfahrensschritte in der angegebenen Reihenfolge des kennzeichnenden Teiles des Patentanspruches gelöst.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist relativ leicht durchzuführen und die Endprodukte ¹³¹J-RTB und ¹²⁵J-RTB erlauben, aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften, nicht nur die Lokalisationsdiagnostik der Gallenblase, sondern auch das Funktionsstudium des Leber- und Gallesystems, so daß zwischen Leber- und Galleerkrankungen unterschieden und deren Abhängigkeit bzw. gegenseitige Beeinträchtigung diagnostiziert werden kann. Er ist möglich, die Funktionsparameter bezüglich der der Leberakkumulation (Akk_L) und Elimination (El_L) des Radioindikators zu erhalten und einen Leberquotienten (LQ) zu bilden, die Aufschluß über den Funktionszustand der Leber erlauben. Aus dem Serum-Eliminationskoeffizienten "K" des ¹³¹J-RTB läßt sich eine Aussage über die Funktion des Gallesystems machen. Somit stehen sich vier korrespondierende Werte gegenüber, die eine genaue Differenzierung von Leber- und Galleerkrankungen erlauben.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird im folgenden anhand eines Ausführungsbeispieles näher erläutert.

Beispiel

a) 20 mg o-Toluidinblau werden in 1 ml Aqua dest. gelöst, indem die Lösung 5 Minuten auf einem Wirbelmixer geschüttelt wird;
b) die gelöste Substanz wird durch einen 0,22 µ- Membranfilter in ein steriles Penicillinfläschchen filtriert, wodurch nicht vollständig gelöste Partikel zurückgehalten werden;
c) es wird zweimal mit 0,5 ml Aqua dest. nachgespült;
d) es werden 321 mg KJO₃ und 479 mg KJ in 100 ml Aqua dest. aufgelöst, die erhaltene Kaliumjodid-Jodat-Lösung ebenfalls durch einen 0,22 µ-Membranfilter sterilisiert und 0,5 ml der sterilen Kaliumjodid-Jodat-Lösung werden in einer sterilen Spritze aufgezogen;
e) zu der vorbereiteten o-Toluidinblau-Lösung wird radioaktives ¹³¹Jod bzw. ¹²⁵Jod hinzugegeben, das frei von reduzierenden Substanzen vorliegen muß und vorzugsweise eine spezifische Aktivität von ca. 200 mCi/ml haben soll; vorher wird eine Luftkanüle durch den Gummistopfen der Penicillinflasche eingesetzt;
f) 5 mCi ¹³¹Jod bzw. ¹²⁵Jod, die ein Volumen von 0,1-0,05 ml haben, werden mit einer sterilen Spritze aufgezogen und zu dem vorbereiteten o-Toluidinblau gegeben; die radioaktive Phiole wird zweimal mit 0,5 ml Aqua dest. ausgespült;
g) o-Toluidinblau und ¹³¹ Jod bzw. ¹²⁵Jod werden für ca. 30 Sekunden auf dem Wirbelmixer gemischt;
i) 1 Tropfen 25%ige HCl wird vorsichtig zu der Lösung hinzugegeben, dann die Luftkanüle aus der Penicillinflasche entfernt und die gesamte Lösung ca. 5 Minuten wieder auf dem Wirbelmixer gemischt;
k) nach 24stündiger Inkubation wird eine 95%ige ± 3%ige Kopplung des ¹³¹Jod bzw. ¹²⁵Jod an o-Toluidinblau erhalten und das freie Jod wird mittels einer Ionenaustauschersäule abgetrennt, wozu die gesamte ¹³¹J-RTB-Lösung bzw. ¹²⁵J-RTB-Lösung mit einer sterilen Spritze aufgezogen und über den Ionenaustauscher durch einen 0,22 µ-Membranfilter bis zu 5 atü gedrückt und die Säule zweimal mit 1 ml Aqua dest. gespült wird, wobei das freie Jod im Ionenaustauscher bleibt, während das reine ¹³¹J-RTB bzw. ¹²⁵J-RTB als Eluat mit einer radioaktiven Konzentration von 1,8 mCi/ml, einer spezifischen Radioaktivität von 250 mCi/g o-Tb, einer radiochemischen Reinheit von 96 ± 2%, einem pH von 7,4-7,5 und einer "in vitro"-Stabilität von über 4 Monaten erhalten wird.

Zur Abtrennung des freien Jods mittels der Ionenaustauschersäule wird 1 g Dowex 1×8 (mesh 50-100) in 1 ml Aqua dest. suspendiert.

Auf einen sterilen 0,22 µ-Membranfilter wird eine Spritze mit Luer-Lok-Ansatz geschraubt, auf der anderen Seite des Membranfilters wird die spezielle Luer-Lok-Kanüle aufgesetzt, die durch den Gummiverschluß in ein neues steriles Penicillinfläschchen führt. Die gesamte ¹³¹J-RTB-Lösung bzw. ¹²⁵J-RTB-Lösung wird dann mit einer sterilen Spritze aufgezogen und wie beschrieben chromatographiert.

