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beschreibung Verfahren und Vorrichtung zum Untersuchen physikalisch-chemischer
Reaktionsketten, insbesondere pharmakokinetischer und biopharmazeutischer Vorgänge
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Untersuchen physikalisch-chemischer Reaktionsket-ten,
insbesondere pharmakokinetischer und biopharmazeutischer Vorg)nge, wie der Auflösung,
Resorption, Verteilung, Metabolisierung und Ausscheidung von Arzneimitteln im Organismus,
bei dem der zeitliche Verlauf der Konzentration einer chemischen Substanz oder eines
Reaktionsproduktes dieser Substanz in einer bestimmten Reaktionsstufe der phys.ikalisch-chemischen
Reaktionskette durch Annahme der Reaktionsordnungen und Reaktionskonstanten der
vorhergehenden Reaktionsstufen, beginnend mit der Einsetzung der Substanz, ermittelt
wird.
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Die Pharmakokineti'c untersucht Gesetzmäßigkeiten, nach denen Arneimittel
resorbiert, verteilt, metabolisiert und ausgeschieden werden. Die Biopharmazie bearbeitet
die Eragenstellung, inwieweit die Arzneiformung, z. Bo durch eine kleine Lösungsgeschwindigkeit
des Wirkstoffes des Arzneimittels,zum limitierenden Faktor der Resorption und damit
der sich anschlie.Senden
.,chritt.e wiwdf In vitro wira zur Untersuchung
pharmakokinetiher Vorgänge häufig die Blutspiegel- oder Plasmakurve herangezogen,
die sich beispielsweise nach der oralen Verabreichung eines Arzneimittels durch
Messung der Konzentration des Wirkstoffes oder seiner Reaktionsprodukte in in zeitlichen
Abständen entnommenen Blut- oder Plasmaproben ergibt. In der pharmazeutischen Forschung
wird nun versucht, eine solche Blutspiegelkurve dadurch zu simulieren, daß für die
Geschwindigkeitskonstanten der verschiedenen pharmakokinetischen Vorgänge, denen
das Arzneimittel von seiner Auflösung bis zur Eliminierung unterworfen ist, Werte
angenommen werden. Mit diesen Werten wird ein mathematisches pharmakokinetisches
Modell aufgestellt, dessen Gültigkeit bisher mit Hilfe von Computern, insbesondere
Analogcomputern!untersucht wird. Ist das erarbeitete Modell gültig, so können mit
entsprechend gefitteten Konstanten Blutspiegelkurven nachgerechnet werden, die im
Rahmen der immer vorhandenen Meßfehler mit den experimentell in vivo ermittelten
Kurven übereinstimmen.
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Somit besteht die Möglichkeit, den Einfluß verschiedener Geschwindigkeitskonstanten
auf die Blutspiegelkurve zu untersuchen. Dies bietet die Möglichkeit, beispielsweise
eine Arzneiform in Richtung auf möglichst schnelles Erreichen eines gewünschten
Blutspiegels oder in Richtung auf ein längers Verbleiben eines erwünschten Blutspiegels
(Retardform) zu optimieren. Beispielsweise kann der Einfluß der Abänderung der Geschwindigkeitskonstanten
der Auflösung des Arzneimittels auf die Resorption und den entsprechenden Blutspiegelverlauf
genau untersucht werden. Eine ausführliche Schilderung dieser Untersuchungsmethoden
findet sich in dem Aufsatz von K.H.
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Frömming, B.C. Lippold und E.R.Garrett "Die Einsatzmöglichkeit des
Analog-Computers in der Entwicklung vor Arzneiformen" Mitteilung deutscher pharmazeutischer
Gesellschaft, 41 205 (1971 Die Verwendung des Analog-Computers bringt e LXige Probleme
mit
sich. Neben erheblichen Kosten einer solchen Anlage ist eine aufwendige Ausbildung
nötig, um mit ihr richtig umgehen zu können. Personen, die im Umgang mit Analog-Computern
geschult sind, und Fachleute für Pharmakokinetik oder Biopharmazie haben wegen der
meist fehlenden gemeinsamen Ausbildung bei der Zusammenarbeit bisweilen Kommunikationsschwierigkeiten.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum
Untersuchen physikalisch-chemischer Reaktionsketten, insbesondere pharmakokinetischer
und biopharmazeutischer Vorgänge zu schaffen, das ohne Verwendung von Computern
auskommt.
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Diese Aufgabe-wird bei einem Verfahren der eingangs beschriebenen
Gattung erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die zunächst eingesetzte Substanz durch
einen Farbstoff ersetzt wird und die mit der Substanz ablaufenden physikalisch-chemischen
Reaktionen durch Verdünnungen bzw. Konzentrierungen des Farbstoffs in hintereinander
geschalteten Flüssigkeitsvolumina simuliert werden, wobei eine einem Flüssigkeitsvolumen
entnommene Volumenströmung zumindest teilweise einem nachfolgenden Flüssigkeitsvolumen
zugeleitet wird und die Flüssigkeitsvolumina und die Volumenströmungen entsprechend
den Reaktionsordnungen und Reaktionskonstanten gewählt werden.
