DE2525825C3 - Verfahren zur Herstellung von Kondensationsprodukten - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von Kondensationsprodukten

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Description

OK
NH- CH2- CH- (CH2),- COOH
Gegenstand der Erfindung ist das in den Patentansprüchen angegebene Verfahren zur Herstellung von Kondensationsprodukten von Nikotinamid-6-(2-hydroxy-3-carboxyalkylamino)-purindinucleotiden der allgemeinen Formel
OH O
I Il /
NH- CH2- CH- (CH2),,- C—N
worin /i = 1, 2, 3 oder 4 ist und das Radikal
NH
N'
von einer beliebigen Verbindung mit Adeninkern stammen kann, z. B. von Nikotinamidadenindinucleotid, Nikotinamidadenindinucleotid-Phosphat, Adenosinmonophosphat, cyclisches Adenosinmonophosphat, Adenosindiphosphat, Adenosintriphosphat, Adenosin selbst oder Ademin. Das in Formel I an die CO-Gruppe gebundene Stickstoffatom ist Teil einer Verbindung aus der Gruppe Polyäthylcnimin, Poly-L-Lysin und Aminohexylsepharose (AHSEPH).
Aus der eigenen italienischen Patentanmeldung 22 105 A/74 vom 30. April 1974 ist ein Verfahren zur Herstellung von Adcninderivaten bekannt, wobei man eine Verbindung mit einem Adeninkern mit Carbonsäuren oder Esterepoxiden umsetzt. Bei der Umsetzung wird die 6-Aminogruppe des Adeninkerns funktionsfäworin η die obige Bedeutung hat
Die wie oben funktionell gemachten Adeninverbindungen reagieren bei dem erfindungsgemäßen Verfahren mit der primären oder sekundären Aminogruppe der erwähnten polymeren Verbindungen, wenn man die Umsetzung in Anwesenheit eines Carbodiimides (das entweder wasserlöslich sein kann, wie z. B. N-Äthyl-N'-(S-dimethylaminopropylJcarbodiimu.chlorhydrat oder nicht wasserlöslich, wie Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid) als Kondensationsmittel durchführt. Man erhält dann die oben definierten makromolekularen Adeninderivate.
Die Kondensationsreaktion zwischen der Carboxylgruppe des wie oben auf bekannte Weise erhaltenen Carboxyladeninderivates und der Aminogruppe des
jo Makromoleküls, bei der eine Amidbindung entsteht, wird durchgeführt in V/asser oder in einem Gemisch aus Wasser und einem wasserlöslichen organischen Lösungsmittel, wie Pyridin, Tetrahydrofuran und Dioxan; die Umsetzungstemperatur liegt zwischen 5 und 500C,
y, wobei Raumtemperatur bevorzugt ist.
Die erfindungsgemäß hergestellten makromolekularen Adeninderivate werden auf verschiedene Weise verwendet. So können beispielsweise die makromolekularen Nikotinamid-adenindinukIeotid-(N AD)- Derivate (und das gleiche gilt auch für die anderen makromoleku-(I) laren Derivate) in der Affinitätschromatographie oder
als sich nicht ausbreitende Coenzyme verwendet werden, wofür sich besonders die erfindungsgemäß hergestellten wasserlöslichen Makromoleküle eignen,
4S die dann wasserlösliche makromolekulare Coenzyme darstellen. Die Bereitstellung solcher Coenzyme verbreitert das Anwendungsfeld der bekannten enzymatischen Systeme, bei denen das Enzym in unlösliche Hüllstrukturen, wie Fasern, Polyacrylamidgel, Mikro-
■50 kapseln usw. eingeschlossen ist, die die Makromoleküle nicht durchlassen. Falls also ein Enzymsystem (bzw. ein polyenzymatisches System) zusammen mit dem wasserlöslichen makromolekularen Coenzym in eine solche Hülle eingeschlossen ist, stehen beide Bestandteile in inniger Berührung und das Coenzym kann dann nicht aus der Hülle herausdispergieren. Insofern sind die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen den bekannten Coenzymen mit wesentlich kleineren Molekülen überlegen.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ebenfalls erhältlichen wasserunlöslichen Makromoleküle können für die Affinitätschromatographie verwendet werden, ebenso aber auch für enzymatische Reaktionen, die in heterogener Phase durchgeführt werden müssen und bei denen das Coenzym wiedergewonnen werden kann.
