DE2304830B2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Fraktionieren von Flüssigkeitssäulen mit unterschiedlicher Dichte nach der Zentrifugalion und eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens mit einer Halterung für ein eine zentrifugierte Flüssigkeit enthaltendes Proberöhrchen und einem über dem Proberöhrchen angeordneten Trichterrohr mit daran anschließbarer Abführleitung, die zu einem Fraktionssammler führt.

Instrumente zur Fraktionierung von Flüssigkeitssäulen unterschiedlicher Dichte, wobei an unterster Stelle im Proberöhrchen die dichteste Schicht eingefüllt ist und danach weitere Flüssigkeit in der Reihenfolge abnehmender Dichte übereinanJergeschichtet ist, sollen ein möglichst hohes Auflösungsvermögen(der geringste Abstand, den zwei Makromoleküle enthaltende Schichten im 7eni.rifngenrr>hrchen haben dürfen, um noch getrennt voneinander fraktioniert werden zu können) besitzen. Die leistungsfähigsten unter den bekannten Instrumenten sind einem speziellen Spektralphoiomeier angepaßt worden und erlauben lediglich eine genaue optische Ausmessung der einzelnen Fraktionen. Die eigentliche Fraktionierung im Sinne der obenerwähnten Definition, die Aufteilung der Flüssigkeitssäule mit unterschiedlicher Dichte in viele, voneinander getrennte Fraktionen, ist zwäi mil uWn Geräien ebenfalls möglich, doch sinkt dann ihr Auflösungsvermögen ab. ,.-Jj 1 · .

rj;_c u;~-u<,; erzielter F^rgebnisse sind dann vergleichbar mit bekannten und irn Handel befindlichen Fraktionierungsgeräten, die meist infolge von im Gerät oder in anschließenden Leitungen auftretenden Turbulenzen geringer auflösen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es. ein Verfahren anzugeben und eine Vorrichtung zu schaffen, die eine Fraktionierung von in einem Zentrifugenröhrchen sehr dicht beieinanderliegenden Schichten, die Makromoleküle enthalten, gestattet und über ein hohes Auflösungsvermögen verfügt.

Gelöst wird diese Aufgabe erfmdungsgemaß dadurch, daß die Fraktionen aus einem Proberöhrchen in ein Trichterrohr gefördert und diesem diskontinuierlich durch Absaugung bei Aufwärtsbewegung der Flüssigkeitssäule in der Reihenfolge ihrer Dichte entnommen werden und daß die erzeugten Fraktionen durch ein Luftpolster voneinander getrennt einem oder mehreren Sammelgefäßen zugeführt werden. Die Vorrichtung ist erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, daß in dem Trichterrohr eine Hohlnadel verschiebbar angeordnet ist, die im Bereich ihr^ dem Proberöhrchen zugekehrten Mündung radiale, auf ihrem Umfang mit Abstand voneinander angeordnete Kanäle aufweist und mit einer Pumpe zum Absaugen der ein/einen Fraktionen verbunden ist.

Weitere Ausgestaltungen der Erfindung sind den Unteransprüchen zu entnehmen.

Das erfindungsgemäße Gerät gestattet eine vollständige Trennung verschiedener, Makromoleküle enthaltender Schichten (z. B. Nukleinsäuren), welche nur um etwa 1 mm voneinander gelrennt sind. Das durch Zentrifugieren erreichte Auflösungsvermögen wird bei der Fraktionierung der Flüssigkeitssäule mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung praktisch nicht vermindert. Da die Fraktionen durch Luftsegmente voneinander getrennt sind, ist keine gegenseitige Vermischung mehr möglich, selbst wenn sie über längere Distanzen und durch verschiedene Analysengeräte, wie z. B. Spektralphotometer, geleitet werden. In bekannten Fraktioniergeräten wird eine solche zusätzliche Vermischung nicht vermieden, wenn die Fraktionen über längere Strecken und durch Analysengeräte geführt werden soll. Das Gerät kann Zentrifugenproberöhrchen von verschiedener Größe, von 2 bis 50 ml Inhalt, aufnehmen.

