DE2331550A1

DE2331550A1 - Festes proteinprodukt enthaltend fibrinogen

Info

Publication number: DE2331550A1
Application number: DE2331550A
Authority: DE
Inventors: John Cecil Charlton; David Lawrence Gravett
Original assignee: Radiochemical Centre Ltd
Current assignee: GE Healthcare Ltd
Priority date: 1972-06-22
Filing date: 1973-06-20
Publication date: 1974-01-17
Also published as: US3933996A; NL7308765A; GB1417003A

Description

UH. IN«. F. WCrwrrHOFF · MÜNC11KN ·« DK IVC I)TJKIlHKN'S »i.froif tiHtll) H:e» TRLRURAMUR t PATKK TAM W Λ LTI

1A-43 242

Beschreibung zu der Patentanmeldung

The Badiochemical Centre Limited, Amershan, Buckinghamshire, Großbritannien

betreffend: Festes Proteinprodukt enthaltend Fibrinogen

Die Erfindung betrifft Proteincubstanzen und besonders Fibrinogen· Fibrinogen ist eine von Natur aus instabile Substanz, die wesentlich instabiler ist als andere übliche Blutproteine. Das ist der Pail, weil das Molekül zu Polymerisationen neigt, wenn sie durch ein geeignetes Enzym (Thrombin) eingeleitet wird. Dadurch werden die Schutzgruppen von den Enden des Pibrinogenmoleküls entfernt, das dann unter Bildung fibrinhaltiger Klumpen polymerisieren kann. Das ist der grundlegende Mechanismus der

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BAD ORtQINAL

Blutgerinnung bei. einem Schnitt oder einer Verletzung der Oberfläche. Fibrinogen ist ,jedoch von Ng.tür aus instabil, selbst wenn Vorsichtsmaßnahmen getroffen worden sind, um Ensyiie wie Thrombin fernzuhalten. So heißt es in "Extra Pharmacopoeia": "Es ist ein weiOes Pulver odor ein krimc-liger Feststoff, der leicht löslich ist in Uasser unter liildiro^ einer farblosen Lösung, die bein »Stehen spontan Kluicpen bilden kann". Aiifgrund (Liur.or all£,crrein bekannten Inr.iabilität in v.;13riij;er Lösung wird Fibrinogen als k'c-irier&etrocknctoi· feststoff zur Vex'-Türrunp gestellt uud toirdtteJ. jyr vor der Verwendung in Y;asser gelöst. In "'.Dnθ "Eritisli .i'aai;;ocopocia^l: heiiit es z.B.: "Es kann aus Hastigen r-iöviccnlichcia Plasma hergestellt werden, durch Ausfällen iai i; or^ani.schc:.'! LooU.fAg5n5.tte3ii unter geregelten Lediu^rrr^ii von. pH-V/nri", lonenkonzeritration u'n.d 5?einp?i?atu.r m?.d Löten des iJ^acx— schisms in einer Lösung von liatriurachloi-rUl und iiatriur.-citrat und Trocknen m·=, gefxorcncr.i Zvr-,t.ar.ü."

Es ist sehr if-chwioric, Pibrincfven für tii Zweck ο (v;ie sie ϋ·ϊ>. in'¹ Ihe Br.lt ich Phamacopocla ' beschrieben sind) zu erkalten, das x-ein und stabil ist; aber diese Probler:ο wurden gelost und ein solches Produkt ist ein iiblicJi^.s Kandelsprodukt.

In den'letzten-Jahren vurdo vielfach ,jodiortes ('^5 j) menschliches Fibrinogen zur j^inguose von Throinben in dan tiefen Venen des Beins vcrv/enöl^t.

