DE2525825A1 - Makromolekulare adeninderivate und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents
Makromolekulare adeninderivate und verfahren zu ihrer herstellungInfo
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Description
8 MÜNCHEN OO SCIIWEIGEHSTHASSE a
TKLKFOW (08B) 60 20 .Tl
TIUI 5 24 070
mCncjikn
1A-46 597
Beschreibung zu der Patentanmeldung
SNAJIPROGETTI S.p.A.
Mailand, Italien, Gorso Venezia,16
betreffend
Makromolekulare Adeninderivate und Verfahren zu ihrer Herstellung
Die Erfindung bezieht sich auf makromolekulare Adeninderivate
und deren Herstellung. Die erfindungsgemäßeη
Verbindungen entsprechen der allgemeinen Formel
OH
NH-CH2-CH-C CH2 ) α-σ-*Γ
ι ,
worin η = 1, 2, 3 oder 4 ist und das Radikal
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von einer beliebigen Verbindung mit Adeninkern stammen
kann, z.B. von Nikotinamidadenindinucleotid, Mkotinamidadenindinuoleotid-Phosphat,
Adenosinmonopliospliat, cyclisches Adenosinmtmophosphat, Adenosindiphosphat,
Adenosintriphospbat, Adenosin selbst oder Ademin.Das in Formel I an die CO-Gruppe gebundene Stickstoffatom gehört
einer hoch-molekularen Verbindung an, die in Wasser löslich oder unlöslich sein kann und eine oder mehrere primäre oder
sekundäre Aminogruppen enthält; Beispiele für derartige hoch-molekulare Verbindungen sind: Polylisin,(>j-Aminoalkylpolyacrylamide,
Polysaccharidester oder <jO -Aminoalkylcarbaminsäuren,
Polyvinylamin,lO-Aminoalkylester oder co-Aminoalkylamide
von Polyglutaminsäure, Glas-Aminoalkylsilicium mit
einem Gehalt an Mikrosphären, Polyäthylenimin usw.
Aus der eigenen italienischen Patentanmeldung 22105 A/74
vom 30. April 1974 ist ein Verfahren zur Herstellung von Adeninderivaten bekannt, wobei diese dadurch funktionell
gemacht werden, daß man eine Verbindung mit einem Adeninkern mit Carbonsäuren oder Esterepoxiden umsetzt. Die Umsetzung
erfolgt solange bis die Amingruppe in 6-Stellung des Adeninkerna funktionell gemacht ist, so daß man Verbindungen
der allgemeinen !Formel
OH
NH-CH2-CH-C CH2)n-COOH
NH-CH2-CH-C CH2)n-COOH
I
worin η d.ie obige Bedeutung hat, erhält.
worin η d.ie obige Bedeutung hat, erhält.
Es wurde nun gefunden, daß die wie oben funktionell gemachten Verbindungen mit einem Polymer reagieren können,
welches mindestens eine primäre oder sekundäre Aminogruppe
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enthält; in Anwesenheit eines Carbodiimides, das entweder wasserlöslich sein kann, wie z.B. N-Äthyl-Nl-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidcfilorhydrat
oder nicht wasserlöslich (z.B. Njli'-Dicyclohexylcarbodiimid), als Kondensationsmittel erhält man dann die oben definierten makromolekularen
Adeninderivate.
Die Kondensationsreaktion zwischen der Carboxylgruppe des funktionell gemachten Adeninderivates und der Aminogruppe
des Makromoleküls, bei der eine Amidbindung entsteht, wird durchgeführt in Wasser oder in einem Gemisch aus Wasser und
einem wasserlöslichen organischen lösungsmittel, wie Pyridin, Tetrahydrofuran, Dioxan usw.; die Umsetzungstemperatur liegt
zwischen 5 und 500C, wobei Raumtemperatur bevorzugt ist.