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Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich nun in einfacher
Weise insbesondere pharmakokinetische Vorgänge mit einer chemischen Substanz, beispielsweise
die Auflösung, Resorption und Elimination eines Arzneimittels im Organismus, untersuchen,
indem man anstelle des Wirkstoffes einen Farbstoff in einem Lösungsmittel zu einem
ersten Flüssigkeitsvolumen löst, aus dem einem nachgeschalteten, zunächst aus reinem
Lösungsmittel bestehenden zweiten FlUssigkeitsvolumen eine bestimmte Volumenströmung
zugeführt wird, aus dem zweiten Flüssigkeitsvolumen wiederum eine Volumenströmung
einem dritten Flüssigkeitsvolumen zugeführt wird und so weiter, bis schließlich
die Farbstoffkonzentration in einem letzten Flüssigkeitsvolumen oder einer
diesem
entnommenen Strömung beispielsweise in herkömmlicher Weise anhand der bekannten
spezifischen Extinktion des Farbstoffes im verwendeten Lösungsmittel als der Konzentration
des interessierenden Wirkstoffes entsprechender Wert gemessen wird. Die Volumenströmungen
zwischen den einzelnen Behältern sowie die einzelnen Lösungsmittelvolumina werden,
wie im folgenden im einzelnen erläutert werden wird, entsprechend den Konstanten
der einzelnen Vorgänge für den betreffenden Wirkstoff gewählt. Somit können beispielsweise
in vivo gemessene Blutspiegelkurven für den Wirkstoff simuliert und die Einflüsse
der verschiedenen Parameter, wie Resorption und Elimination aus dem Blutstrom, auf
dem Blutspiegel untersucht werden. Die in das Lösungsmittel anfänglich eingesetzte
Farbstoffmenge wird nach einem später zu beschreibenden Verfahren entsprechend der
Menge des eingesetzten Wirkstoffes gewählt.
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Bei nacheinander ablaufenden Vorgängen erster Ordnung sind vorteilhafterweise
alle in die entsprechenden Flüssigkeitsvolumina gelangenden und den entsprechenden
Flüssigkeitsvolumina entnommenen Volumenströmungen gleich groß und es werden Konstanten,
wie Auflösungskonstante, Resorptionskonstante und Eliminationskonstante durch Wahl
der während des Reaktionsablaufes jeweils konstant bleibenden Flüssigkeitsvolumina
entsprechend dem Gesetz k = V eingestellt, wobei k die Konstante, x die Volumenströmung
und v das Volumen des zugehörigen Flüssigkeitsvolumen bezeichnen.
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Als Farbstoff hat sich Methylenblau bestens bewährt, das beispielsweise
in Wasser als Lösungsmittel gelöst wird.
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Eine Vorrichtung zum Durchführen des erfindungsgemäßen Verfahrens
ist dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Behälter durch je eine Leitung miteinander
verbunden hintereinander geschaltet sind und in jeder von einem zum nachfolgenden
Behälter führenden Leitung eine Pumpe enthalten ist.
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Werden in einem Teil der Vorrichtung nacheinander ablaufende ~ die
Vorgänge erster Ordnung simuliert, so sind die gleichen Volumenströmungen erzeugenden
Pumpen vorteilhafterweise von einer gemeinsamen Welle angetrieben.
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Eine abgeänderte Ausiührungsform der Vorrichtung zeichnet sich dadurch
aus, daß die Behälter abgeschlossen sind und das in einem Behälter enthaltene Flüssigkeitsvolumen
jeweils mit einem Kolben einstellbar ist.
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Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Vorrichtung
sind alle Leitungen durch eine gemeinsame peristaltische Pumpe geführt und die Ouerschnitte
der Leitungen entsprechenlden zu ererzeugenden Volumenströmungen gewählt.
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Die Erfindung ist nicht nur zum Simulieren pharmakokinetischer Vorgänge
geeignet, sondern kann auch für Demonstrations- und Lehrzwecke vorteilhaft eingesetzt
werden, um beispielsweise nacheinander ablaufende pharmakokinetische Vorgänge anhand
der Farbstoffkonzentrationen in den nacheinander geschalteten Behälter unmittelbar
anschaulich sichtbar zu machen.
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Es können nicht nur hintereinander ablaufende Vorgänge, wie beispielsweise
die Auflösung, Resorption und die Elimination eines Arzneimittels untersucht werden,
sondern es können auch komplexe Vorgänge simuliert werden. Beispielsweise kann ein
tieferliegendes Kompartiment dadurch simuliert werden, daß aus dem letzten Flüssigkeitsbehälter
nicht nur eine Volumenströmung durch ein Photometer zur Messung der Farbstoffkonzentration
geleitet wird sondern eine weitere Volumenströmung in einen weiteren Behälter abgeleitet
wird, dessen Volumen um so größer ist je tiefer das Kompartiment liegt. Die Abwanderungsgeschwindigke:.t
aus dem Blut is das tiefe Kompartiment kann dabei allerdings nicht durch das Volumen
des vorgeschalteten Behälters simuliert werden, da dieses Volumen schon der Einstellung
der Reaktionskonstente der Elimination dient. Die Abwanderungsgeschwindigkeit muß
vielmehr
über die @e@enderung der Volumenströmung in den das tieferliegende
Kompartiment darstellenden Behälter variiert werden, während die Rückwanderungsgeschwindigkeit
aus dem tiefen Kompartiment durch das Volumen des entsprechenden Behälters einstellbar
ist.
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Weiter kann beispielsweise der Einfluß einer Initialdosis und einer
Erhaltungsdosis eines Retardpräparates untersucht werden, in dem der Auflösung entsprechende
Behälter den nachgeschalteten Behältern vorgeschaltet werden und aus den vorgeschalteten
Behältern die schnell zur Verfügung stehende Initialdosis und bei größerem Volumen
die retardierte Erhaltungsdosis abgepumpt werden. Der Weitertransport des Arzneimittels
aus den nachgeschalteten Behältern muß mit der Summe der Flüssigkeitszufuhr aus
den beiden Auflösebehältern erfolgen, damit die nachgeschalteten Volumina konstant
bleiben.
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Weiter kann eine Vielfachdosierung oder das optimale Dosierungsintervall
untersucht werden, indem in entsprechenden Zeitabständen neue Farbstoffmengen in
konzentriert gelöster Form (um das Volumen des Auflösebehälters möglichst klein
zu halten) in den Auflösebehälter eingebracht werden.
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en Auch die Nachahmung eines entherohepatisch Kreislaufes ist mit
dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich.
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Die für die Simulation einer Blutspiegelkurve benötigten Zeiten können
verkürzt werden, indem bei kleinen Volumina der in den einzelnen Behältern enthaltenen
Flüssigkeiten große Volumenströmungen verwendet werden.
