DE2455583A1

DE2455583A1 - Diffusions-entfleckungsgeraet und entfleckungsverfahren fuer tafelfoermiges gel

Info

Publication number: DE2455583A1
Application number: DE19742455583
Authority: DE
Inventors: Stanton Albert Hoefer
Original assignee: Hoefer Scientific Instruments
Current assignee: Hoefer Scientific Instruments
Priority date: 1974-03-18
Filing date: 1974-11-23
Publication date: 1975-10-02
Also published as: US3930880A; DE2455583C3; DE2455583B2

Description

Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, Kalif. (V.St.A.)

Diffusions-Entfleckungsgerät und Entfleckungsverfahren für

tafelförmiges Gel.

Für diese Anmeldung wird die Priorität aus der entsprechenden tr.S.-Anmeldung Serial Ko. 452,07b vom 18. März 1974 in Anspruch, genommen.

Die Erfindung betrifft ein Entfleckungsgerät für tafelförmiges Elektrophorese-Gel, bei dem die getrennten Proteinfraktionen nicht gestört werden, sowie ein Verfahren zur Entfleckung von derartigen Geltafeln.

Das Entflecken von Acrylamidgel ist zur Vervollständigung der Analyse von Proteinen erforderlich, welche durch Elektrophorese getrennt worden sind. Die ionischen Bestandteile eines Proteingemischs in einem Acrylamidgel sind von "blattförmiger Gestalt. Die !Trennung der ionischen Bestandteile ist für das menschliche Auge unsichtbar, solange die Geltafeln noch nicht eingefärbt und mit einem entsprechenden Farbstoff fixiert worden sind. Der Farbstoff oder die "Beize" durchdringt das Gel vollkommen und verleiht ihm eine dichte, opake Farbgebung, wobei der überflüssige Farbstoff, d.h. sämtlicher Farbstoff, der-nicht von den ionischen Bändern gehalten wird, entfernt werden muß bevor die Bänder selbst sichtbar werden. Die Entfleckung kann auch elektrophoretisch erfolgen, indem ein Gleichstrom durch das Gel durchgeschickt wird. Bei Entfleckung vermittels Diffusion wird das Gel in

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einer umgewälzten Waschflüssigkeit gebadet..Bei elektrophoretischer Entfleckung besteht die Gefahr von BandVerlagerungen und der Entstehung von Artifakten, so daß der Verfahrensablauf ständig von einer Person beobachtet werden muß. Daher bestellt ein Bedarf an einer Vorrichtung und tinem Verfahren zur Entfleckung von Gel, die keine ständige Aufsicht erfordern und nicht zu BandVerlagerungen innerhalb der Geltafeln führen.

Beim Diffusionsverfahren ist weiterhin erforderlich, daß die vom Gel weggeführten Farbstoffteilehen absorbiert werden, bevor die Flüssigkeit erneut das Gel bestreicht, um überschüssige Färb- oder Beizteilchen abzuführen.

Durch die Erfindung sollen nunmehr ein verbessertes Entfleckungsgerät für Elektrophorese-Geltafein und ein entsprechendes Entfleckungsverfahren geschaffen werden, welche eine verhältnismäßig rasche Entfleckung gestatten, dabei jedoch Bandverschiebungen innerhalb der Geltafeln vermeiden, ein Minimum an Bedienung, sowie Handhabung der Geltafeln erfordern und nicht die Einhaltung einer vorgeschriebenen Behandlungszeit erforderlich machen. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist die Schaffung eines Entfleckungsgeräts, bei dem keine Teile durch die Behälterwand durchgeführt sind.

Das erfindungsgemäß vorgeschlagene Entfleckungsgerät für tafelförmiges Elektrophorese-Gel zum Betrieb mit Waschflüssigkeitsumwälzung ist erfindungsgemäß gekennzeichnet durch einen Flüssigkeitsbehälter mit Seitenwänden, einer Bodenwand und einer innerhalb des Behälters gehaltenen Trennwand, welche im wesentlichen den ganzen Querschnitt zwischen den Seitenwänden ausfüllt, den Behälter in eine erste und eine zweite Kammer unterteilt, und die mit Aus-

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nehmungen versehen ist, einem Zylinder, der einen in Verbindung mit dem einen Ende der ersten Behälterkammer und durch eine Ausnehmung in der Trennwand in Verbindung mit dem anderen Ende der zweiten Behält erkammer stehenden Rückstromweg "bildet, einen innerhalb des Rückstromweg-Zylinders angeordnetes PiIter, mehrere durch die Trennwand gehaltene Geltafel-Halterobre, die in Verbindung mit den übrigen Ausnehmungen stehen, und mehrere zur Aufnahme der Geltafeln und zum Einsetzen derselben in die Geltafel-Halterobre dienende flexible Halterungen, wobei der Zylinder und die Geltafel-Halterobre in einem kontinuierlichen Durchflußweg-Rückstromweg angeordnet sind und eine zum Umwälzen von Waschflüssigkeit entlang des Rückstromweges dienende Vorrichtung vorgesehen und praktisch sämtliche Waschflüssigkeit im filtrierten Zustand an den Geltafeln vorbeiführbar ist.