Die erfindungsgemäßen makromolekularen Adeninderivate werden auf verschiedene Weise Verwendet. So können beispielsweise
die makromolekularen Nikotinamid-adenindinuklßotid-(HAD)-Derivate
(und das gleiche gilt auch für die anderen makromolekularen Derivate) in der Affinitätschromatographie oder
als sich nicht ausbreitende Coenzyme verwendet werden.
Was also die Verwendung von wasserlöslichen Makromolekülen betrifft, so können diese als wasserlösliche, sich nicht ausbreitende
makromolekulare Coenzyme Verwendung finden. Dies verbreitert das Anwendungsfeld der bekannten enzymatischen
Systeme, bei denen das Enzym physikalisch in unlösliche Strukturen, wie Fasern, Polyacrylamidgel, Mikrokapseln usw.,
die makromoleküldicht sind, eingeschlossen ist.
Praktisch sind, falls ein Enzym- oder ein polyenzymatisches
System zusammen mit dem wasserlöslichen makromolekularen Coenzym eingeschlossen ist, beide Bestandteile in inniger
Berührung und deswegen wird das Coenzym nicht außerhalb der umschließenden Struktur dispergiert, was bisher aufgrund des
niedrigen Molekulargewichtes von Coenzymen nicht möglich war.
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Was die Verwendungsmöglichkeit für wasserunlösliche Makromoleküle betrifft, so können diese Derivate verwendet
werden für die Affiaitätschromatographie oder für enzymatische Reaktionen, die in heterogener Phase durchgeführt
werden müssen und bei denen das Coenzym wiedergewonnen werden kann.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen sei
anhand folgender Beispiele beschrieben:
Herstellung von 4-(NAD-N )-3-hydroxybutyril-PEI (Formel I,
worin η = 1; IiC ist der Polyäthylenünin-/PEl7"-rest und
NAD entspricht dem Radikal
NH
N )
127 mg Polyäthyleniminchlorbydrat mit einem pH-Wert von 6 (hergestellt durch Zusatz von konzentrierter HCl zu PEI
mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 und nachfolgendem Eindampfen zur Trockne) in wässriger Lösung mit einer
Konzentration von 25 % (Gewicht/Volumen) wurden versetzt mit 10 mg Nikotinamid-6-(2-hydroxy-3-carboxypropylamino)-purindinucleotid
(Formel II,worin η = 1 und
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die in 0,125 ml destilliertem Wasser gelöst waren, und
daraufhin mit 10 mg NjlP-Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst
in 0,125 ml Pyridin.
Das Gemisch wurde 36 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten und filtriert. Das mit dem Waschwasser vereinigte
Piltrat (Gesamtvolumen =10 ml) wurde in ein Zentrifugengefäß überführt und dort mit 10 ml 1 M Phosphatpuffer
bei pH 6 gefällt. Nach 10 Minuten langem Zentrifugieren bei 39 OOOxg wurde die überstehende Lösung von dem
Polymerniederschlag abgezogen. Zwecks weiterer Reinigung wurde das Polymer in 2 ml einer wässrigen Lösung gelöst,
die 2 M HaCl und 0,05 M Acetatpuffer enthielt und einen pH-Wert von 5,5 hatte. Die so erhaltene Lösung wurde nach
Zugabe von 8 ml Wasser wieder mit 10 ml 1 M Phosphatpuffer
bei pH 6 ausgefällt und 10 Minuten bei 39 OOOxg zentrifugiert, worauf das Polymer wie oben durch Dekantieren gewonnen
wurde. Der Reinigungsvorgang wurde viermal wiederholt.
Das Produkt wurde wieder in einer Lösung von 2 M HaOl und 0,05 M Acetatpuffer (pH 5,5) gelöst und dann in einem
Dialyseteströhrchen 24 Stunden gegen 250 ml einer Lösung, die 2 M NaCl und 10"^M HCl enthielt, dialysiert. Das gleiche
wurde dann dialysiert gegen Portionen von 250 ml 10 M HCl und zwar 4 Tage lang, wobei die Lösung täglich gewechselt
wurde; das in dem Dialysetestrohr enthaltene Produkt wurde durch Lyophilisierung gewonnen. Es wurden 90 mg Polymer erhalten;
X___ bei 266 nm.