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Zusammenfassend eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren somit zur
Beantwortung fast aller pharmakokinetischer Fragestellungen, wie beispielsweise
Menge eines zu gebenden Wirkstoffes
und Form, in der der Wirkstoff
verabreicht werden muß, um eine erwünschte Blutspiegelkurve zu erhalten.
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Die Erfindung wird im folgenden näher erläutert, wobei zunächst einige
mathematische Grundlagen entwickelt werden und dann Durchführungsbeispiele der Erfindung
zum Teil anhand schematischer Zeichnungen mit weiteren Einzelheiten geschil.-dert
werden.
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In den beigefügten schematischen Zeichnungen zeigen: Fig. 1 u. 3 Seitenansichten
zweier Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung, Fig. 2 eine Aufsicht
auf eine abgeänderte Ausführungsform, Fig. 4 ein Flußbild einer für ein Anwendungsbeispiel
benutzten Vorrichtung.
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Fig. 5 Blutspiegelkurven des Anwendungsbeispiels.
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Theoretische Grundlagen: Pharmakokinetische Vorgänge laufen meistens
nach einer Gesetz mäßigkeit erster Ordnung, manchmal nullter Ordnung ab. Bei einer
Reaktion erster Ordnung ist der Stoffumsatz proportional der Konzentration des Ausgangsstoffes.
Bei einer Reaktion nullter Ordnung ist der Umsatz unabhängig von der Konzentration
konstant. Reaktionen nullter Ordnung beruhen meist auf der Sättigung eines Enzym-Systems,
wie beispielsweise die Äthyl-Alkohol-Elimination aufgrund der beschränkten Menge
von Alkoholdehydrogenase nach einem Gesetz nullter Ordnung erfolgt, was dazu führt,
daß unabhängig von der getrunkenen Alkoholmenge pro Stunde nur etwa 7 Gramm Äthylalkohol
eliminiert werden können.
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Die Gesetzmäßigkeit für eine Reaktion erster Ordnung lautet: a) abnehmende
Konzentration: Ct cO e (1) b) zunehmende Konzentration: Ct = cO . (1 - e kt) (2)
ct
= Konzentration einer Substanz zum Zeitpunkt t cO = Anfangskonzentration e = 2,718,
Basis des natürlichen Logarithmus k = Geschwindigkeitskonstante, Dimension H-1 t
= Zeit in Stunden Während im Analog-Computer die Konzentration eines Stoffes durch
die elektrische Spannung dargestellt wird, geschieht dies bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren durch die Konzentration eines Farbstoffes. Die Geschwindigkeit der ablaufenden
Vorgänge wird folgendermaßen berücksichtigt: Führt man einer Farbstofflösung mit
einem bestimmten Volumen v und einer Konzentration cO eine Verdünnungsflüssigkeit
(z.B.
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Wasser) mit einer Geschwindigkeit von x ml/min zu und führt die entstehende,
verdünnte Farbstofflösung mit der gleichen Geschwindigkeit von x ml/min ab, so nimmt
die Konzentration dieser Farbstofflösung nach der Formal (1) ab. Für die Geschwindigkeitskonstante
k gilt dabei: k = x (3).
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Durch Einsetzen von (3) in (1) erhält man: co = cO exv (4).
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In ähnlicher Weise kann auch eine Farbstofflösung einer bestimmten
Konzentration cO in ein bestimmtes Volumen v von Verdünnungsflüssigkeit (z. B. Wasser)
gepumpt werden. Für die Abhängigkeit der Konzentration von der Zeit gilt dann: ct
= co . (1 - e-x/v.t) (5)
Um nun eine gewünschte Geschwindigkeitskonstante
einzustellen, genügt es, eine der beiden Größen x oder v zu ändern.
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Dies sei an einem Beispiel erläutert: Sei die Eliminationskonstante
eines Arzneimittels aus dem Blutplasma 0,3/h. Bei einer nu- und Ablaufgeschwindigkeit
von beispielsweise 1 ml/ min = 60 ml/h ergibt sich für die Geschwindigkeitskonstante
0,3/h das zugehörige Volumen zu: k = x/v 60 ml : h v = x/k = = 200 ml 0,3 : h d.h.
die Konzentration des Farbstoffes in einer Farbstofflösung von 200 ml, der 1 ml/min
Wasser zugeführt werden und aus der 1 ml/min. Lösung abgepumpt werden, ändert sich
entsprechend der Formel (4) mit v = 0,3/h.
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Es empfiehlt sich, für die Einstellung der Geschwindigkeitskonstanten
nach Möglichkeit nur das Volumen und nicht den Zu-und Ablauf zu ändern, da bei Hintereinanderschaltung
mehrer "Reaktionen erster Ordnung" sich sonst das Flüssigkeitsvolumen in einem Behälter
verändert und die einzelnen Reaktionskonstanten nicht mehr unabhängig voneinander
eingestellt werden können.
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Auf diese Weise ist es möglich, alle Geschwindigkeitskonstanten erster
Ordnung eines pharmakokinetischen Modell allein durch unterschiedliche Flüssigkeitsvolumina
darzustellen, denen gleiche Volumenströmungen zu- bzw. aus denen gleiche Volumenströmungen
abgeführt werden.
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Etwas komplizierter liegen die Verhältnisse be der Simulation von
Reaktionen nullter Ordnung. Hier gilt nach Arbeiten, die T.K. Lakshmanan und S.
Lieberman im "Arch. biochem. biophys.
53, 258 (1954) veröffentlichen,
folgende Gesetzmäßigkeit:
v0 = Anfangsvolumen R1 = Zulauf in ml/min R2 = Ablauf in ml/min Wenn R2 = 2R1 wird
der Exponent 1 und man erhält:
wobei also gilt, daß R1 = der Zulauf und 2 R1 = der Ablauf ist.
