DE2304830C3

DE2304830C3 -

Info

Publication number: DE2304830C3
Application number: DE19732304830
Authority: DE
Filing date: 1973-02-01
Publication date: 1976-01-29

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Fraktionieren von Flüssigkeitssäulen mit unterschiedlicher Dichte nach der Zentrifugation lind eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens mit einer Halterung für ein eine zentrifugierte Flüssigkeit enthaltendes Proberöhrchen und einem über dem Proberöhrchen angeordneten Trichterrohr mit daran anschließbarer Abführleitung, die zu einem Fraktionssammler führt.

Instrumente zur Fraktionierung von Flüssigkeitssäulen unterschiedlicher Dichte, wobei an unterster Stelle im Proberöhrchen die dichteste Schicht eingefüllt ist und danach weitere Flüssigkeit in der Reihenfolge abnehmender Dichte übereinandergeschichtet ist, sollen ein möglichst hohes Auflösungsvermögen (der geringste Abstand, den zwei Makromoleküle enthaltende Schichten im Zentrifugenröhrchen haben dürfen, um noch eetrennt voneinander fraktioniert werden zu können) besitzen. Die leistungsfähigsten unter den bekannten instrumenten sind einem speziellen Spektralphotometer angepaßt worden und erlauben lediglich eine genaue optische Ausmessung der einzelnen Fraktionen. Die eigentliche Fraktionierung im Sinne der obenerwähnten Definition, die Aufteilung der Flüssigkeitssäule mit unterschiedlicher Diciite in viele, voneinander getrennte Fraktionen, ist zwar mit diesen Geraten ebenfalls möglich, doch sinkt dann ihr Auflösungsvermögen ab. .-IJ , · .

Die hierbei erzielten Ergebnisse sind dann vergleichbar mit bekannten und im Handel befindlichen Fraktionierungsgeräten, die meist infolge von im Gerät oder in anschließenden Leitungen auftretenden Turbulenzen geringer auflösen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben und eine Vorrichtung zu schaffen, die eine Fraktionierung von in einem Zentrifugenröhrchen sehr dicht beieinanderliegenden Schichten, die Makromoleküle enthalten, gestattet und über ein hohes Auflösungsvermögen verfügt.

Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch, daß die Fraktionen aus einem Proberöhrchen in ein Trichterrohr gefördert und diesem diskontinuierlich durch Absaugung bei Aufwärtsbewegung der Flüssigkeitssäule in der Reihenfolge ihrer Dichte entnommen werden und daß die erzeugten Fraktionen durch ein Luftpolster voneinander getrennt einem oder mehreren Sammelgefäßen zugeführt werden. Die Vorrichtung ist erfindurigsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß in dem Trichterrohr eine Hohlnadel verschiebbar angeordnet ist, die im Bereich ihrer dem Proberöhrchen zugekehrten Mündung radiale, auf ihrem Umfang mit Abstand voneinander angeordnete Kanäle aufweist und mit einer Pumpe zum Absaugen der einzelnen Fraktionen verbunden ist.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind den Unteransprüchen zu entnehmen.

Das ertindungsgemäße Gerät gestattet eine vollständige Trennung verschiedener, Makromoleküle enthaltender Schichten (z. B. Nukleinsäuren), welche nur um etwa 1 mm voneinander getrennt sind. Das durch Zentrifugieren erreichte Auflösungsvermögen wird bei der Fraktionierung der Flüssigkeitssäule mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung praktisch nicht vermindert. Da die Fraktionen durch Luftsegmente voneinander getrennt sind, ist keine gegenseitige Vermischung mehr möglich, selbst wenn sie über längere Distanzen und durch verschiedene Analysengeräte, wie z. B. Spektralphotometer, geleitet werden. In bekannten Fraktioniergeräten wird eine solche zusätzliche Vermischung nicht vermieden, wenn die Fraktionen über längere Strecker; und durch Analysengeräte geführt werden soll. Das Gerät kann Zentrifugenproberöhrchen von verschiedener Größe, von 2 bis 50 mi inhalt, aufnehmen.