Fibrinogen als Produkt des menschlichen Blutes, das nicht wäruiebehandelt v/erden kann, zur Zerstörung von

Viren, birgt das "Risiko der Übertragung von Serum Hepatitis,

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BAD ORIGINAL

Wenn es therapeutisch verwendet wird, wird Fibrinogen im wesentlichen zur Lebensrettung verwendet und das gerinne Risiko von. Serum Hepatitis sehließt seine Verwcndxuig nicht aus. Wenn es als diagnostisches Kittel verwendet wird, v/o es nicht zur lebensrettung im strengen Sinne dient, muß dos Risiko von Serum Hepatitis auf die geringstjaöp;l.iche ilöhe vermindert v;erdon. In der Praxis bedeutet das, daß Fibrinogen für dio-mos; ti sehe Zwecke aus dem Plasiaa einer geringen Anzahl von Spend π·η hergestellt wird, die regelmäßig einem gründlichen klinischen ürtii^uo/riun^spro^raHia unterworfen verdon, um so v;oit wie iaö glich. «ichorKUstt -¹ lt?n, daß sie keine Serum Hepatitis übertragen. Dieses Plarraa wird speziell behandelt und in Geringem liaßstab hergestellt und besitzt aus Gründen, die nicht ii-caer klar find, nicht die Stabilität wie das iti Haiidol erbältliche.

Das jodierte ( "^ J) menschliche fibrinogen, v/ird auch als gcfricrgetroclaietei? Feststoff zur Verfügung gestellt imd * an Stabilität war ein Hauptproblem. Me<?er Kangel an Strbilitiit drückt sieh in erster Linie aus durch die Urwafidlung von wa^scrlöslichei/i Fibrinogen, in eine v/asserunlösliche Forn, veriautlich FibrinpolyjTicr. Während es möglich ißt, daß die Verfahren do3ⁿ Jo.iierung, lleinigung und Gefriertrocknung au einer weiteren Instabilität führt-.n, besteht trot«dtoi eine enge Beziehung zwischen der Stabilität des Endproduktes und der Art des Fibrinogens, das für die Joöierung verv:endet wird. Eine einzelne Charge Fibriiicgon v/ird für eine Anzahl von Präparaten des kodierten Produktes verwandt. Diese einzelnen Präparate aus einer einzelnen Charge Ausgangsmatorial zeigen alle eine ähnliche Stabilität. Einige Chargen von Ausgangsmaterial

der Mangel

— 4. _

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MWOmO CIAfI BADORiGtNAt

geben einheitlich stabiles kodiertes FibirLnogen, während andere Chargen einheitlich instabiles kodiertes Fibrinogen ergeben. Eine mögliche Erklärung scheint darin zu liegen, daß die Fibrinogenmoleküle bei einer bestimmten Stufe des Verfahrens, z.B. beim Sammeln oder Lagern dos Blutplasmas oder bei der Abtrennung des Fibrinogons von dem Plasma eine gewisse Zerstörung erlitten haben und daß diese zu einem von Natur aus instabilen Produkt; führt, während das angewandte chemische Verfahren nicht zwischen den /.erstörten und nicht zerstörten Ilolekülen unterscheidet (in dienern Zusammenhang nvuß daran t.x-innert werden, dciß Fibrinogen ein ungewöhnlich großes Molekül ist., HG 340 OOü), wobei eine Zerstörung d.er Enden des Holeküls dazu führt, daß sie leichter polymerisieren, wobei Fibriapolymor entsteht.

Es ist Aufgebe der vorliegenden Erfindupg, Mittel zu findeu, um die unerwünschte Zerstörung von Fibrinogen «u verringern oder zu vermeiden.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein festes Prodi?kt, umfassend Fibtanogen oder ein Derivat davon zusar/^i.:!! mit Albumin in einer Menge, die ausreicht, ua die unorwünsehte Zerstörung von Fibrinogen herabzusetzen oder zu vermeiden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des oben beschriebenen festen Produktes, das dadurch gekennzeichnet ist, daß men Wasaer von einer wäßrigen Lösung oder Suspension des Fibrinogens und Albumins entfernt«, Diese Entfernung kann günstig durch Gefriertrocknen erzielt werden. V/ahlweise ist es im Prinzip auch möglich, das

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BAD ORIGINAL

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Proteinge&isöh aus eiüer wäßrigen Losung oder Suspension mit Hilfeorganischer flüssigkeiten auszufällen.