Entsprechend einer weiteren Ausgestaltung kann innerhalb des Behälters ein Rührstab vorgesehen sein, der vermittels eines behälteraußenseitig angelegten magnetischen Drehfelds gedreht wird. Das Entfleckungsgerät weist einen in sich geschlossenen Waschflüssigkeitsumlauf auf.

Entsprechend dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Entflecken von Geltafeln wird eine Geltafel in eine flexible Halterung eingelegt und- diese dann in einen Durehflüßweg eingesetzt, eine Ehtfleckungsflüssigkeit durch den Durchflußweg durchgeleitet, und die Entfleckungsflüssigkeit filtriert und insbesondere kontinuierlich umgewälzt.

Bei dem erfindungsgemäßen Entfleckungsgerät wird die Waschflüssigkeit innerhalb des Flüssigkeitsbehälters fortlaufend umgewälzt. Die im Flüssigkeitsbehälter angeordnete Trennwand unterteilt den Flüssigkeitsbehälter in eine erste und eine zweite Kammer. Der innerhalb des Behälters ausge-

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bildete Ruckstromweg verbindet ersten und zweiten Bebälter miteinander. Das zum Entfernen von Farbstoff- oder Beizteilchen dienende Filter befindet sich im Rückstromweg. Die flexible Halterung für die Geltafeln kann aus einem flexiblen oder biegsamen Sieb bestehen, das sich zylindrisch aufrollen und in die Geltafel-Halterohre einsetzen läßt. Die Geltafel-Halterohre sind in Ausnehmungen der Trennwand eingesetzt, so daß vermittels einer in der zweiten Behälterkammer angeordneten Pumpvorrichtung Waschflüssigkeit aus der zweiten Kammer durch die Geltafel-Halterohre hindurch gepumpt wird und dabei überschüssige Farbstoff- oder Beizteilchen von den Geltafeln abführt. Die Waschflüssigkeit tritt über die erste Kammer in den Rückstromweg ein, durchsetzt das Filter, in welchem Farbstoffteilchen aus der Waschflüssigkeit ausgeschieden werden, und wird dann im filtrierten Zustand vermittels der Pumpvorrichtung vom Filter wiederum in die zweite Kammer eingeführt, in welcher sie wiederum die Geltafeln in kontinuierlichem Umlauf bestreicht.

Die Erfindung wird im nachfolgenden anhand des in der Zeichnung dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert.

Fig. 1 ist ein teilweise im Schnitt gehaltener seitlicher Aufriß des Entfleckungsgeräts für tafelförmiges Gel nach, der Erfindung.

Fig. 2 ist ein Querschnitt entlang der Linie 2-2 von Fig. 1.

Fig. 3 ist ein Querschnitt entlang der Linie 3-2 von Fig. 1.

Fig. 4 ist eine isometrische Ansieht einer Geltafel-Halterung in Form eines flexiblen Siebes.

Das Geltafel-Entfleckungsgerät weist entsprechend der Darstellung in Fig. 1 einen Flüssigkeitsbehälter 11 von zylindrischer Formgebung mit einer geschlossenen Bodenwand

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12 und einem offenen oberen Ende auf. Ein Deckel 13 dient zum Verschließen des offenen oberen Endes des Flüssigkeitsbehälters 11. Eine beispielsweise als Flansch ausgeführte Trennwand 14 erstreckt sich über den ganzen Innendurchmesser des Behälters 11 und unterteilt den Behälterinnenraum in eine erste Kammer 16 und eine zweite Kammer 17. Die Trennwand 14 wird innerhalb des Behälters 11 durch. Füße 18 gehalten, welche sich gegen die Bodenwand 12 abstützen. Ein zylindrischer Mantel 19 ist von der Trennwand 14 nach unten geführt, berührt jedoch die Bodenwand 12 nicht. Ein einen magnetischen Werkstoff enthaltender Stab 24 ist drehbar auf der Bodenwand 12 innerhalb des nach unten vorstehenden zylindrischen Mantels 19 gelagert.