Die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen sei anhand folgender Beispiele beschrieben, wobei
der Einfachheit halber stets das Radikal
NH-
mit »NAD« bezeichnet ist
Beispiel 1
Herstellung von 4-(NAD-N6)-3-hydroxybutylryI-polyäthylenimin (Formel I. worin /J=I; NC ist das Stickstoffatom aus dem Polyäthyleniminrest).
127 mg Polyäthyleniminchlorhydrat mit einem pH-Wert von 6 (hergestellt durch Zusatz von konzentrierter HCl zu PEI mit einem Molekulargewicht von etwa 50 000 und nachfolgendem Eindampfen zur Trockne) in wäßriger Lösung mit einer Konzentration von 25% (Gewicht/Volumen) wurden versetzt mit 10 mg Nikotinamid-6(2-hydroxy-3-carboxypropyIamino)-purindinucleotid (Formel II, worin n=\) die in 0,125 ml destilliertem Wasser gelöst waren, und daraufhin mit 10 mg N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid, gelöst in 0,125 ml Pyridin.
Das Gemisch wurde 36 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten und filtriert. Das mit dem Waschwasser vereinigte Filtrat (Gesamtvolumen =10 ml) wurde in ein Zentrifugengefäß überführt und dort mit 10 ml 1 M Phosphatpuffer bei pH 6 gefällt. Nach 10 Minuten langem Zentrifugieren bei 39 000xg wurde die überstehende Lösung von dem Polymerniederschlag abgezogen. Zwecks weiterer Reinigung wurde das Polymere in 2 ml einer wäßrigen Lösung gelöst, die 2 M NaCI und 0,05 M Acetatpuffer enthielt und einen pH-Wert von 5,5 hatte. Die so erhaltene Lösung wurde nach Zugabe von 8 ml Wasser wieder mit 10 ml IM Phosphatpuffer bei pH 6 ausgefällt und 10 Minuten bei 39 OOOxg zentrifugiert, worauf das Polymere wie oben durch Dekantieren gewonnen wurde. Der Reinigungsvorgang wurde viermal wiederholt.
Das Produkt wurde wieder in einer Lösung von 2 M NaCI und 0,05 M Acetatpuffer (pH 5,5) gelöst und dann in einem Dialyseteströhrchen 24 Stunden gegen 250 ml einer Lösung, die 2 M NaCI und 10-4M HCl enthielt, dialysiert Das gleiche wurde dann dialysiert gegen Portionen von 250 ml 10-4 M HCl, und zwar 4 Tage lang, wobei die Lösung täglich gewechselt wurde; das in dem Dialysetestrohr enthaltene Produkt wurde durch Lyophilisierung gewonnen. Es wurden 90 mg Polymeres erhalten; X11111x bei 266 nm.
Die Bestimmung von NAD, aktiv als Coenzym und durch Covalenzbindung an das Polymere gebunden, wurde durchgeführt in wäßriger Lösung des Polymeren mit Hilfe einer quantitativen enzymatischen Reduktion mit Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe in einem 0,15 N Tris-Puffer bei pH 9 in Anwesenheit von 0,5 M Äthylalkohol und 0,075 M Semicarbazidchlorhydrat.
Die bei 340 nm durchgeführte spektrophotometrische Messung von NADH ermöglichte die Bestimmung, daß je Gramm Polymeres 28,5 μΜοΙ NAD, das enzymatisch reduzierbar war, gebunden waren.
Das so erhaltene makromolekulare NAD zeigte gegenüber natürlichem NAD in Anwesenheit von verschiedenen Dehydrogenasen eine bemerkenswerte Coenzymaktivität. So zeigte es beispielsweise in Anwesenheit von Lactico-dehydrogenase aus dem Kaninchenmuskel eine spezifische Aktivität von 55% in bezug auf natürliches Coenzym. Die Bestimmung wurde durchgeführt in einem 0,1 M Ammoniumcarbonatpuffer bei einem pH-Wert von 8,5 und 25°C.