Durch die Erfindung werden folgende Vorteile erzielt:

Die nach Ultrazentrifugation entstandenen, Makromoleküle enthaltenden Schichten der Flüssigkeitssäule werden während des Fraktionierens — also bei der Isolierung derselben — nicht wieder vermischt. In der Praxis sind Schichten, die etwa 1 mm voneinander entfernt sind, noch vollständig voneinander getrennt worden. Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist für die Fraktionierung aller zentrifugierten Flüssigkeitssäulen (im biochemischen Labor meistens Cäsiumsalz-Saccharoseoder Eiweißlösungen) verwendbar, sie ist ferner an ver-

hiedene Analysengeräte, wie Spektralphotomeier, ^x _{r qua}ntitativen Erfassung des Gehaltes der Makro-^Z leküle in den Schichten anschließbar. Während des Fraktionierens werden Scherkräfte vermieden oder klein gehalten, so daß keine durch diese Kräfte verurhte Zerstörung der Makrc molckülc eintritt. Diese !? rderung muß erfüllt sein, wenn die Fraktionen z. B. . £|_ekt_ronenmikroskop untersucht werden sollen. Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist leicht zu bedieen bequem auseinanderzunehmen und kann leicht geⁿ Wt werden. Zentrifugenröhrchen verschiedener Tröße können verwendet werden. Die zum Bau der Vorrichtung verwendeten Werkstoffe sind chemisch in-

In den Zeichnungen ist ein Ausführungsbeispiel der Erfindung rein schematisch dargestellt. Es zeigt

Fig. 1 eine Seitenansicht des Gerätes in einem Schnitt entlang der Längsachse,

F i g. 2 das Gerät in Vorderansicht,

Fig.3a die Hohlnadel des Gerätes stark vergrößert •m Längsschnitt,

Fig.3b die Hohlnadel des Gerätes stark vergrößert _m Unteransicht,

F i g. 4 den Trichter des Gerätes und

F i g. 5 ein Zenirifugenröhrchen, passend in das Ge-

Wie der F i g. 1 zu entnehmen, besteht das Gera; aus Hohlnadelhalter 3, der entlang der Führungsi 1 mittels eines Schneckenantriebs 8 und einer „uJ 2 bewegt werden kann. Die Vorrichtung weist eirierTweiteren Halter 7 für die Halterung eines Trichters auf. An einem dritten Halter 13 ist mittels Schraube 14 der die Proberöhrchen aufnehmende Teller befestigt. Da eine Feder 16 das Proberöhrchen 24 wasserdicht in den im Trichterhalter 7 befindlichen Trichter hineinpreßt, ist keine weitere Dichtung erforderlich gelagert.

Die Vorrichtung besteht, mit Ausnahme des I ellers 15 aus Plexiglas und des Trichters 22 aus Glas, aus Metallteilen. Die Größe des Trichters hängt von der oroße des Proberöhrchens 24 ab. Jedoch soll dit Konizitat des Trichterkopfes nicht zu groß sein, um die laminare Strömung nicht zu stören. Um z. B. 5-ml-Zentrifugenröhrchen zu fraktionieren, ist eine Neigung von etwa 70' zur Horizontalen für brauchbar gefunden worden, ίο Der Durchmesser des Trichterrohres 22 ist sehr wichtig, denn je kleiner der Querschnitt, um so breiter sind die Räume zwischen zwei Schichten, die voneinander zu trennen sind; man muß sich jedoch vor Augen halten, daß die Schichten in sehr engen Trichtern infolge Kapillarkräften aufwärts entlang der Trichterrohrwanduna gezogen werden können und so eine Vermischung zustande kommt Des weiteren können Turbulenzen auftreten, wenn der Übergang zwischen Kopl und Rohrabschnitt des Trichters zu abrupt ist. Aus d.esen Gründen muß ein Kompromiß gefunden werden. In einem Trichterrohr 22 von beispielsweise d mm Querschnitt und 50 mm Länge können Schichten, die in einem 5-ml-Proberöhrchen 1 mm voneinander entlernt liegen wieder auf b mm Entfernung voneinander gebracht werden, wobei keine erkennbare gegenseitige Vermischung infolge von Kapillarkräften auftritt.