Durch die Erfindung werden folgende Vorteile erzielt:

Die nach Ultrazentrifugation entstandenen, Makromoleküle enthaltenden Schichten der Flüssigkeitssäule werden während des Fraktionierens — also bei der Isolierung derselben — nicht wieder vermischt. In der Praxis sind Schichten, die etwa 1 mm voneinander entfernt sind, noch vollständig voneinander getrennt worden. Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist für die Fraktionierung aller zentrifugierte!! Flüssigkeitssäulen (im biochemischen Labor meistens Cäsiumsalz-Saccharose- oder Eiweißiösungen) verwendbar, sie ist ferneren ver-

schiecene Analysengeräte, wie Spektnilphotometer, L₁,. quantitativen Erfassung des Gehaltes der Makromoleküle in den Schichten anschließbar. Während des fraktionierens werden Scherkräfte vermieden oder Wein gehalten, so daß keine durch diese Kräfte verursachte Zerstörung der Makromoleküle eintritt. Diese Forderung muß erfüllt sein, wenn die Fraktionen z. B. im Hekironeiiiüikröskup ünieriuchi werden sollen. Die Vorrichtung gemäß der Erfindung ist leicht zu bedienen bequem auseinanderzunehmen und kann leicht gereinigt werden. Zentrifugenröhrchen \erschiedener Größe können verwendet werden. Die zum Bau der Vorrichtung ■> erwendeten Werkstoffe sind chemisch inert.

In den Zeichnungen ist ein Ausführungsbeispiel der Erfindung rein schematisch dargestellt. Es zeigt

pig. 1 eine Seitenansicht des Gerätes in einem Schnitt entlang der Längsachse,
F i g. 2 das Gerät in Vorderansicht, pig.3a die Hohlnadel des Gerätes stark vergrößert im Längsschnitt,

pig. 3b die Hohlnadel des Gerätes stark vergrößert in Unteransicht,

F i g. 4 den Trichter des Gerätes und F i g. 5 ein Zentrifugenröhrchen, passend in das Gerät.

Wie der F i g. 1 zu entnehmen, besteht das Gerät aus einem Hohlnadelhalter 3, der entlang der Führungsstangen 1 mittels eines Schneckenantriebs 8 und einer Spindel 2 bewegt werden kann. Die Vorrichtung weist einen weiteren Halter 7 für die Halterung eines Trichters auf. An einem dritten Halter 13 ist mittels Schraube 14 der die Proberöhrchen aufnehmende Teller 15 befestigt. Da eine Feder 16 das Proberöhrchen 24 wasserdicht in den im Trichterhalter 7 befindlichen Trichter hineinpreßt, ist keine weitere Dichtung erforderlich. Die Hohlnadel 21, welche die Flüssigkeitsfraktionen mit unterschiedlichen Dichten entnimmt, ist im Hohlnadelhalter 3 mittels einer Schraube 5 befestigt; sie läßt sich variabel in gewünschter Höhe einstellen. Der das Proberöhrchen 24 tragende Proberöhrchenhalter 13 wird mittels eines Ziehringes 17 entlang zweier Führungsstangen 1 bewegt, die auf einer Grundplatte 19 mittels Gewinde 20 eingeschraubt sind. Der Halter 7 für den Trichter 22, welcher mittels eines Gummiringes 23 in dem Halter eingepaßt wird, kann entlang der Führungsstangen 1 bewegt werden, wenn die Schrauben gelöst wurden.

Der Halter 3 für die Hohlnadel 21 wird entlang der Führungsstangen 1 mittels des Schneckenantriebs zwecks Einstellung der Hohlnadel durch einen Einstellknopf U. der auf der Spindel 8 sitzt, bewegt. Der Antrieb selbst wird in seiner Lage durch eine Feststellschraube 10 festgehalten, während die Feineinstellung durch die Spindel 2 erfolgt. Wenn sich der Proberöhrchenhalter 13 von seiner niedergehaltenen Stellung (zur Aufnahme des Proberöhrchen?) bei voll nach unten bewegter Spindel infolge der Kraft der Feder versentlich aufwärts bewegen sollte, so halten zwei Abstandshalter 12 einen Mindestabstand zwischen dem Proberöhrchenhalter 13 und dem Halter 7 für den Trichter 22. Diese Abstandshalter verhindern einen Bruch der Schrauben 18 des Ziehringes 17. Der Trichterhalter 7 wird seinerseits mittels der Druckfedern 6, welche die Führungsstangen 1 umgeben, auf Abstand von dem Halter 3 für die Hohlnadel 21 gehalten. Die .Spindel 2 ist mittels einer ringumlaufenden Nut und eines'in diese eingreifenden Stiftes 4 im Halter gelagert.

