DE2415812A1

DE2415812A1 - Poly(5-hydroxycytidylsaeuren)

Info

Publication number: DE2415812A1
Application number: DE2415812A
Authority: DE
Inventors: Michael Anthony William Eaton; David Wesley Hutchinson
Original assignee: GD Searle LLC
Current assignee: GD Searle LLC
Priority date: 1973-04-02
Filing date: 1974-04-01
Publication date: 1974-10-17
Also published as: CA1006871A; FR2223046A1; US3935185A; FR2223046B1; ZA742062B; DK134994B; BE813201A; DK134994C; GB1435571A; NL7404394A

Description

RECHTSANWÄLTE

DR. JUR. Dirt-CHEM. WALTER BEIL

Alfred ι ic?-, f pen er 2 8. März 1974

DR. JÜR. DJ-³L-CHsAA. H.-J. WOLFP DR. JUR. UMiS CHR. BEIL

623 FRANKFURT AM MAiN-HOCHST

AÜELONSl RaSSc Sä

Unsere Nr. 19 222 Pr/br

G.D. SearIe & Co., Ltd. Buckinghamshire, England

Poly(5-hydroxycytidylsäuren)

Die Erfindung betrifft neue Polynucleotide, insbesondere Poly(5-hydroxycytidylsäuren) und ein neues Verfahren zu deren Synthese.

Die Synthese von Polynucleotiden ist wichtig geworden, da sie sich als fähig erwiesen, auf das Viruswachstum in Tierzellen störend einzuwirken. Jedoch war es bisher schwierig, ein Polynucleotid zu erhalten, das in zufiiedenstellender Ausbeute hergestellt werden kann, das

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bei der Beeinträchtigung eines Virus wirksam ist und das bei Säugetieren nicht toxisch ist.

Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein neues Polynucleotid, das alle diese Eigenschaften in sich vereinigt, und neue Verfahren zur Synthese eines solchen Polynucleotide bereitzustellen.

Diese Aufgabe wurde mit dem erfindungsgemäßen Polynucleotidgelöst, das aus einer Poly(5-hydroxycytidylsäure), die mehr als 10 5-Hydroxycytidinreste enthält, besteht. Besonders bevorzugt sind solche Polynucleotide, die mehr als 10, jedoch nicht mehr als 200 Reste enthalten. Das Ausgangsmaterial für die Herstellung der Poly(5-hydroxycytidy!säure) ist Cytidindiphosphat als Trinatriumsalz, üblicherweise wird dies mit Brom und Pyridin und anschließend mit einem Anionenaustauscherharz behandelt. Jedoch liefert diese Methode eine sehr geringe Ausbeute. Es wurde nun gefunden, daß die Behandlung von Cytidindiphosphat mit Brom und anschließend mit 2,456-Collidin eine stark verbesserte Ausbeute des 5-Hydroxyderivates zur Folge hat.

Es wurde außerdem gefunden, daß die Zugabe eines Mittels, das die Dehydrobromierung in Verbindung mit dem Brom katalysiert, die Ausbeute an 5-Hydroxycytidindiphosphat stark erhöht. Beispielsweise kann ein Überschuß an Mercurioxid oder Silberoxid in Suspension mit dem Brom zugesetzt werden.

Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung von Poly(5-Hydroxycytidylsäure) bereit, das darin besteht, daß man Cytidindiphosphat mit 0rom zusammen umsetzt, dann das sich bildende Produkt mit 2,4,6-Collidin umsetzt und

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anschließend das erhaltene 5-Hydroxycytidindiphosphat polymerisiert. Das 5-Hydroxycytidindiphosphat-Ausgangsmaterial wird in zwei Stufen hergestellt. Die erste Stufe betrifft die Zugabe von flüssigem Brom zu einer wäßrigen Lösung des Trinatriumsalzes von Cytidindiphosphat bei OC. überschüssiges Brom kann durch Extraktion mit einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Cyclohexen, entfernt werden. Das Produkt der ersten Stufe wird dann durch Umsetzung mit einer Base, wie Pyridin, in das 5-Hydroxycytidindiphosphat übergeführt, obgleich das bevorzugte Reagens 2,4,6-Collidin ist. Man läßt die Reaktion 1 bis 2 Stunden bei 37°C ablaufen.