Die Vorteile des Herstellungsverfahrens liegen u. a. darin, daß ein Produkt mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute erhalten wird, das eine hohe Stabilität "in vitro" und "in vivo" aufweist und eine hohe spezifische Aktivität hat.

Vergleichende Untersuchungen des beispielsgemäßen Präparates und des der Publikation von CZERNIAK et al. (vgl. vorstehendes Zitat) zugrunde liegenden Präparates. I. Auswertung des quantitativen Radio-Papierchromatogramms von Czerniak et al.: S. 90 Fig. 11 und S. 76 Fig. 1

Das Radio-Papierchromatogramm nach Czerniak et al., S. 76 Fig. 1, hat folgende Rf-Werte:

¹³¹Jod0,28 ¹³¹J-RTB0,79

Demnach handelt es sich bei Czerniak et al. (vgl. Fig. 11) um 13,7% freies ¹³¹Jod und 72% ¹³¹J-RTB, bezogen auf die Gesamtmenge an Radiojod in der Galle nach Leberpassage und Sekretion in die Galle.

Czerniak et al. gibt auf Seite 90, Fig. 11 an, daß der Anteil ¹³¹J-RTB im Urin 48h p.i. noch 62% beträgt, der Anteil freies ¹³¹Jod 13%.

Dagegen kommt man gemäß obiger Auswertung zu dem Ergebnis, daß das ¹³¹J-RTB im Urin 48h p.i. 40%, das freie ¹³¹Jod 48h p.i. 32% beträgt.

II. Präparation von ¹³¹J-RTB nachgearbeitet gemäß der Methode von Czerniak et al.

Nach den glaubhaften Angaben der Anmelderin, die zuvor selbst im Laboratorium von Prof. Dr. Czerniak gearbeitet hat, wird dabei eine bereits angesäuerte o-Toluidinblau- Lösung in den Markierungsversuch eingesetzt.

1. Rf-Werte im Urin-Radio-Papierchromatogramm 2. Prozentuale Kopplung von Radiojod nach in vivo Applikation am Patienten im Urin-Radio-Papierchromatogramm 3. Vergleich mit den Ergebnissen von Czerniak et al. gemäß I 4. Fazit

Vergleichbare Ergebnisse sind in den Rf-Werten des 48 h-Urin im Radio-Papierchromatogramm von Czerniak et al. (vgl. Fig. 11) und Chen-Stute (erfindungsgemäß) zu sehen; die Rf-Werte der beiden, an unterschiedlichen Orten und Zeiten, aber nach der gleichen Methode hergestellten Chargen stimmen überein. Betrachtet man das ¹³¹J-RTB im 48h-Urin bei Czerniak et al., Fig. 11, so werden dort 62% angegeben. Rechnet man an Hand von Fig. 11 nach, so findet man nur 40% anstelle der angegebenen 62%. Ebenso verhält es sich mit dem freien ¹³¹ Jod, das mit 13% angegeben wird, tatsächlich aber bei Nachrechnung zu 32% vorhanden ist.

In einem exakt nach der Czerniak-Methode durchgeführten Versuch fand die Anmelderin im Urin nach 48 h eben 36% ¹³¹J-RTB und 15% freies ¹³¹Jod. Diese Werte stimmen mit den Czerniakwerten in etwa überein, wobei zu bedenken ist, daß sowohl die Methode der Radio-Papierchromatographie als auch die Auswertung der Photokopie der Arbeit Czerniaks ihre Fehler birgt. Leider fehlt bei Czerniak die Angabe über die genaue Zusammensetzung des radioaktiv markierten Präparates vor Applikation am Patienten bezüglich ¹³¹J-RTB und ¹³¹Jod.

III. Erfindungsgemäße Präparation von ¹³¹Jod-RTB, erhalten gemäß vorstehendem Ausführungsbeispiel 1. Chargencharakteristik ¹³¹J-RTB

Im Radio-Dünnschichtchromatogramm des ¹³¹J-RTB weist dieses Präparat andere Rf-Werte auf (stationäre Phase: Fa. Merck Kieselgel 60 F, Fa. Macherey-Nagel Polygram SIL MN).

¹³¹J-RTB erfindungsgemäß¹³¹J-RTB nach Czerniak et al. DünnschichtchromatographieRadio-Papierchromatographie

¹³¹J-RTB 0,310,73 ¹³¹J-RTB-Isomere 0,60- ¹³¹J-RTB-Isomere 0,63- ¹³¹J-RTB-Isomere 0,73- freies ¹³¹Jod 0,940,27

Die etwas ungenaue Radio-Papierchromatographie wurde durch die Radio-Dünnschichtchromatographie ersetzt. Das Laufmittelsystem von Czerniak et al. wurde dagegen beibehalten.

2. Patientenuntersuchungen mit erfindungsgemäßen ¹³¹J-RTB, erhalten gemäß vorstehendem Ausführungsbeispiel

Radio-Dünnschichtchromatographie des Urins:
stationäre Phase: Fa. Merck Kieselgel 60 F, Fa. Macherey- Nagel Polygram SIL MN, Laufmittel gemäß Czerniak et al.