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Die Konzentration einer verdünnt werdenen Farbstofflösung sinkt linear
mit der linearen Abnahme des Volumens, bis sich keine Flüssigkeit mehr in dem Gefäß
befindet.
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Ein entsprechendes Gesetz gilt bei Zuführen von Farbstofflösung in
ein Volumen:
Diese Gesetzmäßigkeit beschreibt die Entwicklung der Konzentration ct in einem Volumen
vO, das anfänglich reines Wasser ist und dem Farbstofflösung mit der Konzentration
cO und der Geschwindigkeit R1 zugeführt wird,und aus dem Lösungsvolumen mit der
Volumenströmung 2 R abgeführt wird.
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Die Konzentration nimmt also hier linear mit abnehmendem Volumen zu,
bis sich keine Flüssigkeit mehr in dem Verdünnungsgefäß befindet bzw. die Konzentration
der zugeführten Farbstofflösung annähernd erreicht ist.
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Beispiel zur Erläuterung der theoretischen Grundlagen: Im folgenden
sei ein Beispiel erläutert, aus dem hervorgeht, wie eine nach einer Reaktion nullter
Ordnung ablaufende Auf lösung eines Arzneimittels mit einer Resorption erster Ordnung
und einer Elimination nullter Ordnung gekoppelt ist.
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Es sei angenommen, daß eine bestimmte Menge Arzneimittel sich über
fünf Stunden lang gleichmäßig (0. Ordnung) auflöst, mit einer Resorptionskonstanten
von 1/h resorbiert und einer Eliminationskonstanten von 0,2 mg/ml/h ausgeschieden
wird.
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Zur Simulation dieses Vorgangs wird die in Fig. 1 dargestellte Anordnung
verwendet. Mit 10, 12 und 14 ist jeweils ein Behälter bezeichnet. 20, 22, 24 und
26 bezeichnen Leistungen, die Bezugszeichen 30, 32 und 34 bezeichnen Pumpen, mit
35 ist ein Hahn bezeichnet, mit dem die Leitung 20 und der Pumpe 30 verbunden werden
kann.
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Die Leitung 26 geht durch eine Durchflußmeßzelle 36 hindurch, in der
die Farbstoffkonzentration einer durch die Leitung 26 strömenden Farbstofflösung
gemessen wird.
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Die Auflösung wird folgendermaßen simuliert: In den Behälter 10 werden
400 ml (Überschuß ist notwendig) Farbstofflösung gegeben. Da in fünf Stunden (300
mg Arzneistoff mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min. zufließen sollen, muß 1 ml
500/300 = 1,66 mg Arzneistoff bzw. dessen äquivalente Menge Farbstoff enthalten.
Über die Leitung 22 wird diese Lösung mittels der Pumpe 30 fünf Stunden lang mit
einer Volumenströmung von 1 ml/ min. abgepumpt und in den Behälter 12 geleitet,
in dem eine bestimmte Menge Verdünnungsflüssigkeit, beispielsweise Wasser enthalten
ist.
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Nachdem auf diese Weise insgesamt 300 ml Farbstofflösung aus dem Behälter
10 abgepumpt sind, wird dem Behälter 10 mit einer Geschwindigkeit von 1 ml/min.
nach Öffnung des Hahns 35 durch die Leitung 20 Wasser zugeleitet. Die durch die
Leitung 22 bzw. 20 in den Behälter 12 gelangende Farbstoffmenge entspricht der Arzneimittelmenge,
die bei sich nach einer Reaktion nullter Ordnung im Magen auflösenden Arzneimittel
in den Magensaft gelangt.
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Die Resorption des Arzneimittels wird im Behälter 12 simuliert.
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Diesem Behälter (er stellt beispielsweise das Magen- und Darmkompartiment
dar) wird also über die Leitung 22 während der ersten fünf Stunden Farbstofflösung
mit der konstanten Konzentration cO und anschließend Wasser mit 1 ml/min. zugeleitet.
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Aus dem Behälter 12 wird die in ihm enthaltene Lösung mit der gleichen
konstanten Volumenströmung durch die Leitung 24 mittels der Pumpe 32 abgeleitet.
Es ist daher die Formel (1) zu verwenden. Damit errechnet sich nach der Formel (3)
für die angenommene Resorptionskonstante: v = 60 ml.
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Das Volumen des Behälters 12 muß also 60 ml betragen.
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Die mit 1 ml/min aus dem Behälter 12 (Resorptionsgefäß) ablaufende
Farbstofflösung hat eine Konzentration, die zunächst über fünf Stunden nach der
Formel (2) zunimmt und dann nach (1) abnimmt.
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Die Elimination wird dadurch simuliert, daß in den Behälter 14 dieFarbstofflösungmit
der aus der Auflösung und der Resorption resultierenden Konzentration mit einer
Volumenströmung von 1 ml/ min. aus dem Behälter 12 eingebracht wird.
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Bei Annahme einer Eliminationsreaktion nullter Ordnung muß entsprechend
der Formel (7) die von der Pumpe 34 abgepumpte Volumenströmung doppelt so groß sein
wie die über die Pumpe 32 zugepumpte
Volumenströmung. Nach Auflösen
der Formel (7) nach vO und Einsetzen von R = 1 ml/min. ergibt sich:
Diese Formel kann mit der angenommenen Eliminationskonstanten k noch umgerechnet
werden in:
Für c0 ist die aus der in vivo ermittelten Blutspiegelkurve der jeweiligen untersuchten
Substanz resultierende Höchstkonzentration einzusetzen. Diese Höchstkonzentration
ist durch den Schnittpunkt der halblogarithmisch aufgetragenen und verlängerten
Blutspiegelkuse mit der Ordinate gegeben. Sei c0 zu 1 mg/ ml angenommen, dann ergibt
sich mit Umrechnung der angenommenen Eliminationskonstanten von 0,2 mg/ml/h in 0,0033
mg/ml/min: v0 = 300 ml.
