DE2546719A1

DE2546719A1 - Verfahren zur herstellung von l-alpha-aminosaeuren

Info

Publication number: DE2546719A1
Application number: DE19752546719
Authority: DE
Inventors: Chikahiko Eguchi; Teruhiko Kagawa; Koji Mitsugi; Ichiro Noda; Konosuke Sano; Fumihide Tamura; Kazushi Togo; Kazuhiko Yamada; Naohiko Yasuda; Kenzo Yokozeki
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1975-10-17
Filing date: 1975-10-17
Publication date: 1977-04-28
Also published as: DE2546719C2

Description

Verfahren zur Herstellung von von α-Aminosäuren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-α-Aminosäuren, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von L-Phenylalanin, L-Tryptophan und ihren Derivaten aus 5-Benzylhydantein, 5-Indolylinetbylhydantein und ihren Derivaten.
Die vorstehend genannten Hydantoine bzw. Hydanteinderivate werden mit Hilfe der Strecker'schen Reaktion aus Aldehyden hergestellt und sind Zwischenprodukte zur Herstellung von L-Aminosäuren. So werden beispielsweise diese Hydantoine mit Hilfe von Enzymen, die durch Flavobacterium proteus ATTC 12848 gebildet werden, zu L-Aminosäuren hydrolysiert (veröffentlichte japanische Patentanmeldung 13850/1967).
Es wurde nun festgestellt,daß die neu aufgefundene Species Flavobacterium aminogenes nov. sp. hauptsächlich in ihren Zellen ein Enzym bildet, das bemerkenswert hohe Aktivität für die Überführung von Hydantoinderivaten der Formel I in der R eine Phenylgruppe, substituierte Phenylgruppe, Indolyl-oder substituierte Indolylgruppe bedeutet, in L-Aminosäuren der Formel II aufeist Dabei werden die L-Aminosäuren in sehr hoher Ausbeute gebildet, wenn die Hydanteinderivate in wässriger Lösung mit dem Enzym von Flavobacterium aminogenes nov. sp. in Berührung gehalten werden.
Die Erfindung wird nachstehend im einzelnen erläutert.
Taxonomische Eigenschaften von Flavobacterium aminogenes nov. sp.
AJ-3912 (FERM-P 3133): 1) Morphologische EIgenschaften : Stäbchen einer Grösse von 0,3 bis 0,5 x 0,7 bis 0,9 Mikron, nicht pleomorph, nicht beweglich, gramnegativ, nicht sporenbildend und nicht säurefest.
2) Kultureigenschaften : Kolonien auf Nähragar : Schlechtes Wachstum, kreisförmig, konvex oder erhaben, ei-nlleitlich u.ld strohgelb.
Agar-Aufstrich : Mäßiges Wachstum, glatt, faserförmig, bernsteinfarben, glänzend, durchscheinend.
Nährbrühe : Mäßiges Wachstum, trübe, kein Wachstum an der Oberfläche, viskoides Sediment.
GElatine-Stichkultur : Streifenförmige Verflüssigung Lackmus-Mileh : Unverändert BCP-Milch : Leicht angesäuert, keine Verflüssigung 3) Phsiologische ienschaften : Aus Nitraten werden Nitrite gebildet. Denitrifikation wird nicht beobachtet; keine Indolbildung, NR-Test ist negativ,VP-Test ist negativ, H2S wird gebildet; keine Hydrolyse von Stärke; kein Verbrauch von Zitronensäure im Koser-Medium, jedoch Verbrauch von Zitronensäure im Christensen-Medium. Kein Abbau von Nitraten und Ammoniak; keine Bildung von wasserlöslichem Pigment, Urease-negativ, Oxydase-leicht-positiv, Katalase-positiv. Wachstum bei pH- 6 bis 9, günstigste Wachstumstemperatur 34°C; aerob, OF-Test : oxydierend. Bildung von Säure, jedoch keine Gasbildung aus D-lucose und keine Säurebildung und keine Gasbildung aus 1-Arabinose, D-Xylose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Lactose, Trehalose, D-Sorbit, D-Mannit, D-Inosit, Glycerin, Stärke, D-Ribose, L-Rhamnose, L-Raffinose, Erythirt, Dulcit, Cellobiose, Melibiose, Adonit, Saliein und Aesculin.
Assimilation von Essigsäure, Milchsäure, D-Glucose, D-Xylose, D-Mannit und Protocatechusäure, jedoch keine Assimilation von p-Hydroxybenzoesäure, Gluconsäure und Lactose.
