DE2452282A1 - Diagnostischer testindikator zur bestimmung der lactatdehydrogenasekonzentration in seren und verfahren zu seiner herstellung - Google Patents

Description

Diagnostischer Testindikator zur Bestimmung der Lactatdehydrogenasekonzentration in Seren und Verfahren zu

seiner Herstellung

Der Einsatz diagnostischer Tests für die klinische Untersuchung von Patienten ist in den letzten Jahren immer beliebter geworden. Bei einer Reihe dieser Tests werden Testpapiere verwendet, wobei die den Test durchführende Person lediglich einen Teststreifen mit einem zur Untersuchung vorgesehenen Material, normalerweise einer Körperflüssigkeit, zusammenbringt und die dabei erhaltene Farbänderung oder Farbintensität des Papierstreifens dann beobachtet, wodurch sich feststellen läßt, ob ein bestimmter Effekt eingetreten ist oder nicht. Teststreifen oder Testkarten dieser Art gibt es beispielsweise zur Bestimmung von Glucose und treponemalen Erkrankungen.

Die bekannten Tests zur Ermittlung der Konzentration von Lactatdehydrogenase in Körperflüssigkeiten bestehen bisher aus äußerst komplexen Flüssigsystemen, wozu Teströhrchen, Meßeinrichtungen, Ultraviolettlicht, standardisierte Instrumente

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sowie Temperatur- und Ablesungskorrekturfaktoren erforderlich sind. Es besteht daher bereits seit geraumer Zeit der Bedarf nach einem einfachen Testmechanismus zur Bestimmung der Konzentration von Serumlactatdehydrogenase in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Blut, und diesem lange empfundenen Notstand wird nun erfindungsgemäß abgeholfen.

Wie bereits oben kurz erwähnt, wurde nun ein neues Testmittel zur Bestimmung der Konzentration von Lactatdehydrogenase in Körperflüssigkeiten gefunden. Das erfindungsgemäße Testiaitbel eignet sich zur qualitativen Feststellung und quantitativen Bestimmung von Lactatdehydrogenase in Seren, und dieses Testmittel besteht aus einer Reagenszubereitung, die einem saugfähigen Träger einverleibt ist.

Die quantitative Bestimmung von Lactatdehydrogenase ist äußerst wichtig zur Entdeckung von Herzleiden, besonders Her-ü-attacken, da die Konzentration an Lactatdehydrogenase im Blut. im Anschluß an Herzattacken stark über die normale Konzentrat tion ansteigt. Die frühzeitige Entdeckung eines solchen abnormalen Anstiegs der Lactatdehydrogenasekonzentration ermöglicht daher ganz offensichtlich eine genauere und schnellere Diagnose von Herzerkrankungen.

Da eine frühe Diagnose abnormaler Herzsustände so wichtig ist muß ein Testverfahren zur Entdeckung von Änderungen in der Lactatdehydrogenasekonzentration im Blut für den Kliniker rasch und möglichst einfach durchführbar sein, jedoch so zuverlässig, daß sich die Diagnose ohne extreme Möglichkeiten eines Irrtums oder einer falschen Beurteilung stellen läßt. Die erfindungsgemäßen neuen Indikatoren erfüllen diese Bedingungen. Für den Einsatz des erfindungsgemäßen neuen Systems braucht man keine speziellen Instrumente, und es ist kein Vermischen und keine Rekonstitution von Reagentien erforderlich. Der Test kann daher ohne spezielle Vorrichtung

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zuhause oder in der Arztpraxis durchgeführt werden.

Die neuen diagnostischen Testindikatoren zur Bestimmung der Konzentration an Lactatdehydrogenase, die im folgenden gelegentlich als LDH bezeichnet wird, in Seren bestehen aus einem saugfähigen Material, das. kovalent gebundene Diaphorase und den getrockneten Rückstand enthält, den man durch Imprägnieren dieses saugfähigen Materials mit einer Reihe von Reagensmaterialien erhält.

Das zur Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Testindikatoren verwendete saugfähige Material besteht vorzugsweise aus einer Cellulosebahn. Es lassen sich jedoch auch andere saugfähige Materialien verwenden, in deren Zwischenräumen ein hydrophiles vernetztes sulfitiertes Aldehyd- oder Ketonpolymer verteilt ist, an das die Diaphorase kovalent gebunden ist. Dieses saugfähige Material ist an sich nicht Gegenstand der Erfindung, sondern lediglich eine Komponente des gesamten erfindungsgemäßen Testindikators. Das sulfitierte Aldehyd- oder Ketonpolymer kann hergestellt werden, indem man ein solches Polymer sulfitiert und vernetzt, um es so hydrophil zu machen. Unter hydrophil versteht man dabei, daß das erhaltene Polymer in Wasser quellbar oder zur Aufnahme von Wasser befähigt ist, -;ich darin jedoch nicht wesentlich löst. Die Reihenfolge des SuIfitierens und Vernetzens des Polymers ist nicht kritisch, die Diaphorase sollte an dieses Material jedoch immer erst am Ende gebunden werden. Die Sulfitierung läßt sich erreichen, indem man das Polymer, beispielsweise Polyacrolein, mit einem geeigneten Sulfit oder einem zur übertragung einer Sulfitgruppe auf die Polymerkette befähigten Material, wie einem Sulfit selbst, einem Hydrosulfit, einem Bisulfit, schwefliger Säure und dergleichen, handelt. Hierzu können insbesondere Alkali- oder Erdalkaliverbindungen oder sonstige Salze, wie Natrium-, Kalium-, Calcium- oder Ammoniumsalze von Sulfiten, Bisulfiten, Hydrosulfiten und dergleichen verwendet werden. Die Umsetzung wird normalerweise bei