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Unter den genannten Bedingungen, d.h. bei einer Einpumpgeschwindigkeit
von 1 ml/min und bei einer Abpumpgeschwindigkeit von 2 ml/min ist das Gefäß 14 nach
5 Stunden leer, d.h. nach fünf Stunden ist das gesamte Arzneimittel eliminiert.
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Die Konzentration der durch die Leitung 26 abgepumpten Farbstofflösung
kann mittels irgendeiner herkömmlichen Durchflußextinktionsmeßzelle gemessen werden
und ergibt die jeweilige Farbstoffkonzentration im Eliminations-Kompartiment, die
der Arzneimittelkonentration im Plasma oder im Blut entspricht. Erfolgt die gesamte
Ausscheidung des Arzneimittels über die Niere, so entspricht die ablaufende Farbstoffmenge
der mit dem Urin ausgeschiedenen Arzneimittelmenge.
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Erläuterung der @@rrichtung: Im folgenden seien einige beim experimentellen
*t- ~bau und der Durchführung einer Simulation zu beachtende Binzelheiten angegeben:
Die in der beschriebenen Weise den einzelnen Kompartimenten des Organismus entsprechenden
Gefäße können Bechergläser sein, die über Schläuche miteinander verbunden sind.
Wichtig ist, daß die Volumenströmungen zwischen den Bechergläsern genau gesteuert
werden können. Dazu wird vorteilhafterweise z.B.
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eine Technicon-Schlauchpumpe, Typ Proportionier-Pumpe I verwendet,
die mit Tygon-Schläuchen mit einer Förderleistung zwischen 1 und 3 ml/min. bestückt
ist. Bei dieser Pumpe bestimmen die Schläuche selbst die Förderleistung. Somit kann
für mehrere gemäß der Fig. 1 hintereinander ablaufenden Reaktionen eine gemeinsame
Pumpe verwendet werden, wobei möglichst darauf zu achten ist, daß alle von den Behältern
zur Pumpe und von der Pumpe zu den Behältern führenden Schläuche gleichlang sind.
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Eine solche Vorrichtung ist in Fig. 2 dargestellt: Vier Behälter 37
sind über Schläuche 38 in Reihe hintereinander geschaltet. Jeder Schlauch ist durch
eine peristaltische Pumpe 39 geführt, deren Fördermenge durch den Schlauchquerschnitt
gegeben ist. Der aus dem letzten Behälter kommende Schlauch ist an ein Durchflußmeßgerät
40 angeschlossen. Mit der dargestellten Vorrichtung kann entsprechend den vier Behältern
eine Reaktionskette aus vier Reaktionen simuliert werden, wobei die anfänglich in
den Behältern enthaltenen Volumina und die Durchflußquerschnitte der Schläuche den
ReaRUionskonstanten entsprechend gewählt werden.
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Die Bechergläser befinden sich auf Magnetruhrernyum für eine gute
Durchmischung der zulaufenden Flüssigkeit mit dem in einem Gefäß vorgegebenen Volumen
zu sorgen. Zur Festlegung in den Bechergläsern werden die Schlauchenden in Glas
röhrchen
eingeführt, die auf einer Stativklemme in Korkstopfen
gehalten sind. Der Abstand zwischen in ein gemeinsames Becherglas einragenden Schlauchenden
soll möglichst groß sein, damit vermieden wird, daß Anteile der zugeführten Flüssigkeit
vor vollständigem Durchmischen mit der Flüssigkeit im Becherglas durch den anderen
Schlauch abgepumpt werden.
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Aus dem letzten Gefäß, daswie im zu Erläuterung der theoretischen
Grundlagen geschilderten Beispiel ausgeführt, im allgemeinen das Eliminationsgefäß
darstellt, wird die Farbstofflösung durch eine Durchflußküvette hindurchgepumpt
und die jeweilige Farbstoffkonzentration über einen Schreiber registriert.
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Als Meßeinrichtung hat sich ein Spektral-Photomet/Hitachi 101 bewährt,
als Schreiber ein Linlog-Schreiber S der Firma Servogor.
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Die Durchflußküvette hat einen Durchmesser von 1 cm und ein Volumen
von 80 Mikrolitern.
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Als Farbstoff wurde Methylenblau in einer Menge von 0,5 bis 2 mgverwendet,
so daß in Abhängigkeit vom Eliminationsvolumen die gemessene Extinktion nicht über
0,8 ansteigt. Unter unseren Versuchsbedingungen ergab sich E1 1cm = 2042 gemessen
1cm bei 675 nm.
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Im Gegensatz zu dem anhand der Fig. 2 beschriebenen offenen System
kann auch ein geschlossenes System verwendet werden, insbesondere dann, wenn die
verwendete Volumenströmung im gesamten Behältersystem konstant ist. Eine solche
Vorrichtung ist schematisch in Fig. 3 dargestellt. Bei dieser Vorrichtung sind mehrere
Behälter 41, die in Form nach unten offenen Zylinder ausgebildet sind, über dicht
durch ihre Stirnwände 42 geführte Leitungen 44 in Reihe geschaltet. In den ersten
Behälter führt eine Leitung 46, die an eine langhubige Kolbenpumpe 48 angeschlossen
ist. Aus dem letzten Behälter führt eine Leitung 50 durch eine Meßzelle 52 hindurch.
Jede Stirnwand weist einen Stopfen 54 auf.
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Jeder Behälter ist nach unten mit einem senkrecht verschiebbaren Kolben
56 verschlossen. Zum Simulieren beispielsweise mehrerer hintereinander ablaufender
Reaktionen erster Ordnung werden die Behältervoluminadurch Einstellung der Kolben
festgelegt. Die Stopfen 54 werden verschlossen und die Pumpe 48, die mit Farbstofflösung
geeigneter Konzentration gefüllt ist, wird in Gang gesetzt. Diese Pumpe 48 ist derart
langhubig, daß sich der gesamte Reaktionsablauf mit einem Hub der Pumpe simulieren
läßt. Für eine einwandfreie Durchmischung der Flüssigkeiten in den Behältern können
Magnetrührer sorgen oder es ist eine Ultraschallrührung vorgesehen.
