DE2302567A1

DE2302567A1 - 3-substituierte rifamycine, verfahren zur herstellung derselben und ihre verwendung

Info

Publication number: DE2302567A1
Application number: DE2302567A
Authority: DE
Inventors: Renato Cricchio; Giancarlo Lancini
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1972-02-23
Filing date: 1973-01-19
Publication date: 1973-08-30
Also published as: IE38686B1; CH555331A; NL7301278A; LU67066A1; AT320858B; FR2181755B1; AU5253373A; ZA73302B; HU164928B; AR194871A1; SU465008A3; DK134486C; IL41370A0; GB1366283A; SE380020B; FR2181755A1; DK134486B; PH10548A; AU467732B2; US3862934A

Description

RECHTSANWÄLTE

DR. JUR. Di?L.-CHEM. WALTER BEIl ALFRtÜ iiO:^=.::··!

DR. JUR. -i.·. "■'■·· H.-J. V.'OLFF DR. JUH. Ηλ..:- :-..λ L^L

623 FRAHKrUiiT AM MAiN-HOCHSl

18. Jan. 1973

Unsere Nr. 18 385

Gruppo Lepetit S.p.A. Mailand / Italien

3-Substituierte Rifamycine, Verfahren zur Herstellung derselben und ihre Verwendung

Gegenstand der Erfindung sind 3-substituierte Rifamycine der allgemeinen Formel I

-R

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in der R ein Wasserstoffatom oder einen Phenylrest, R₁ einen Phenyl- oder einen p-Carboxyphenylrest bedeuten und R und R₁ zusammen mit dem benachbarten Kohlenstoffatom einen Cycloalkylxdenrest darstellen können, sowie deren 25-Desacetyl- und 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivate.

Der Ausdruck "Cycloalkylxdenrest" umfaßt cycloaliphatische Reste, die von Ringen mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen abgeleitet sind.

Die vorliegend verwendeten Ausdrücke "Cycloalkylrest" und "Cycloalkylxdenrest" umfassen auch Reste, die von aliphatischen Spiranen abgeleitet sind. Selbstverständlich können die cycloaliphatisch^! Ringe ein oder mehrere Doppelbindungen und ein oder mehrere Substituenten, wie Hydroxy-, Carboxy-, Amino- oder Di-nied.-alkylamino-, niedere Alkyl-, Hydroxy-nied.-alkyl-, Amino-nied.-alkyl-, niedere Alkylamino-nied.-alkyl- oder Di-nied.-alkylamino-nied.-alkylreste enthalten.

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen werden durch Umsetzung von 3-Formylrifamycin oder seinem 25-Desacetyl- oder Hexahydroderivat mit einem Hydrazin der allgemeinen Formel

H₀N-N=C II

2 \p

in der R und R₁ die vorstehend genannte Bedeutung besitzen, hergestellt.:.

Die Reaktion wird im allgemeinen bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei eine Lösung des als Ausgangsstoff verwendeten 3-Formylrifamycins in einem organischen inerten Lösungsmittel mit einer äquimolaren Menge des Hydrazins der Formel II versetzt wird. Die Reaktion ist im allgemeinen innerhalb von 10 Minuten bis 4-5 Stunden beendet. In einigen Fällen, in denen die Reaktionsgeschwindigkeit sehr niedrig ist, kann es angebracht sein_s das Reaktionsgemisch zu erhitzen. Um das Endprodukt zu gewinnen, was dem Fachmann

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keine besonderen Schwierigkeiten bereitet, wird das Reaktionslösungsmittel abgedampft und das Rohmaterial durch Kristallisation und/oder Säulenchromatographie gereinigt.

Die als Ausgangstoffe verwendeten Hydrazine werden nach bekannten Verfahren hergestellt, wobei ein gewähltes Carbonylderivat der allgemeinen Formel

O=C

in der R und R₁ die vorstehend genannten Bedeutungen besitzen, mit einer äquimolaren Menge des Hydrazins in einem inerten organischen Lösungsmittel erhitzt wird.

Es liegt auf der Hand, daß durch Auswahl der geeigneten Carbony!verbindungen die Herstellung einer großen Reihe von Hydrazinen der Formel II möglich ist, die sich wiederum mit den 3-Formylrifamycinderivaten zu den entsprechenden Endverbindungen der Formel I leicht umsetzen lassen.