Die Bestimmung von NAD, aktiv als Coenzym und durch Covalenzbindung
an das Polymer gebunden, wurde durchgeführt in wässriger Lösung des Polymers mit Hilfe einer quantitativen
enzymatisehen Reduktion mit Alkohol-Dehydrogenase aus
Hefe in einem 0,15 N Iris-Puffer bei pH 9 in Anwesenheit von 0,5 M Äthylalkohol und 0,075 M Semicarbazidchlorhydrat.
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Die bei 340 nm durchgeführte spektrophotometrisohe
Messung von UADH ermöglichte die Bestimmung, daß je '
Gramm Polymer 28,5 yuMol~NAD, das enzymatisch reduzierbar
war, gebunden waren.
Das so erhaltene makromolekulare NAD zeigte gegenüber
natürlichem NAD in Anwesenheit von verschiedenen Dehydrogenasen eine bemerkenswerte Coenzymaktivität. So zeigte
es beispielsweise in Anwesenheit von Lactico-dehydrogenase aus dem Kaninchenmuskel eine spezifische Aktivität
von 55 i° in Bezug auf natürliches Coenzym. Die Bestimmung wurde durchgeführt in einem 0,1 M Ammoniumoarbonatpuffer
bei einem pH-Wert von 8,5 und 250C,
Herstellung
worin η =Ί; NC= Polyäthylenimin-^PElJ-rest und
Herstellung von 4-(NAD-N )-3-hydroxybutyril-PEI (Formel I,
NAD-Rest =
125 mg PEI, erhalten gemäß Beispiel 1 bei pH 6 in wässriger Lösung von 25 $ (Gewicht/Volumen) wurden versetzt mit
40 mg Nikotinamid-6-(2-hydroxy-3-carboxypropylamino)purindinucleotid
(Formel II, worin η = 1 und NAD die obige Bedeutung haben), gelöst in 0,5 ml Wasser, worauf noch 40 mg
N-Äthyl-N'-(3-dimetbylaminopropyl)carbodiimidchlorhydrat,
gelöst in 0,5 ml Wasser, zugesetzt wurden· Das Gemisch wurde mit 1 M NaOH auf pH 5,5 gebraoht und 48 Stunden unter
Rühren bei Raumtemperatur gehalten,
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Nach Auffüllen mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 ml wurde die Lösung in ein Zentrifugengefäß überführt und
dort mit 10 ml 1 M Phospharpuffer bei pH 6 gefällt. Nach
10 Minuten langem Zentrifugieren bei 39 OOOxg wurde die Lösung vom Niederschlag abgezogen. Zur weiteren Reinigung
wurde das Polymer in 10 ml einer Lösung von 2 M NaCl und 0,05 M Acetatpuffer bei pH 5,5 gelöst. Der so erhaltenen
Lösung wurden 8 ml V/asser zugefügt, worauf sie wiederum mit 10 ml 1 M Phosphatpuffer bei pH 6 versetzt und dann
10 Minuten bei 39 OOOxg zentrifugiert wurde, worauf das Polymer durch Dekantieren gewonnen wurde. Dieser Reinigungs—
Vorgang wurde viermal wiederholt.
Das gereinigte Produkt wurde wieder in einer Lösung von 2 M NaOl und 0,05 M Acetatpuffer bei pH 5,5 gelöst und die
Lösung in eine Dialysegefäß überführt und 24 Stunden gegen 250 ml einer Lösung von 2 M NaGl und 10"^M HCl dialysiert.
Dann wurde das Produkt gegen Portionen von je 250 ml 10 M HCl dialysiert, und zwar vier Tage lang, wobei die Lösung
täglich gewechselt wurde; das im Dialysegefäß enthaltene Produkt wurde durch Lyophilisierung gewonnen.
