DE2338043B2 - Diagnosemittel zur Bestimmung der gamma-Glutamyltranspeptidasekonzentration in biologischen Flüssigkeiten - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Diagnosemittel zur Bctimmung der y-Glutamyltranspeptidasekonzentration n biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung ein s Substrats in Form einer auf einen pH-Wert \on u«-a 7,9 bis etwa 8,4 gepufferten wäßrigen Substratlösung mit, jeweils bezogen auf 1 ml biologische Flüssigkeit, mindestens etwa 45 Mikromolen L-y-Glutamyl-p-nitroanilid und mindestens 400 Mikromolen Glycylglycerin, von NaNO₂ und eines Farbkupplers.

Die y-Glutamyltranspeptidase ist ein in Nierenextrakten gefundenes Enzym, welches Transpeptisierungsreaktionen von Stoffwechsel-y-Glutamylp:;ptiden "und Aminosäuren unter Bildung neuer die y-Glutamyleinheit enthaltender Peptide '- -ialysiert. Die Reaktion besteht in einer Überuagung der y-Glutamyleinheit aus einer Bindung mit dem Peptid auf eine Bindung mit der Aminosäureeinheit in einer Akzeptoraminosäure. Somit führen also Transpeptidreaktionen zu einer Umverteilung von y-Glutamylein-

heiten.

Die y-Glutamyltranspeptidase findet sich vornehmlich in den Nieren, verschiedener Tierarten und von Menschen. Verfahren zur Isolierung der y-Glutamyltranspeptidase aus Schaf-, Schweine- oder Ochsennieren, aus Ochsenpankreas sowie aus Kuh- und Menschennieren sind bekannt.

Es ist ferner bekannt, daß y-Glutamyltranspeptidase in verschiedenen Körperorganen und -geweben sowie in Urin, Blutserum und -plasma enthalten ist. Kürzlich wurde gefunden, daß anomale y-Glutamyltranspeptidasekonzentrationen in bestimmten Körperflüssigkeiten ein Anzeichen für bestimmte krankhafte Zustände sind. So wird beispielsweise von Szczek-1 i k und Mitarbeitern in der Zeitschrift »Gastroenterology«, Bd. 41, S. 353 bis 359 (1961), berichtet, daß bei Patienten mit Virushepatitis oder chronischer Hepatitis eine lediglich mäßige Erhöhung der y-Glutamyltranspeptidasewerte zu beobachten ist. Sehr hohe y-Glutamyltranspeptidasewerte wurden jedoch bei Patienten gefunden, die an Okklusions-lkterus, Gallenzirrhose, Cholangitis sowie Leberneoplasie, primärem Leberkrebs oder intrahepatären Metastasen leiden. Die Enzymaktivität ist bei solchen Patienten gelegentlich lOOmal größer als bei normalen Patienten. Nicht auf einen Ikterus zurückzuführende, sehr hohe y-Glutamyltranspeptidasewerte begründen einen starken Verdacht auf primären oder metastatischeu Leberkrebs.

Von N ο s s 1 i η und Mitarbeitern wird in der Zeilschrift »Scand. J. Clin. and Lab. Invest.«, Bd. 18, S. 178 bis 180, Ergänzung 92 (1966), über Vergleichsuntersuchungen bezüglich der y-Glutamyltranspeptidaseaktivität und der alkalischen Phosphatase bei Hepatitis und Okklusions-lkterus berichtet. Aus ihren Vergleichsuntersuchungen zogen die Verfasser der. Schluß, daß trotz identischem Reaktionsverhalten von Phosphatase und y-Glutamyltranspeptidase die letztere bei den untersuchten pathologischen Zuständen besser nachweisbar war.