Beispielsweise lassen sich die nachstehend genannten Carbonylverbindungen in das entsprechende Hydrazon und dann in Verbindungen der Formel I, in denen die gleichen Reste R und R. vorhanden sind, überführen.

/^R Carbony!verbindungen der Formel: 0=C_v

Cyclopentanon
Cyclohexanon
(±) Menthon
(-) Menthon
(ί) Campfer
(+) Campfer
Carvon
Pulegon

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Isopulegon

Cy c lohexan- Μ·-οη-1- carbonsäure

2-Butyl-3-methyl-2-cyclohexenon

2-(2-Dimethylaminoäthy1)-cyclohexanon Cyclohexan-3-on-1-essigsäure

Cycloheptanon

4,4-Dimethylcycloheptanon

3,5,5-Trimethylcycloheptanon

Cyclooctan-2-on-l-propionsäure

Cyclodecanon

Spiro-[5,5]-undecan-l-on

Spiro-[6,73~tetradecan-8-on

Die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen sind gefärbte Feststoffe, die aus üblichen organischen Lösungsmitteln, wie niederen Alkanolen, Äthylacetat, Dioxan, Tetrahydrofuran, Benzol und »Chlorkohlenwasserstoffen, kristallisiert werden können. Ihre Löslichkeit in den organischen Lösungsmitteln hängt offensichtlich von der Art und dem Ausmaß der Reste R und R₁ ab. Wenn saure Funktionen vorhanden sind, sind die Verbindungen als Alkalimetallsalze auch in Wasser löslich.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen eine gute antibakterielle Wirksamkeit gegenüber Gram-positiven und Gramnegativen Bakterien. Insbesondere weist die neue Klasse der Verbindungen eine bemerkenswerte Wirksamkeit gegenüber Staphylococcus aureus-Stämmen auf. In diesem Fall beträgt die Mindesthemmkonzentration etwa 0,001 bis -etwa 0,05 Mg/ml.

Die Verbindungen sind in Konzentrationen von 1 bis 50 Mg/ml auch gegenüber Staphylococcus aureus-Stämmen, die gegenüber anderen bekannten Rifamycinen resistent sind, wirksam. Die Toxizität der neuen Verbindungen ist sehr gering.

Eine weitere sehr wichtige Eigenschaft der erfindungsgemäßen Verbindungen ist ihre Hemmwirkung auf DNA-Polymerasen , die für Lymphoblasten aus menschlichem leukämischen Blut charakteristisch sind, und gegen typische Nucleotidyl-3 0 9835/1162

Transferasen (Polymerasen) von Viren, die von der normalen Zelle nicht verwendet werden können. Aus Untersuchungen an repräsentativen Gliedern von Virusgruppen ist bekannt, daß sie als wesentlichen Teil ihrer Reproduktion Polymerasen in die Wirtszellen tragen oder in ihnen erzeugen. So gibt es Viren, wie z. B. Picornaviren oder Polioviren, die RNS-abhängige RNS-Polymerase erzeugen, während andere Gruppen, wie z. B. Leukämie-Sarkom-Viren eine RNS-abhängige DNS-Polymerase tragen. Die Gegenwart und die außerordentlich wichtige Rolle der RNS-abhängigen DNS-Polymerase (reverse Transcrxptase) bei Tumor bildenden RNS-Viren wurde von D. Baltimore» Nature, Bd. 226,S.1209 (1970) und von H. M. Temin u. Mitarbeiter, Nature, Bd. 226, S. 1211 (19 70) entdeckt.. Die kürzliche Entdeckung von RNS-abhängigem DNS-Polymerase-Enzym in RNS-Tumarviren in Tierarten wurde auch von anderen Autoren bestätigt, wie.z.'B. aus den nachstehend aufgeführten Literaturstellen hervorgeht: Green u. Mitarbeiter, "Mechanism of carcinogenesis by RNA tumor viruses, I. An RNA-dependent DNA-PοIymerase in murine sarcoma viruses"(Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Bd. 67, S. 385 - 39 3, 1970).- Spiegelman u. Mitarbeiter, "Characterization of the products of RNA directed DNA-polymerase in oncogenic RNA viruses" (Nature, London, Bd. 227, S. 563,1970).- Hatanaka u. Mitarbeiter, "DNA polymerase activity associated with RNA tumor viruses" (Proc. Nat, Acad. Sex. USA, Bd. 67, S. 143, 1970).- Scolnick u. Mitarbeiter, "DNA synthesis by RNA containing tumor viruses" (Proc. Nat. Acad. Sex. USA, Bd. 67, S. 1031+,■ 1970).