Wie aus der Tabelle ersichtlich, liegt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eine hohe Stabilität der Bindung des ¹³¹Jod an Toluidinblau unter physiologischen Bedingungen vor:

- bis zu 8 h p.i. 75-79% ¹³¹J-RTB (inklusive Isomere), obwohl die Substanz eine Glucoronidierung durch die Leber, Sekretion in die Gallenblase und Exkretion durch die Nieren erfahren hat.
- das freie ¹³¹Jod bewegt sich nach 8 h zwischen 1,7-2,2%, erst nach 24-48 h liegt es etwas höher, zwischen 2,0-5,2%.
- der Anteil freies ¹³¹Jod bei Czerniak et al. (vgl. I.) beträgt 32% - erfindungsgemäß 1,7-5,2%.
- das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Präparat ¹³¹J-RTB weist somit eine höhere in-vivo-Stabilität auf und führt deshalb zu einer deutlich niedrigeren Konzentration von freiem Jod im Organismus und damit zu einer wesentlich geringeren Strahlenexposition für die Schilddrüse.
- klinisch sind das bedeutende Unterschiede, weil erst bei einer ausreichenden Stabilität reproduzierbare Funktionsuntersuchungen der Galle durchgeführt werden können und die Strahlenexposition der Schilddrüse so gering wie möglich gehalten wird.

Eine Untersuchung des Serums des Patienten nach 30 und 60 min. p.i. ergab, daß nur ein äußerst geringer Teil der Radioaktivität als freies ¹³¹Jod vorliegt und das ¹³¹J-RTB sich dagegen weitgehend stabil und unverändert unter physiologischen Bedingungen verhält.

3. Exkretion des ¹³¹J-RTB in die Gallenblase und in den Urin von Patienten, Verhältnis von Radioaktivität in der Gallenblase zu Radioaktivität in der Schilddrüse

Gemessen wurden mit dem Szintigraphen die Impulse über den Organen mehrerer Patienten, denen erfindungsgemäß hergestelltes ¹³¹J-RTB injiziert worden war.
Dabei wurde ein Background von 200 cpm subtrahiert.

Hieraus wird deutlich, daß der Anteil an freiem ¹³¹Jod, der dann auch zur unerwünschten Belastung der Schilddrüse führt, vernachlässigbar gering ist und in der Größenordnung des Backgrounds liegt.

4. Spezifische Radioaktivität der Organe von Kaninchen und Hunden gemäß Czerniak et al

Betrachtet man die spezifische Radioaktivität in Kaninchen und Hunden gemäß Czerniak et al. (vgl. Fig. 6), so ergibt sich in Zahlen ausgedrückt, folgendes Bild:

Kaninchen (3 Tiere)2,5-3 h p.i. % RTB i.v. / g Gewebe

Schilddrüse0,125 / 0,125 / 0,030 Nieren0,030 / 0,125 Leber0,050 / 0,140 Pankreas0,025 / 0,050 Lunge0,020 / 0,150 Herz0,020 Milz0,015 Trachea0,010 Nebennieren0,135 Diaphragma0,005 Ovar0,055 Galle (2,5 h p.i.)0,679 / 0,640 / 0,400 Blut (10 min. p.i.)0,030 / 0,070 Uterus0,60 Urin0,370 / 0,470 / 0,380

Hunde (3 Tiere)

Nebenschilddrüse (Ns)0,025 Schilddrüse + Ns0,125 Pankreas0,015 Niere0,015 Blut0,001 Galle0,320 / 0,560 / 0,630 Urin0,470 / 0,210

Verhältnis der spezifischen Radioaktivität in der Gallenblase zu jener in der Schilddrüse

Der Quotient von Galle/Schilddrüse hat beim Kaninchen eine Schwankungsbreite von 5,12-13,3, bzw. einen Mittelwert von 7,9. Beim Hund errechnet sich ein mittlerer Quotient von 4,02.

Claims

Verfahren zur Herstellung von ¹³¹J- oder ¹²⁵J-Radio-Toluidinblau unter Verwendung von o-Toluidinblau, Radiojod und Kaliumjodid/ Kaliumjodat in salzsaurer Lösung im Verlauf einer Inkubationsbehandlung, gekennzeichnet durch die Kombination folgender Verfahrensschritte in der nachstehend angegebenen Reihenfolge:
- a) eine wäßrige Lösung des o-Toluidinblau wird mit einer Lösung von radioaktivem und von reduzierenden Substanzen freiem ^{131 (125)}Jod, vorliegend als Jodid in NaOH, versetzt,
- b) der Mischung nach a) wird eine Lösung des Kaliumjodid/ Kaliumjodat zugegeben,
- c) anschließend wird 25% HCl zugegeben und
- d) nach einer 24stündigen Inkubationsbehandlung wird nicht mit o-Toluidinblau reagiertes Jod mittels eines unter dem Handelsnamen "Dowex 1×8" erhältlichen Ionenaustauschers abgetrennt.