Als Fibrinogen kann das Protein selbst oder ein Derivat davon, z.B. ein kodiertes derivat» besonders Jcdiertes ( ^J J) oder ( J) Fibrinogen verwandt werden. Wenn das Produkt zur Behandlung von Henschen verwendet werden soll, ist das Fibrinogen frblieiierweise menschliches .Fibrinogen« Die Art des Pibrinogonrr oder Deriva% ist erfindunssgesuß jedoch nicht kritisch.

Wenn das Produkt zur Behandlung von Menschen verv/endet werden soll, ist das Albumin üblicherweise

menschliches r>erutBalbuKiin, abor für andere Zwecke kann auch tierisches Albumin verwendet werden. Es ist zu bemerken, daß das Albumin nicht unbedingt rein sein muß. So ist es möglich_f wenn auch nicht bevorzugt, anstelle von roinem menschlichem Serujaalbuoin menschliches Plasjaa oder besonders gereinigte Praktionen Von menschlichen Serumproteinen, enthaltend und vorzugsweise reich an menschlichem Sexuaalbuaiin su verv;enden.

Es ist bekannt, Albuaain zu kodiertem oder anders markiertem Protein in Lösung zuzugeben, entweder um die Absorption des markierten Proteins an dsm Glas herabzusetzen oder um die radiolytieche Zersetzung durch Verdünnung des markierten Proteins herabzusetzen.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf keine dieser Wirkungen. Es ist in erster Linie Aufgabe der Erfindung, die unerwünschte Umwandlung von fibrinogen in die unlöslich© Form herabzusetzen öder au verhindern und nicht die Adsorption

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iMü£!flQ BAD ORIGINAL

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des Proteins an Glas herabzusetzen oder zu verhindern. Außerdem hängt die Wirkung, gegen die ein Schutz angestrebt wird, nicht mit der Strahlung oder radiolytischen Produkten des Fibrinogenmoleküls zusammen. Dieser letzte Punkt wird dadurch deutlich, daß es ßöglich ist, Chargen von markierten Fibrinogen herzustellen, die die gleichen spezifischen Aktivitäten besitzen, aber ungeheuer unterschiedliche Stabilität. Wenn man sich mit der Strahlung beschäftigt, wäre der Stabilitätsgrad sehr ähnlich. Die Schutswirkung auf Fibrinogen, die durch Verwendung von ßeruraalbumin nach der Erfindung erzielt wird, ist sehr groß und wie aus den Beispielen hervorgeht, kann sie ein Präparat zur Verwendung geeignet machen, das ohne diese Behandlung unter praktischen Beiständen nutzlos wäre. Die Stärke der Schu.tzwirkimg ist äußerst überraschend.

Es wunden gute Ergebnisse ersielt bei Verwendung von 20 Teilen Scruraalbumin pro Gew.-Teil Fibrinogen und es wird erwartet, daß mindestens ebenso gute Ergehnisse erhalten werden können bei Verwendung größerer Kengen von Albumin,·z.B. bis zu 1000 Gew.-Teilen Albumin pro Gew.—Teil Fibrinogen. Die Verwendung größerer Mengen von Albumin pro Gew.-Teil Fibrinogen kann besonders günstig sein, wenn es als wünschenswert erachtet wird, ein minimales Gev/icht an Albumin in einem Behälter aufrechtzuerhalten, selbst wenn das Gewicht des verwendeten Fibrinogens sehr viel geringer ist als das Gewicht von 1 mg, wie in den? folgenden Beispiel angegeben (wie es der Fall wäre z.B. um die Anwendung vom Fibrinogen wirtschaftlicher zu machen, wurde eine spezifische Aktivität von weit mehr als 200/uCi/mg Fibrinogen angewandt).