Das ■ Vorliegen von RNS-Viren in einigen Tumoren wird auch durch andere Fakten bestätigt:reverseTranscriptase wurde in Teilchen der Milch von Frauen mit bekannter Brustkrebsanamnese und von solchen Frauen, in deren Familie Brustkrebs aufgetreten war, gefunden (Scholitlu. Mitarbeiter, Bd. 231, S. 97, 1971), während Priori u. Mitarbeiter (Nature New Biology, Bd. 232, S. 16, 1971) ein als ESP bezeichnetes, reverse Transcrxptase enthaltendes Virus aus Zellen der Pleuralflüssigkeit eines Kindes mit Lymphom isolierten und es erfolgreich auf fiewebekulturen züchteten.

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Das Vorliegen von RNS-Homologen bei menschlichem Brust- ' krebs zu Tumorvirus-RNS bei der Mamma der Maus wurde von R. Axel u. Mitarbeiter (Nature, Bd. 235, S. 32, 1972) durch Molekularhybridisationsversuche demonstriert. Die Möglich-, keit eines Virus beim menschlichen Brustkrebs wurde auch durch Elektronenmikroskopie menschlicher Milch gestützt (N. H. Sarkar u. Mitarbeiter, Nature, Bd. 236, S. 103, 1972). Auf RNS gerichtete DNS-Polymerasewirksamkeit und Virusähnliche Teilchen wurden auch aus menschlichen Rhabdomyosarkomzellen isoliert (McAllister u. Mitarbeiter, Nature, New. Biol.j Bd. 235, S. 3, 1972). Zur Zeit existieren keine sehr wirksamen Arzneimittel zur Behandlung von Viruserkrankungen, da die Stoffwechselerfordernisse für Viren und Zellen gleich sind. Der meistversprechende Weg zur Chemotherapie von Viruserkrankungen ist die Entwicklung geeigneter Chemikalien, die sich in spezifischer Weise mit Viruspolymerasen oder mit von Viren transformierten Zellpolymerasen, aber nicht mit den Polymerasen der Wirtszellen, die die genetische Information der Viren kontrollieren ,vereinigen. Spezifische Inhibitoren für Virus- oder durch Viren transformierte Zellenzyme und insbesondere Inhibitoren für Polymerasen von RNS-Tumorviren können eine bedeutende Rolle bei der Bereitstellung von Arzneimitteln zur Behandlung der Leukämie· und anderer Krebserkrankungen spielen. Die Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen wurde an RNS-abhängiger DNS-Polymerase des Muridae-Sarkom-Virus (endogen) und an der DNS-abhängigen DNS-Polymerase-Wirksamkeit gereinigter Enzyme untersucht. Die Hemmwirkung wurde gemäß den von C. Gurgo u. Mitarbeiter in Nature, New Biology, Bd. 229, S. Ill, 1971, beschriebenen Methoden getestet.

Die Wirkung der verschiedenen Arzneimittelkonzentrationen auf die Polymerasewirksamkeit wurde anschließend an die ³EHdTTP (tritiertes Thymindesoxyribosidtriphosphat) -Einverleibung in die unlösliche Fraktion bestimmt. Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben.