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Temperaturen von 25 bis 90 C sowie unter atmosphärischem Druck vorgenommen. Unter sulfatiert versteht man dabei, daß das Polymer durch Behandlung mit einen solchen Material modifiziert wurde, wobei nach Binden der Diaphorase an dieses Polymer diese Sulfitgruppen nicht unbedingt erhalten bleiben müssen, obwohl dies der Fall sein kann.

Nach der Sulfitbehandlung wird das sulfitierte Aldehyd- oder Ketonpolymer immobilisiert,· beispielsweise durch eine chemische Vernetzung mit einem Vernetzungsmittel, oder mit einem für diesen Zweck geeigneten anderen Immobilisiermittel unlöslich gemacht. Bei dieses Verfahren wird das sulfitierte Polymer s.B. mit einem Diamin, wie Äthylendiamin, Tefcraissthylendiamin., ϊϊ-MethyX-äfchylenaiamin, 1,6-Hexamethylendiamin und dergleichen, bei Temperaturen von 0 bis 150 ⁰C in einem Lösungsmittel behandelt.

Das Icovalents Binden der Diaphorass an das erhaltene vernetzte sulfitierte Polymer wird bei einer Temperatur durchgeführt, die unterhalb derjenigen liegt., bei der das Sazym desaktiviert wird. Im allgemeinen sollte man bei Temperaturen von unter etwa 50 ⁰C, vorzugsweise bei Temperaturen von etwa 5 bis etwa 25 ^JC_t arbeiten, Das Binden erfolgt in Gegenwart von Puffern CpH 7,O bis 7,5) sowie unter Rühren. Das Binden der Diaphorase an das Polymer sollte in Gegenwart -von Wasser durchgeführt werden, da organische Lösumgsiaittel die Diaphorase gerne inaktivieren »

Die Menge an in den Zwischenräumen des saugfähigen Materials, beispielsweise der Cellulosehaltig gebundenem Diaphorasematerial beträgt, auf das Gewicht der Bahn bezogen, beispielsweise etwa 5,0 bis etwa 50,0 Gewichtsprozent.

Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen nsuen Testinäiketoren verwendete saugfähige Material kann aus jedem fase rhi läenäer· cellulosischer! Material hergestellt- werden =, Das saugfähigs

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Element ist vorzugsweise Cellulosepapier, das sich aus allen Arten von Fasermaterialien herstallen läßt, z.B. aus Fasermaterialien minderer Qualität., wie Fasermaterialien aus Eiche, Pappel, Gelbbirke und solchen äußerst kurzer Faserlänge, sowie ferner auch aus langfasrigem Material mit guter Qualität, wie einem Fasermaterial aus Kiefer und Hemlockflehte. Es läßt sich eine breite Vielfalt fasriger Cellulosematerialien einsetzen, wie man sie zur Herstellung von Papier und dergleichen verwendet, wie beispielsweise Kraftpulpe, Lumpenpulpe, Holzschliff, Sulfitpulpe, alpha-Pulpe und dergleichen. In ähnlicher Weise können auch andere Arten papierbildender fasriger Cellulose verwendet werden, wie Baumwollinters, Leinen und dergleichen. Diese Materialien lassen sich entweder allein oder im Gemisch mit Fasern aus anderen Quellen verwenden, wie Jute, Hanf, Sisal, Fasern, die insbesondere beim Bohnenschälen anfallen, zerhaktes Kanevas und sonstige Materialien.

Das cellulosische Papier kann ferner aus gebleichtem oder ungebleichtem Kraftmaterial, gebleichtem oder ungebleichtem Sulfitmaterial oder gebleichten oder ungebleichten halbchemischen Pulpen hergestellt sein. Ferner kann es sich bei dem Papier um ein aus Gemischen cellulosepapierbildender Pulpen mit bis zu 10 % der erwähnten anderen Fasern und dergleichen hergestelltes Material handeln. Es lassen sich auch Fäden cellulosischer Materialien, wie Celluloseacetat, regenerierte Cellulose und dergleichen, verwenden.

Für die meisten Zwecke sollten die verwendeten Cellulosefasern vorzugsweise nicht geschlichtet und im allgemeinen frei von Harzzusatz sein. Für einige Zwecke kann es jedoch auch erwünscht sein, als saugfähiges Material ein poröses hochnaßfestes Papier zu verwenden, wie man es beispielsweise erhält, wenn man dem Papier etwa 0,5 bis 5,0 Gewichtsprozent, bezogen auf das Gewicht der Fasern, eines warmhärtenden Aminoplastharzes zusetzt, wie beispielsweise ein Harnstoff-Formaldehyd-Harz, ein Melamin-Formaldehyd-Harz und dergleichen. Solche naßfeste

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Cellulosepapiex-e erhält man in üblicher Weise durch Zugabe eines derartigen Harzes zu den Pulpesuspensionen.