309883/1316 BAD

233IbSO

Versuche zeigen, daß die Anwendung von 10 Gew.-Teilen Albumin pro Gew.-Teil Fibrinogen zu ausgezeichneten Ergebnissen führt, während die Anwendung von 5 Gew.-Teilen Albumin zu Produkten führt, die eine geringere Stabilität besitzen, die jedoch immer noch wesentlich besser ist als diejenige die ohne Albumin erzielt werden kann. Es wird angenommen, daß mindestens 1 Gev;.-Teil Albumin pro Gew.-Teil Fibrinogen erforderlich ist, um eine wesentliche Verbesserung der Stabilität gegenüber nicht behandelten Fibrinogen zu ergeben.

Da angenommen wird, daß die durch die erfindungsgemäße Verwendung von Albumin erzielte Schutzwirkung keine radioiytisehe Wirkung ist, folgt daraus, daß die spezifische Aktivität des markierten Fibrinogens nicht kritisch ist. Z.B. kann jodiertes ( J) menschliches Fibrinogen hergestellt, werden reit einer spezifischen Aktivität bis zu 200yvCx/uQ Fibrinogen und darüber und Fibrinogen mit gar "keiner oder irgend einer Aktivität in diesem Ber.eicli kann erfindimgsgemäß geschützt i.-erden.

Die Menge an Fibrinogen in jeden Ansatz von festem Produkt* das geschützt wird, ist nicht kritisch. Jodiertes 0 J) menschliches Fibrinogen wird häufig in Mengen von 1 mg verkauft. Dxe Erfindung ist besonders anwendbar auf den Schutz solcher Mengen im Bereich von bis .zu 10 mg Fibrinogen. Sie ist jedoch auch auf größere Mengen Fibrinogen anwendbar.

Das erfindungsgemäße feste Produkt kann durch Gefriertrock-

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nen einer Lösung oder Suspension, z.B. einer wäßrigen Lösung oder Suspension von Fibrinogen und Albumin hergestellt werden. Der Peststoffgehalt dieser Lösung oder Suspension ist nicht kritisch. Das Albumin und das .Fibrinogen können zu der Flüssigkeit, z.B. Wasser zusammen odei"· in beliebiger Reihenfolge gegeben werden. Die Lösung oder Suspension kann in einer V/ei so. wie sie zum Gefriertrocknen von Fibrinogen üblich ist, gefriergetrocknet v/erden.

Die folgenden experimentellen Daten erläutern die Erfindung.

• 125 -kodierte Nach der Jodierung besitzt das C J) menschliche

Fibrinogen eine spezifische Aktivität von 100 bis 200/uCi/mg Fibrinogen und wird in einer Konzentration von ungefähr 1 mg cm in wäßriger Lösung, enthaltend 0,75 Natriurncitrat und 0,65 % natriumchlorid gelöst. 1,1 cm-* Anteile dieser Lösung werden in Flaschen gegeben und gefriergetrocknet. Bei den Versuchen, bei denen die Wirkung von Albumin untersucht wird, wird menschliches Albumin in einer Konzentration von ungefähr 20 mg pro cur vor dem Gefriertrocknen zugegeben. Die Gefäße v/erden bei der angegebenen Temperatur die angegebene Zeit ge-

■5

lagert und dann wird 1,1 cur Wasser zugegeben und bei Raumtemperatur 10 Hinuten leicht geschüttelt. Das lösliche, radioaktive Material wird entfernt und die zurückgewinnbare Radioaktivität bestimmt. Diese Zurückgewinnung von löslichem radioaktivem Material, angegeben als Prozentsatz, wird bezeichnet als "R". Sie besteht aus kodiertem ( J) menschlichem Fibrinogen plus verschiedenen ( J)