Die Vorrichtung besteht, mit Ausnahme des Tellers 15 aus Plexiglas und des Trichters 22 aus Glas, aus Metallteilen. Die Größe des Trichters hängt von der Größe des Proberöhrchens 24 ab. Jedoch soll die Konizität des Trichterkopfes nicht zu groß sein, um die laminare Strömung nicht zu stören.-LJm z. B.*5-ml-ZentrifugenröhVchen zu fraktionieren, ist eine Neigung von etwa 70° zur Horizontalen für brauchbar gefunden werden, ίο Der Durchmesser des Trichterrohres 22 ist sehr wichtig, denn je kleiner der Querschnitt, um so breiter sind die Räume zwischen zwei Schichten, die voneinander zu trennen sind; man muß sich jedoch vor Augen halten, daß die Schichten in sehr erigen Trichtern infolge Kapillarkräften aufwärts entlang de^r Trichterrohrwandung gezogen werden können und so eine Vermischung zustande kommt. Des weiteren können Turbulenzen auftreten, wenn der Übergang zwischen Kopf und Rohrabschnitt des Trichters zu abrupt ist. Aus diesen Gründen muß ein Kompromiß gefunden werden. In einem Trichterrohr 22 von beispielsweise 5 mm Querschnitt und 50 mm Länge können Schichten, die in einem 5-ml-Proberöhrchen 1 mm voneinander entfernt liegen, wieder auf 6 mm Entfernung voneinander gebracht werden, wobei keine erkennbare gegenseitige Vermischung infoige von Kapillarkräften auftritt.

Zur Fraktionierung der in dem zentrifugierten Proberöhrchen enthaltenen Flüssigkeitssäule mit unterschiedlicher Dichte wird eine Flüssigkeit, welche dichter ist als die Schicht mit der größten Dichte, durch eine in den Boden des Proberöhrchens eingestochene Hohlnadel mit Hilfe einer Infusionspumpe eingebracht (z B. für Cäsiumsalz-Gradienten 1,1,2,2-Tetrabromäthan). Um das Eindringen von Luftblasen, die die einzelnen Fraktionen vermischen wurden, zu vermeiden, werden sowohl die von der Infusionspumpe zur Hohlnadel führende Schlauchleitung als auch die Nadel selbst vorher mit der Infusionsflüssigkeit gefüllt.

Zur Fraktionierung einer 5-ml-Probe z. B. werden. wie es die Praxis ergab, vorteilhafterweise 0,3 ml Tetrabromäthan/Minute in das Proberöhrrhen gepumpt. Die Probe wird dabei ohne auftretende Turbulenzen nach oben in den Trichter geschoben. Die Fraktionierung eines 5-ml-Gradienten dauert 16 Minuten; in einer Stunde lassen sich bequem 3 Proberöhrchen, inklusive Reinigung des Gerätes, fraktionieren. Die die Fraktionen entnehmende Hohlnadel ist mit einer peristaltischen Pumpe verbunden, die die Fraktionen abpumpt.

Es gibt zwei Verfahren, um die Flüssigkeitssäule mit unterschiedlicher Dichte, die in das Trichterrohr 22 hineingepumpt wurde, zu fraktionieren:

Beispiel 1

Die Hohlnadel wird zunächst auf ein bestimmtes Niveau im Trichterrohr eingestellt und wird auf diesem Niveau während der Fraktionierung gehalten. Wenn die peristaltische Pumpe das gleiche Flüssigkeitsvolumen abpumpt, welches mit der Infusionspumpe einge-

drückt wird, ergibt sich eine kontinuierliche Entleerung des Proberöhrchens. Die Fraktionen werden am Ende ».!er Leitung der pcristallischen Pumpe getrennt. Diese Art der Fraktionierung gleicht jenen, die auch mit herkömmlichen Geraten möglich sind. Beispiel 2

Die Flüssigkeitssäule mit unterschiedlicher Dichte wird fraktioniert, indem man Hje oberste Flüssigkcits-