Man erhielt 85,7 mg Polymer;k^„^ bei 266 nm.
max
Die Bestimmung von NAD, aktiv als Coenzym und durch Covalenzbindung
an das Polymer gebunden, wurde durchgeführt in wässriger Lösung des Polymers mit Hilfe einer quantitativen
enzymatischen Reduktion mit Alkohol-Dehydrogenäse aus Hefe
in 0,15 M Tris-Puffer bei pH 9 in Anwesenheit von 0,5 M
Äthylalkohol und 0,075 M Semicarbazidchlorhydrat. Die spektrophotometrische Messung des gebildeten NADH-Derivates
bei 340 nm erlaubte die Annahme, daß je Gramm Polymer 125 «Mol enzymatisch reduzierbares NAD gebunden waren.
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Herstellum
worin α = 1; N1C = Poly~Ir-lysia-/PLYS7-rest und
Herstellung von 4-(NAD-Ii6)-3-hydroxybutyril-PLYS (Formel I,
NH-
100 mg Poly-L-lysinbromhydrat mit einem Molekulargewicht
von ungefähr 50 000, gelöst in 1 ml Wasser, wurden versetzt mit 40 mg Nikotinamid-6-(2-hydroxy-3-carboxypropylamino)-purindinucleotid
(Formel II, worin η und NAD die obige Bedeutung haben), gelöst in 0,5 ml Wasser, worauf 40 mg N-Äthyl-Nf-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidchlorhydrat,
gelöst in 0,5 ml Wasser, zugefügt wurden. Der pH-Wert des Gemisches wurde mit 1 M NaOH auf 5,5 gebracht und das Gemisch
dann unter Rühren 48 Stunden bei Raumtemperatur gehalten·
Daraufhin wurde das Gemisch in ein Dialysegefäß überführt und 24 Stunden gegen 250 ml einer Lösung von 2 M NaCl und
10 M HCl dialysiert· Anschließend wurde es gegen Portionen von 250 ml 10 M HCl dialysiert, und zwar 4 Tage lang, wobei
die Lösung täglich gewechselt wurde. Das in dem Dialysegefäß enthaltene Produkt wurde durch Lyophilisierung gewonnen;
man erhielt 45,4 mg Polymer; λ _o_ bei 266 nm.
Die Bestimmung von NAD, aktiv vom Gesichtspunkt eines Coenzyms aus und durch Covalenzbindung an Poly-L-lysin gebunden,
wurde mit Hilfe der Spektrophotometrie durchgeführt, und zwar nach enzymatisch quantitativer Reduktion des Polymers
mit Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe in 0,15 M Tris-Puffer
bei pH 9 in Anwesenheit von 0,5 M Äthylalkohol und 0,075 M Semicarbazidchlorhydrat; die Ablesung bei 340 nm ergab
90/uMol enzymatisch reduzierbares NAD je Gramm Polymer,
gebunden durch Covalenzbindung.