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Wie aus den eingangs erläuterten theoretischen Grundlagen hervorgeht,
ist eine mit einer beschriebenen Vorrichtung aufgenommene Farbstoffkonzentrationskurve
einer Blutspiegelkurve unmittelbar vergleichbar. Abszisse und Ordinaten müssen dazu
jedoch sinnvoll geeicht werden.
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Die Abszisse ist bei einer Blutspiegelkurve die Zeitachse. Im Abschnitt
theoretische Grundlagen wurde davon ausgegangen, daß die tatsächlichen Reaktionskonstanten
simuliert werden, d.h.
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die Farbstoffkonzentrationskurve in der gleichen Zeit aufgenommen
wird, wie eine Blutspiegelkurve. Es ist jedoch wünschenswert, die entsprechenden
Informationen in kürzerer Zeit zu erhalten, um je Arbeitstag mehrere Kurven aufnehmen
zu können.
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Dies kann dadurch erreicht werden, daß die Volumina entsprechend verkleinert
werden0 Die Vorgänge laufen dann um den Verkleinerungsfaktor des Volumens schneller
ab. Da manche Reaktionskonstanten, beispielsweise Resorptionskonstanten, Werte von
10/h annehmen können, sind der Volumenverkleinerung Grenzen gesetzt.
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Einer Reaktionskonstanten von 10/h entspricht bei einer Volumenströmung
von 2 ml/min ein Volumen von 12 ml.
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Sine Verkleinerung unter 4 ml ist nicht angebracht, da sonst keine
Durchmischung mehr gewährleistet ist.
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Auch einer Erhöhung der Pumpgeschwindigkeit sind wegen der notwendigen
Durchmischung in den Behältern Grenzen gesetzt.
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Bei in-vivo-Untersuchungen sind in der Regel die ersten neun Stunden
wichtig. Beim erfindungsgemäßen Verfahren hat sich bewährt, mit einer um den Faktor
3 erhöhten Geschwindigkeit zu arbeiten, d.h. die simulierten Blutspiegelkurven können
innerhalb von drei Stunden erstellt werden. Somit ist es möglich, in vivo gemessene
Blutspiegelkurven innerhalb eines oder weniger Tage durch mit entsprechend gefütterten
Reaktionskonstanten simulierte Färbeflüssigkeitskonzentrationskurven anzunähern
und die den in vivo ablaufenden Reaktionen entsprechenden Konstanten zu ermitteln.
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Bezüglich der Eichung der Ordinate, die bei Blutspiegelkurven die
Konzentration des Arzneistoffes darstellt, ist folgendes zu beachten: Die eingesetzte
Farbstoffmenge (im eingangs geschilderten Beispiel beispielsweise 1 mg Methylenblau)
entspricht einer bestimmten Menge Arzneistoff, z.B.
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200 mg . Die Konzentration, die die Farbstofflösung in dem vor allem
interessierenden Eliminationskompartiment annimmt, hängt in erster Linie von dem
Volumen des Eliminationskompartimentes (Behälter 14 im geschilderten Beispiel) ab,
wie auch die Konzentration des Arzneistoffes im Blut vom Verteilungsvolumen abhängt,
das dem Arzneistoff zur Verfügung steht. Die interessierende, theoretische Höchstkonzentration
würde sich ergeben, wenn sich der gesamte eingesetzte Farbstoff im Eliinationsbehälter
befinden würde, im geschilderten Beispiel 1 mg Methylenblau in 400 ml. Die Extinktion
dieser Lösung betrüge (spezifische Extinktion des Methylenblaus bei 675 nm = 1 a
= = 2042) 032.
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1 cm Die theoretische Höchstkonzentration des Arzneistoffes ergibt
sich, wie bereits ausgeführt, durch den Schnittpunkt der Blutspiegelkurve bei semilogarithmischer
Auftragung mit der Ordinate. Dieser Schnittpunkt sei für eine Arzneimitteldosis
von 200 mg bei einer Konzentration von 2,5 fg/ml
Dann entspricht
eine Extinktion von 1 ml Farbstoff in 400 ml Eliminationsvolumen = ü,2 einer Konzentration
vo 2,5 Mikrogramm/ml des Arzneistoffes im Blut. Mit dem so geonnenen Maßstab kann
die Ordinate beschriftet werden.
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Die durch Analyse ermittelten Blutspiegelwerte können entsprechend
der angegebenen Eichung in das Registrierpapier der Farbstoffkonzentrationskurve
eingetragen werden, so daß bestimmt werden kann, ob die simulierte Blutspiegelkurve
der tatsächlichen Blutspiegelkurve folgt, d.h. ob das pharmakokinetische Modell,
das der simulierten Blutspiegelkurve zugrundeliegt, richtig aufgestellt ist.
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Anwendunrsbeispiel: Typisch für die Pharmakokinetik ist die Nachahmung
von Blutspiegelkurven. Eine geqlückte Nachahmung zeigt dem Pharmakokinetiker, dap
die experimentell ermittelten Daten richtig interpretiert werden, d.ü. die richtigen
Konstanten gefunden sind.
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In der Zeitschrift Europ. J. clin. Pharmacol. 7, 17 - 24 (1974) erschien
kürzlich eine Arbeit von R. Gugler et al, in der das pharmakokinetische Verhalten
des neuen Arzneimittels Pindolol am Menschen beschrieben wird. In dieser Arbeit
findet sich die Aussage, daß ein Blutspiegelwert von 10 ny/ml Pindolol die für das
Blockieren von ß-Rezeptoren minimale Konzentration ist. Das Arzneimittel wurde in
der arbeit in einer Dosierung von 5 mg verfolgt, was zu einer durchschnittlichen
Spitzenkonzentration von 33 ng/ml führte.