Hydrolyse von Ca sein, DNS-ase-positiv; Wachstum auf 2 % NaCl, jedoch nicht auf 5%; DNS-ase-Zusammensetzung 69,0 % GC.
Nach 1,Bergey's Manual of Determinative Bacteriology1,, 8. Auflage (1974) gehört der Stanm AJ 3912 dem Genus Flavobacterium an, da er gramnegative Sräbchen bildet, nicht beweglich,aerob, Oxydase-positiv (schwach), Katalase-positiv ist, gelbe Farbbildung zeigt und Glucose nur oxydativ langsam abbaut.
Flavobacterium-Species werden in zwei Gruppen unterteilt. Die erste Gruppe hat einen GC-Gchslt von 26 bis 43 : in der DNS (Gruppe I) und die zweite Gruppe hat einen GC-Gehalt von 63 bis 70 £% (Gruppe II). Der Stamm 3912 gehört der Gruppe II an, da er einen GC-Gehalt von 69 % aufweist. Der Gruppe II gehören vier bewegliche Species und zwei nicht bewegliche Species an.
Der Stamm AJ 3912 ist nicht beweglich; er unterscheidet sich jedoch von F. capsulatum in nachstehenden Punkten : F. capsulatum ist halophil, verflüssigt Gelatine nicht und bildet keine Säure aus Lactose, Saccharose, Maltose, Xylose , Sorbit und Raffinose. Stamm 3912 unterscheidet sich auch von F. lutescens durch nachstehende Merkmale : F. luteseens ist halophil, wächst bei 37 0C und hydrolysiert Stärke, während Stamm AJ 3912 nicht halophil ist, bei 37 0C nicht wächst und Stärke nicht hydrolysiert.
Aus den vorstehend angegebenen Gründen wird Stamm hJ 3912 als neue Species betrachtet, die dem Genus Flavobacterium angehört.
Wenn Flavobacterium aminogenes nov. sp. in üblichen Medien gezüchtet wird, so wird das zur Umwandlung der Hydantoine in B-Aminosäuren befähigte Enzym hauptsächlich in den Zellen und in geringem Maß in der Kulturbrühe gebildet. Die verwendeten Kulturmedien enthalten eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Ionen und erforderlichenfalls organische Nährstoffe. Wenn das verwendete Xulturmedium eine Hydanteinverbindung der Formel I, wie 5-Indolylmethyl-hydantoin, enthält, so wird im allgemeinen eine weit höhere Enzymaktivität erzielt.
Geeignete Kohlenstoffquellen sind beispielsweise Kohlenhydrate, wie Glucose, Xylose, Saccharose, Stärkehydrolysate, Stärke odr Melassen, organische Säuren, wie Essigsäure oder Milchsaure, Alkohole, wie Äthylalkohol, Methylalkohol oder Glycerin.
Zu geeigneten Stickstoffquellen gehören beispielsweise Ammoniak, Stickstoff enthaltende Ionen und Harnstoff. Geeignete anorganische Ionen sind beispielsweise Phosphat-, Magnesium-, Ferre-, Calcium-, Kalium , Mangan-Ionen und andere übliche Ionen. Zu geeigneten organischen Spurennährstoffen gehören beispielsweise Vitamine, Aminosäureaund Rohmaterial er, welche diese organischen Spurennähratoffe enthalten, wie Hefeextrakt, Pepton, Bouillon, Maisquellflüssigkeit oder Caseinhydrolysate.
Die Züchtung wird bei einem pH-Wert von 6 bis 9 und vorzugsweise bei 20 bis 40°O unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Nach 1-bis 5-tägiger Züchtung ist in den Zellen das Enzym gebildet worden.
Als Enzymquelle werden vorzugsweise die Zellen enthaltende Eulturbrühe, intakte Zellen, Zellhomogenisat, das durch Ultraschall erhaltene Zerkleinerungsprodukt der Zellen, gefriergetrocknete Zellen oder mit Lösungsmitteln etc. getrocknete Zellen verwendet.
Proteinfraktionen, die mit Hilfe gleicher Methoden, wie durch Gelfiltration oder Aussalzen, aus dem Zellhomogenisat oder den durch Ultraschall zerkleinerten Zellen abgetrennt wurden, können ebenfalls als Enzynquelle eingesetzt werden. Es wird angenommen, daß mehrere Enzyme an der Reaktion der Umwandlung von Hydantoinderivaten in L-Aminosäuren teilnehmen.
Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Hydantoindeivate sind folgendc Verbindungen 5-Benzyl-hydantoin 5-(4'-Hydroxybenzyl)-hyndantoin 5-(3',4'-Dihydroxybenzyl)-hyndantoin 5-(2',4'-Dihydroxybenzyl)-hyndantoin 5-(3'4'-Methylendioxybenzyl)-hyndantoin 5-(3',4'-Dimethoxybenzyl)-hyndantoin 5-(3'(4t)-Methox.y-4'(3')-hydroxybellzyl)^hydantoin 5-(3',4'-Isopropylidendioxybenzyl)-hyndantoin 5-(3',4'-Cycloxexylidendioxybenzyl)-hyndantoin 5-INdolymethyl-hyndantoin 5-(5'Hydroxy-indolymethyl)-hyndantoin 5-(5'-Methyl-indolymethyl)-hyndantoin und 5-(3',4',5'-Rtihydroxybenzyl)-hyndantoin dus den entsprechenden Hyndantoinderivaten werden folgende Aminosäuren in der L-Form erhalten Phenyla lanin Tyrosin 3, 4-Dihydroxyphenylalanin 2, 4-Dihydroxyphenylalanin 3,4-Methylendioxyphenylalanin 3,4-Dimethoxyphenylalanin 3(4)-Methox.y-4(3)-hydroxyphenylalanin 3,4-Isopropylidendeioxyphenylalanin 3,4-Cyclohexylidendeioxyphenylalanin Tryptophan 5-Hydroxytryptophan 5-Methyltryptophan und 3,4,5-Trihydroxyphenylalanin Das Reaktionsgemisch enthält das Hydantoinderivat und das Enzym oder die Enzymquelle von Flavobacterium aminogenes nov. sp. Die Mengen des Hydantoin oder Hydantoinderivats in dem Reaktionsgemisch betragen gewöhnlich weniger als 50 g/dl und vorzugsweise weniger als 10 g/dl. Gewöhnlich wird als Lösungsmittel eine QJässrige Lösung eingesetzt. Hydrophile oder hydrophobe organische Lösungsmittel können zusammen mit Wasser eingesetzt werden, um die Löslichkeit der Hydantoine zu erhöhen.
Speziell bei der Bildung von L-Triptophan aus 5-Indolylme-lhylhydantoxin ist es günstig, folgende Reagenzien dem Reaktionsgemisch zuzusetzen, um eine weitere Zersetzung des L-Triptophans zu vermeiden : Na@N, NH2OH.HCl, Phenylhydrazin.HCl, Semicarbazid.HCL, Kaliumferricyanid, D-Cyclosserin, Natriumazid, Phenol und dergleichen.
Einem Reaktionsgemisch, welches 5-Dihydroxybenzylhydatoin, 5-Trihydroxybenzylhydation und 5-(5'Hydroxyindolymethil)-hydantoin enthält, Können Reduktionsmittel, wie Natriumsulfit, zugesetzt werden, um die Oxydation der Hydantoinderivate zu verhindern.
Das Reaktionagemiseh wird bei einem pH-Wert von 5 bis 11, vorzugsweine 7 bis 10, und bei einer Temperatur von 15 bis 70°C, vorzugsweise 30 bis 50°O, gehalten.
Nach 5 bis 150 Stunden hat sich die L-Aminosäure in dem Reaktionsgemisch angereichert. Die angereicherte L-Aminosäure kann in üblicher Weise, wie durch Ionenchromatographie (Ionenaustauschchromatogrsphie), gewonnen werden.
Beispiel 1 Es wurde ein wässriges Kulturmedium hergestellt, welches 0,5 g/dl Glucose, 1,0 g/dl Hefeextrakt, 1,0 g/dl Pepton, 0,5 g/dl NaCl und 0,2 g/dl DL-5-Indolylmethylhydantoin enthielt. 50 ml-Anteile des wässrigen Kulturmediums wurden in 500 ml-Schüttelkolben gegeben, die mit Dampf beheizt waren, und mit Blavobacterium aminogenes nov. sp. AJ 3912 inokuliert. Jeder Kolben wurde 16 Stunden bei 300C geschüttelt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation aus 500 ml Kulturbrühe abgetrennt, mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und in 500 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 8,0) suspendiert.
Zu je 5 ml der Suspension wurden 50 mg der in Tabelle 1 aufgeführten Hydantoine und 15 mg Natriumsulfit bei Verwendung von DL-5-(3',4'-Dihydroxybenzyl)-hydantoin und D-5-(5'-Hydroxyindolylmethyl)-hydantoin gegeben, und die Gemische wurden 24 Stunden bei 37°C gehalten.
Danach wurden die Mengen der in dem Reaktionsgemisch angereicherten L-Aminosäuren bestimmt. Die entsprechenden Werte sind in Tabelle 1 aufgeführt.