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Herstellung von 4-(NAD-N6-3-hydroxybutyril-AHSEPH (Formel
I, worin η = 1, N- = Radikal von Sepharose 4B, funktionell
gemacht mit Hilfe der Cyanogen-bromid-Methode mit 1,6 Diaminohexan, enthaltend 6 bis 10 Mol Aminreste
je Gel ml
NH-
NAD =
500 mg AHSEPH (Handelsname AH-Sepharose-4B) wurden verschäumt durch 0,5 M NaCT-Lösung und mit 200 ml 0,5 M NaCl
und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Wenn das Gel ein Volumen von etwa 2 ml erreicht hatte, wurde es
versetzt mit 92 mg Nikotinamid-6-(2-hydroxy-3-carboxypropylamin)purindinucleotid
(Formel II, η und NAB wie oben), gelöst in 2 ml destilliertem Wasser, worauf der pH-Wert mit
1 M NaOH auf 5 gebracht wurde. Die Suspension wurde mit Hilfe eines Rührwerks mit niedriger Umlaufzahl bei Raumtemperatur
gerührt, worauf ihr tropfenweise 75 mg N-Äthyl-N1-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidchlorhydrat,
gelöst in
2 ml destilliertem Wasser, zugesetzt wurden. Während der ersten fünf Stunden wurde der pH-Wert durch Zugabe von HCl
auf etwa 5 gehalten und es wurde langsam gerührt. Man ließ die Reaktion etwa 24 Stunden laufen, worauf das Gel abfiltriert
und zuerst mit 200 ml einer lösung von 1 M NaCl und 10 M HCl und dann mit destilliertem Wasser gewaschen
wurde; man erhielt ungefähr 1,8 ml feuchtes Gel, λ_ον bei
xiisx
266 mn.
Der durch Covalenzbindung an Sepharosegel gebundene NAD-gehalt
wurde spektroskopisch bei 266 nm als Coenzym in
- 10 -
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oxidierter Form (NAD) und bei 340 mn ala Coenzym (NADH),
das enzymatisch reduziert war durch Alkohol-Dehydrogenase.
aus Hefe in 0,15 M Tris-^uffer bei pH 9 in Anwesenheit von
0,5 M Äthylalkohol und 0,075 M Semicarbazidchlorhydrat bestimmt.
Die Ultraviolett-Spektren wurden ermittelt durch Suspendieren
des Gels in einer wässrigen 1$igen Lösung von PoIyoxy-WSR-301,
wodurch das Absetzen des Gels verlangsamt wurde
Aus der Bestimmung der optischen Dichte bei 266 nm ließ sich ermitteln, daß je Gramm trockener Sepharose ingesamt 2,04
IfAD durch Covalenzbindung gebunden waren.
Aus Messungen der enzymatischen Reduktion und der optischen
Dichte bei 340 nm ließ sich ermitteln, daß je Gramm trockener
Sepharose 1,15/uMol enzymatisch reduzierbares HAD durch Covalenzbindung
an das Polymer gebunden waren.
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Claims (1)
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Patentansprüche
Patentansprüche
CJi · Makromolekulare Adenin-Derivate, enthaltend eine oder
mehrere Einheiten der allgemeinen Formel
OH
NH-CH,
rCH-(CH2)a-C-Ii
N^1 N
ι l[ fl
(D
worin η = 1, 2, 3 öder 4 ist, wobei in Formel I der Rest
HH-
von einer beliebigen Verbindung mit Adeninkern stammen
kann und das an die CO-Gruppe gebundene Stickstoffatom zu einer in Wasser löslichen oder unlöslichen makromolekularen Verbindung gehört, die eine oder mehrere primäre oder sekundäre Aminogruppen enthält.
kann und das an die CO-Gruppe gebundene Stickstoffatom zu einer in Wasser löslichen oder unlöslichen makromolekularen Verbindung gehört, die eine oder mehrere primäre oder sekundäre Aminogruppen enthält.
Verfahren zur Herstellung der Adeninderivate nach Anspruch
1, dadurch gekennzeichnet, daß man
eine funktionell gemachte Adeninverbindung der allgemeinen Formel
eine funktionell gemachte Adeninverbindung der allgemeinen Formel
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OH
I
NH-CH2-CH-C CH2)a-C00H
NH-CH2-CH-C CH2)a-C00H
in der η die obige Bedeutung hat, in Anwesenheit eines in Wasser löslichen bzw. unlöslichen Carbodiimides mit einem
Polymer umsetzt, welches mindestens eine primäre oder sekundäre Gruppe enthält·
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Wasser oder in
Anwesenheit eines Gemisches aus Wasser und einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung bei einer
Temperatur von +5 bis +500C, vorzugsweise bei Raumtemperatur,
durchführt.
8643 509851/1116
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