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D Isolierung des Virus und Reinigung der Viruspolyinerase

Der Virus wurde wie zuvor beschrieben (Green u. Mitarbeiter, Proc. Nat. Acad. Sei. USA¹, Bd. 67, S. 385, 393, 1970, Rokutanda u. Mitarbeiter, Nature, Bd. 227, S. 1026 - 1028, 1970) aus durch Muridae-Sarkom-Virus (Moloney-Isolat) veränderten Rattenzellen (7 8Al Zellen) und aus durch Muridae-Sarkom-Virus (Harvey-Isolat) veränderten Mäusezellen(MEH-Zellen) isoliert und gereinigt. Die Viruspolymerase wurde durch Inkubation des gereinigten Virus mit 0,5 % NP-40 (nonidet P-40) in 0,1 molarem NaCl, 0,01 molarem Tris-Puffer (pH 7,6), 0,001 molarem EDTA während 5 Minuten bei Raumtemperatur und durch Zonenzentrxfugation in von 15 auf 30 % ansteigender Saccharose in 10 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,4), 2,5 mM MgCl„, 10 mM Dithiothreit und 5 % Glyzerin während 24 Stunden bei 38 000 UpM in einem Spinco SW 41 Rotor 20- bis 40fach gereinigt. Die Spitzenfraktionen der Enzymwirksamkeit (13 - 17) der 22 gesammelten Fraktionen wurden vereinigt und bei -70 °C in 30 % Glyzerin aufbewahrt.

DNS-Polymerase-Bestimmung

Die Enzyminkubation wurde wie von Green u. Mitarbeiter in Proc. Nat. Acad. Sei., USA, Bd. 67, S. 385 - 393, 1970 beschrieben, eine Stunde bei 37 C in 100 Ml eines Reaktionsgemisches, das 40 mM Tris-Puffer (pH 8,0), 5 mM Dithiothreit, 30 mM NaCl, 2,5 mM MgCl₂, 0,1 mM dATP, dGTP, dCTP und 10 MCi ³H-dTTP (12 - 18 Ci/Millimol) enthielt", durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 μΐ In Perchlorsäure beendet. Als Träger wurde Kalbthymus-DNS (100 Mg) zugesetzt. Das radioaktive DNS-Produkt wurde wie in den beiden oben angegebenen Literaturstellen beschrieben aufgearbeitet. Die endogene RNS-abhängige DNS-Polymerasewirksamkeit wurde nach der Zugabe von 0,01 % NP-40 zu dem gereinigten Virus zum Zeitpunkt des Versuchs gemessen. Die DNS-Polymerasewirksamkeit der gereinigten Viruspolymerase wurde mit 2 Mg von Poly d(A-T) als Matrize und ohne NP-40 gemessen.

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Test zur Ermittlung der Henmwirkung von Rifamycinderivaten \ "

Rifamycinderivate wurden in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer Konzentration von 5 mg/ml gelöst und bei h ⁰C aufbewahrt. Die Hemmung der endogenen RNS-abhängigen DNS-Polymerasewirksamkeit wurde dadurch untersucht, daß man das Probegemisch mit 2 μΐ des in DMSO entsprechend verdünnten Derivats oder 2 μΐ DMSO (Kontrolle) versetzte, bevor man es dem aufgebrochenen Virus zusetzte, das 15 bis 30 Mg Virusprotein enthielt. Die Enzyminkubation wurde 60 Minuten lang bei 3? ⁰C durchgeführt. Die Hemmung des gereinigten Enzyms wurde durch Vorinkubation von 2 μΐ des Derivats oder von DMSO mit 30 μΐ Enzym (1 bis 2 μg Protein) während 10 Minuten bei 37 ⁰C untersucht; dann wurden 70 μΐ Substratgemisch zugesetzt, und das Gemisch wurde, wie oben beschrieben, weiterinkubiert und aufgearbeitet.

In repräsentativen Versuchen verringerten die erfindungsgemäßen Verbindungen in einer Konzentration von 2 - 100 Mg/ml oder weniger die Einverleibung von H -dTTP auf weniger als 10 %, als sie in den Kontrollversuchen festgestellt wurde, wobei die Hemmwirkung auf den Mechanismus der Carcinogenese durch RNS-Tumorviren nach den neuesten biochemischen Erkennt-

• *»

nissen klar gezeigt wurde.