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Im folgenden erläuterten Anwendungsbeispiel werden folgende Aufgabenstellungen
verfolgt: Nach Einsetzen der in der obigen Arbeit angegebenen Resorptionskonstanten
von 2,36/h und der Eliminationskonstanten von 0,2/h soll unter Berücksichtigung
des angegebenen, durchschnittlichen Verteilungsvolumens von 142 l nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren
eine Blutspiegelkurve ermittelt und mit den Meßwerten der obigen Arbeit verglichen
werden. Da keine Angaben über die Auflösekonstanten des Arzneimittels gefunden werden
konnten, obwohl jedes in fester Form gegebene Arzneimittel bekanntlich vor seiner
Resorption aufgelöst werden muß wird die Auflösungskonstante aus dem Handelspräparat
Visken (R), das 5 mg Pindolol pro Tablette enthält, bestimmt und die Mit spiegelkurve
unter Berücksichtigung der so ermittelten Autlösekonstanten bestimmt.
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2. Unter Abänderung der Auflösekonstanten in Richtung auf eine verzögerte
Auflösung soll unter Berücksichtigung des angegebenen Wirkspiegels von 10 ng/ml,
der sicherheitshalber auf 15 ng/ml angehoben wird, eine Depotform entwickelt werden,
die neun Stunden lang einen Blutspiegelwert von etwa 15 ng/ml ergibt.
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Dabei interessiert vor allem, welche Unterschiede hinsichtlich der
Auflösung einer Retardform nach 0. Ordnung, die bei einer Dauertropfinfusion als
ideal angesehen wird, und nach 1. Ordnung sich in der Praxis ergeben.
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In der Fig. 4 ist der grundsätzliche Aufbau der verwendeten Vorrichtung
skizziert, wobei die Bezugszeichen 60, 62, 64 und 66 Behälter, das Bezugszeichen
68 ein Meßgerät und die Bezugszeichen 70, 72, 74, 76, 78 und 80 Leitungen bezeichnen.
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In der Fig. 5 sind die ermittelten Blutspiegelkurven angegeben, wobei
die Ordinate der Arzneimittelkonzentration in ng/ml und die Abszisse die Zeit nach
Verabreichung des Arzneimittels in Stunden angibt.
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Die in Fig. 5 ausgezogen dargestellte Kurve wurde mit einer gegenüber
der Fig. 4 etwas abgeänderten Vorrichtung aufgenommen, in der die beiden Gefässe
60 und 62 durch ein einziges Auflösegefäß ersetzt wurden, in das eine Leitung hineinführt
und aus dem eine Leitung in das nachgeschaltete Resorptionsgefäß 64 herausführt.
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Mit einem von Stricker (Firma Satorius)- angegebenen Lösemodell und
nach der in der oben erwannten Pindolol-Arbeit angegebenen analytischen Methode
wurde eine Auflösungskonstante von 6,4/h ermittelt, wobei aus der Interpolation
der Kurve bei 50 % Auflösung die Halbwertszeit ermittelt und daraus die Konstante
erster Ordnung berechnet wurde. In dem Auflösegefäß wurden zwei Milligramm Methylenblau
entsprechend einer Menge von 5 mg Pindolol aufgelöst. Das Volumen des Auflösegefäßes
errechnet sich bei einer Strömungsgeschwindigkeit des Wassers in das Auflösungsgefäß
und der Farblösung aus dem Auflösegefäß von 3,54 ml/min. aus der vorne angegebenen
Formel (3) Strömungsgeschwindigkeit Volumen = = 33 ml.
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Konstante Für das nachgeschaltete Resorptionsgefäß errechnet sich
das Volumen aus der Durchströmungsgeschwindigkeit von ebenfalls 3,54 ml/min. und
der Resorptionskonstanten von 2,36/h zu 90 ml.
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Für das Eliminationsgefäß 66 errechnet sich das Volumen aus der Eliminationskonstanten
von 0,2/h und einer Durchströmungsgeschwindigkeit durch die Leitungen 78 und 80
von ebenfalls 3,54 ml/min. zu 1062 ml. Tatsächlich wurde, um die Versuchsdauer um
den Faktor 3 zu verkürzen, jeweils ein mit 1/3 multipliziertes Gefäßvolumen verwendet.
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Nach entsprechender Eichung wurde die in Fig.
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5 durchgezogene Blutspiegelkurve erhalten, die in idealer Weise die
in der Pindolol-Arbeit angegebenen, durchschnittlichen Meßwerte umschreibt. Dies
beweist einerseits die Richtigkeit der von den Autoren angegebenen Konstanten und
andererseits, daß auch unter Berücksichtigung der vorgeschalteten Auflösekonstanten
keine ins Gewicht fallende Abweichung resultiert.
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Diese Abweichung würde nur dann ins Gewicht fallen, wenn die Auflösekonstante
nicht in einem so günstigen Verhältnis zur Resorptionskonstanten stünde wie im Beispiel
der durchgezogenen Kurve (6,4 : 2,36), weil jeweils die kleinere Konstante die
limitierende
Größe ist.
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Für die Lösung der zweiten Aufgabe, d. h. für die Darstellung der
geforderten Retardform, die über neun Stunden einen Blutspiegel von ca. 15 ng/ml
ergeben sollte, waren folgende Überlegungen erforderlich: a) enn 5 mg Pindolol einen
Blutspiegel von 33 ng/ml ergeben, müssen unter Voraussetzung des bei Arzneimitteln
üblichen passiven Resorptionsprozesses 2,5 mg einen Blutspiegel von 16,5 ng/ml,
also etwa der gewünschten Blutspi gel von 15 ng/ml ergeben.
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b) Zum Blutspiegel nch einer Stunde trägt nicht 7-ur die Initialdosis,
sondern in gewissem Umfang auch die Erhaltungsdosis bei. Nach der von J A. Robinson
und S.P. Eriksen J. Pharm.