Das Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemäß geeigneten Cellulosepapiers ist nicht kritisch, und es kann hierzu jedes bekannte Papierherstellungsverfahren verwendet werden. Bei der üblichen Papierherstellung werden beispielsweise Cellulosefasern, wie aus Holzpulpe erhaltene Fasern, in Wasser'kalandriert, ura die Fasarn darin zu verteilen und die Fasern auf eine zur Papierherstellung geeignete Länge und Feinheit zu bringen. Während des Kalandrierens werden die Zellulosefasern unter Bildung winziger Ranken zerfasert, durch die die Fasern miteinander verkettet werden, sobald man aus dem zur Herstellung des Papieres verwendeten Brei auf dem Sieb der Papiermaschine die Suspensionsflüssigkeit abzieht. Die an das sulfitierte Polymer gebundene Diaphorase kann dem Cellulosepapier jederzeit während dessen Herstellung oder nach Herstellung der Papierbögen zugegeben werden, sofern die hierzu angewandte Temperatur das Snaya nicht desaktiviert_f was bereits oben erwähnt wurde. Es läßt sick daher eine Holländerpulpe aus zur Papierherstellung geeigneten cellulosischer! Fasern jeder geeigneten Konsistenz herstellen*, Diese Pulpe kann dann mit der an das sulüitierts Polymer gebundenen Diaphorase versetzt werden. Die erhaltene Suspension wird dann zur gleichförmigen Verteilung des Materials leicht gerührt, worauf man dis wäßrige Suspension vorzugsweise bei pH-Werten zwischen- etwa 6,0 und 7,5 zu einer Bahn formt, wobei diese wasserhaltige Bahn dia gebunden® Diaphorase enthält. Die erhaltene Bahn wird anschließend getrocknet„ und zwar vorzugsweise an der Luft oder unter Vakuum* Besonders günstig ist ein Vakuumtrocknen ante.? Verwendung von Calciumchlorid als Entwässerungsirtlt-fcsl. Ein Trocknen bei erhöhten Temperaturen sollte vermieden werden, da die Diaphorass bei hohen Tesaperafcurezi gerne cesaktiviert wird ^ wodurch das dispergierte Material imgeeignet wird, Das dabei erhaltene Bildmaterial sollte vorzugsweise über einen Res twas sergehall: von weniger als etwa 0,1 % verfügen«

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Durch direkte Einarbeitung der gebundenen Diaphorase in das Papier während dessen Herstellung erhält man durch direktes Zusammenwirken von Fasern und gebundenem Enzym eine integrale mechanische Bindung zwischen dem gebundenen Enzym und dem Papier. Die hervorragende Porosität und Permeabilität des Papiers erlauben eine Zirkulation des Puffers und der Reagentien, mit denen die Papierbahn zur Herstellung der erfindungsgemäßen Testindikatoren imprägniert wird. Innerhalb des Papieres verknüpfen sich die Faserkomponenten unter Bildung einer zusammenhängenden Struktur, die für das darin dispergierte gebundene Enzym eine Halte- und Verstärkungsmatrix ergibt.

In den Papiermühlen, in denen die Holländer mit verschiedenen Pigmenten versetzt werden, kann die gebundene Diaphorase gleichzeitig damit zugegeben werden oder zu jedem Punkt, der mehr als 1 Minute vom Draht entfernt liegt. Bei Papiermühlen, in denen die Pulpesuspension einer strengen Aufbereitung unterzogen wird, kann man die gebundene Diaphorase dem Holländer, dem Raffinierabstrom oder dem Siebabstrom in einem ausreichenden Abstand vom Draht zusetzen, so daß die Zersetzung vor der Bahnbildung praktisch beendet ist. Die Zugabe der gebundenen Diaphorase kann daher den meisten Papierarten oder Mahlbedingungen angepaßt werden, und somit vor der Bahn- bzw. Bogenherstellung erfolgen, oder, was sich weniger empfiehlt, auch an einem geeigneten Punkt nach der Bahn- bzw. Bogenherstellung auf dieses Material vorgenommen werden. Es lassen sich auch Fasern verwenden, die sich in dem Aufschlämmedium sehr leicht lösen. Nachdem das Papier im allgemeinen aus einem wässrigen Brei gegossen wird, können die Fasern beispielsweise eine gewisse Menge leicht löslicher Polyvinylalkoholfasern enthalten. Nach Entfernen des Mediums hängen diese Fasern im Papier dann an Faserverknüpfungen, wodurch sie dem fertigen Material weitere Festigkeit verleihen. Um die Bahn zusätzlich porös

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zu machen, kann man auch eine zweite Phase verwenden, die in dem Aufschlämmedium unlöslich, in einem anderen Medium jedoch selektiv löslich ist, mit dem man die Bahn dann zur Entfernung der löslichen Fasern wäscht, wodurch weitere Hohlräume entstehen.