T a b e l l e 1

Hydantoinderivat angereicherte L-

Aminosäure (mg/ml)

DL-5-Benzyl-hydantoin L-Phenylalanin 8,7

DL-5-(3',4'-Dihydroxybenzyl)- L-3,4-Dihydroxyphenyl 8,9

hydantoin alanin

DL-5-(3',4'-Methylendioxy- L-3,4-Methylendioxy- 9,0

bensyl)-hydantoin phenylalanin

DL-5-(3',4'-Dimethoxybenzil)- L-3,4-Dimethoxy-phe- 0,5

hydantoin nyla lanin

DL-5-(3',-Methoxy-4'-hydroxy- L-3-Methoxy-4-hydroxy- 8,7

benzyl)-hydantoin phenylalanin

DL-5-Indolymethyl-hydantoin L-Triptophan 2,6

DL-5-(5'-Hydroxyindolylmethyl)- L-5-Hydroxytriptophan 0,72

hydantoin

DL-5-(5'-Hydroxyindolylmethyl)- L-5-Hydroxytriptophan 0,73

hydantoin

Beispiel 2 Flavobacterium aminogenes AJ 3912 wurde mit N-Ilitro-N'-methyl- N-nitrosoguanidin behandelt. Danach wurden zwei Mutanten, AJ 3939 (FERM-P 3134) und AJ 3940 (FERM-P 3135), die nicht befähigt sind , in einem Medium zu wachsen, welches L-Tryptophan als einzige Stickstoffquelle enthalt , mit Hilfe der Replikationsmethode aus den behandelten Elternstämmen isoliert.