L u m und Mitarbeiter zeigten in der Zeitschrift »Clin. Chem.«, Bd. 18, S. 358 bis 362 (1972), daß die y-Glutamy!transpeptidase-Aktivität bei sämtlichen untersuchten Formen einer Lebererkrankung (Virushepatiiis. Leberzirrhose, Uallenblasenentzündung, Lebernietastasenkarzinom, Pankreaskarzinom, Lebergranulom und akute Par.kreatitis) über normal liegt. Die y-Glutamyllranspeplidase ist ein empfindlicher Indikator für Lebeierkrankungen als alkalische Phosphatase und ein noch empfindlicherer Indikator als Lcucinaminopcplidase. Darüber hinaus hat es sich gezeigt, daß die Bestimmung der y-Gluiamyltranspcpiidasc-Aktivität. ein einfaches, empfindliches direk-

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tes Mittel zur Unterscheidung, ob eine erhöhte alka- für genaue Messungen verfeinerte Instrumente erlische Seruoiphosphataseaktivität auf ein Knochen- forderlich sind. Aus sämtlichen genannten Gründen oder Leberleiden zurückzuführen ist, darstellt. Die bereitete eine Automatisierung der Szasz-Methode höchste Aktivität wurde bei Leberverstopfungser- größte Schwierigkeiten.

krankungeu festgestellt, ₅ Aus L. N a f t a 1 i η und Mitarbeitern »Clin. Chim. Im Laufe der letzten Jahre wurden die verschie- Acta« 26, 293 bis 296 (1969), ist es bekannt, 0,05 ml densten Verfahren zur Bestimmung der y-Glutamyl- Serum, in welchem die y-Glutamyltranspeptidasetranspeptidasekonzentration in biologischen Flüssig- Aktivität bestimmt werden soll, mit 0,5 ml einer einen keiten beschrieben. Zuerst wurde Glutathion als pH-Wert von 7,8 aufweisenden, mit Tris-Salzsäure-Substrat verwendet und die Wirkung der y-Glutamyl- io puffer gepufferten y-Glutamyl-p-nitroanilidlösung zu transpeptidase auf das Substrat bestimmt. In jüngster inkubieren, dann 2,0 ml 10%iger Essigsäure und weiter Zeit wurden bei derartigen Bestimmungen künstliche 1,0 ml einer 0,l%igen NaNO₂-Lösung, nach 3minü-Substrate mit y-DjL-Glutamylaminopropionitril, tigern Stehenlassen bei Raumtemperatur 1,0 ml 1 %iger y-L-Glutamyl-Ä-naphthylamid oder N-D,L-y-Glut- Ammoniumpersulfatlösung und schließlich nach lmiamylanilid verwendet. Bei letzteren Besümmungs- 15 nütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur 1,0 ml methoden wurde das Auftreten eines oder mehrerer O.Oi^^igerN-Naphthyläthylendiamin^HCl-Lösungzu-Spaltprodukte (s) e, das (die) bei der Einwirkung der zusetzen. Der gebildete Farbstoff wird bei 540 nm in der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit ermittelt. Nachteilig an den bekannten Maßnahmen enthaltenen y-Glutamyltranspeptidase auf das Sub- ist, daß die Substrat- und Kupplerlösung und auch strat entstand(en), als Maß für die Enzymaktivität an- 20 die sonstigen Reagenzien unter besonderen Sichergesehen. Verbesserte Testverfahren setzten das ge- heitsvorkehrungen getrennt gelagert und erst unmittelbildete Spaltprodukt mit einem Farbstoffbildner um, bar vor der Durchführung der Bestimmung zubeum photometrische Meßgeräte zur Bestimmung der reitet und daß Kontroll-, Standard- und Leerwerte y-Glutamyltranspeptidase ausnutzen zu können. Eine mit angesetzt werden müssen. Die Tatsache, daß die weitere Vereinfachung dieses allgemeinen Testver- 25 im Rahmen des bekannten Testverfahrens verwendeten fahrens brachte die Verwendung von y-L-Glutamyl- Reagenzier wegen ihrer Instabilität in gebrauchsp-nitroanilid als Substrat, da hierbei ein farbiges Spalt- fertigem Zustand erst unmittelbar vor Gebrauch in produkt, nämlich p-Nitro; η lin, entsteht, das ohne die gebrauchsfertige Form überführt werden dürfen, weitere Umsetzung zur Bildung eines Farbstoffs bedingt, daß das bekannte Verfahren nur von gut (direkt) kolorimetrisch gemessen werden konnte. 30 eingearbeitetem, sorgfältigem und entsprechend kost-Die Bestimmung der y-GIutamyltranspeptidase- spieligem Personal durchgeführt werden kann. Weiter-Aktivität unter Verwendung von y-L-Glutamyl- hin birgt sie die Gefahr einer Über- oder Unterdosis p-nitroanilid als Substrat sowie die verschiedensten einzelner Bestandteile und dadurch bedingter Meß-Modifikationen dieser Beslimmungsmethode werden fehler in sich.

