DE2448552B2 - Kammer und verfahren fuer die durchfuehrung des zweiten kreuz-elektrophoreseschrittes - Google Patents

Description

Gegenstand des Hauptpatentes 23 65 284 ist eine Kammer für den zweiten Kreuz-Elektrophoreseschritt nach vorhergehender elektrophoretischer Auftrennung einer eiweißhaltigen Probe in einem ersten Träger unter Auftrennung in einem zweiten Träger in einer zur ersten Trennrichtung senkrechten Richtung, welche eine Grundplatte mit einem Trog für den zweiten Träger aufweist, wobei der Trog in der Grundplatte durch ein Magazin zur Aufnahme des ersten Trägers in einem Migrationstrog und einen Verbindungstrog unterteilt ist und für das Magazin eine Abdeckung vorgesehen ist, welche jeweils einen in seiner Höhe veränderlichen Spalt frei läßt, durch den der erste Träger in dem Magazin mit dem zweiten Träger in den Trögen in Berührung steht. Vorzugsweise ist die Gelschicht in dem Magazin etwa 1 bis 3 mm hoch.

Der Erfindung gemäß Hauptpatent lag in erster Linie die Aufgabe zugrunde, eine geeignete Kammer für die Durchführung der zweiten Kreuz-Elektrophorese-Phase vorzugsweise unter Verwendung unterschiedlicher Träger bzw. Gele für den Elektrophorese- und den Elektroimmunomigrations-Schriu zu entwickeln, um auf diese Weise die Vorteile verschiedener Gele für die Auftrennung auszunutzen. Mit Hilfe der Kammer gemäß Hauptpatent läßt sich erstmals in technisch unkomplizierter Weise die Elektroimmunomigration in einwandfreier Weise in einem anderen Träger als dem für die vorangehende Elektrophorese verwendeten Träeer durchführen. Die beiden Träger können in der Kammer gemäß Hauptpatent durch eine zwischen sie angegossene antikörperfreie Agarosegelschicht miteinander in Kontakt gebracht werden. Der in seiner Höhe variierbare Spalt, durch den die beiden verschiedenen Träger in Berührung stehen, reicht überraschewlerweise zum Obertreten praktisch sämtlicher Antigene aus dem ersten Träger in den zweiten Träger aus.

Meist wird als erster Träger ein Polyacrylamidgel und als zweiter Träger ein Agarosegel verwendet. Häufig

ίο wäre es aber günstig, als ersten Träger Celluloseacetat-Membranfolien zu verwenden. Sie haben sich für die Eiweißelektrophorese bestens bewährt und werden für diesen Zweck im klinisch-chemischen Laboratorium derzeit am häufigsten als Trägermaterial verwendet.

Auch für Immundiffusionsmethoden und die Immunelektrophorese sind Celluloseacetatfolien ein gut geeignetes Trägermedium. Für die zweite Phase der Kreuzimmunelektrophorese mit ihren verschiedenen Modifikationen ist Agarose als Trägermaterial besser geeignet. Für die erste Phase der Kreuzimmunelektrophorese kann die Celluloseacetat-Membranfolie ohne Schwierigkeiten als Trägermaterial verwendet werden. In der zweiten Phase ist dies jedoch mit erheblichen Schwierigkeiten und Einschränkungen verbunden. Es tritt dabei nämlich erhebliche Verdunstung auf, was ein Austrocknen bzw. Schrumpfen der Folie bewirken kann. Das Arbeiten mit einer Intermediärschicht ist praktisch unmöglich.

Diese unter Umständen auftretenden Schwierigkeiten lassen sich gemäß Erfindung dadurch ausräumen, daß bei einer Kammer gemäß Hauptpatent die Magazin-Abdeckung Bohrungen in dem an den Migrationstrog angrenzenden Bereich aufweist. Durch eine dieser Bohrungen läßt sich in das geschlossene Magazin auf den im ersten Kreuz-Elektrophorese-Schritt erhaltenen Celluloseacetatstreifen warme Agarose einfüllen, wodurch die Celluloseacetat-Membranfolie in Agarose eingebettet und ein Verdunsten mit seinen Folgen verhindert wird.

Gemäß einer weiteren Ausbildung der Kammer gemäß Hauptpatent sind mehrere Einzelkammern zu einer Mehrfachkammer zusammengefaßt. Dadurch wird die gleichzeitige Durchführung des zweiten Kreuz-Elektrophorese-Schrittes mit mehreren, im ersten Schritt aufgetrennten Trägern ermöglicht.

Gegenstand des Hauptpatentes ist weiterhin ein Verfahren zur Durchführung der Kreuz-Elektrophorese unter Anwendung der Kammer gemäß Hauptpatent, bei welchem man einen Streifen des zweiten Gels im Migrationstrog unmittelbar angrenzend an das Magazin frei von Antiserum läßt.