Die Hemmwirkung der reversen Transkriptasen wurde auch, durch Versuche an Polymerase aus Muridae-Leukämie-Viren bestätigt. Muridae-Leukämie-Virus-RMS-abhängige DNS-Polymerase wurde wie von Gallo u. Mitarbeiter in Nature, New Biology, Bd. 232, S. 141 (1971) besenrieben aus mit Triton X 100 aufgebrochenen Viren hergestellt. Viren der beiden Arten Rauscher und Moloney wurden zuvor durch Bandenbildung im 1,16 g/ml-Bereich eines Saccharosedichtegradienten nach anfänglicher Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit zur Entfernung von Zellbruchstücken und Schichtenbildung auf SaccharoseÄbnzertn*icnsgradienten von 60 % bis 20 % gereinigt. Die Endkonzentration des Viruspräparats betrug 10¹¹ Teilchen/ml. Als Matrize wurde endogene 70S RNS verwendet. Es wurde festgestellt, daß Konzentrationen von 50 μg oder weniger das Enzym wirksam hemmten.

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Ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von Tumorzellpolymerasen menschlichen Ursprungs erzielt. In diesem Fall wurde die Heinmwirkung auch an Polymer as en normaler Zellen untersucht, um einen selektiven Effekt zu charakterisieren. Repräsentative Rifamyeinderivate der Formel I wurden auf ihre Wirkung auf zwei gereinigte DNS-Polymerasen untersucht, die (I) aus menschlichen normalen (PHA-stimulierten) Blutlymphocyten, (II) aus LymphoblastzeIlen (von einem normalen Spender) und (III) aus menschlichen leukämischen Blutlymphoblasten isoliert worden waren. Es wurden synthetische und/oder native Matrizen verwendet.

Ein typisches Beispiel für das experimentelle Verfahren ist nachstehend beschrieben:

Menschliche Blutlymphoblasten

Leukämische Lymphoblasten wurden aus dem peripheren Blut von Patienten mit akuter lymphocytischer Leukämie (ALL) durch Leukophorese isoliert. Die Zellen wurden gewaschen und die Erythrocyten durch hypotonische Auflösung entfernt. Normale Lymphocyten ■ wurden aus dem peripheren Blut von gesunden Spendern nach der Entfernung der Granulocyten durch Nylon-Säulenchromatographie erhalten. Sie wurden wie vorstehend beschrieben (Gallo u. Mitarbeiter, Nature, Bd. 228, S. 927, 1970; Gallo u. Mitarbeiter, Science, Bd. 165, S. UOO, 1968) 72 Stunden lang mit Phytohämagglutinin (PHA) behandelt, um ihre DNS-PoIymerasewirksamkeit zu verstärken.

Wegen des Problems, ausreichende Mengen dieser Zellen zu . erhalten, wurde zur Gewinnung weniger gereinigter DNS-Polymerasen für einige der anfänglichen Untersuchungen zur Gewinnung eines Überblicks eine menschliche "normale" Gewebezellkultur (1788) verwendet. Die interessierenden Verbindungen wurden dann an den stärker gereinigten Enzymen aus den normalen und leukämischen Blutlymphocyten genauer untersucht. Die Gewebezellkulturen wurden von der Associated Biomedic Systems, Inc. _y erhalten.

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DNS-Polymerasepräparte

DNS-Zellpolymerasen wurden aus normalen Blut- (PHA-stimulierten) -lymphocyten, leukämischen Blutlymphocyten und 17 88 Lymphoidzellen durch Homogenisierung in hypotonischer Pufferlösung und nachfolgende Behandlung mit Triton X 100 und/oder starke Salzextraktion des extralysosomalen Pellets, extrahiert und gereinigt. Nach der Differentialzentrifugation wurden die Zellextrakte durch Säulenchromatographie über DEAE-Cellulose, Phosphocellulose und Sephadex G 200 weitergereinigt.