von zahlreichen Wissenschaftlern, z. B. M. Orlowski 35 Schließlich ist das bekannte Testverfahren aus den in der Zeitschrift »Arch. Immunol. Therap. Exptl.«, genannten Gründen nicht einwandfrei reproduzierbar Bd. 13, S. 538 (1965), von D. M. Dimov und Mit- und folglich nicht absolut zuverläßlich. Ein Einsatz arbeitern in der Zeitschrift »Clin. Chem. Act.«, Bd. 16, des bekannten Testverfahrens bei Routineunter-S. 271 bis 277 (1967) und G. S ζ a s ζ in der Zeit- suchungen verbietet sich von selbst, schrift »Clin. Chem.«, Bd. 15, S. 124 bis 136 (1969), 4" Der Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, ein beschrieben. stabiles, handelsfähiges Diagnosemittel für eine ver-Von den geschilderten Bestimmungsmethoden zur besserte Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase-Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase-Aktivität konzentration in biologischen Flüssigkeiten, insbehat das von G. Szasz entwickelte Verfahren allge- sondere Körperflüssigkeiten, zu entwickeln, meine Anerkennung gefunden und wird nun in der 45 Gegenstand der Erfindung ist somit ein Diagnose-Regel als die klinische Standardmethode angesehen. mittel der eingangs definierten Art, welches dadurch Der Hauptvorteil dieser Bestimmungsmethode ist gekennzeichnet ist, daß das NaNO₂ in einer Menge, ihre besondere Einfachheit, da bei klinischen Routine- bezogen auf 1 ml biologische Flüssigkeit, von minuntersuchungen das Weglassen oder die Beschleuni- destens 36,2 Mikromolen im Substrat enthalten ist gung von Verfahrensschritten besonders zweckmäßig 5<> und daß der Farbkuppler aus einer auf einen pH-Wert ist. Nichtdestoweniger ist die von Szasz ent- von etwa 0,8 bis etwa 1,3 eingestellten wäßrigen Minewickelte Bestimmungsmethode doch mit bestimmten ralsäurelösung mit, bezogen auf 1 ml biologische Nachteilen behaftet. So sollte beispielsweise bei jeder Flüssigkeit, etwa 11,8 bis etwa 29,5 Mikromolen Serumprobe zur Gewährleistung genauer Bestim- 8-Hydroxychinoiinsulfat und, bezogen auf das Gemungen eine Blindprobe mitgetestet werden, da die 55 samtvolumen der Mincralsäurelösung, etwa 1 bis Trübung der Probe oftmals die Messungen der opti- etwa 5 Volumprozent eines wasserlöslichen nicht sehen Dichte stört. Darüber hinaus berücksichtigt die ionischen Emulgators besteht. Szasz-Methode nicht eine nicht enzymatische Hydro- Mit dem Diagnosemittel gemäß der Erfindung lyse des Substrats Hierdurch wird aber zwangsläufig lassen sich nun die dem bekannten, von L. N a f t a 1 i η die Genauigkeit der Bestimmungen beeinträchtigt. ^6o und Mitarbeitern entwickelten Testverfahren anda hohe Werte für die enzymatische Aktivität in haftenden Nachteile vermeiden. Bei dem Diagnoseirgendeiner untersuchten Probe Ablesungswerte für mittel gemäß der Erfindung handelt es sich um ein am die optische Dichte ergeben könnten, die außerhalb Hcrstellungsorl sorgfältig standardisiertes und aus des Bereichs üblicher klinischer Laborinstrumente zwei Bestandteilen bestehendes haltbares Handelsliegen. Diese Schwierigkeiten werden noch weiter ⁶5 produkt, dessen Bestandteile bei Gebrauch lediglich verstärkt, wenn die zu untersuchende Probe einen in vorgegebener Reihenfolge mit der jeweils zu prühohen Biürubingehalt (Gelbfärbung) aufweist. Hier- fenden Probe gemischt werden müssen. Über- oder durch wird die gelbe Farbe so stark intensiviert, daß Unterdosierungen und dadurch bedingte Meßfehler