Bei dieser Reaktion bildet sich ein Gemisch aus 5-Hydroxycytidindiphosphat und 5-Bromcytidindiphosphat.

Die 5~Brom- und 5-Hydroxyderivate von Cytidindiphosphat können durch Chromatographie nach üblichen Methoden getrennt werden. In einer bevorzugten Methode werden die Derivate an einer Säule aus Triäthylaminoäthyleellulose getrennt, üblicherweide ist der pH-Wert eines solchen Säuleneluierungsmittels etwa 7,0, jedoch wurde gefunden, daß eine stark verbesserte. Trennung erreicht werden kann, wenn der pH-Wert des Säuleneluierungsraittels etwa 9,5 beträgt. Zuerst wird das 5-Brom-cytidindiphosphat und dann das 5-Hydroxycytidindiphosphat bis es in reiner Form vorliegt eluiert,und die das 5-Hydroxycytidindiphosphat enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und zusammengeschüttet.

Das erfindungsgemäße 5-Hydroxycytidindiphosphat wird durch die Wirkung von Polynucleotidphosphorylase nach üblichen Methoden polymerisiert. Für die erfindungsgemäßen.Zwecke

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jedoch erwies sich die löLymerisationsgeschwindigkeit als abhängig von der Konzentration der Magnesiumionen im Medium, so daß hohe Konzentrationen bevorzugt werden. Daher werden äquimolare Konzentrationen von 5-Hydroxycytidindiphosphat und Magnesiumionen in einem Trischloridpuffer in Gegenwart eines Enzyms inkubiert.

Das entstehende Polynucleotid wird entproteinisiert, beispielsweise durch Behandlung mit einem Gemisch aus Chloroform und Isopropanol oder mit anderen geeigneten Lösungsmittelgemischen. Die Polynucleotidlösung wird dann dialysiert, um Salze in der Lösung zu entfernen und die endgültige Lösung wird lyophilisiert, wobei hygroskopische Poly(5-Hydroxycytidylsäure) entsteht.

Die Tatsache, daß im Polynucleotid keine anderen Reste als 5-Hydroxycytidinreste vorliegen, kann durch verschiedene Maßnahmen bewiesen werden. Das Polynucleotid kann enzymatisch abgebaut und die dabei entstehenden Monomereinheiten getrennt und durch Chromatographie analysiert werden. Außerdem stellt die Verwendung eines reinen Präparates von 5-Hydroxyeytidindiphosphat bei der Polymerisation zum Polynucleotid die Herstellung des Homopolymers Poly(5-hydroxycytidylsäure) sicher.

Es ist ein wesentlicher Paktor der Erfindung, daß das Polynucleotid im wesentlichen nur Reste aus 5-Hydroxycytidin enthalten sollte und nicht aus einem Heteropolymer, das andere Nucleotidreste enthält, besteht.

Die erfindungsgemäßen Polynucleotide bestehen aus Molekülen mit unterschiedlichen Molekulargewichten, die ver-

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schiedene Anzahlen an Nucleotldresten enthalten. Die Erfindung soll nicht auf Polynucleotide mit einem bestimmten Molekulargewicht begrenzt sein und .der Ausdruck "Polynucleotide" soll auf alle Oligo- und Polynucleotide anwendbar sein, die mehr als 10 Nucleotidreste enthalten. Das Molekulargewicht der vorliegenden Polynucleotide ist bei unterschiedlichen Polymerisationsbedingungen verschieden. Beispielsweise entsteht bei der Polymerisation, die unter Verwendung von Polynucleotidphosphorylase, die an einen unlöslichen Träger gebunden ist, ein Polymer mit einem Durchschnittsmolekulargewicht, das größer ist als dasjenige, was unter Verwendung eines löslichen Enzyms erhalten wird. Das ungefähre Molekulargewicht kann aus der Sedimentationsgeschwindigkeit der Polynucleotide durch Zentrifugierung in einem Salzgradienten bestimmt werden,und es wurde gefunden, daß ein typisches Molekulargewicht für ein Material, .das unter Verwendung eines löslichen Enzyms polymerisiert wurde, zwischen 40 000 und 80 000 und unter Verwendung eines unlöslichen Enzyms zwischen 100 000 und 150 000 liegt.