Nach dem Verfahren der Papierbildung aus einem wässrigen Brei erhält man in den meisten Fällen eine zusammenhängende Papierbahn, ohne daß man noch weiteres Bindematerial nichtfaseriger Art verwenden muS. Wird jedoch ein Binder für erforderlich gehalten, dann kann man die zur Papierherstellung verwendeten Fasern und das gebundene Enzym vor dem Gießen der Bahn z.B. mit einer wässrigen Emulsion von kolloidalem Polytetrafluoräthylen versetzen. Durch Röhren des Breies wird die kolloidale Suspension gebrcehaa, und das Polytetrafluoräthylen koaguliert in dsm Brei. Wird der so hergestellte Brei vergossen, dann erstreckt sich das Polytetrafluoräthylen über die gesamte BaIm hinweg und verbindet so die gebundene Diaphorase mit den Fasern. Für diesen Zweck können jedocli auch andere Polymer— materialien verwendet werden«

Das erste Reagens, mit dem das die an das Aldehyd- oder Ketonpolymer gebundene Diaphorase enthaltende saugfähige Material behandelt wird, ist ein Alkalilactatsalz, %«/ie Lithiumlactat, Natriumlaetat, Kaliumlactat und dergleichen. Das Lactatsalz wird in Mengen von etwa O,O3 bis etwa 1,5 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,02 bis etwa O,O9 Gewichtsteilen, bezogen auf 1CO Teile wässriger Lösung, eingesetzt.

Ein kritisches Reagens der erfindungsgemäßen neuen Testindikatoren ist zweitens Nikotinamid-Adenin-Dinucleotid, das im folgenden gelegentlich als HM) bezeichnet wird, Dieses Material ist bekannt. Es sollte in Konzentrationen

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von etwa O,01 bis etwa 0,20 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,015 bis etwa 0,08 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile wässriger Lösung, verwendet werden. Dieses Material wirkt als Oxydationsmittel, das das Tetrazoliumsalz nach Reduktion zu NADH in den gefärbten Formazanfarbstoff umwandelt .

Das dritte Reagens, daß zur Herstellung der erfindungsgeraäßen Testindikatoren verwendet wird, ist ein Tetrazoliumsalz. Diese Elektronenträgerkomponente verleiht der Fläche des Testindikators, die letztlich mit Serum behandelt wird, eine Farbe (Formazanfarbstoff) derart variierender Intensität, daß sich hierdurch die Konzentration der Lactatdehydrogenase (LDH) im Testserum ermitteln läßt. Diese Farbstoffe sind ebenfalls bekannt und hahen im allgemeinen die Formel

worin R₁, R_ und R- gleich oder verschieden sind und für Aryl oder substituiertes Aryl stehen, und X ein Anion bedeutet, wie ein Halogenid und dergleichen.

Geeignete Salze sind beispielsweise 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-S-phenyl^H-tetrazoliumchlorid (JNT), Nitroblautetrazolium, Blautetrazolium, 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliurachlorid und dergleichen.

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Diese Salze werden dem Indikator in Konzentration von etwa 0,05 bis etwa 0,35 Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 0,2 Gewichtsteilen einverleibt, und zwar bezogen auf 100 Teile wässriger Lösung.

Der Mechanismus der Wirkungsweise der erfindungsgemäßen Testindikatoren ist nicht ganz klar. Ohne daß hierdurch eine Bindung an irgendeine besondere Theorie bestehen soll, wird hierfür jedoch folgender Reaktionsablauf angenommen:

LDH

(1) Alkalilactat + NAD < .' ^ Pyruvinsäure + NADH

Diaphorase

(2) NADH + Tetrazoliumsalz > Reduzierter Farbstoff + NAD

(farblose oxydierte Form) (gefärbte Form)

Obigen Gleichungen läßt sich entnehmen, daß die Lactatdehydrogenase nach erfolgter Zugabe des Serums zu dem Testindikator zu einer Reaktion führt, bei der das Tetrazoliumsalz reduziert und ein Farbindikator gebildet wird, dessen Farbintensität der Konzentration an LDH im Serum direkt proportional ist. Der Kliniker braucht dann lediglich die erhaltene Farbe, mit einer Sfcandardfarbfcafel vergleichen, um die LDH-Konsentration des untersuchten Serums zu ermitteln«

Es kann gegebenenfalls erwünscht sein, während der Herstellung des Testindikators diesen mit einem Stabilisator au. versetzen _t so daß man den Testindikator längere Zeit aufheben und irgendwann später verwenden kann» Dies läßt sich durch Einarbeiten irgendeines bekannten Antioxydationsmittels für das Tetrasoliumsalz erreichen, beispielsweise