entfallen dadurch, so daß das Diagnosemittel gemäß der Erfindung auch im Rahmen von Routineuntersuchungen von angelerntem Personal verwendet werden kann und wegen der Standardisierung reproduzierbare Ergebnisse liefert. Im übrigen läßt sich das Testverfahren «roter Verwendung eines Diagnosemittels gemäß der Erfindung wesentlich einfacher gestalten als das bekannte Testverfahren, da wegen der sorgfältigen Standardisierung des Diagnosemittels auf vom Hersteller gelieferte, auf die y-Glutamyltranspeptidase-Konzentration in verschiedenen Proben geeichte Farbkarten zurückgegriffen und auf die Durchführung von Kontroll-, Standard- oder Leerbestimmungen verzichtet werden kann.

Wie bereits erwähnt, besteht das bei einer solchen verbesserten Bestimmung verwendete Substrat aus einer gepufferten Lösung von L-y-Glutamyl-p-nitroanilid, Glycylglycin, Natriumnitrit und gegebenenfalls Magnesiumchloridhexahydrat. iiei dem L-y-Glutamylp-nitroanilid handelt es sich um das eigentliche Substrat, auf welches das y-Glutamyltranspeptidaseenzym einwirkt. Das Glycylglycin wirkt als Akzeptor für die y-Glutamyleinheit. Das Natriumnitrit diazotiert in saurer Umgebung das p-Nitroanilin-Spakprodukt. Das möglicherweise anwesende Magnesiumchloridhexahydrat trägt dazu bei, das Substrat in Lösung zu halten, und aktiviert vermutlich ferner die Reaktion. Die Anwesenheit von Magnesiumchloridhexahydrat ist jedoch bei der Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase nicht zwingend erforderlich.

Der in der Substratlösung enthaltene Puffer hält deren pH-Wert vorzugsweise auf dem für eine enzymatische Aktivität optimalen pH-Wert von etwa 8,2. Als Puffer können in der Substratlösung (2-Amino-2-methylpropan-l,3-diol)-hydrochlorid oder Tris-(hydrcxymethyl)aminomethanhydrochlorid enthalten sein.

Die zur Durchführung der Diagnoiiemethode erforderlichen Mengen an Substrat, Glycylglycin, Natriumnitrit und gegebenenfalls Magnesiumchloridhexahydrat hängen von der Menge der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit ab. Um sicherzustellen, daß eine genügende Menge an Reagenzien zur Umsetzung mit der bisher höchsten bekannten Menge an dem betreffenden Enzym in der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit zur Verfügung steht, sollte die gepufferte Substratlösung, wie bereits erwähnt, pro 1 ml der 7¹M untersuchenden biologischen Flüssigkeit mindestens 45 Mikromole L-y-Glutamylp-nitroanilid, mindestens 400 Mikromole Glycylglycin, mindestens 36,2 Mikromo'e Natriumnitrit und gegebenenfalls mindestens 100 Mikromole Magnesiumchloridhexahydrat enthalten. Es ist in der Regel von Vorteil, wenn das Diagnosemittel einen Überschuß an Natriumnittrit enthält. Mengen bis zu 290 Mikromolen pro 1 ml biologische Flüssigkeit stören die Versuchseirgcbnisse nicht. Vorzugsweise werden pro 1 ml der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit 72,4 Mikromole Natriumnitrit verwendet.

Vorzugsweise enthält die Substratlösumg als Paffer TrisOrydroxymethy^aminomethanhydrochlorid. Der letztlich gewünschte pH-Wert wird dann durch Zugabe weiterer Mineralsäure, z. B. von Chlorwasserstoffsäure, eingestellt. -

Bei dem in dem neuen Farbkuppler enthaltenen Farbstoffbildner handelt es sich um eine mineralsaure Lösung von 8-Hydroxychinolinsulfat. Die Säure dient unter anderem dazu, die enzymatische Umsetzung zu stoppen, damit die Menge an innerhalb eines gegebenen Zeitraums gebildeten Spaltprodukts gemessen werden kann. Um das kolorimetrisch zu messende farbige Endprodukt zu stabilisieren, hat es sich als notwendig erwiesen, dem Diagnosefarbkuppler einen wasserlöslichen nicht ionischen Emulgator zuzusetzen. Geeignete Emulgatoren sind beispielsweise äthoxylierter Tridecylal kohol, äthoxylierter Oleylalkohol und äthoxylieae Stearinsäure. Derartige

ίο Produkte sind unter d:n verschiedensten Handelsbezeichnungen im Har.del erhältlich. Ein weiterer geeigneter nicht ionischer Emulgator ist beispielsweise handelsübliches Octylphenoxypolyäthoxyäthanol.