Die erfindungsgemäßen Polynucleotide besitzen die Fähigkeit, die Produktion von Interferon zu induzieren und sind außerdem als antivirale Mittel geeignet. Die vorliegenden Verbindungen können deshalb zur Verhütung von VirusInfektionen oder zur Milderung einer bereits vorhandenen Virusinfektion verwendet werden. Zu diesem Zweck kann die Verbindung an ein Säugetier in jedem geeigneten Trägermaterial, wie einer gepufferten wäßrigen Lösung, verabreicht werden. Der Verabreichungsweg hängt von der verwendeten Formulierung ab, wobei sich der intravenöse Weg als am wirksamsten für die Verabreichung des.Stoffes an ein Säugetier erwies.

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Nachstehende Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung. Die Mengen der Stoffe sind als .Gewichtsteile angegeben.

Beispiel 1

Eine lQJiige G/V-Lösung des Trinatriumsalzes von Cytidindiphosphat in Wasser wurde bei O⁰C langsam mit Brom versetzt, bis eine gelbe Farbe bestehen blieb. Die Lösung wurde dann mit Cyclohexan geschüttelt, um überschüssiges Brom zu entfernen. Danach wurde 2,4,6-CoIUdIn zugesetzt und die Emulsion 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch 4 χ mit 2 Teilen Äther extrahiert. Die wäßrige Schicht wurde auf eine Triäthylaminoäthylcellulosesäure in Bicarbonatform gegeben und wurde mit einem linearen Gradienten eluiert, indem man Wasser (11) mit Triäthylammoniumbicarbonat (0,14 πι , eingestellt auf einen pH-Wert von 9>5 durch Zugabe von Triäthylamin) versetzte. Zuerst wurde 5-Bromcytidindiphosphat eluiert, wie in Peak I gezeigt wird, und anschließend 5-Hydroxycytidindiphosphat bei etwa 0,1 m , Bicarbonat, wie in Peak II der Zeichnung gezeigt wird.

Die 5-Hydroxycytidindiphosphat enthaltenden Fraktionen wurden zusammengegossen, zur Trockne eingedampft _t und überschüssiges Triäthanolammoniumbicarbonat wurde durch wiederholte Zugabe und Verdampfen von Methanol entfernt. Der Rückstand wurde mit Hilfe einer Dowex 50 (sulfoniertes Styrol-Divinylbenzol-Polymer-Kationenaustauscherharz in Kaliumform) Säule in ein blaßgelbes hygroskopisches Trikaliura-5-hydroxycytidin-5'-diphosphat überführt.

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Das wie vorstehend beschrieben hergestellte 5-Hydroxycytidindiphosphat wurde mit Hilfe von Polynucleotidphosphorylase in einen Trischloridpuffer (0,15m pH 9,0), worin 2,5 mMol Äthylendiamintetraessigsäure und 0,02 % Natriumazid enthalten waren, polymerisiert. Für eine annehmbare Reaktionsgeschwindigkeit waren 3000 Einheiten Phosphorylase je mg 5-Hydroxycytidindiphosphat erforderlich, und es waren äquimolare Konzentrationen an Substrat und Magnesiumionen erforderlich.

Das Inkubationsmedium wurde durch wiederholte Extraktion mit Chloroform/Isopropanol (5:2 v/v) entproteinisiert und die wäßrige Phase durch aufeinanderfolgende Dialyse gegen 0,2 m Kaliumchlorid, 0,02m Kaliumäthylendiamintetraessigsäure (pH 8,0), 0,02m Kaliumäthylendiamintetraessigsäure (pH 7,0) und 2 χ gegen Wasser entaalzt. Die dabei entstehende Lösung wurde bei 0⁰C lyophilisiert, wobei man eine hygroskopische Poly(5-hydroxycytidylsäure) in etwa 25£iger Ausbeute erhielt.