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markierten Verunreinigungen, wie kodierten Proteinen außer Fibrinogen, 4°äiorten/ Fibrinogen, das so denaturiert ißt, daß es mit Thrombin nicht mehr gerinnt und dem JodiMnn ( ^ J). Zu dem löslichen Material wird Rinderthrombin in Gegenwart von menschlichem Plasma gegeben, der Klumpen abgetrennt und die Menge an Radioaktivität bestimmt. Der Prozentsatz an gerinnfähigem Fibrinogen in der löslichen Fraktion wird als C bezeichnet. Es ist festzustellen, daß, da die Bildung von unlöslichem Material bei der Lagerung auf der Polymerisation von kodiertem (^ J) menschlichem Fibrinogen beruht, die Menge an löslichem Fibrinogen abnimmt, während die Menge an nicht gerinnbaren Verunreinigungen konstant bleibt. Das bedeutet, daß mit einer Abnahme von H O ebenfalls abnehmen muß. Im Prinzip kann C schneller abnehmen als nach der oben angegebenen !Theorie, da andere Denaturierungsverfahren, die zu löslichem aber nicht gerinnungsfähigem Fibrinogen führen, eintreten können. Die diagnostische Anwendung des Materials hängt in erßtor Mnio von der Menge an löblichem gerinnungsfähigem kodiertem (~*^ J) menschlichem Fibrinogen in dem Gefäß ab, d.h. von dem mathematischen Produkt R-C*

Bei spiel.. 1

Die Ergebnisse einer typischen Produktionscharge von Qodiertem («*·-* J) menschlichem Fibrinogen mit und ohne Zusatz von menschlichem Albumin, die bei 31°0 gelagert wurden, sind folgende:-Wenn ein Bereich angegeben, beziehen sich die Messungen auf mindestens 3 Ampullen.

- 10 -

3Q9883/t3t6

bad οβιθϊηαι.'

- ίο -

Tage	kein Albumin	84	C	Albumin	(20 lnr/cnr )	91
	R	76	- 91	R	G	91
O	92 -	57	- 80			86
3	33 -		- 63
5	9 -			95 -	90 -
9				72 -	88 -
14

. 94
■ 34
■ 13	- 97
	- 95
	87

Beispiel 2

Die Ergebnisse eines Materials, das hergestellt worden icb aus einer Charge Fibrinogen, von der bekannt ist, daß sie ein sehr instabiles Produkt ergibt, νηά gelagert worden sind bei + 2⁰C (die empfohlene Lagerungsteuperatur) und "bei 31°C sind die folgend on:

Bei 2°C	Ta_Ke	kein Albir	'α in	C	- 79	Albumin	(20	C	On⁵)
	R	60	-37	R		94
4	8 -	20	—	93 -		91
15	0 -			96		91
29	0 -			88 -			- 92

	- 20		- 95
- 13
■ 10	- 91

- 11 -

309883/1316 OBiGlNAL INSPECTED

2 3 3 Ί 5 5 U

Bei 31°C:

Tage kein Albumin Albumin (20 ing/cnr)

RCEO

4 0-18 13-60 5^-59 93

4-9 0 - 40 11 -28 70 29 0 - 8 - 16 40

Die Ergebnisse eines Haterials, das hergestellt worden ist von einer anderen Charge Qodiertom ( ^ J) Fibrinogen, von den bekannt wa:e, daß es ein sehr instabiles Produkt ergibt und das stabilisiert worden v/ar mit 20, 10 und 5 rag Albumin pro mg Fibrinogen und bei -20,·*- 2 und + 31 °C bis zu 63 Tagen gelagert worden war» sind in der folgenden Tabelle angegeben. Daraus ist leicht zu ersehen, daß die Verwendung von so wenig wie 5 mg Albumin pro iag Fibrinogen zu einer deutlichen Verbesserung der Stabilität führt.