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Sci. 55, 1254 (1966)] angegebenen Methode wurde die Freisetzungsrate
der Erhaltungsdosis mit 0,35 mg/h bestimmt, während sich die entsprechende Initialdosis
dann zu 2,15 mg errechnete. Über neun Stunden unten somit 2,5 mg + (9 x 0,35) mg
= 5,3 mg Arzneimittel eingesetzt werden.
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In Fig. zur ist der grundsätzliche Aufbau der verwendeten Vorrichtung
dargestellt. Die gleichzeitige Gabe von Initialdosis und Erhaltungsdosis wurde dadurch
simuliert, daß zwei Auflösegefäße 60, 62 verwendet wurden. Vtit dem einen, 62, und
den Leitungen 72 und 74 wurde die Gabe der Initialdosis, mit dem anderen 60 und
den Leitungen 70 und 76 die Gabe der Erhaltungsdosis bei 1.Ordnung bzw. nur der
Leitung 76 bei O.Ordnung simuliert.
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Es wurde wieder mit einer Zeitraffung um den Faktor 3 gearbeitet:
at) Beim Simulieren der Erhaltungsdosis nach O. ter Ordnung wurde mit folgenden
Werten gearbeitet:
(Abkürzungen: Pi@@@lol = P Methylenblau = MB.)
Auflösegefäß 60: Es soll die Gabe von 0,35 mgP/h während 9 Stunden simuliert werden.
Entsprechend sind 0,35 9 = 3,15 mgP, also ,15 . 0,4 = 1,260 mg UB einzusetzen. Bei
einer Ströinungsge schwindigkeit von 1,77 ml/min durch die Leitung 76 ist diese
Menge in 955,8 ml Wasser im Auflösegefäß 60 zu lösen. Wegen der Zeitraffung sind
die 1,25 mg MB daher in 318,6 ml Wasser zu lösen.
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Auflösegefäß 62: Es ist die Gabe von 2,15 mg P entsprechend 0,86 mg
MB mit einer Auflösungskonstanten von 6,4/h zu simulieren. Strömungsgeschwindigkeit
in der Leitung 72: 1,77 mllmin Wasser; in der Leitung 74: 1,77 ml/min.
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Lösung: Das Volumen im Auflösegefäß 62 errechnet sich zu 16,5 ml und
beträgt entsprechend der Zeitraffung 5,5 ml.
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Resorptionsgefäß 64: Das Volumen errechnet sich, wie vorne, zu 90
ml (Strömungsgeschwindigkeit durch die Leitung 78: 3,54 ml/min ). Wegen der Zeitraffung
beträgt das Volumen 30 ml.
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Eliminationsgefaß 66: Das Volumen errechnet sich, wie vorne, zu 1062
ml und beträgt (Zeitraffung) 554 ml.
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Mit der beschriebenen Vorrichtung wurde die gestrichelte Blutspiegelkurve
der Fig. 5 erhalten, die im Bereich zwischen der dritten und der neunten Stunde
etwa linear verläuft. Sie sagt aus, daß mit eier Gesamtdosis von 5, mg Pindolol
die
geforderte Blutspiegelkonzentration von ca. 15 ng/ml erreicht
und über neun Stunden gehalten werden kann, ohne daß diese Konzentration, wie bei
der durchgehenden Kurve, um den Faktor 2 - 3 überschritten wird. Die nicht retardierte
Konzontration der durchgehenden Kurve unterschreitet bereits nach et.fa sechs Stunden
wieder den Wert von 15 ng/ml.
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@) Die Erhaltungsdosis für eine Auflösegeschwindigkeit des Arzneimitteldepots
nach erster Ordnung wurde ebenfalls nach J.R. Robinson und S.P. Eriksen (Literaturstelle
wie oben) berechnet und mit O,05/h bestimmt. Entsprechend wurde In Fig. 4 das Gefäß
60 mit folgenden Daten verwendet: Durchströmungsgeschwindigkeit durch die Leitung
70: 1,77 ml/min Wasser.
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Durchströmungsgeschwindigkeit durch die Leitung 76: 1,77 ml/min Lösung.
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In das Gefäß 60 eingesetzter Farbstoff: 2,8 mg r; entsprechend 7 mg
P. Das Volumen im Gefäß 60 errechnet sich zu 1,77 . 60 = 2124 2124 ml und beträgt
wegen der Zeitraffung 708 ml.
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0,05 -Im übrigen entsprach der Versuchs aufbau der letzterwähnten
Anordnung für eine Auflösung nach 0. Ordnung.
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Die gepunktete Kurve der Fig. 5 gibt den gemessenen Blutspiegelverlauf
wieder. Zwischen eins und neun Stunden wurde ein Blutspiegel zwischen 16 und 13
mg/ml erreicht. Allerdings ist zu berücksichtigen, daß in diesem Fall 9,15 mg Arzneistoff
eingesetzt wurden, während bei der Auflösung nach 0. Ordnung nur 5,3 mg eingesetzt
wurden.
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Während aber nach 0. Ordnung die gesamten 5,3 mg in das System eingeflossen
sind, sind bei der Auflösung nach 1.Ordnung nach Ablauf von neun Stunden nur 2,15
mg aus der Initialdosis und 2,6 mg aus der Erhaltungsdosis zur Verfügung gestellt
worden,
also insgesamt 4,75 mg, was auch durch die annähernd gleichen Flächen der Kurven
0. Ordnung und 1. Ordnung demonstriert wird. Ca. 4,4 mg Arzneistof- befinden sich
im Falle der Auflösung der Erhaltungsdosis nach 1. Ordnung noch im Arzneidepot und
stehen für die weitere Resorption zur Verfügung.
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Das Beispiel zeigt eindeutig die Überlegenheit einer Depot -arzneiform
mit einer uflösecharakteris-isik 0. Ordnung. Diese ist aber nur selten technisch
realisierbar. Bei Einsatz eines Überschusses an Arzneistoff kann aber mit einer
Depotform mit Auflösecharakteristik nach 1. Ordnung ein befriedigend konstanter
Blutspiegel erreicht werden.