Beispiel 2
125 mg PEl, erhalten gemäß Beispiel 1 bei pH 6 in wäßriger Lösung von 25% (Gewicht/Volumen), wurden versetzt mit 40 mg Nikotinamid-6-(2-hydroxy-3-carboxypropylaminojpurindinucleotid (Formel II, worin /7= 1 und NAD die obige Bedeutung haben), gelöst in 0,5 ml Wasser, worauf noch 40 mg N-Äthyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidchlorhydrat, gelöst in 0,5 ml Wasser, zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde mit 1 M NaOH auf pH 5,5 gebracht und 48 Stunden unter Rühren bei Raumtemperatur gehalten.
Nach Auffüllen mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 10 ml wurde die Lösung in ein Zentrifugengefäß überführt und dort mit 10 mil M Phosphatpuffer bei pH 6 gefällt. Nach 10 Minuten langem Zentrifugieren bei 39 OOOxg wurde die Lösung vom Niederschlag abgezogen. Zur weiteren Reinigung wurde das Polymere in 10 ml einer Lösung von 2 M NaCl und 0,05 M Acetatpuffer bei pH 5,5 gelöst. Der so erhaltenen Lösung wurden 8 ml Wasser zugefügt, worauf sie wiederum mit 10ml IM Phosphatpuffer bei pH 6 versetzt und dann 10 Minuten bei 39 OOOxg zentrifugiert wurde, worauf das Polymere durch Dekantieren gewonnen wurde. Dieser Reinigungsvorgang wurde
jo viermal wiederholt.
Das gereinigte Produkt wurde wieder in einer Lösung von 2 M NaCI und 0,05 M Acetatpuffer bei pH 5,5 gelöst und die Lösung in ein Dialysegefäß überführt und 24 Stunden gegen 250 ml einer Lösung von 2 M NaCl und
j5 10"4 M HCl dialysiert. Dann wurde das Produkt gegen Portionen von je 250 ml 10"4M HCI dialysiert, und zwar vier Tage lang, wobei die Lösung täglich gewechselt wurde; das im Dialysegefäß enthaltene Produkt wurde durch Lyophilisierung gewonnen.
Man erhielt 85,7 mg Polymeres; \mlx bei 266 nm.
Die Bestimmung von NAD, aktiv als Coenzym und durch Covalenzbindung an das Polymere gebunden, wurde durchgeführt in wäßriger Lösung des Polymeren mit Hilfe einer quantitativen enzymatischen Reduktion mit Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe in 0,15 M Tris-Puffer bei pH 9 in Anwesenheit von 0,5 M Äthylalkohol und 0,075 M Semicarbazidchlorhydrat. Die spektrophotometrische Messung des gebildeten NADH-Derivates bei 340 nm erlaubte die Annahme, daß je Gramm Polymeres 125μΜοΙ enzymatisch reduzierbares NAD gebunden waren.
Beispiel 3
Herstellung von 4-(NAD-Nb)-3-hydroxybutyryl-PLYS (Formel I, worin /J=I; NC =Poly-L-lysin-[PLYS]-rest).
100 mg Poly-L-Iysinbromhydrat mit einem Molekulargewicht von ungefähr 50 000, gelöst in 1 ml Wasser, wurden versetzt mit 40 mg Nikotinamid-6-(2-hydroxy-S-carboxypropylaminoJ-purindinucleotid (Formel II, worin η und NAD die obige Bedeutung haben), gelöst in 0,5 ml Wasser, worauf 40 mg N-Äthyl-N'-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidchlorhydrat, gelöst in 0,5 ml Wasser, zugefügt wurden. Der pH-Wert des Gemisches b5 wuivic mit 1 M NaOH auf 5,5 gebracht und das Gemisch dar.n unter Rühren 48 Stunden bei Raumtemperatur gehalten.
Daraufhin wurde das Gemisch in ein Dialysegefäß
überführt und 24 Stunden gegen 250 ml einer Lösung von 2 M NaC! und 10-" M HCl dialysiert Anschließend wurde es gegen Portionen von 257 ml 10-4M HCl dialysiert, und zwar 4 Tage lang, wobei die Lösung täglich gewechselt wurde. Das in dem Dialysegefäß enthaltene Produkt wurde durch Lyophilisierung gewonnen; man erhielt 45,4 mg Polymeres; Xmax bei 266 nm.