AJ 3912, AJ 3939 und AJ 3940 wurden in 3 ml der nachstehend beschriebennen Medien I und II, die in 30 ml-Reagzensgkläser gegeben worden waren, 24 Stunden bei 30°C gezüchtet.
T a b e l l e II Medium I Medium II Glucose 5 g/l 5 g/l KH2PO4 1 g/l 1 g/l K2HPO4 3 g/l 3 g/l MgSO4*7H2o 0,1 g/l 0,1 g/l MgCl2 10 mg/l 10 mg/l CaCl2*2H2O 1 mg/l 1 mg/l Metallionen enthaltende Lösung * 1 ml/l 1 ml/l (NH4)2S04 1,5 g/l Harnstoff 1,5 g/l -L-Tryptophan - -* Metallionen enthaltende Lösung : 8800 mg ZnSO4*/h2o, 970 mg FeCl3*6H2O, 393 mg CuSO4*5H2O, 72 mg MnCL*4H2O, 37 mg (NH4)6MoO2*4 H2O und 88 mg NaB407.H20 wurden in 1 1 Wasser gegeben.
Das Wachstum wurde durch Messung der optischen Dichte der Kulturbrühe bei 562 nm bestimmt. Die dabei erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Stamm relatives Wachstsm Medium I Medium II AJ 3912 100 100 AJ 3939 98,6 10,1 AJ 3940 100 12,6 Zellen von AJ 3939 und AJ 3940 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten und die Reaktion der Hydantoinumwaldung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt. Der Stamm AJ 3939 bildete 5,4 mg/ml un-l der Stamm AJ 3940 bildete 5,6 mg/ml L-TryptoyJhan.
Beispiel 3 Flavobacterium aminogenes AJ 3940 wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet und die erhaltene Kulturbrühe wurde zur Abtrennung der Zellen zentrifugiert. Die Zellen wurden dann mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen.
10 g der Zellen wurden in 200 ml 0,1 m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 suspendiert, welche 2 g DL-5-Indolylmethylhydantoin enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 27 Stunden bei 43°C gehalten.
Das Reaktionsgemisch enthielt 1,75 g L-Tryptophan.
Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, mit Hilfe einer Ultrafiltrationsmembran filtriert und auf 30 ml eingedampft. Durch Abkühlen wurden Kristalle erhalten, die aus einer Wasser-Äthanol-Lösung umkristallisiert wurden.
Das umkristallisierte Produkt wurde in einer Menge von 1,30 g erhalten.
Die Kristalle wurden im Vergleich mit authentischem L-Tryptophan durch das NMR-Spektrum, Röntgenbeugungsmuster, den R-Wert der Papierchromatographie und durch die optische Drehung identifiziert.
Die optische Reinheit der Kristalle betrug 99,1 .
Beispiel 4 Zellen von Flavobacterium aminogenes AJ 3912 wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.
50 g der Zellen wurden in 1 1 0,1 m Phosphatpufferlösung (pH 8,0), die 3 g Natriumsulfit und 10 g D-5-(5'-Hydroxyindolylmethyl)-hydantoin enthielt, suspendiert. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei 370C gehalten und enthielt danach 0,73 g L-5-Hydroxytryptophan. In gleicher Weise wie in Beispiel 3 wurde dann 0,53 g L-5-Hydroxytryptophan in Form von Kristallen erhalten.
Die Kristalle wurden im Vergleich mit authentischem L-5-Hydroxytryptophan in der in Beispiel 3 beschrßebenen Weise identifiziert.
Die optische Reinheit der Kristalle betrug 99,2%.
Beispiel 5 Die gleiche Verfahrenweise wie in Beispiel 4 wurde durchgeführt, dabei wurde jedoch DL-Benzylhyndantoin anstelle von D-5-(5'-Hydroxyindolylmethyl)-hydantoin verwendet.
das Reaktionsgemisch enthielt 1,73 g L-Phenylalanin.
In gleicher Weise ie in Beispiel 3 wurden 1,41 g einer kristallinen Substanz erhalten. Die Kristalle wurden durch Vergleich mit autentischem L-Phenylalanin mit Hilfe des NMR-Spektrums, durch Röntgenbeugung, den Rf-Wert der Papierchromatographie und die optische Drehung identifiziert. Die optische Reinheit betrug 98,4 %.
Beispiel 6 Es wurde ein wässriges Kulturmedium hergestellt, das pro 100 ml 0,5 g Glucose, 0,5 g (NH4)2SO4, 0,1 g KH2PO4, 0,3 g K2HPO4, 0,01 4 MgS04.7H20, 0,001 g CaC12.2tI20, 5 ml Maisquellflüssigkeit enthielt und auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt war. 50 ml-Änteile dieses Mediums wurden in 500 ml-Kolben gegeben.