'Ein oder mehrere Geltafel-Halterohre 22 sind innerhalb der ersten Kammer 16 angeordnet. Die Geltafel-Halterohre sind an beiden Enden durch Endkappen 23 verschlossen, welche mit Durchbrechungen 24 versehen sind, wie am besten aus Fig. 3 ersichtlich ist. Die Trennwand 14 weist ebenfalls durchgehende Ausnehmungen 26 auf, welche so bemessen sind, daß sie zur Aufnahme der Endkappen 23 dienen. Eine weitere Ausnehmung 27 in der Trennwand 14 befindet sich innerhalb des von dem nach unten vorstehenden zylindrischen Mantel 19 umschlossenen Bereichs der Trennwand 14.

Wie am besten aus Fig. 1 ersichtlich, trägt die Trennwand 14 einen Zylinder 28 mit Durchbrechungen 29, vermittels welcher die erste Kammer 16 mit dem Innenraum des Zylinders 28 in Verbindung steht, und welche einen Ruckstromweg bilden. Ein Filter 31 füllt praktisch den ganzen Innendurchmesser des Zylinders 28 auf und ruht auf Blöcken 32 am unteren Ende des Zylinders 28.

Wie am besten aus Fig. 2 ersichtlich, tragen die Gel-

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tafel-Halterobre 22 an ihrer Innenwandung mehrere Stäbe 30, welche sich, über die ganze Länge der Rohre 22 erstrecken. Bei dem hier dargestellten Ausführungsbeispiel sind vier Stäbe 30 um 90° zueinande;
Halterohre 22 vorgesehen.

Stäbe 30 um 90° zueinander versetzt an der Innenwand der

]?ig. 2 zeigt weiterhin ein Sieb 33 am Einlaßende des Filters 31. Bin entsprechendes Sieb ist am entgegengesetzten, d.h.. am Auslaßende angeordnet. Die Geltafel-Halterohre 22 enthalten Geltafel-Halterungen in 3?orm von zusammengelegten, biegsamen Sieben 34, in welche die Geltafeln eingelegt sind, und welche die Geltafeln innerhalb' der Halterohre 22 halten.

Fig. 4 zeigt eine Geltafel 36, welche auf einem biegsamen Sieb 34 liegt. Das Sieb 34 läßt sich zusammenfalten, so daß es gegen beide Oberflächen der Geltafel 3b anliegt und diese zwischen sich. hält.

Die Arbeitsweise des Geltafel-Entfleckungsgeräts ist kurz wie folgt: Entsprechend der Darstellung in Pig. 4 wird eine Geltafel 36 nach, der Elektrophorese auf ein biegsames Sieb 34 gelegt, welche als Halterung und Schutz dient. Das Sieb 34 wird dann in eine zylindrische Porm gerollt und in ein Geltafel-Haiterohr 22 eingesetzt, wonach, an beiden Enden Endkappen 23 auf das Geltafel-Halterohr 22 aufgesetzt werden. Die Stäbe 30 halten das Sieb in einem Abstand von der Innenwand der Halterohre 22. Das Färben der Geltafeln erfolgt dadurch, daß die Geltafel-Halterohre 22 in ein Färbbad eingebracht werden, in welchem sie ein dichtes, opakes Aussehen annehmen, wonach sie entfleckt werden müssen, um die ionischen Bänder sichtbar zu machen. Der Flüssigkeitsbehälter 11, der Deckel 13 und sämtliche innerhalb des Behälters 11 befindlichen Teile sind aus Werkstoffen hergestellt, die von der im Diffusions-Entfleckungsgerät umgewälzten

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Waschflüssigkeit nicht angegriffen werden. So kann bei der hier dargestellten Ausführungsform die Trennwand 14 aus Polyvinylchlorid",--und der Flüssigkeitsbehälter 11 aus vergossenem TPX (Polymethylpenten: Warenzeichen von International Chemical Industries ltd) "bestehen. Die flexiblen Siebe 34 bestehen aus Polypropylen und können bei der hier betrachteten Ausführungsform Tafeln von bis zu 17,0 cm Breite und 33 cm Länge und jeder gewünschten Stärke aufnehmen. Die Stärken liegen im allgemeinen zwischen 0,75 bis 3 mm. Die G-eltafel-Halterohre 22 bestehen aus durchsichtigem Polyvinylchlorid, während die Bndkappen 23 aus Polyäthylen hergestellt sein können.