Der Farbkuppler sollte pro 1 ml der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit vorzugsweise etwa 14,8 Mikromole 8-Hydroxychinolinsulfat enthalten. Vorzugsweise sollte der Emulgatorgehalt des Farbkupplers zur Stabilisierung des letztlich gebildeten Farbstoffs 1 Volumprozent betragen.

Ein sehr wesentliche;- Faktor bei der Bildung des Farbstoffs ist der pH-Wert der Reaktionslösung während der Farbstoffb:ldung. Es hat sich gezeigt, daß eine optimale Kupplung (zur Bildung des Farbstoffs) bei pH-Werten von etwa 1,2 bis etwa 2, vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 1,9, stattfindet. Um zu gewährleisten, daß dieser pH-Wert erreicht wird, muß der zu der Substratreaktionslösung zugesetzte Farbkuppler, d. h. die den Emulgator enthaltende

Mineralsäurelösung von 8-Hydroxychinolinsulfat, einen pH-Wert von etwa 0,8 bis etwa 1,3, vorzugsweise von etwa 1,1, aufweisen. Diesen pH-Wert erreicht man, indem men eine wäßrige Mineralsäurelösung, z.B. eine wäßrige Chlorwasserstoff säure lösung, verwendet, deren Säurekonzentration etwa 0,1 bis 0,5 η beträgt. Derartige Säurekonzentrationen reichen auch aus, um die enzymatische Aktivität vor der Farbstoffbildung und der kolorimetrischen Bestimmung des gebildeten Farbstoffs zu stoppen.

Bei der Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidasekonzentration wird die zu untersuchende biologische Flüssigkeit eine gegebene Zeit lang mit der beschriebenen gepufferten Substratlösung inkubiert, um in

der Reaktionslösung das p-Nitroanilin-Spaltprodukt zu bilden. Hierauf wird die Reaktionslösung bei einem gesteuerten pH-Wert mit dem beschriebenen Farbkupp'^r versetzt. Nach 15 Sekunden bis 10 Minuten wird eine genügende Menge Alkali zugesetzt, um den pH-Wert der Reaktionslösung in den alkalischen Bereich zu verschieben. Schließlich wird die optische Dichte der purpurrcten Reaktionslösung als Maß der Enzymaktivität in der untersuchten biologischen Flüssigkeit abgelesen.

Die bei der Durchführung des Diagnoseverfahrens am Schluß zugesetzte alkalische Lösung soll dem ausreagierten Reaktionsgemisch einen pH-Wert von zweckmäßigerweise etwa 10,5 bis etwa 12, vorzugsweise von etwa 1C,5, verleihen, um die Farbe des zu messenden Farbstoffs zu entwickeln. In typischer Weise wird hierzu Natriumhydroxid verwendet. Es wurde gefunden, d<iß mindestens 0,05 n-Natriumhydroxid erforderlich ist, um konstante Absorptionsablesungen zu gewährleisten. Eine Erhöhung der Natriumhydroxidkonzentration bis zu etwa 0,25 η stört die Ergebnisse nicht.

Wenn die ursprüngliche Substratlösung (als Gegebenenfalls- Maßnahme) Magnesiumchloridhexahy-

drat enthielt, muß zusammen mit der alkalischen Erfindung letzlich gebildeten farbigen Komplexes Lösung eine bestimmte Menge Äthylendiamintelra- ist etwa 4,5mal größer als der molare Extinktionsnatriumacetat zugesetzt werden, um ein Ausfallen koeffizient des nach der Szasz-Methode erhaltenen des Magnesiumchlorids als Magnesiumhydroxid aus p-Nitroanilins.