Nach dem Sterilisieren während 15 Minuten bei 1200C wurde das Medium mit dem Stamm AJ 3940 angeimpft und unter Schütteln 12 Stunden bei 30°C gehalten.
Das gleiche Medium wie das vorstehend beschriebene wurde zusätzlich mit 0,35 g/dl DL-5-Indolylmethylhydantoin versetzt und mit 2,5 ml der vorstehend angegebenen Kulturbrühe angeimpft und danach unter Schütteln 20 Stunden bei 300C gehalten.
Zu der Kulturbrühe (5 ml) wurden jeweils 250 nig der in Tabelle 4 aufgeführten Hydantoinderivate gegeben und das Gemisch wurde 90 Stunden bei 40°C gehalten. Bei Verwendung von 5-(5'-Hydroxyindolyl methyl) -hydant oln und 5-(3',4'-Dihydroxybenzyl)-hydantoin wurden der Suspension außerdem 15 mg Natriumsulfit zugesetzt. In dem Reaktionsgemisch wurden die in der nachstehenden Tabelle 4 angegebennen Mengen an L-Aminosäuren angereichert.
T a b e 1 1 e 4 Hydantoinderivat angereicherte Aminosäure mg/ml DL-5-(3',4'-Dihydroxybenzyl)- L-3,4-Dihydroxyphenyl 27,0 hydantoin alanin DL-5-(3',4'-Methilendioxybenzyl)- L-3,4-Methylendioxyphe- 44,5 hydantoin nylalanin DL-5-(3',4'-Dimethoxybenzyl)- L-3,4-Dimethoxy- 3,1 hydantoin phenylalanin DL-5-(3'-Methoxy-4'-hydroxyben- L-3-Methoxy-4-hydroxy- 12,4 zyl)-hydantoin phenylalanin DL-5-Benzyl-hydantoin L-Phenylalanin 42,6 DL-5-(5'-Hidroxyindolymethyl)- L-5-Hydroxytryptophan 8,9 hydantoin Beispiel 7 Zu der in Beispiel 6 beschriebenen Zellsuspension wurden 250 mg DL-5-Indolymethyl-hydantoin, 290 mg Inosin und 50 mg KH2PO4 geoeben, das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 8,1 eingestellt und danach 110 Stunden bei 400C gehalten.
Das in dem Reaktionsgemisch ausgefällte Inosinsalz von L-Tryptophan wurde gelöst, indem zu dem Reaktionsgemisch 5 ml ln NTaOH zu gesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch enthielt 44,5 mg/ml L-Tryptophan.
Beispiel 8 Zellen von Flavobacterium aminogenes AJ 3912 (15 g), die in gleicher Weise wie in Beispiel 1 erhalten worden waren, wurden in 300 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung vom pH 8,0 suspendiert.
Der Suspension wurden 3 g 5-(3',4'-Methylendiioxybenzyl)-hydantoin (Reaktionsgemisch I) oder 3 g 5-(3',4'-Dihydroxybenzyl)-hydantoin und 0,9 g Natriumsulfit (Reaktionsgemisch II) oder 3 g 5-(3'-Iiethoxy-4'-hydroxybenzyl)-hydantoin und 0,9 g Natriumsulfat (Reaktionsgemisch III) zugesetzt. Die so erhaltenen Reaktionsgemische wurden 30 Stunden bei 37°C gehalten. Danach enthielt das Reaktionsgemisch I 2,73 g L-3,4-Methylendioxyphenylalanin, das Reaktionsgemisch II 2,65 g L-3,4-Dihydroxyphenylalanin und das Reaktionsgemisch III 2,78 g L-3-Methoxy-4-hydroxyphenylalanin.
In gleicher Weise wie in Beispiel 4 wurden 1,54- g L-3,4-Methylendioxyphenylalanin in Form von Kristallen, 1,92 g L-3,4-Dihydroxyphenylalanin in Form von Kristallen und 1,71 g L-3-Methoxy-4-hydroxyphenylalanin in Kristallform gewonnen.
Beispiel 9 Nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren wurden Reaktionsgemische hergestellt, die 25 mg DL-5-Indolymethyl-hyndantoin sowie außerdem die in Tabelle 5 aufgeführten Zusätze enthielten. Die Reaktionsgemische wurden 16 Stunden bei 370C gehalten.
Die in dem Reaktionsgemisch angereicherten Mengen an L-Trytophan sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5 Zusatz Konzentration angereichertes Tryptophan (g/ml) keiner --- 1,93 NH2OH.HCl 50 4,14 Phenylhydrazin.HCl 50 4,32 NaCN 5 2,58 Semicarbazid.HCl 5 2,48 Kalium-ferricyanid 5 2,64 D-Cycloserin 5 2,59 Natriumazid 50 3,33 Phenol 5 2,31 Die FERM-P-Nummern, mit denen die erfindungsgemäß eingesetzten Stamne von Flavobacterium aminogenes nov. sp. bezeichnet sind, sind Eintragungsnummern, die sie bei der Hinterlegung bei dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Inage, Chiba-shi, Japan, erhalten haben. Alle mit FERM-P-Nummern bezeichneten Stämme sind von dem Fermentation Research Institute zu erhalten.