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eines Alkylphenols, wie 2,6-Ditertiärbutyl-p-cresol, butyliertes Hydroxytoluol, 4-t-Butylcatechol, Octadecyl-3 ,S-di-t-butyl^-hydroxyhydrocinnaniat, Alkylidenbisphenolen, wie 2,2'-Methylenbis-(6-t-butyl-4-methylphenol), 4,4'-Butylidenbis-(6-t-butyl-3-inethylphenol) , Thiobispheno-Ie, wie 4,4'-Thibbis-(6-t-butyl-3-methylphenol), 2,2'-Thiobis-(6-t-butyl-4-methy!phenol), Polyphenolen, wie Tetrakis/methylen (3 _/5-di-t-butyl-4-hydroxyhydrocinnainatj^/-methan, 1,3_f5-Trimethyl-2,4,6-tris(3,5-di-t-butyl-4-hydroxybenzyl)benzol, Estern, wie Ditridecylthiodipropionat, Distearylthiodipropionat, Dilaurylthiodipropionat, Aminen, wie diaryl- oder dialkylsubstituierte p-Phenylendiamine, Diphenylamin, N-Phenyl-alpha-naphthylamin, organischen Phosphiten, wie Dibutylphosphit, Didecylphosphit, Dioctylphosphit, Diphenyldecylphosphit, Ditetradecylphosphit, Phenyldidecylphosphit, Phenylneopentylphosphit, Tridecylphosphit, Trilauryltrithiophosphit, Triphenylphosphit, Trisnonylphosphit oder anderen bekannten Antioxydantionsitiitteln, wozu auch Chinone gehören, wie beispielsweise Hydrochinon, Hydrochinonmonomethyläther, Mono-t-buty!hydrochinon, 2,5-Di-t-buty!hydrochinon, Toluhydrochinon, 2,5-Di-t-amylhydrochinon und dergleichen. Ferner lassen sich hierfür auch Phenothiazin, Hydroxybenzophenon, p-Dimethylaminonitrosobenzol, Thiodipropionsäure und dergleichen verwenden. Diese Materialien werden in Mengen von etwa 0,01 bis 2,O Gewichtsteilen, vorzugsweise etwa 0,02 bis 1,0 Gewichtsteilen, bezogen auf 100 Teile Lösung eingesetzt, und sie können in Form einer wässrigen Lösung oder einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel zugegeben werden.

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Das Antioxydationsmittel verhindert die Entwicklung einer Farbansammlung bzw. eines Farbaufbaus aus dem Tetrazoliumsalz, dessen vorzeitige Farbentwicklung die spätere Analyse des Diagnostikers natürlich stören würde.

In die erfindungsgemäßen Testindikatoren können ferner Langzeitstabilisatoren eingearbeitet werden, damit die Diaphorase enzymatisch aktiv bleibt. Für diesen Zweck eignen sich Kohlenhydrate wie Maltose, Sorbit, Jaugar-Gummi sowie wasserlösliche hoch— oder niedermolekulare Polyäthylenoxide und dergleichen, und diese Stabilisatoren werden in Mengen von etwa 5,0 bis etwa 25,0 Gewichtsteilen, vorzugsweise 15,0 bis 20,0 Gewichtsteilen auf je 100 Teile wässriger Lösung eingesetzt.

Um eine chromatographische Bewegung des Farbstoffes durch den Celluloseträger zu verhindern, können in die Testindikatoren ferner Materialien eingearbeitet werden, wie PoIymethacrylsäure, Polyacrylsäure, Carboxymethylcellulose, Copolymaleinsäuremethylvinyläther und dergleichen, und somit im allgemeinen alle möglichen polyanionischen Materialien, Diese Materialien werden in Mengen von etwa 0,1 bis etwa 3*0 Teilen, vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 2,5 Teilen, bezogen auf 100 Teile Lösung, verwendet.

Für eine gleichförmige Verteilung der Bestandteile des Testindikators über die Oberfläche der saugfähigen Bahn können alle geeigneten nichtionischen Netzmittel verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind. Hierzu lassen sich beispielsweise Fettalkanolamide verwenden, nämlich die Alkanolaminreaktionsprodukte mit Fettsäuren, wie Laurinsäure oder destillierter Kokonfettsäure, wobei sich als Alkanolamine beispielsweise Diäthanolamin, Monoäthanolamin, Monoisopropanolamin und dergleichen eignen. Ferner kommen hierfür von Äthylenoxid abgeleitete Materialien in Frage, nämlich Reaktionsprodukte aus Äthylenoxid und Alkylphenolen, bei

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denen die Alkylgruppe für Octyl, Nonyl oder einen höheren langkettigen Fettalkohol steht, wie Tridecylalkohol, Lanolin, Lecitinalkohol und dergleichen, langkettige Fettsäuren, wie Tallöl, ölsäure, Abietinsäure und dergleichen, langkettige Fettmercaptane, langkettige Fettamine, Polyoxypropylenglycol, Fettsäuresorbitanester, Zuckerester, nämlich Alkoholysereaktionsprodukte aus dem Methylester einer Fettsäure und Saccharose oder Raffinose, Polysorbit, Polyvinylalkohol, Methylcellulose, äthoxylierte Phenol- und Formaldehydharze und dergleichen. Diese Materialien können bei Einzelanwendung zusammen mit jeder Komponente des Indikators zugesetzt werden oder im Gemisch damit, wenn man den Indikator aus einem Gesaratgemisch herstellt, wobei O,01 bis 1,0 Teile Netzmittel auf 100 Teile Lösung verwendet werden.

Das Herstellungsverfahren für die erfindungsgemäßen neuen Testindikatoren hängt davon ab, ob man ein Antioxydationsmittel für das Tetrazoliumsalz verwendet oder nicht, und ob dieses Antioxydationsmittel in Wasser oder in einem organischen Lösungsmittel löslich ist.

Verwendet man kein Antioxydationsmittel oder ist das Antioxydationsmittel wasserlöslich, dann stellt man eine Pufferlösung aus dem Alkalilactat, dem Tetrazoliumsalz und NAD mit einem pH-Wert von etwa 8,8 her und gibt diese Pufferlösung zu der eine gebundene Diaphorase enthaltenden Trägerbahn. Das so imprägnierte Material wird hierauf beispielsweise in einem Trockentunnel, einem Zwangsumluftofen und dergleichen getrocknet und schließlich gewonnen. Müssen außer dem in einem Lösungsmittel löslichen Antioxydationsmittel irgendwelche anderen Zusätze zugegeben werden, dann werden diese lediglich in ihren geeigneten Konzentrationen zur Pufferlösung gegeben und als solche zugesetzt.