Die vorstehend hergestellte Poly(5-hydroxycytidylsäure) besaß einßSp_0W von 2,0 bis 5j0, wie durch Ultrazentrifugierjung in einem isokinetischen Saccharosegradienten, der Natriuraacetat enthielt, bei einem pH-Wert von 7,0 bestimmt wurde, was ein Molekulargewicht von 40 000 bis 80 000 anzeigt. Bei der Polyacrylamidgel-Elektrophorese zeigte sie ein einziges Peak. Das Ultravioletmaximum von Poly(5-hydroxycytidylsäure) bei 20⁰C in 0,3 m Natriumchlorid, 0,01m Natriumcacodylat bei pH 6,5 betrug 292 nm und bei pH 11,0 320 nm.

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Beispiel 2

Eine wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Poly(5-hydroxycytidylsäure) besteht darin, daß sie mit anderen Polynucleotiden keine Hybride zu bilden vermag. Diese Eigenschaft wird durch nachstehende Beobachtungen erläutert;

a) Bei 12stündigem Vermischen äquimolarer Mengen von Poly(5-hydroxycytidylsäure) mit Polyinosinsäure, Polyguanylsäure oder Polyadenylsäure in einem Natriumchlorid/O₉Im Natriumcacodylat-Gemisch bei einem pH-Wert von 6,5 und 37°C waren die UV-Spektren rein additiv, wodurch angezeigt wurde, daß nur ein Vermischen und keine Hybridbildung der Polynucleotide stattfand.

b) Unter vorstehenden Bedingungen konnte bei Temperaturen zwischen 5 und 95°C keine T (mittlere; (midpoint) Denaturier ungs temperatur) festgestellt werden, womit angezeigt wurde, daß die Polynucleotide absolut nicht in der Lage waren, Hybride zu bilden.

c) Die Hydrolysegeschwindigkeit von Polyinosinsäure in 0,1m Tris-HCl, 0,3m Natriumchlorid durch T.-Ribonuclease bei 20°C war die gleiche sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Poly(5-hydroxycytidylsäure), wodurch wiederum angezeigt wurde, daß zwischen den Polynucleotiden keine Hybridbildung stattgefunden hatte.

d) Beim Aufbringen eines äquimolaren Gemischs aus Polyinosinsäure und Poly(5-hydroxycytidylsäure) in 0,3m Natriumchlorid/O,01m Natriumcacodylat auf eine Sephadex G-200-(Dextranpolymer mit einem Wasserzurückhaltewert von 20 g Wasser/g Polymer) -Säule wurde nur Polyinosinsäure und PoIy-(5-hydroxycytidylsäure) eluiert, wodurch angezeigt wurde, daß zwischen den beiden Verbindungen keine Komplexbildung stattfand.

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Beispiel 3

Die antivirale Wirkung von Poly(5-hydroxycytidylsäure) wurde anhand ihrer Fähigkeit, Zellen in Gewebekulturen gegen Infektion mit Sindbis-Virus (100 χ TCD„_Q) zu schützen, veranschaulicht. Diese Virusdosis tötet normalerweise die Zellen binnen 2 Tagen ab, jedoch wurden durch einstündige Vorinkubierung der Zellen mit 0,03 Mg/ml Poly(5-hydroxycytidylsäure) 12 Stunden vor der Zugabe des Virus die Zellen gegen Infektion voll geschützt.

Beispiel 4

Poly(5-hydroxycytidylsäure) zeigte sich beim Schützen von Mäusen gegen Infektion mit Encephalomyocarditis-Virus (EMC) als wirksam. Mäuse wurden intraperitoneal mit 10⁵ plaque-bildenden Einheiten (PFU)des EMC-Virus entweder allein oder zusammen mit 100 ng Poly(5-hydroxycytidylsäure) oder anderen Polynucleotiden injiziert. Die durchschnittliche Überlebenszeit von Mäusen wird nachstehend gezeigt.