Nach dem Färben der Geltafeln 3t> werden die Geltafel-Halterohre 22 mit den aufgesetzten Endkappen 23 in die Ausnehmungen 26 in der Trennwand 14 eingesetzt. Bei der hier beschriebenen Ausführungsform lassen sich, zwei Geltafel-Halterohre 22 einsetzen; durch entsprechende Abänderungen an der Trennwand I.4 kann eine beliebig andere Anzahl von Halterohren eingesetzt werden. Die Trennwand 14, welche die Geltafel-Halterohre 22 trägt, befindet sich, innerhalb des Behälters 11, der mit einer sauren Bntfleckungslösung gefüllt ist, die als Waschflüssigkeit dient. Zuletzt wird der Deckel 13 auf das offene Behälterende aufgesetzt und dann ein magnetisches Drehfeld auf der Unterseite der Behälterbodenwand 12 angelegt. Der Stab 21, welcher magnetischen Werkstoff enthält, ist mit einem für die Waschflüssigkeit undurchdringbaren überzug versehen und wird vermittels des magnetischen Drehf elds innerhalb des durch, den zylindrischen Mantel 19 umschriebenen Innenraums in Umdrehung versetzt. Beim Umlauf des Stabes 21 wird die Waschflüssigkeit zentrifugal in die zweite Kammer 17 gepumpt und durchsetzt die Ausnehmungen 26 in der Trennwand Η, sowie die Durchbrechungen 24 in den Endkappen 23 und gelangt auf diese Weise in das Innere der Geltafel-Halterohre 22. Innerhalb

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der Halterohre 22 bestreicht die Waschflüssigkeit die inneren und äußeren Oberflächen des flexiblen Siebes 34, in welchem die Geltafel 36 enthalten ist. Das ist ohne weiteres möglich,, da das Sieb 34 durch die Stäbe 30 in. einem Abstand von den Halterohrinnenwänden gehalten ist. Auf diese Weise erfolgt ein rasches, gleichförmiges Spülen und Entflecken der Geltafel 36. Die Waschflüssigkeit tritt durch die Durchbrechungen 24 in der Endkappe 23 am entgegengesetzten Halterohrende aus und tritt in die erste Kammer 16 ein und verläßt diese wiederum durch die Durchbrechungen 2y im Zylinder, welcher einen Rückstromweg bildet, in welchem das "Filter 31 angeordnet ist. Die Waschflüssigkeit durchsetzt das Filter 31 und tritt an der Ausnehmung 27 in der Trennwand 14 aus und wird wiederum durch den umlaufenden Stab 21 durch Zentrifugalwirkung in die zweite Kammer 17 gepumpt. Auf diese Weise ergibt sich, eine kontinuierliche umwälzung, wobei filtrierte Waschflüssigkeit auf allen Seiten an den Geltafeln 36 in den Geltafel-Halterohren 22 vorbeigepumpt wird und dabei an diesen anhaftende Farbstoff- oder Beizteilchen abführt.

Das Geltafel-Diffusions-Entfleckungsgerät erlaubt, eine 0,75 mm starke Geltafel, die mit Öoomassie-Blau gebeizt worden ist, im Verlauf etwa einer Stunde völlig zu entfärben. Während der Entfleckung besteht keine Gefahr von Bandverlagerungen oder Bandauslöschungen. Vom Ende der Elektrophoresebehandlung bis zur Beendigung des EntfleckungsVorgangs sind mit Ausnahme des Einlegens keine Handreichungen erforderlich. Alle Teile des Geräts sind standfest gegenüber der Waschflüssigkeit.

Das vorgeschlagene Entfleckungsverfahren für Geltafeln besteht darin, daß eine Geltafel in einen kontinuierlichen Umwälzstrom gebracht, die im Umwälzstrom umgewälzte Entfleckungsflüssigkeit filtriert und die filtrierte Entfleckungsflüssigkeit erneut umgewälzt wird.