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Verwendet man ein Antioxydationsmittel, das lediglich in einem organischen Lösungsmittel löslich ist, dann stellt man zunächst eine wässrige Lösung des Tetrazoliumsalzes her und bringt diese bei einem pH-Wert von 7,5 bis 8,8 mit dem saugfähigen Träger zusammen. Der Träger wird dann getrocknet, was beispielsweise in einem Trockentunnel oder einem Zwangsumluftofen erfolgen kann. Im Anschluß daran wird das Antioxydationsmittel in einem organischen Lösungsmittel gelöst, worauf man den bereits einmal imprägnierten Träger mit dieser Lösung imprägniert und dann wieder trocknet. Sodann stellt man eine zweite Pufferlösung aus NAD und Alkalilactat mit einem pH-Wert von 8,8 her, und der bereits zweimal imprägnierte Träger wird weiter auch mit dieser Lösung imprägniert und getrocknet.

Wird ein Mittel zur Verhinderung eines chromatographischen Effekts eingesetzt, dann gibt man dieses, zusammen mit dem Tetrazoliumsalz zu. Ein Kohlehydratstabilisator für die Diaphorase ?cann einzeln vor dem Tetrazoliumsalz oder zu irgendeiner Zeit danach zugegeben v/erden, oder man kann ihn auch in Verbindung mit einer der anderen Bestandteile des Indikatorsystems zusetzen. Die Netzmittel werden vorzugsweise zusammen mit jedem Imprägnierverfahren zugesetzt, sie können jedoch auch nur mit einigen der in den Träger zu imprägnierenden Bestandteile oder auch allein zugegeben werden.

Die oben zusammen mit den Komponenten, die den erfindungsgemäßen neuen Indikatoren zugesetzt werden können, angegebenen Konzentrationen beziehen sich auf die Lösungan dieser Bestandteile,, mit denen der saugfähige Träger lediglich gesättigt wird, und man versteht darunter nicht die Menge einer jeden Komponente, die eventuell auf dem saugfähigen Träger vorhanden ist* Dies bedeutet, daß man durch Sättigen des saugfähigen Trägers mit einer spezifischen Konzentration

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Giner bestimmten Komponente in Lösung nicht einfach auch die gleiche Prozentmenge der in der Lösung vorhandenen Komponente auf dem saugfähigen Träger erhalten muß. Es zeigte sich jedoch, daß die obigen Lösungskonzentrationen im allgemeinen ausreichen, damit das saugfähige Material nach entsprechender Sättigung damit über eine ausreichende Menge der jeweiligen Komponente verfügt, und man einen funktionsfähigen Testindikator erhält, wobei die Absorptionsfähigkeit des saugfähigen Materials charakteristisch ist für Materialien, die man normalerweise für diesen Zweck verwendet.

Nach obigen Ausführungen erfolgt die Sättigung des saugfähigen Ilatoriais bei der Herstellung der erfindungsgemäßen neuen Indikatoren durch Tauchen. Gelegentlich kann es jedoch erfor- d«iJ ich sein, und zwar insbesondere bei Durchführung einer Reihe von Sättigungen, den Träger nicht in die Komponentenlösung zu tauchen, sondern letztere direkt auf den saugfähigen Träger aufzubringen, da die vorher abgelagerten Bestandteile gegebenenfalls durch mehrmaliges Tauchen ausgewaschen werden.

Als Puffer lassen sich zur Herstellung der erfindungsgemäßen Indikatoren beispielsweise Phosphatpuffer, Phthalatpuffer, Trispuffer, Citrat-Phosphat-Puffer, Borat-Succinat-Puffer und dergleichen verwenden.. Der bevorzugte Puffer ist Trispuffer, nämlich 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol, und zwar in 0,05 bis 0,2 molarer Konzentration.

Die erfindungsgemäßen Testindikatoren ändern ihre Farbe von farblos zu tiefrotbraun.

Beispiel A Solubilisierung von Polyacrolein

Ein mit Rührer, Kühler, Thermometer, Stickstoffeinleit-

rohr und Thormostatbad versehenes Reaktionsgefäß wird mit

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BAD ORiQiNAL

344 Teilen Natriummetabisulfit und 2400 ml destilliertem Wasser versetzt. Der pH-Wert dieser Lösung wird durch Zugabe von 10 η Natriumhydroxidlösung auf 5,6 eingestellt, und dann werden 300 Teile feinverteiltes Polyacrolein zugesetzt. Man läßt die Reaktion solange bei 65 ⁰C unter Stickstoff fortlaufen, bis sich ein klares viskoses wasserlösliches PoIyacroleinaddukt bildet. Sodann wird das Reaktionsgemisch abgekühlt und aufgehoben.

