DE2544298C3 - Spektralphosphorimeter - Google Patents

Description

Biochemie und Laserforschung erfordern oft eine Kenntnis der Spektren, Lebensdauer und Quantenausbeuten von Molekülfarbstoffen.

In F i g. 1 ist das Signal Vo, 31 im Signalkanal 13 gegen das Referenzsignal 20 phasenverschoben und wird (anders als in der konventionellen Phasenfluorimeirie) nur teilweise zur weiteren Signalverarbeitung ausgenützt Der gewünschte Ausschnitt des Signals, das Tor Δ,

29, ist dem Wirkungsgrad D= ψ proportional, wobei

ω= -γ- die Frequenz des Referenzsignals 20 ist.

Dadurch werden alle Signale unterdrückt, die zeitlich wesentlich (d. h. mindestens eine Zehnerpotenz) schneller abklingen als der Frequenz des Referenzsignals 20 entspricht Eine 100%ige Trennung von zeitlich langsam abklingenden Signalen (Phosphoreszenzemission) von zeitlich schnell abklingenden Signalen (Fluoreszenz- und Streulicht, Fluoreszenz von Verunreinigungen und Photoprodukten) ist dadurch möglich.

Der Lichtverschluß im Emissionslichtstrahl wird durch einen schnellen elektronischen Schalter (Spannungsteiler, bestehend aus dem Widerstand A₁, 15 und dem Schalttransistor 14) ersetzt, der zwischen dem Detektor 10 und den LIV 11 eingebracht wird. Der Lichtverschluß im Anregungslichtstrahl 2 besteht aus einer rotierenden Lochblende 4 (o. ä.), die ohnehin als Referenzsignal 20 für den LIV11 benötigt wird.

Die Spannung Vl, 16 für den LIVIl, dessen Eingangswiderstand Z_1n= 10 M ist, wird an einem Spannungsteiler abgegriffen, bestehend aus dem Widerstand 15, R\ = 27 k und dem Schalttransistor 14, dessen Widerstand von der Vorspannung V& 18 abhängt. Im Zustand »HIGH« (Vb= -6 V) ist sein Widerstand etwa 50 Ω, im Zustand »LOW« (Vc=OV) ist er größer als 10⁷Ω. Durch Schalten des Schalttransistors 14 fällt die Spannung Vt, 16 am Eingang des LIV 11 von der Spannung 31 Vp (»HIGH«) auf weniger als 0,002 · V_D (»LOW«) ab, ein Wert, der normalerweise vernachlässigt werden kann. Um die Phase »NULL« zwischen dem Referenzkanal 21 und dem Signalkanal 13 herzustellen, ist ein Phasenschieber 37 vorgesehen.

Die Vorspannung V₀,18 wird von einem Komparator 17 erzeugt (siehe Fig. 2). Die Kombination aus Potentiometer R_a 19, Diode 25 und Kondensator 26 garantieren, daß die Spannung U_a 32, die auf den negativen Eingang des Operationsverstärkers (Abkürzung OPV) 27 gelegt wird, ein konstanter Bruchteil der Amplitude t.'„„», 28 des Referenzsignals 20 ist. Auf den positiven Eingang des OPV 27 wird die erste Harmonische 23 des Referenzsignals 20 gelegt. Dadurch ist die Größe des Wirkungsgrades D allein durch die Größe des Potentiometers R_a 19 bestimmt, unabhängig von Schwankungen der Amplitude U_ma\, 28 des Referenzsignals 20.

Durch die Erfindung werden folgende Vorteile erzielt:

1. Die Größe des Fensters Δ, 29 und damit der Wirkungsgrad D, kann stufenlos variabel durch Veränderung der Spannung U_a 32 eingestellt

werden. Der Wirl·
Funktion von

D= ist nur eine

U,-U,„„_x

und ist für alle Frequenzen der rotierenden Lochblende 4 konstant Die Neueinstellung bei jeder Frequenz ist nicht mehr erforderlich.

2. Die Amplitude A und Phase φ von Vl, 16 ist

bestimmt durch den Wirkungsgrad D= _T und die

Frequenz ω der Lochbiende 4, wobei D und ω einstellbar sind. Es ist dadurch möglich, sehr genaue Lebensdauer- und Intensitätsmessungen auch eines sehr schwachen, langsam abklingenden Signals ίο (Phosphoreszenz) trotz einer überlagerten starken

Fluoreszenz durchzuführen (siehe Veröffentlichung »Phasenfluorimetry with variable duty cycle« F. Grüneis, et al. Scientific Instruments).

3. Unter Weglassung des elektronischen Schalters, d.h. indem man den Detektor 10 direkt mit dem LIV 11 verbindet, ist das Gerät sofort als Spektralfluorimeter verwendbar, d. h. Fluoreszenzemission ist beobachtbar.