Untersuchung der DNS-Polymerase

Die Untersuchung der DNS-Polymerase wurde in einem Endvolumen von 100 μΐ durchgeführt. Das untersuchte Gemisch enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,3, 6,0 mM MgAc, 8.0 mM Dithiothreit und 60 mM NaCl. Die Einstellung des pH-Wertes wurde nach der Zugabe der zuvor in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelösten Inhibitoren durchgeführt. Die Endkonzentration an DMSO betrug 0,5 %, und alle Kontrollproben enthielten diese Menge an DMSO. Im Versuch wurde eine Enzymkonzentration verwendet, die die Einverleibung von etwa 1,0 pMol/Std. katalysiert. Das Enzym war in den meisten Fällen 5 Minuten lang mit dem Inhibitor vorinkubiert worden. Die Umsetzung wurde dann durch Zugabe von entweder synthetischer DNS (Poly d (AT) Miles Lab.) und DNS-.RNS-Hybrid (Oligo dT. poly rA), 5 Mg/ml, oder nativer Matrize : aktivierte Salm-Sperma-DNS, 50 μg/ml, und endogene 70S Virus-RNS; 10 MCi (³H-MethyI)-TTP (New England-Nuclear, 18,6 mCi/μΜοΙ» lyophilisiert und erneut gelöst in 0,01 m HCl unmittelbar vor der Anwendung) und dATP (8 χ 10"⁵M, mit synthetischer Matrize) oder allen drei Desoxynucleosid-triphosphaten (8 χ 10.*" M mit RNS oder DNS als Matrize) eingeleitet. Bei eingigen Versuchen wurde das Enzym nicht mit dem Inhibitor vorinkubiert.

In diesen Fällen wurden die Reaktionen durch kugroe des Enzyms zu dem vollständigen, den Inhibitor enthaltenden Reaktionsgemisch eingeleitet. Zu Beginn der Inkubation und nach 30 Minuten wurden Proben entnommen, die Vorgänge

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in ihnen durch Zugabe von 2 ml 0,08 m Hatrxumpyrophosphat unterbrochen, und anschließend wurden diese Proben in 12,5 %iger kalter Trichloressigsäure (TCS) mit Hefe-RNS (HOO Mg) als Träger ausgefällt. Die Produkte wurden auf einem Millxporenfilter gesammelt, gründlich mit 5 %iger Trichloressigsäure und 1 ml DMSO-Äthanol-0,1 m NaCl (0,5 : 70 : 29,5) gewaschen, getrocknet und in 2 ml BBS„ (Beckman). und 10 ml Liquifluor (New England Nuclear) in einem Packard-Flüssigkeits-Szintillationszähler gezählt. Es wurde gefunden, daß Konzentrationen von 5 bis 20 pg/ml bei einer synthetischen DNS-Matrize eine 50 %ige Hemmung der Leukämie-Polymerase bewirken. Bei einer synthetischen RNS-Matrize (Poly rA.rU) war die Reaktion sogar noch empfindlicher. Repräsentative Untersuchungen, die mit einer nativen Matrize an Polymerase von normalen und Tumorzellen durchgeführt wurden, ergaben eine höhere Empfindlichkeit der Tumorenzyme gegenüber den untersuchten Verbindungen. Andere biologische Eigenschaften der neuen Rifamycinderivate sind die Hemmung der Fokusbildung bei Zellen der Maus, der Ratte und des Menschen durch den Moloney- und Kirsten-Stamm des Muridae-Sarkom-Virus, die selektive -Hemmung der Viruserzeugung durch bereits veränderte Maus- und menschliche Zellen, die Auffindung sich zurückbildender Zellen unter Verwendung der durch Muridae-Sarkom-Viren veränderten nichtproduzierenden Maus- und Rattenzellsysteme. Die erfindungsgemäßen Hydrazonverbindungen haben sich außerdem als selektiv toxisch für durch Viren veränderte Zellen von Mäusen, Ratten und Menschen erwiesen, wenn sie auf ihre Kolonie-bildende Fähigkeit untersucht wurden.

In Versuchen zur Ermittlung der Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen, die Fokusbildung durch Moloney-Sarkom-Viren bei BALB/3T3-Gewebekulturen zu hemmen, wird das folgende Verfahren angewandt:

BALB/3T3-Zellkulturen werden in 250 ml-Kunststoffflaschen in einem Wachstumsmedium gezüchtet, das aus Eagle's minimalem essentiellen Medium mit 10 % fötalem Rinderserura besteht. Mit einem Coulter-Zähler werden nach der Suspendierung der Zellen mit Trypsin-EDTA und dem Verdünnen mit Wachs-