Beispiel B Vernetzung von löslichem Polyacrolein

Ein mit Glas ausgekleidetes und mit einem Rührer sowie einem Stickstoffeinleitrohr versehenes Reaktionsgefäß wird mit 2500 ml des gemäß Beispiel Ä hergestellten Polyacroleinhisulfitaddukts in 4000 ml destilliertem Wasser versetzt«, Unter leichtem Rühren gibt man sra dieser Lösung dann tropfenweise über eine Zeitspanne von 4 Stunden 300 Teile 1,6-Hexamethylendiamin in 400 Eil destilliertem Wasser. Es kommt zur Suspension eines gelben vernetzten Polymers _t- und man erhitzt den Ansatz unter starkem Stickstoffstrom 10 Minuten auf 6O C und kühlt dann auf Raumtemperatur ab» Das erhaltene Polymer wird dann durch ein Seihtuch abfiltriert., in einen Büchner-Trichter gegeben und gründlich mit Wasser gewaschen. Sodann schlämmt man das vernetzte Polymer leicht 15 bis 20 Minuten lang in dem zehnfachen Volumen Wasser auf, läßt das Gänse dann 20 Minuten stehen und filtriert schließlich. Dieses Waschen wird solange wiederholt, bis der pH-Wert der Waschlaugen zwischen 6_y5 und 7,0 liegt., Das erhaltene feste Äddukt wird dann 20 Minuten leicht mit auf pH 6,5 eingestelltem 1,0-molarem Dinatriumphosphat aufgeschlämmt und mit destilliertem Wasser gewaschen.

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Beispiel C Herstellung von gebundene Diaphorase enthaltendem Papier

Zu einem geeigneten Reaktionsgefäß werden 0,1 Teile Diaphorase und 80 ml Phosphatpuffer (0,1 m, pH 7,2) gegeben. Die Lösung läßt man ohne Rühren 30 Minuten im Kühlschrank stehen. Im Anschluß daran wird das Enzym durch Rühren völlig gelöst. In einem getrennten Reaktionsgefäß werden 2,0 Teile des modifizierten Polyacroleins gemäß Beispiel B mit 50 ml des gleichen Phosphatpuffers aufgeschlämmt. Nach 10 Minuten langem Rühren stellt man den pH-Wert mit O,1 η Natriumhydroxid auf 7,2 ein. Die Inhalte beider Reaktionsgefäße werden dann miteinander vermischt, und das erhaltene Gemisch rührt man leicht über Nacht bei 40 C. Das so entstandene Enzymaddukt wird dann abfiltriert und mit reichlich viel deionisiertem Wasser gewaschen. Bei diesem Verfahren erhält man 75 bis 97 % zusammenhängende Bindungen.

Eine 50/50 Albacel/Astracel-Pulpe (Konzentration 2,6 g/100 cc) wird zur Entfernung von restlichem Sulfit mit Wasser und dann mit Methanol gewaschen und schließlich getrocknet. 10,0 Teile der erhaltenen Pulpe werden in einem geeigneten Mischgefäß mit 2,O Teilen des feuchten Enzymaddukts versetzt. Die Bestandteile werden 5 Minuten vermischt, wobei man das Gemisch zur Verhinderung einer Erwärmung mit Eis versetzt. Der Mischbrei wird dann auf einer British Hand Sheet Mold zu einer Papierbahn verarbeitet, deren Stärke etwa der Stärke von Standardfilterpapier entspricht und die einen Durchmesser von 15,24 cm hat. Das erhaltene Papier trocknet man 16 Stunden im Vakuum über einem Trockenmittel. Die so hergestellte Bahn wird gewonnen.

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Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert. Alle darin enthaltenen Teil- und Prozentangaben sind auf das Gewicht bezogen, sofern nichts anderes gesagt ist.

Beispiel 1

Das gemäß Beispiel C erhaltene Papier sättigt man mit 100 Teilen einer wässrigen Lösung aus 0,7 Teilen Polymethacrylsäure, 1,0 Teilen Trispuffer, nämlich 2-Amino-2-(hydroxymethyl)-1,3-propandiol, 20,0 Teilen d (+) Maltose, 0,025 Teilen Polyoxyäthylen (20) cetylather, 0,08 Teilen Nicotinamid-Ädenin-Dinucleotid (NM)), 0,16 Teilen /2-(p~Jodphenyl) -3-(pnitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (JNT), 0,5 Teilen p-Dimethylaminonitrosobenzol und 1,5 Teilen einer 60-prozentigen Lösung von Lithiumlactat, wobei alles einen pH-Wert von 8,6 hat. Das feuchte Papier wird dann bei Raumtemperatur im Dunklen unter Vakuum getrocknet. Das hierbei erhaltene trockne gelbe Papier ergibt bei der Untersuchung mit einer Reihe Testseren einen rostfarbenen Fleck, wobei die Farbschattierung bzw. Stärke der Farbe der Menge an in jedem einzelnen Testserum vorhandera LDH proportional ist. Mit dem Testpapier lassen sich sowohl normale als auch abnormale Mengen LDH in den Testseren feststellen.