Claims

P a t e n t a n s p p r ii c h e 1. Verfahren zur Herstellung einer L-Aminosäure der Formel der R eine Phenyl- oder substituierte Phenylgruppe, eine Indolyl- oder subtituierte IndolylÖruppe bedeutet, durch enzymatische Hydrolyse eines Hydantions der Formel in wässriger Lösung und anschließende Gewinnung der gebildeten L-Aminosäure aus der wässringen Lösung, dadurch g e k e n n z e i c h n e t , daß man die Hydrolyse des Hydantions bei einem pH-Wert der wässrigen Lösung von 4 bis 11 in Gegenwart einer wirksamen Menge eines Rnzyms von Flavobacterium aminogenes nov. sp. durchführt, das zur Umwandlung des Hydantoins in die L-Aminosäure befähigt ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß man als Ausgangsverbindung 5-Benzylhydantoin einsetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß man als Ausgangsverbindung 5-Indolylmethyl-hydantoin einsetzt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e e k e n n-z e i c h -n e t , daß man als Ausgangsverbindung 5-(3',4'-Dihydroxybenzyl)-hydantoin einsetzt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß man als Hydantoin 5-(3' oder 4' -Methoxy-4' oder 3'-hydroxybenzyl)-hydantion einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß man als Ausgangsverbindung 5-(3' $-Methylendioxyben zyl)-hyndantion einsetzt.
7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n -n- z e i c h -n e t , daß man als Ausgangsverbindung 5-(3',4'-Isopropylidendioxybenzyl)-hydantoin einsetzt.
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß man als Ausgangsverbindung 5-(5'-Hydroxy-indolymethyl)-hydantoin einsetzt.
9. Verfahren nach anspruch 1, dadurch g e k e n n z e i c h -n e t , daß man als Ausgrngsverbindung 5-(3',4'- Dimethoxybenzil)-hydantoin einsetzt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß man ein Enzym verwendet, das durch eine Mutante von Flavobacterium aminogenes nov. sp. gebildet wird, die nicht befähigt ist, in einem Medium, das L-TCryptophan als einzige Kohlenstoffquelle enthält, zu wachsen.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß man ein Enzym verwendet, das durch Flavobacterium aminogenes nov. sp. FERM-P 3133, 3134 oder 3135 gebildet wird.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch g e -k e n n s e i c h n e t , daß man ein Enzym verwendet, das durch Züchtung von Flavöbacterium aminogenes nov. sp. in einem das Äusgangahydantein enthaltenden wässrigen Eulturmedium gebildet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß man das Enzym in Form eines Zellhomogenisats, von ultraschallbehandelten Zellen oder gefriergetrockneten Zellen als Enzymquelle einsetzt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch g e -k e n n z e i c h n e t , daß man der wässrigen Lösung außerdem Hydroxylamin-hydrochlorid, Phenylhydrazin-hydrochlorid, Natriumcyanid, Semicarbazid-hydrochlorid, Kaliumferricyanid, D-Cycloserin, Natriumazid oder Phenol zusetzt.