Gemäß Erfindung wird dieses Verfahren dahingehend weiter ausgebildet und verbessert, daß in den Migrationstrog und/oder Verbindungstrog mehrere mit Antiserum beschickte, jeweils durch eine undurchlässige Schicht voneinander getrennte Träger eingebracht werden. Dabei ist es gemäß einer bevorzugten Ausführungsform auch möglich, daß man mit verschiedenen Antiseren beschickte Träger verwendet. Dadurch lassen sich in einem Arbeitsgang von einer elektrophoretischen Auftrennung der ersten Phase mehrere Pherogramme der zweiten Phase erhalten, deren Peaks so auch simultan lokalisiert und identifiziert werden können. Auch die Eigenschaften von Antiseren lassen sich mit dieser Technik schnell und leicht vergleichen, da beispielsweise deckungsgleiche oder -ungleiche Pherogrammbilder entstehen. Bei der Untersuchung von Gammopathien kann analog zur klassischen Immun-

elektrophorese jede der Gelplatten mit einer anderen Verdünmingsstufe des gleichen, beispielsweise monospezifischen Antiserums beschickt werden.

Die Erfindung wird anhand der Figuren erläutert; es zeigt

F i g. 1 die Kammer in perspektivischer Darstellung mit der erfindungsgemäßen Ausbildung der Magazinabdeckung;

F i g. 2 die Kammer im Teüschnitt längs der Linie INI der F i g. 1 nach Füllung in einer Ausführuiigsform;

Fig.3 die Kammer im Teilschnitt längs der Linie IH-III der Fig.! nach der Füllung in einer weiteren Ausführungsform und unter Verwendung mehrerer, durch eine undurchlässige Schicht getrennter Träger im Migrationstrog; F i g. 4 eine Mehrfachkammer.

F i g. 1 zeigt die Kammer gemäß Hauptnatent mit der erfindungsgemäßen Abdeckung 6' für das Magazin 2. Die Abdeckung 6' dient zum Schutz des ersten Trägers 16' (F i g. 2), beispielsweise eine in Agarosegel eingebettete Celluloseacetat-Membranfolie, gegen Austrocknen und Schrumpfen und wird mit Hilfe geeigneter Befestigungsmittel 18, 19 und 18', 19' im Randbereich des Magazins 2 festgehalten.

Zwischen das Magazin 2 und die Abdeckung 6' werden geeignete Abstandhalter 8, 8' eingelegt. Die Abdeckung 6' weist eine U-förmige Rinne auf, die in dem an den Migrationstrog 1 angrenzenden Bereich etwa 0.5 mm tief ist. Üblicherweise liegt die Höhe der Spalte zwischen Magazin 2 und Abdeckung 6' bei aufgesetzter und festgeschraubter Abdeckung zwischen 0,5 und 1,0 mm. Insbesondere beträgt sie 0,7 mm. wenn der erste Träger eine in Agarosegel gebettete Celluloseacetat-Membranfolie mit einer Schichtdicke von etwa 0,10 bis 0,15 mm und der zweite Träger ein Agarosegel mit einer Schichtdicke von etwa 1 mm ist. Die Abdeckung 6' weist in dem an den Migrationstrog 2 angrenzenden Bereich Bohrungen 64,64' auf. Sie dienen zum Einfüllen von warmer Agarose in das Magazin 2 und zum Entweichen der Luft aus dem Magazin 2. Sollen in der ersten Phase der Kreuzimmunelektrophorese verwendete Celluloseacetat-Membranfolien in Verbindung mit antikörperhaltiger Agarose in der anschließenden zweiten Phase verwendet werden, so wird zur Verhinderung Jes Verdunstens und seiner Folgen (Schrumpfung und Austrocknung) für den ersten Träger etwa 1 ml heißer Agarose auf den Boden des Magazins 2 pipettiert, erkalten gelassen und der passend zugeschnittene Celluloseacetat-Streifen wird unmittelbar nach Abschluß der ersten Kreuz-Elektrophorese-Phase auf die Agarosegelschicht gelegt. Die Abdeckung 6' wird auf das Magazin 2 gelegt, verschraubt und 1 °/oige 52° C warme Agarose durch eine der Bohrungen, beispielsweise Bohrung 64 in das Magazin 2 eingefüllt. Die von der eingefüllten Agarose verdrängte Luft entweicht durch eine andere Bohrung, beispielsweise Bohrung 64'. Wird mit Agarose gearbeitet, deren Erstarrungspunkt unter 45° C liegt, so schaltet man vorher eine Kühlvorrichtung ein und füllt erst dann den Verbindungstrog 3 und den Zwischenraum zwischen Magazin 2 und dem im Migrationstrog 1 liegenden, antikörperhaltigen Träger, beispielsweise Agarosegel, mit Agarose von maximal 56° C.