Die Bestimmung von NAD, aktiv vom Gesichtspunkt eines Coenzyms aus und durch Covalenzbindung an ic Poly-L-Iysin gebunden, wurde mit Hilfe der Spektrophotometrie durchgeführt, und zwar nach enzymatisch quantitativer Reduktion des Polymeren mit Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe in 0,15 M Tris-Puffer bei pH 9 in Anwesenheit von 0,5 M Äthylalkohol und 0,075 M Semicarbazidchlorhydrat; die Ablesung bei 340 nm ergab 90μΜοΙ enzymatisch reduzierbares NAD je Gramm Polymeres, gebunden durch Covalenzbindung.
Beispiel 4
.■■0
Herstellung von 4-(NAD-N6-3-hydroxybutyryl-AHSEPH (Formel I, worin /7=1, N^=Radikal von Sepharose, funktionell gemacht mit Hilfe der Cyanogenbromid-Methode mit 1,6 Diaminohexan, enthaltend 6 bis 10 Mol Aminreste je Gel ml [AHSEPH]).
500 mg AHSEPH wurden verschäumt durch 0,5 M NaCI-Lösung und mit 200 ml 0.5 M NaCl und anschließend mit destilliertem Wasser gewaschen. Wenn das Gel ein Volumen von etwa 2 ml erreicht hatte, wurde es versetzt mit 92 mg Nikotinamid-6-(2-hydroxy-3-carb- j(> oxypropylamin)purindinucleotid (Formel II, π und NAD wie oben), gelöst in 2 ml destilliertem Wasser, worauf der pH-Wert mit 1 M NaOH auf 5 gebracht wurde. Die Suspension wurde mit Hilfe eines Rührwerks mit niedriger Umlaufzahl bei Raumtemperatur gerührt, worauf ihr tropfenweise 75 mg N-Äthyl-N'-(3-dime;hylaminopropyl)carbodiimidch!orhydrat, gelöst in 2 ml destilliertem Wasser, zugesetzt wurden. Während der ersten fünf Stunden wurde der pH-Wert durch Zugabe von HCl auf etwa 5 gehalten und es wurde langsam gerührt Man ließ die Reaktion etwa 24 Stunden laufen, worauf das Gel abfiltriert und zuerst mit 200 ml einer Lösung von 1 M NaCl und 10« M HCl und dann mit destilliertem Wasser gewaschen wurde; man erhielt ungefähr 1,8 ml feuchtes Gel, kmx bei 266 nm.
Der durch Covalenzbindung an Sepharosegel gebundene NAD-Gehalt wurde spektroskopisch bei 266 nm als Coenzym in oxidierter Form (NAD) und bei 340 nm als Coenzym (NADH), das enzymatisch reduziert war durch Alkohol-Dehydrogenase aus Hefe in 0,15 M Tris-Puffer bei pH 9 in Anwesenheit von 0,5 M Äthylalkohol und 0,075 M Semicarbazidchlorhydrat bestimmt.
Die Ultraviolett-Spektren wurden ermittelt durch Suspendieren des Gels in einer wäßrigen l%igen Lösung von Polyoxy-WSR-301, wodurch das Absetzen des Gels verlangsamt wurde.
Aus der Bestimmung der optischen Dichte bei 266 nm ließ sich ermitteln, daß je Gramm trockener Sepharose insgesamt 2,04 μΜοΙ NAD durch Covalenzbindung gebunden waren.
Aus Messungen der enzymatischen Reduktion und der optischen Dichte bei 340 nm ließ sich ermitteln, daß je Gramm trockener Sepharose 1,15 μΜοΙ enzymatisch reduzierbares NAD durch Covalenzbindung an das Polymere gebunden waren.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Herstellung von Kondensationsprcdukten von Nikotinamid-6-(2-hydroxy-3-carboxyalkylamino^purindinucleotiden, worin »-alkyl-« in der Carboxyalkylaminogruppe eine Methylen-, Äthylen-, Propylen- oder Butylengruppe bedeuten kann, mit Polyäthyleniminchlorhydrat, PoIy-L-lysinbromhydrat oder Aminohexylsepharose-4B (AHSEPH) durch Umsetzen der Reaktionsteilnehmer in Wasser oder einer wäßrigen Lösung eines organischen Lösungsmittels bei 5 bis 50°C, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Anwesenheit eines Carbodiimides als Kondensationsmittel durchführt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Anwesenheit eines wasserlöslichen Carbodiimides durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Anwesenheit eines in Wasser unlöslichen Carbodiimides durchführt.
hig und man erhält Verbindungen der allgemeinen Formel
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