F i g. 2 zeigt ein Ausführungsbeispiel der elektronisehen Schaltung. Um Schaltspitzen zu kompensieren, die durch die Kapazität zwischen Tor und Drain des Schalttransistors entstehen, erzeugt man einen konvertierten Puls mittels eines OPV 33, dessen Ausgang mit dem Drain mit einer Kapazität 34 von 50 pf verbunden ist.

Mit dem driftarmen OPV 36 wird die Leistungsanpassungsschaltung 24 hergestellt. Die Änderung seiner Verstärkung mittels des Potentiometers A₁, 35 gewährleistet eine Renormalisierung von Vi., 16, wenn der Wirkungsgrad Dgeändert wird.

Die verschiedenen variablen Widerstände werden folgendermaßen eingestellt:

Das Potentiometer A₁, 19 wird so geregelt, daß das schnell abklingende Signal gerade unterdrückt wird,

d. h. ein Fluoreszenzsignal verschwindet. Dann wird der Eingangsruhestrom (bestimmt durch das Potentiometer Ro, 30) des OPV 36 so gewählt, daß der LIV 11 Null Volt anzeigt, wenn der Detektor 10 nicht beleuchtet wird. Damit wird der Dunkelstrom des Detektors 10 kompensiert, dessen Beitrag zum Ausgang bei V/, !6 sich ändern würde, wenn man den Wirkungsgrad D ändert. Mit dem Potentiometer R_n 35 kann man schließlich die gewünschte Verstärkung einstellen.

Um die Effektivität der vorgeschlagenen Methode zu

■45 demonstrieren, wurde die Emissionsspektren zweier Lösungen gemessen, nämlich 10 ^J molares Benzophenon (Φρ= 0,3) und 10 -² molares Azulen (Φι- = 0,03), beide in Äthanol bei 77⁰K. Mit Hilfe der konventionellen Phasenfluorimetrie wurde die Phosphoreszenzlebensdauer zu (5,5 ± 0,5) · 10-³ see bestimmt. Danach werden beide Lösungen gemischt. Das aufgenommene Spektrum ist eine Überlagerung der beiden Einzelspektren (siehe F i g. 3, Kurve a). Eine Lebensdauermessung der Phosphoreszenz des Benzophenon ist unmöglich, da sie mit der Fluoreszenz des Azulens überlappt. Das Emissionsspektrum, das mit der Methode der Phasenfluorimetrie mit variablem Wirkungsgrad (D= ) aufge-

Is

nommen wurde, erwies sich identisch mit dem Spektrum bo des reinen Benzophenon (siehe F i g. 3, Kurve b). Die Fluoreszenz des Azulens wurde also völlig unterdrückt. Die Phosphoreszenzlebensdauer wurde bestimmt mit der Methode, die oben dargestellt ist und gab als Ergebnis (5,5 ±0,5) · 10^Jsec, wie im Fall der konvenb5 »'onellen Phasenfluorimetrie. Damit ist bewiesen, daß eine Messung der Phosphoreszenzlebensdauer auch in Gegenwart eines schnell zerfallenden Signals möglich ist.

Hierzu 3 Hliitt Zeichnungen

Claims (6)

Patentansprüche:

1. Spektralphosphorimeter mit folgenden Merkmalen:

a) eine gepulste Lichtquelle bestrahlt eine zu untersuchende Probe

b) die von der Probe ausgehende Lumineszenzstrahlung wird von einem Detektor empfangen

c) das Detektorsignal wird dem ersten Eingang eines Vergleichers, z. B. eines phasenempfindlichen Verstärkers, zugeführt

d) es sind Mittel zum Erzeugen eines zur Lichtquelle nach a) frequenzgleichen Referenzsignals vorgesehen, das dem zweiten Eingang des Vergleichers zugeführt wird

e) es sind Einrichtungen vorgesehen, dte mit Hilfe des Signals nach d) ein Tor für den Betrieb des Detektors nach b) in den Dunkelpausen der Bestrahlung der Probe durch die Lichtquelle nach a) öffnen,

gekennzeichnet durch folgende Merkmale:

f) ein Filter für höhere Harmonische macht das Referenzsignal nach d) nicht rechteckfermig

g) eine veränderbare Amplitudenbegrenzung des Signals nach f) liefert an den Einsatzpunkten Signale für die Schaltpunkte der Einrichtungen nach e) zum öffnen des Tores, wobei die Öffnungsdauer kleiner als die Dunkelpause und veränderbar ist

h) ein eigener Phasenschieber im Referenzkanal nach d) ermöglicht die relative Veränderung der zeitlichen Lage der Öffnungsdauer des Tores zur Dunkelpause.