F i g. 3 zeigt die Verwendung von Trägerplatten 7,7', welche beispielsweise mit antikörperhahigem Agarosegel 14', 14" beschichtet sind. Eine der Platten kann beispielsweise ein polyvalentes, eine andere ein monospezifisches Antiserum enthalten. Nach dem Erstarren der Gelschichten bedeckt man beispielsweise eine der Gelplatten mit einer dünnen, undurchlässigen Schicht 17, beispielsweise einer entsprechend zugeschnittenen Kunststoffolie. Auf die so vorbereitete erste Glasplatte 7 wird nun eine zweite gleich große Platte 14' mit der Gelschicht nach unten, die erste Platte T genau deckend, daraufgelegt. Von der kathodischen Seite der beiden Gelschichten 14'. 14" waren vor dem Zusammenlegen der Platten über die ganze Länge 3 mm breite und von der anodischen Seite 6 mm breite Gelstreifen abgeschnitten und entfernt worden. Auf der Kathodenseite dient dieser freie Raum zur Aufnahme von 52° C warmer, antiserumfreier Agarose. Nach dem Erstarren der antiserumfreien, angegossenen Agarose wird mit ihrer Hilfe eine lückenlose Verbindung zum ersten Träger 16, beispielsweise Polyacrylamid, Agarose oder Celluloseacetat-Streifen mit den in der ersten Phase aufgetrennten Antigenen hergestellt. Auf der Anodenseite liegt der freie Raum zur Aufnahme der die Verbindung mit der Elektrodenwanne herstellenden Filterpapierbrücke. Die Dicke der Glasplatten 7, T und der auf ihnen befindlichen Gelschichten 14', 14" wird vorzugsweise so gewählt, daß die zwischen ihnen befindliche Kunststoffolie 17 in der halben Höhe des Längsschlitzes des Magazins 2 zu liegen kommt. Nun wird die zweite Phase der Kreuzimmunelektrophorese durchgeführt. Die Weiterverarbeitung der Pherogramme geschieht in der üblichen Weise, nämlich Auspressen, Trocknen und Färben.

Fig.4 zeigt die Zusammenfassung von Einzelkammern zu einer Mehrfachkammer. Die Anzahl der Einzelkammern wird durch die Laborbedingungen festgelegt. In den durch die Stege 54 voneinander getrennten Migrationströgen Γ lassen sich im zweiten Kreuz-Elektrophorese-Schritt jeweils mehrere Proben gleichzeitig auftrennen. Zweckmäßigerweise werden Magazin 2 und je nach Betriebsart die Abdeckung 6 oder 6' über die gesamte Breite der Mehrfachkammer durchgehend ausgebildet. Die Haltestücke 74 dienen zum Einklemmen einer entsprechend zugeschnittenen Kunststoffolie, die als undurchlässige Schicht zur Trennung von zwei Trägern im Migrationstrog Γ verwendet werden kann. Eine auf diese Weise mit Fortsätzen versehene Kunststoffolie läßt sich nach Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens leichter aus dem Migrationstrog Γ herausheben.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Kammer für den zweiten Kreuz-Elektrophorese-Schritt nach vorhergehender elektrophoretischer Auftrennung einer eiweißhaltigen Probe in einem ersten Träger unter Auftrennung in einem zweiten Träger in einer zur ersten Trennrichtung senkrechten Richtung, welche eine Grundplatte mit einem Trog für den zweiten Träger aufweist, wobei der Trog in der Grundplatte durch ein Magazin zur Aufnahme des ersten Trägers in einen Migrationstrog und einen Verbindungstrog unterteilt ist und für das Magazin eine Abdeckung vorgesehen ist, welche jeweils einen in seiner Höhe veränderlichen Spalt frei läßt, durch den der erste Träger in den* Magazin mk dem zweiten Träger in den Trögen in Berührung steht, gemäß Hauptpatent 23 65 284, dadurch gekennzeichnet, daß die Abdeckung (6') Bohrungen (64,64') in dem an den Migrationstrog (1) angrenzenden Bereich aufweist.

2. Kammer gemäß Hauptpatent 23 65 284. dadurch gekennzeichnet, daß mehrere Einzelkammern zu einer Mehrfachkammer zusammengefaßt sind.

3. Verfahren zur Durchführung des zweiten Kreuz-Elektrophoreseschrittes unter Verwendung der Kammer gemäß Hauptpatent 23 65 284. dadurch gekennzeichnet, daß in den Migrationstrog (2) und/oder in den Verbindungstrog (3) mehrere mit Antiserum beschickte, jeweils durch eine undurchlässige Schicht (17) voneinander getrennte Träger (14', 14") eingebracht werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man mit verschiedenen Antiseren oder mit verschiedenen Verdünnungsstreifen ein und desselben Antiserums beschickte Träger verwendet.