Bai spiel 2

Das geiaäS Beispiel C hergestellte Testpapier wird in eine Lösung aus 20,0 Teilen Maltose in 100 Teilen Wasser mit einem pH-Wert von 7 _a2 getaucht und dann getrocknete Das hierbei erhaltene Material wird dann ein zweites Mal ge-¹ taucht, Lind zwar dieses Mal In eine Lösung aus 1 _?G Teilen Dilaurylthiodipropionat und 0^03 Teilen Polyoxyä'bhylaix-20-cetylather in 100 Teilen Hexan» Das Papier wird erneut

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getrocknet. Das so erhaltene getrocknete Papier taucht man dann in eine dritte Lösung aus 0,2 Teilen des JNT gemäß Beispiel 1 in 100 Teilen Wasser und 1,0 Teilen Polymethacrylsäure mit einem pH-Wert von 7,5. Es wird wiederum getrocknet. Das getrocknete Papier wird dann in eine Lösung aus einem weiteren Teil DLTDP und 0,03 Teilen Netzmittel in 100 Teilen Hexan getaucht und erneut getrocknet. Abschließend wird das erhaltene Papier noch in eine Lösung aus 0,09 Teilen NAD, 0,02 Teilen des gleichen Netzmittels und 0,86 Teilen Lithiumlactat in 100 Teilen 0,1-molarem Trispuffer von pH 8,8 getaucht. Das so hergestellte Testpapier ergibt bei Verwendung für einen Serumtest einen violettroten Fleck, dessen Farbintensität mit derjenigen eines Standardserums vergleichbar ist, das eine bekannte Menge LDH enthält.

Beispiele 3 - 8

Das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei die einzelnen Komponenten und ihre Konzentrationen jedoch in der aus Tabelle I hervorgehenden Weise geändert werden. Zur Herstellung eines jeden darin angeführten Testindikators verwendet man das gleiche Papier und dasselbe NAD wie bei Beispiel 2, das gebundene Diaphorase enthält. Die Konzentrationen sind auf je 100 Teile Wasser oder Lösungsmittel bezogen angegeben. In jedem Fall erhält man einen wirksamen Testindikator.

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Tabelle

Bei- Binderspiel polymer

Acrolein-Styrol
(93,8/6,2)

Polymethyl-Vinylketon

Acrolein-Vinylacetat
(60/40)

wie bei
Beispiel B

dito

dito

Antioxyda- Tetrazoniumdationsmittel salz Lactat

Nitroblau- wie bei tetrazolium Beisp.2 0,15

Phenothiazin
1,0

Dibutylphosphit
2,0

Hydroxybenzophenon
0,01

N-Phenylalphanaphthylamin 1,5

2,6-Di-tbutyl-pcresol 0,80

dito

Blautetrazolium 0,35

dito

2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid 0,08

dito

Natriumlactat 0,05

Kalium

1actat

0,1 Mittel zur
Verhinderung
eines chromato-Enzymstagraphischen
bilisator Effekts

nicht-ionisches Netzmittel

Sorbit
25,0

Diäthylengly-
col 15,0

Maltose
10,0

Maltose
20,0

Carboxymethylcellulose 2 ,0

Polyacrylsäure
0,80

Maleinsäure-Methylvinyl-
äther-Copolymer(75/25) 2,8

wie bei Beispiel 2

Äthylenoxid-Tallöl-Reaktionsprodukt 0,05

Polysorbit 0,75

Methylcellulose 1,0

Laurinsäure-Jithanolamin-Reaktionspro dukt 1,0

Claims (14)

1. Patentansprüche

   Diagnostischer Testindikator zur Bestimmung der Lactatehydrogenasekonzentration in Seren, gekennzeichnet durch ein saugfähiges Material, in dessen Zwischenräumen eine an ein hydrophiles vernetztes sulfitiertes Aldehyd- oder Ketonpolymer covalent gebundene Diaphorase dispergiert ist, und das in seinen Zwischenräumen ferner den getrockneten Rückstand enthält, den man durch Imprägnieren dieses Materials mit

   (1) einem Alkalilactatsalz,

   (2) Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid, und

   (3) einem Tetrazoliumsalz

   erhält.
2. 2. Diagnostischer Testindikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bestandteil (1) Lithiumlactat ist.
3. 3. Diagnostischer Testindikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Bestandteil (3) 2~(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid ist.
4. 4. Diagnostischer Testindikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material Papier ist.
5. 5. Diagnostischer Testindikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polymer Polyacrolein ist.

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6. 6. Diagnostischer Testindikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das. saugfähige Material als Bestandteil (4) ferner einen Stabilisator für die Diaphorase enthält.
7. 7. Diagnostischer Testindikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material als Bestandteil (5) ferner ein Antioxydationsmittel enthält.
8. 8. Diagnostischer Testindikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material als Bestandteil (6) ferner ein Mittel zur Verhinderung eines chromatographxschen Effekts enthält.
9. 9. Diagnostischer Testindikator nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das saugfähige Material als Bestandteil (7) ferner ein nichtionisches Netzmittel enthält.
10. 10-. Verfahren zur Herstellung des diagnostischen Testindikators nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus cellulosischen Fasern und aus einem hydrophilen vernetzten sulfitierten Aldehyd- oder Ketonpolymer, an das covalent Diaphorase gebunden ist, eine Bahn oder einen Bogen herstellt, das so erhaltene Material dann mit einer wässrigen Lösung der Komponenten (1), (2) und (3) gemäß Anspruch 1 versetzt und das auf diese Weise imprägnierte Material schließlich trocknet.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Komponente (1) Lithiumlactat verwendet.

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12. 12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Komponente (3) 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl) 5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid verwendet.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als cellulosische Fasern Fasern für die Papierherstellung verwendet.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polymer Polyacrolein verwendet.

    509820/0996 ORIGINAL INSPECTED