Zur Fraktionierung der in dem zentrifugierte!! I roberöhrchen enthaltenen Flüssigkeitssäule nut unieischiedlichcr Dichte wird eine Flüssigkeit, welche dichter ist als die Schicht mit der größten Dichte, durch eine in den Boden des Proberöhrchens eingesehene Hohlnadel mit Hilfe einer Infusionspumpe: emgeb.i.ü" {z B für Cäsiumsalz-Gradienten 1,1.2.2-1 etrabmm äthan) Um das Eindringen von Luftblasen, die die cm-/einen Fraktionen vermischen würden, zu vermeiden, werden sowohl die von der Infusionspumpe zur Hohl-■ - · iU :uirh die Nadel

de halter 3 mittels einer Schraube 5 befestigt; sie läßt

rungssiangeii ι umvgi, ^.^ *.„. _t

mittels Gewinde 20 eingeschraubt sind. Der Halter für den Trichter 22, welcher mitte's eines Gummiringes 23 in dem Halter eingepaßt wird, kann entlang der Fiihrungsstangen 1 bewegt werden, wenn die Schrauben gelöst wurden.

Der Halter 3 für die Hohlnadel 21 wird entlang der Führungsstangen 1 mittels des Schneckenantriebs 8 zwecks Einstellung der Hohlnadel durch einen Einstellknopf U, der auf der Spindel 8 sitzt, bewegt. Der Antrieb selbst wird in seiner Lage durch eine Feststellschraube 10 festgehalten, während die Feineinstellung durch die Spindel 2 erfolgt. Wenn sich der Proberöhrchenhalter 13 von seiner niedergehaltenen Stellung (zur Aufnahme des Proberöhrchens) bei voll nach unten bewegter Spindel infolge der Kraft der Feder versentlich aufwärts bewegen sollte, so halten zwei Abstandshalter 12 einen Mindestabstand zwischen uem Proberöhrchenhalter 13 und dem Halter 7 für den Trichter 22. Diese Abstandshalter verhindern einen Bruch der Schrauben 18 des Ziehringes 17. Der Trichterhalter 7 wird seinerseits mittels der Druckfedern 6, welche die Führungsstangen 1 umgeben, auf Abstand von dem Halter 3 für die Hohlnadel 21 gehalten. Die Spindel 2 ist mittels einer ringumlaufenden Nut und eines in diese eingreifenden Stiftes 4 im Halter

eines 5-mi-urauieincn uam.11 .„

Stunde lassen sich bequem 3 Proberöhrchen. inklusive Reinigung des Gerätes, fraktionieren. Die die Fraktionen entnehmende Hohlnadel ist mit einer peristaltischen Pumpe verbunden, die die Fraktionen abpumpt.

Es gibt zwei Verfahren, um die Flüssigkeitssäule mit unterschiedlicher Dichte, die in das Trichterrohr 22 hineingepumpt wurde, zu fraktionieren:

Beispiel 1

Die Hohlnadel wird zunächst auf ein bestimmtes Niveau im Trichterrohr eingestellt und wird auf diesem Niveau während der Fraktionierung gehalten. Wenn die peristaltische Pumpe das gleiche Flüssigkeitsvolumen abpumpt, welches mit der Infusionspumpe eingedrückt wird, ergibt sich eine kontinuierliche Entleerung des Proberöhrchens. Die Fraktionen werden am Ende der Leitung der peristaltischen Pumpe getrennt. Diese Art der Fraktionierung gleicht jenen, die auch mit herkömmlichen Geräten möglich sind. Beispiel 2

Die Flüssigkeitssäule mit unterschiedlicher Dichte wird fraktioniert, indem man die oberste Flüssigkeits-