2. Spektralphosphorimeter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Signal nach f) sinusförmig ist.

3. Spektralphosphorimeter nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Filter nach f) das Eingangsfilter eines nach c) benützten phasenempfindlichen Verstärkers benützt wird.

4. Spektralphosphorimeter nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnungsdauer des Tores und die Lage des Tores nach g) und h) so eingestellt sind, daß die schnell abklingende Fluoreszenz praktisch völlig abgetrennt wird und nur die langsamer abklingende Phosphoreszenz empfangen wird.

5. Spektralphosphorimeter nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Einsatzpunkte nach g) symmetrisch zur Mitte der Dunkelpause liegen.

6. Spektralphosphorimeter nach Anspruch 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Einsatzpunkte nach g) unabhängig von Amplitudenschwankungen des sinusförmigen Signals nach f) sind, wobei die Einsatzpunkte nach g) mittels eines Operationsverstärkers erzeugt werden, daß das Signal nach f) dem positiven Eingang des Operationsverstärkers zugeführt ist, während der negative Eingang (invertierender Eingang) über einen Kondensator mit Masse und über die Diode mit einem Potentiometer verbunden sind, das zwischen positivem Eingang und Masse liegt.

Die Erfindung betrifft ein Spektralphosphorimeter nach dem Oberbegriff des Anspruches 1.
Aus den Vorveröffentlichungen

(a) DE-OS 24 02 405,
(b) Analytical Chemistry, Vol. 45, No. 8, July 1973, p.

1581,
(c) Applied Optics. Vol. 12, June 1973, p. 1286

sind bereits Spektralphosphorimeter bekannt, die

ίο ermöglichen, überlagertes Fluoreszenzlicht

(τ sz 10-⁹S = schnell abklingendes Signal) von Phosphoreszenzlicht (ttssIO-⁴ bis 100s = langsam abklingendes Signal) zu trennen. Diese bestehen im Prinzip aus zwei synchrongeschalteten Lichtverschlüssen, dessen einer im Anregungslichtstrahl einer Probe und dessen anderer im Emissionslichtstrahl angeordnet ist Die Lichtverschlüsse werden wechselweise so geöffnet bzw. geschlossen, daß der Emissionslichtstrahl einen Detektor nur während der Dunkelperiode des Anregungslichtstrahls erreicht Durch einen elektronischen oder mechanischen Schalter wird aus dem Emissionslichtstrahl mittels eines Tores ein bestimmter Bereich ausgeblendet, der für die weitere Meßauswertung verwendet wird.

j Der Nachteil des in (b) beschriebenen Gerätes besteht dann, daß mit einer festen Frequenz des Anregungssignals gearbeitet wird; ein weiterer Nachteil ist, daß die Einsatzpunkte für Beginn und Ende des Tores durch Schlitze in einer mechanischen Lochblende erzeugt

jo werden. Will man diese Einsatzpunkte für Beginn und Ende des Tores verändern, so muß man die Schlitze der Lochblende verändern.

Der Nachteil des bekannten Gerätes, das in (c) beschrieben wird, besteht darin, daß die Einsatzpunkte

ji für Beginn und Ende des Tores bei jeder Frequenz des Detektorsignals neu bestimmt und von Hand neu eingestellt werden müssen. Dies erschwert die Bedienung und führt zu Meßungenauigkeiten, weil das Tor nur ungenau in den optimalen Bereich gelegt werden kann.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Spektralphosphorimeter zu schaffen, bei dem durch eine elektronische Schaltung bei jeder Frequenz des Detektorsignals das Tor automatisch in den optimalen Bereich der

4^r) Dunkelperiode gelegt wird.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die im Kennzeichen des Anspruch 1 beschriebene Maßnahme gelöst. Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen 2 bis 6 beschrieben.

"ίο Anhand der Zeichnung wird die Erfindung näher erläutert.
Es zeigt

Fig. 1 ein Blockschaltbild eines Spektralphosphorimeters,

ν") F i g. 2 ein Detailschaltbild des Spektralphosphorimeters nach der Erfindung,
F i g. 3 Einzelspektren.

Das Spektralphosphorimeter nach der Erfindung enthält einen phasenempfindlichen Verstärker (Lock-in-

wi Verstärker, Abkürzung LIV), der zur Messung der Phase und Intensität eines gegen ein Referenzsignal 20 phasenverschobenen elektrischen Signals Vo, 31 (z. B. Detektorstrom) verwendet wird. Solche Spektralphosphorimeter werden vor allem für Lichtmessungen in der

hi Atom- und Molekülspektroskopie eingesetzt, um Phosphoreszenzspektren, Lebensausdauer sowie Quantenausbeuten von Atomen und Molekülen zu messen. Arbeiten auf dem Gebiet der analytischen Chemie,