Polynucleotid Durchschnittsüberlebenszeit (Tage)

keines 84,4

Iblyadenylsäure . 94,4

Polyuridylsäure 98,6

Poly(5-hydroxycytidylsäure) 120,6

Die anderen Polynucleotide -lieferten keinen wesentlichen Schutz gögen Infektion mit dem EMC-Virus. Im Gegensatz dazu bewirkte Poly(5-hydroxycytidylsäure) einewesentliche Verlängerung des Lebens der Tiere.

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Beispiel 5

Es zeigte sich außerdem, daß Poly(5-hydroxycytidy!säure) Mäuse gegen Infektion mit Semliki-Forest-Virus (SFV) schützte. 5 Tage alte säugende Mäuse wurden mit einer 32 χ LD^_n-DoSXS von SFV (an 2 Tagen gemessen) injiziert und 2"std.-vor dieser Injektion außerdem mit Dosen an Poly(5-hydroxycytidylsäure), Poly-I/Poly-C oder mit keinem Polynucleotid injiziert. Der durch diese Mittel gebotene Schutz wird als prozentuale Anzahl der Tiere, die 20 Tage nach der Injektion überlebten, angegeben.

Polynucleotid	Dosis	% Überlebende
keines	keine	0 %
Polyinosin/Polycytidyl- säure (Poly-I/Poly-C)	' 100 ^g	50 %
Poly(5-hydroxycytidy1- säure)	100 ug	75 %
Poly(5-hydroxycytidy1- säure)	20 ug	67 %

Poly(5-hydroxycytidylsäure) erwies sich somit als wirksamer als die üblichen, xnterferoninduzxerenden Mittel Polyinosin/Polycytidylsäure beim Schützen von Mäusen gegen Infektion mit SFV, selbst bei Verabreichung der Poly(5-hydroxycytidylsäure) bei einer niederen Dosis.

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Es.erwies sich außerdem, daß hohe Dosen an Poly(5-hydroxycytidylsäure) allein an Mäuse verabreicht, keine Toxizität, die den Tod zur Folge hatte, zeigte. Dosen bis zu 400 mg Polynucleotid je kg Maus hatte binnen Ik Tagen keinen Tod zur Folge. Die vorliegenden Verbindungen zeigten somit ganz klar starke antivirale Wirkung bei Dosen, die keine akute Toxizität gegenüber Tieren besaß.

Claims

Patentansprüche:

1. Poly(5-hydroxycytidylsäuren) mit mehr als 10 5-Hydroxycytidinresten.

2. Poly(5-hydroxycytidy!säuren) nach Anspruch 1 mit mehr als 10 und bis zu 200 5-Hydroxycytidinresten.

3. Poly(5-hydroxycytidylsäure) nach Anspruch 1 mit 100 bis 200 5-Hydroxycytidinresten und weiter gekennzeichnet durch eine Sedimentationskonstante (s_?ow) von 2,0 5,0, einem Molekulargewicht von 40 000 bis 80 000, einem einzigen Peak bei der Polyacrylamidgelelektrophorese und einem UV-Maximum, gemessen bei 20⁰C in 0,3m Natriumchlorid und 0,01m Natriumcacodylat, von 292 nm bei pH 6,5 und von 320 nm bei pH 11,0.

Λ. Poly(5-hydroxycytidy!säuren) nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch enzymatische Polymerisierung von 5-Hydroxycytidindiphosphat hergestellt worden sind.

5. Poly(5-hydroxycytidylsäure) nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Inkontaktbringen von 5-Hydroxycytidindiphosphat mit Polynucleotidphosphorylase hergestellt worden ist.

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6. Poly(5-hydroxycytidylsäure) nach Anspruch. 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Inkontaktbringen von äquimolaren Mengen an 5-Hydroxycytidindiphosphat und Magnesiumionen mit Polynucleotidphosphorylase hergestellt worden ist.

Für: G.D. Searle & Co. Ltd

Dr.H.J.Wolff Rechtsanwalt

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