schicht im Trichter diskontinuierlich entfernt, ohne sie mit den nachfolgenden Schichten zu vermischen. Die Hohlnadel bleibt während der Fraktionierung nicht fixiert. Sie wird miltels der Spindel derart in Kontakt mit der Oberfläche der Flüssigkeitssäule gebracht, daß nur die oberste Schicht abgesaugt wird. Nach einer bestimmten Zeitdauer, die dem Fraktionsvolumen entspricht (= Volumen eines fraktionierten Einzelvolumens), wird die Hohlnadel von der Oberfläche abgehoben und Luft in die Hohlnadel eingesaugt. Nach einem kurzen Zeilintervall wird die Hohlnadel wieder auf die Oberfläche aufgesetzt. Während der Fraktionierung wird die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe konstant gehalten. Die Infusionspumpe pumpt die Flüssigkeit mit einer solchen Geschwindigkeit aufwärts, daß ihre Oberfläche im Trichter in den Intervallen, in denen Luft durch die Hohlnadel angesaugt wird, das Ursprungsniveau erreicht. Durch diese Methode werden Fraktionen erzielt, die durch einen Luflzwischenraum vollkommen voneinander getrennt sind. Eine Vermischung wird selbst dann vermieden, wenn die Fraktionen über lange Entfernungen und/oder durch Spektralphotometer geführt werden. Wegen der kurzen Zeitintervalle können die Zeitsignale für das Absenken und Abheben der Hohlnadel in einem herkömmlichen Tonbandgerät vorteilhaft gespeichert werden, das zu Beginn der Fraktionierung eingeschaltet wird. Aul diese Weise ist eine einzige Person in der Lage, die Fraktionierung durchzuführen; auf die AbIesung von Zcitintervallcn an Uhren kann somit verzichtet werden. Ein elektrisch gesteuerter Antrieb, der die Hohlnadel automatisch nach frei wählbaren Zcitintervallen senkt und hebt, kann an das Gerät mittels Kupplung angeschlossen werden.

ίο Das Gerät hat sich in der Praxis gut bewährt. So wurden mit ihm Proben von 5 bis einschließlich 30 ml fraktioniert. Für 30-ml-Röhrchen wird ein größerer Trichter benötigt.

Zum Herstellen einer Flüssigkeitssäule mit untcrschiedlicher Dichte kann auch wie folgt verfahren werden:

Die Flüssigkeit wird von oben durch die Hohlnadel in das Proberöhrchen eingefüllt derart, daß an unterster Stelle im Proberöhrchen die dichteste Schicht eingefüllt wird, und danach weitere Flüssigkeiten in der Reihenfolge abnehmender Dichte übereinandergeschichtel werden, wobei die Hohlnadel der Einfüllgeschwindigkcit entsprechend angehoben wird. Bei diesem Füllvoigang ist die Hohlnadel an eine geeignete Pumpe angcschlossen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Fraktionieren von Flüssigkeitssäulen mit unterschiedlicher Dichte nach der Zentri- fugation, dadurch gekennzeichnet, daß die Fraktionen aus einem Proberöhrchen (24) in ein Trichterrohr (22) gefördert und diesem diskontinuierlich durch Absaugung bei Aufwärtsbewegung der Flüssigkeitssäule in der Reihenfolge ihrer Dichte entnommen werden und daß die erzeugten Fraktionen durch ein Luftpolster voneinander getrennt einem oder mehreren Sammelgefäßen zugeführt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine dichtere Flüssigkeit aus einem Meßbehälter von unten in das Proberöhrchen (24) eingefüllt wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei Flüssigkeiten, die nach der Zentrifugation eine bekannte Dichteverteilung aufweisen, ein Steuergerät selbsttätig die für das Fraktionieren erforderlichen Verfahrensschritte Absenken und Heben der Hohlnadel (21) innerhalb des Trichterrohres (22) so durchführt, daß diese stets mit dem Flüssigkeilsspiegel in Kontakt steht.

4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Absauggeschwindigkeit im Verlauf der Fraktionierung zunimmt.

5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Halterung für ein eine zentrifugierte Flüssigkeit enthaltendes Proberöhrchen, einem über dem Proberöhrchen angeordneten Trichterrohr mit daran anschließbarer Abführleitung, die zu einem Fraktionssammler führt, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Trichterrohr (22) eine Hohlnadel (21) verschiebbar angeordnet ist, die im Bereich ihrer dem Proberöhrchen (24) zugekehrten Mündung radiale, auf ihrem Umfang mit Abstand voneinander angeordnete Kanäle aufweist und mit einer Pumpe zum Absaugen der einzelnen Fraktionen verbunden ist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Absaugung der Fraktionen eine peristaltische Pumpe vorgesehen ist.