schicht im Trichter diskontinuierlich entfernt, ohne sie mit den nachfolgenden Schichten zu vermischen. Die Hohlnadel bleibt während der Fraktionierung nicht fixiert. Sie wird mittels der Spindel derart in Kontakt mit der Oberfläche der Flüssigkeitssäule gebracht, daß nur die oberste Schicht abgesaugt wird. Nach einer bestimmten Zeitdauer, die dem Fraktionsvolumen entspricht (= Volumen eines fraktionierten Einzelvolumens), wird die Hohlnadel von der Oberfläche abgehoben und Luft in die Hohlnadel eingesaugt. Nach einem kurzen Zeitintervall wird die Hohlnadel wieder auf die Oberfläche aufgesetzt. Während der Fraktionierung wird die Geschwindigkeit der peristaltischen Pumpe konstant gehalten. Die Infusionspumpe pumpt die Flüssigkeit mit einer solchen Geschwindigkeit aufwärts, daß ihre Oberfläche im Trichter in den Intervallen, in denen Luft durch die Hohlnadel angesaugt wird, das Ursprungsniveau erreicht. Durch diese Methode v/erden Fraktionen erzielt, die durch einen Luftzwischenraum vollkommen voneinander getrennt sind. Eine Vermischung wird selbst dann vermieden, wenn die Fraktionen über lange Entfernungen und/oder durch Spcktralphotomeier geführt werden. Wegen der kurzen Zeitintervalle können die Zeitsignale- für das Absenken und Abheben der Hohlnadel" in einem herkömmlichen Tonbandgerät vorteilhaft gespeichert werden, das /u Beginn der Fraktionierung eingeschaltet wird. Auf diese Weise ist eine einzige Person in der Lage, die Fraktionierung durchzuführen; auf die AbIesung von Zeitintervallcn an Uhren kann somit verzichtet werden. Ein elektrisch gesteuerter Antrieb, der die I lohlnadel automatisch nach frei wählbaren Zcitintcrvallen senkt und hebt, kann an das Gerät mittels Kupplung angeschlossen werden.

ίο Das Gerät hat sich in der Praxis gut bewährt. So wurden mit ihm Proben von 5 bis einschließlich 30 ml fraktioniert. Für 30-ml-Röhrchen wird ein größerer Trichter benötigt.

Zum Herstellen einer Flüssigkeitssäule mit unter-

!5 schiedlicher Dichte kann auch wie folgt verfahren werden:

Die Flüssigkeit wird von oben durch die Hohlnadel in das Proberöhrchen eingefüllt derart, daß an unterster Stelle im Proberöhrchen die dichteste Schicht eingefüllt wird, und danach weitere Flüssigkeiten in der Reihenfolge abnehmender Dichte übereinandergeschichtet werden, wobei die Hohlnadel der Einfüllgeschwindigkcit entsprechend angehoben wird. Bei diesem Füllvorgang ist die Hohlnadel an eine geeignete Pumpe angeschlossen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

1. sitzen. Die

   Patentansprüche:

   ί. Verfahren zum Fraktionieren von Flüssigkeitssäule:*, mit unterschiedlicher Dichte nach der Zentrifugation, dadurch, gekennzeichnet, daß die Fraktionen aus einem Proberöhrchen (24) in ein Trichterrohr (22) gefördert und diesem diskontinuierlich durch Absaugung bei Aufwärtsbewegung der Flüssigkeitssäule in der Reihenfolge ihrer Dichte entnommen werden und daß die erzeugten Fraktionen durch ein Luftpolster voneinander getrennt einem oder mehreren Sammelgefäßen zugeführt werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch geker, . zeichnet, daß eine dichtere Flüssigkeit aus einem Meßbehälter von unten in das Proberöhrchen (24) eingefüllt wird.
3. 3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß bei Flüssigkeiten, die nach der Zentrifugalion eine bekannte Dichteverteilung aufweisen, ein Steuergerät selbsttätig die für das Fraktionieren erforderlichen Verfahrensschritte Absenken und Heben der Hohlnadel (21) innerhalb des Trichterrohres (22) so durchführt, daß diese stets mit dem Flüssigkeitsspiegel in Kontakt steht.
4. 4. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Absauggeschwindigkeit im Veriauf der Fraktionierung zunimmt.
5. 5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 4 mit einer Halterung für ein eine zentrifugierte Flüssigkeit enthaltendes Proberöhrchen, einem über dem Proberöhrchen angeordneten Trichterrohr mit daran anschließbarer Abführleitung, die zu einem Fraktionssammler führt, dadurch gekennzeichnet, daß in dem Trichterrohr (22) eine Hohlnadel (21) verschiebbar angeordnet ist, die im Bereich ihrer dem Proberöhrchen (24) zugekehrten Mündung radiale, auf ihrem Umfang mit Abstand voneinander angeordnete Kanäle aufweist und mit einer Pumpe zum Absaugen der einzelnen Fraktionen verbunden ist.
6. 6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Absaugung der Fraktionen eine peristaltische Pumpe vorgesehen ist.