dem ausreagierten Reaktionsgemisch zu verhindern. 5 Die Aktivität des y-Glutamyltranspeptidaseenzyms Eine solche Ausfällung würde selbstverständlich die wird in internationalen Einheiten (IE) als Menge der Absorptionsablesungen stören und die Genauigkeit pro Minute aus 1000 ml Serum entbundenen Mikro- und Empfindlichkeit der Bestimmungsmethode be- mole p-Nitroanilin angegeben,
einträchtigen. Um das Magnesiumchloridhexahydrat Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher in Lösung zu halten, sind pro Mikromol Magnesium- 10 veranschaulichen,
chloridhexahydrat mindestens 6,0 Mikromole Äthylen- Beispiel 1
diarnintetranatriurnacetat erforderlich. Die Menge an Zubereitung der Substratlösung
Atnylendiamintetranatriumacetat kann ohne Beeinträchtigung der Ergebnisse auf das bis zu etwa lOfache Durch Auflösung von 126,3 mg L-y-Glutamylerhöht werden. Da jedoch die Mindestkonzentration 15 p-niiroaniiid, 290,7 mg Glycylglycin, 50 mg Natriumausreicht, wird diese in der Regel bevorzugt. nitrit und 223,7 mg Magnesiumchloridhexahydrat

Zur Durchführung der Bestimmungsmethode mit unter konstantem Rühren in 100 ml eines 0,05 m Hilfe eines Substrats und eines Farbkupplers gemäß (2 - Amino - 2 - methylpropan -1,3 - diol)hydrochloridder Erfindung ist nur etwa 0,1 ml biologische Flüssig- Puffers eines pH-Werts von 8,6 bei einer Temperatur keit erforderlich. Gewünschtenfalls können jedoch ao von 50 bis (30° C wurde ein bei einer Temperatur von auch größere Mengen Untersuchungsfiüssigkeit unter- 25°C einen pH-Wert von 8,05 aufweisenden Diagnosesucht werden. Eine Verdünnung der Probe ist nicht mittel hergestellt, welches an L-y-Glutamyl-p-nitroerforderlich. So können beispielsweise Blutserum, anilin 4,5 Millimolar, an Glycylglycin 40 Millimolar, Blutplasma, Urin, Rückenmarksflüssigkeit und ahn- an Natriumnitrit 7,25 Millimolar und an Magnesiumliche biologische Flüssigkeiten unter Verwendung 25 chloridhexahydrat 10 Millimolar war.
eines Diagnosemittels und eines Diagnosefarbkupplers . .
gemäß der Erfindung direkt untersucht werden. Beispiel 2

In der Regel wird 1 ml des beschriebenen gepufferten 126,3 mg L-y-Glutamyl-p-nitroanilid, 290,7 mg GIy-Substratreagens mit 0,1 ml Flüssigkeitsprobe ver- cylglycin, 50 mg Natriumnitrit, 223,7 mg Magnesiumsetzt, worauf das Ganze eine bestimmte Zeit lang 30 chloridhexahydrat und 605,7 mg Tris(hydroxymethyl)-bei bestimmter Temperatur inkubiert wird. Die aminomethan wurden unter Rühren in 90 ml destil-Inkubationsdauer und -temperatur können sehr ver- liertem Wasser gelöst, worauf der pH-Wert der schieden sein. Zur Gewährleistung genauer Ergebnisse Lösung (gemessen bei einer Temperatur von 25° C) werden häufig die kürzest mögliche Inkubationsdauer durch Zugabe von 1 n-Chlorwasserstoffsäure auf 8,2 und die geringstmögliche Inkubationstemperatur be- 35 eingestellt wurde. Nach dem Verdünnen auf 100 ml vorzugt. Eine Inkubation bei einer Temperatur von mit destilliertem Wasser war die Substratlösung geetwa 37°C während 10 Minuten liefert zuverlässige brauchsfertig.
Ergebnisse und wird folglich empfohlen. Nach be- B e i s ρ i e 1 3
endeter Inkubation wird das Reaktionsgemisch mit , . . , _T -. _o « λ
1 ml der das 8-Hydroxychinolinsulfat und den wasser- 40 Zubereitung der sauren Losung von 8-Hydroxylöslichen nicht ionischen Emulgator enthaltenden, chinolinsullat
mineralsauren Reagenzlösung und etwa 15 Sekunden, 100 mg 8-Hydroxychinolinsulfat wurden in etwa jedoch nicht mehr als 10 Minuten später mit etwa 80 ml einer 0,2 n-Chlorwasserstoffsäure gelöst, worauf 5 ml einer (falls die Substratlösung Magnesium- die erhaltene Lösung mit 1 ml eines handelsüblichen chloridhexahydrat enthielt, 0,1% Äthylendiamin- 45 äthoxylierten Tridecylalkohol versetzt und dann tetranatriumacetat enthaltenden) 0,1 n-Natriumhy- durch Zugabe von 0,2 n-Chlorwasserstoffsäure auf droxidlösung versetzt. Das Absorptionsvermögen der 100 ml verdünnt wurde,
endgültigen Lösung wird bei 570 nm bestimmt. Der