Instabile Chargen von Fibrinogen wurden für die Beispiele 2 und 3 verwendet, da die Stabilisierungswirkung von Albumin leichter mit solchen Chargen in kürzerer Zeit ge-

- 12 -

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BAD ORIGINAL

/_ J O ") J

- 12 -

zeigt werden kann. Die Stabilisierungswirkung von Albumin vmrde gleichermaßen an stabileren Chargen von Fibrinogen untersucht. Offensichtlich ist es bei üblichen Verfahren günstig, von verhältnismäßig stabile).! Chargen von Fibrinogen auszugehen. Die Verwendung von Albumin nach der Erfindung führt zu festen Produkten, enthaltend Fibrinogen oder ein Derivat, z.B. ein kodiertes ( J) oder ( ^J J) Derivat davon, wobei das Verhältnis

lösliches gerinnbares'ilbrinogen, des vorhanden ist

löclichofj gerinnbares .fibrinogen, das ursprünglich vorhanden war

größer als 0,5 während e inn on at jger Lagerung bei 2 C bleibt. Wenn die Ausg.sngßchar^e von Fibrinogen ausreichend stabil ist, bleibt: günstiger tt'eifje dd eses Verhältnis oberhalb von 0,8 während 2monatigc--r Lagerung bei 2^OC»

Tabelle

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0RK3INAL INSPECTED

Tabelle

<£>
00
00

U)

c+
(D

3
Q)

ο
sr

(D

Stabilisiert
mg/cnK
HSA

Stabilisiert

mg/cm
HSA

Stabilisiert

mg/cm
HSA

Vergleich

nicht stabilisiert

Lagerantjs-

C.

26

55

63

11

11 26 52

65

26

55

65

26

:5

55

— £.0

+51

-20

+2

+51

97.3

95,5 95^ U]'- 94;2

9l\i ΐΐΐ

96,4 9ί«

95,1 S5i

96,7 £8,

Γ·?,2 o-fl 7Κ,3 94,1.

70. ί

40,3 81,4

29,7 76,1

95,1 92,3

91,9 91

85,2

S5,7 65,S

94,9 95,6 94,7 94,2 92,5 91»6

91,2 76

92,0 =3,9 91,0 έ?,5

79,3 32,2. j 70;2 75,5

96,7

95^3

5,5 96,6

96.0

97,1 97,5 9? . =6.2

•9V ,94,4

95,3

97,4 95,4 97 95,9

87,5 65,5

79,5 72.0

50,5 55,0

55,8 54,9

32.3 λ:,2

92»8 54.6 95,5 55,9 91,8. 92,1

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Claims

IUt. IXi.. K. W ti S ΤΙ1.ΜΓ uif.::.. ri-:t'irv.-v.\\\ du. f.\<;. n. i5Ki!in-:-\'s ΤΙ.Ι.ΙΛ > Vl <!.U ijiim.. i.\c;. i;.(;oi;iv,ι·ΛΤi:.vr.\.vv. Λ ι.-π: rt.i.Kiiit ^ -tMi::15501A-43242233 Patentansprüche

1. Festes Proteinprodukt enthaltend Fibrinogen oder ein Derivat davon, dedurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich Albumin enthält.

2. Produkt nacli^Anspruch 1, dadurch g e k e η η ζ e i c h η e t,

daß das F:

vorliegt.

,pgen ,125

daß das Fibrin/in Form seines joiiex'ten ( J) Derivats

3. Produkt nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fibrin/issiiijchliches Fibrinogen und das Albumin Huinan-Scium-Albur.in ist.

4. Produkt nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens 1 vorzugsweise-/^' Gewichtsteile Albumin pro Gov/.-Teil Fibronogen enthält.

5. Verfahren zur Herstellung des Produktes nach Anspruch

1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man von einer wässrigen Lösung oder Suspension von Fibrinogen enthaltend Albumin das Wasser entfernt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das ¥asser durch Gefriertrocknen entfernt.

62V

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