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Claims

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Patent ansprach, e

Entfleckungsgerät für tafelförmiges Elektrophorese-GeI zum Betrieb mit Waschflüssigkeitsumwälzung, gekennzeichnet durch einen Flüssigkeitsbehälter (11) mit Seitenwänden, einer Bodenwand (12) und einer innerhalb des Behälters gehaltenen Trennwand (14), welche im wesentlichen den ganzen Querschnitt zwischen den Seitenwänden ausfüllt, den .Behälter in eine erste und eine zweite Kammer (16 bzw. 17) unterteilt, und die mit Ausnehmungen (26) versehen ist, einem Zylinder (28), der einen in Verbindung mit dem einen Ende der ersten Behälterkammer (16) und durch eine Ausnehmung (26) in der Trennwand (14) in Verbindung mit dem anderen Ende der zweiten Behälterkammer (17) stehenden Rückstromweg bildet, einen innerhalb des'Rückstromweg-Zylinders (28) angeordneten Filter (31), mehrere durch die Trennwand (14) gehaltene Geltafel-Halterohre (22), die in Verbindung mit den übrigen Ausnehmungen (26) stehen, und mehrere zur Aufnahme der Geltafeln und zum Einsetzen derselben in die Geltafel-Halterohre (22) dienende flexible Halterungen (34), wobei der Zylinder (28) und die Geltafel-Halterohre (22) in einem kontinuierlichen Durchfluß-Rückstromweg angeordnet sind und eine zum Umwälzen τοη Waschflüssigkeit entlang des Durchflußweges dienende Vorrichtung (21) vorgesehen und praktisch sämtliche Waschflüssigkeit im filtrierten Zustand an den Geltafeln (36) vorbeiführbar
2. Entfleckungsgerät nach. Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß jedes Filter (31) im wesentlichen den ganzen Querschnitt des Rückstromweg-Zylinders (28) einnimmt.
3. Entfleckungsgerät nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet ,^üie Geltafel-Halterohre (22) an beiden Enden durch. Endkappen (23) verschlossen sind, die Entkappen (23)

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Durchbrechungen (24) aufweisen und in die Ausnehmungen (26) der Trennwand (H) einpaßbar sind, und daß die zur Aufnahme der Geltafeln (36) dienenden flexiblen Halterungen (34) vor Einsetzen in die Halterobre (22) in eine zylindrische Formgebung aufwickelbar sind.
4. Entfleckungsgerät nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Halterohre (22) in Längsrichtung verlaufende, von der Halterohrinnenwand vorstehende Stäbe (30) aufweisen, welche dazu dienen, die flexiblen Halterungen in einem Abstand von der Halterohrinnenwand zu halten, so daß die Waschflüssigkeit im wesentlichen sämtliche Geltafel-Außenflächen bestreichen kann.
5. Entfleckungsgerät nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß die Umwälzvorrichtung für Waschflüssigkeit aus einem einen magnetischen Werkstoff enthaltenden Stab (21) besteht, der drehbar an der Bodenwand (12) des Behälters (11) gelagert und magnetisch, mit einem äußeren magnetischen Drehfeld gekoppelt und innerhalb der zweiten Kammer (17) in Umlauf versetzbar ist.
6. Entfleckungsgerät nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet," daß die Trennwand (14) in einem Abstand von der Bodenwand (12) angeordnet, mit dem einen Ende des Zylinders (28) verbunden ist, im wesentlichen den ganzen Querschnitt zwischen den Behälterseitenwänden und dem Zylinder einnimmt und wenigstens eine durchgehende Ausnehmung (26) aufweist, die Geltafel-Halterohre (22) jeweils in eine Ausnehmung (26) der Trennwand (14) eingepaßt und durch diese gehalten sind, ein Filter (31) im Rückstromweg (28) angeordnet ist, und die Waschflüssigkeit vermittels der Umwälzvorrichtung (21) zwecks Waschen der in den Halterungen (34) gehaltenen Geltafeln (36) durch die Trennwandausnehmungen (26), die Geltafel-Halterohre (22) und über den Rückstromweg-Zylinder (28) umwälzbar ist.

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7. Entfleckungsgerät nach. Anspruch. 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Achse des Rückstromweg-Zylinders gegen die Achse des Flüssigkeitsbebälters (11) versetzt angeordnet ist und die Achse der Geltafel-Halterohre (22) parallel zur Rückstromweg-Zylinderachse ausgerichtet ist.
8. Entfleckungsgerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Wascbflüssigkeits'umwälzvorrich/fcung (21) aus einem als Zentrifugalpumpe wirkenden umlaufenden Glied besteht, durch das die Flüssigkeit von dem Bebälter (31) weg den Irennwandausnehmungen (26) zuführbar ist.
9. Entfleckungsgerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Waschflüssigkeit aus einer sauren Lösung besteht und der Flüssigkeitsbehälter (11), der Rückstromweg-Zylinder (26), die Trennwand, (14), die Geltafel-Halterohre (22), die Geltafel-Halterungen (34), die Filter (31) und die Wascbflüssigkeitsumwälzvorrichtung (21) aus säurefesten Werkstoffen hergestellt sind.
10. Verfahren, zum Entflecken von Geltafeln vermittels eines Entfleckungsgeräts nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 - 9, dadurch gekennzeichnet, daß eine Geltafel (36) in eine flexible Halterung (34) eingelegt und diese dann in einen Durchflußweg (28) eingesetzt, eine Entfleckungsflüssigkeit durch den Durcbflußweg durchgeleitet, und die Entfleckungsflüssigkeit filtriert und insbesondere kontinuierlich umgewälzt wird.

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