ermittelte Wert entspricht der Menge des bei der B e i s ρ i e 1 4

enzymatischen Reaktion freigesetzten p-Nitroanilins. ₅o _{Zubereitu der} Äthylendiamintetranatriumacetat

Die Konzentration des p-N.troamlms wird aus einer enthaltenden Natriumhydroxidlösung
Eichkurve ermittelt, die aus den Absorptionswerten

wäßriger Lösungen mit verschiedenen Konzentra- Zu diesem Zweck wurden 500 mg Äthylendiamin-

tionen an freiem p-Nitroanilin aufgestellt wurde. Die tetranatriumacetat in 100 ml einer 0,05 n-Natrium-

ermittelten Mikromole p-Nitroanilin werden nach 55 hydroxidlösung gelöst,
folgender Gleichung

IE = optische Dichte bei 570 nm · 0,172 Beispiel 5

in die enzymatische Aktivität umgerechnet. IE stellen Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase

»internationale Einheiten« dar, die als Menge der 60 ^m Blutserum

innerhalb von 1 Minute aus 1000 ml Serum ent- Ein Teströhrchen wurde mit 1 ml der gemäß

bundenen Mikromole p-Nitroanilin definiert sind. Beispiel 2 zubereiteten Substratlösung und dann mit

Die Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidase- 0,1 ml Blutserum beschickt. Das Ganze wurde 10 Mi-

konzentration mit Hilfe des Substrats und Färb- nuten lang bei einer Temperatur von 37°C inkubiert,

kupplers gemäß der Erfindung hat sich als 4,5mal 65 Nach beendeter Inkubation wurde 1 ml der gemäß

empfindlicher erwiesen als die bekannte Szasz-Me- Beispiel 3 zubereiteten Reagenslösung (Farbkuppler)

thode. Der molare Extinktionskoeffizient des bei Ver- zugegeben. Hierauf wurde mindestens 15 Sekunden

wendung des Substrats und Farbkupplers gemäß der lang, jedoch nicht mehr als 10 Minuten lang, gewartet,

worauf die Reaktionslösung mit 5 ml der gemäß Beispiel 4 zubereiteten Reagenslösung versetzt wurde. Hierauf wurde das Absorptionsvermögen der Reakt;o islösung mit Hilfe eines handelsüblichen Spektralphotometers bei 570 nm ermittelt, wobei ein Wert von 1,033 abgelesen wurde. Dieser Wert wurde aus der Eichkurve entnommen und entspricht 0,177 Mikromolen an in Freiheit gesetztem p-Nitroanilin. Die Konzentration an y-Glutamyltranspeptidase in dem zu untersuchenden Blutserum errechnet sich nach folgender Gleichung:

IE = optische Dichte · 0,172,

IE = 1,033 · 0,172,

IE = 0,177 (bzw. 177 Millieinheiten pro ml).

ίο

0,1 ml Urin beschickt. Das Ganze wurde 10 Minuter lang bei einer Temperatur von 37"C inkubiert. Nach beendeter Inkubation wurde 1 ml der gemäß Beispie! 3 zubereiteten Reagenslösung (Farbkuppler) zugesetzt. Hierauf wurde mindestens 15 Sekunden, jedoch nicht mehr als 10 Minuten, lang gewartet, worauf 5 ml der gemäß Beispiel 4 zubereiteten Reagenslösung zugesetzt wurden. Nun wurde das Absorptionsvermögen der Reaktionslösung mit Hilfe

ίο eines handelsüblichen Spektralphotometers bei 570 nm bestimmt, wobei ein Wert von 0,200 abgelesen wurde. Dieser Wert wurde aus der Eichkurve entnommen und entspricht 0,034 Mikromolen an in Freiheit gesetztem p-Nitroanilin. Die Konzentration an y-Glut-

amyltranspeptidase in dem untersuchten Urin berechnet sich nach folgender Gleichung:

Beispiel 6
Bestimmung von y-GIutamyltranspeptidase in Urin

Ein Teströhrchen wurde mit 1 ml der gemäß Beispiel 2 zubereiteten Substratlösung und dann mit IE = optische Dichte · 0,172,

IE = 0,200 ■ 0,172,

IE = 0,034 (bzw. 34 Millieinheiten pro ml).

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Diagnosemittel zur Bestimmung der y-Glutamyltranspeptidasekonzentration in biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung eines Substrats in Form einer auf einen pH-Wert von etwa 7,9 bis etwa 8,4 gepufferten wäßrigen Substratlösung mit, jeweils bezogen auf 1 ml biologische Flüssigkeit, mindestens etwa 45 Mikromolen L-y-Glutamyl-p-nitroanilid und mindestens 400 Mikromolen Glycylglycin, von NaNO₂ und eines Farbkupplers, dadurch gekennzeichnet, daß das NaNO₂ in einer Menge, bezogen auf 1 ml biologische Flüssigkeit, von mindestens 36,2 Mikromolen im Substrat enthalten ist und daß der Farbkuppler aus einer auf einen pH-Wert von etwa 0,8 bis etwa 1,3 eingestellten wäßrigen Mineralsäurelösung mit, bezogen auf 1 ml biologische flüssigkeit, etwa 11,8 bis etwa 29,5 Mikromolen i-HydroxychinolinsuIfat und, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mineralsäurelösung, etwa 1 bis etwa 5 Volumprozent eines wasserlöslichen eicht ionischen Emulgators besteht.

2. Diagnosemittel nach Anspruch 1, dadurch «kennzeichnet, daß der Farbkuppler aus einer Mineralsäurelösung eines pH-Wertes von etwa 1,1 mit, bezogen auf 1 ml biologische Flüssigkeit, •twa 14,8 Mikromolen 8-Hydroxychinolinsulfat !besteht.

3. Diagnosemittel nach Anspruch 1 oder 2, «dadurch gekennzeichnet, daß der Farbkuppler bezogen auf das Gesamtvolumen der Mineralsäurelösung, etwa 1 Volumprozent äthoxylierten Tridecylalkohol als wasserlöslichen nicht ionischen Emulgator enthält.

4. Diagnosemittel nach einem der Ansprüche 1 tois 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbkuppler als Mineralsäure wäßrige Chlorwasserttoffsäure enthält.

5. Diagnosemittel zur Bestimmung der y-G!ut- *° •myltranspeptidasekonzentration in biologischen Flüssigkeiten unter Verwendung eines Substrats in Form einer mit Hilfe eines Tris-(hydroxymethyl)-•minomethanhydrochlorid-Puffersystems auf einen pH-Wert von etwa 8,2 gepufferten wäßrigen Sub-Stratlösung mit, jeweils bezogen auf 1 ml biologische Flüssigkeit, mindestens etwa 45 Mikromolen L-y-Glutamyl-p-nitroanilid, mindestens 400 Mikromolen Glycylglycin und etwa 100 Mikrotnolen Magnesiumchloridhexahydrat, von NaNO₂ Und eines Farbkupplers, dadurch gekennzeichnet, daß das NaNO₂ in einer Menge, bezogen auf 1 ml biologische Flüssigkeit, von etwa 72,4 Mikromolen im Substrat enthalten ist und daß der Farbkuppler Aus einer auf einen pH-Wert von etwa 1,1 einge- »teilten wäßrigen Mineralsäurelösung mit, belogen auf 1 ml biologische Flüssigkeit, etwa 1.4,8 Mikromolen 8-Hydroxychinolinsulfat und, bezogen auf das Gesamtvolumen der Mineralsäurelösung, etwa 1 Volumprozent eines äthoxy- ⁽⁾⁰ lierten Tridecylalkohois besteht.