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tumsmedium Zellzählungen durchgeführt. Als Tumorhomogenat wird Moloney-Muridae-Sarkom-Virus verwendet. Man unterwirft es. viermal einer Zellpassage in Mausembryozellen der Schweizer ■Rasse mit hoher Passagezahl und untersucht es auf Fokusbildende Einheiten in den BALB/3T3-Zellen. Bei der Durchführung der Untersuchungen wird eine Modifizierung der von Hartley und Rowe, Proc. Nat. Acad. Sei.,Bd. 55, S. 780 (1966) beschriebenen Methode angewandt. Im vorliegenden Fall werden Flaschen mit 1 - 2 χ 10 Zellen in 25 ml des Wachstumsmediums geimpft und 24 Stunden lang bei 37 ⁰C inkubiert. Nach Entfernung der Flüssigkeiten wird das Virus mit einer vorbestimmten Anzahl von Fokus-bildenden Einheiten in 0,5 ml des Wachstumsmediums eingeführt. Dann läßt man es 90 Minuten lang bei 37 ⁰C an der Monosehicht der Zellen adsorbieren. Nach dieser Adsorbtionsperiode wird eine vorbestimmte Menge, gewöhnlich etwa 5 bis 10 Mg/ml einer Hydrazon-Rifamycinverbindung (die zuvor in Dimethylsulfoxid in einer Konzentration von 1 mg/ml gelöst worden war.) in 25 ml des Wachstumsraediums gebracht, und die Kulturen werden in den Inkubator zurückgebracht. Als Kontrolle wird Dimethylsulfoxid allein im Wachsturnsmedium zu einer getrennten Kultur zugesetzt. Nach 3tägiger Inkubation sind die Kultur.en flüssig-verändert und die Poki der veränderten _ Zellen werden am 7· Tag gezählt.

Auf die gleiche Weise wird das Bläschenstomatitis-Virus, New Jersey Serotyp, untersucht. Methoden zur Vermehrung und Untersuchung dieses Virus wurden von Hackett u. Mitarbeiter in Virology, Bd. 31, S. 114 (196 7) beschrieben.

Diese Eigenschaften zeigen, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen eine Hemmwirkung auf durch Viren hervorgerufene Tumoren bei Tieren besitzen.

Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

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Beispiel 1 ■

3-(2-Cyclooctylidenhydrazono)-methyl-rifamycin-SV

Eine Menge von 1,3 g Cyclooctanon wurde in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 0,5 g 9 8 %igem Hydrazinhydrat versetzt. Die Lösung wurde eine Stunde lang unter Rückfluß erhitzt, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum abgedampft, wobei 0,90 g eines öligen Rückstands, nämlich rohes Cyclooctylidenhydrazin, erhalten wurden. Dieses Rohprodukt wurde zu 4,5 g 3-Formy!rifamycin, das in 300 ml Tetrahydrofuran gelöst war, zugesetzt. Nach 15 Minuten wurde die Lösung zur Trockene eingedampft, und der feste Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt, wobei als Elutionsmittel Chloroform und anschließend Chloroform/Methanol-Gemische, die bis zu 1,5 % Methanol enthielten, verwandt wurden.

Der nach der Säulenchromatographie gewonnene Feststoff wurde zweimal aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 1,5 g; Schmelzpunkt; 252 - 256 ⁰C (Zers.).

Analyse

Berechnet für ^C4₆ ^H ₆₁ ^N3^O ₁₂ ^{: C} 65,15, H 7,25, N 4,95 Gefunden : C 64,95, II 7,22, N 5,10

J max ^SO 333 260 Schulter bei 505

_E 1 % 166 280 326
1 cm

Beispiel 2 3-(2-Benzylidenhydrazono)-methyl-rifamycin-SV

Eine Menge von 750 mg 3-Formy!rifamycin-SV in 10 ml Tetrahydrofuran wurden unter Rühren bei Raumtemperatur 150 mg Benzylidenhydrazin zugesetzt. Die Reaktion war nach 20 Minuten abgeschlossen. Das Gemisch wurde zur Trockene eingedampft, und der rohe Feststoff wurde aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute: 500 mg; Schmelzpunkt: 203 - 214 ⁰C (Zers.).

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Analyse

C 65,28, H 6,45, N 5,08 C 64,98, H 6,69, N 5,11

Berechnet	für C₁	l5^H5 3^N3	O₁₂:
Gefunden			•
	500	345	310
_Pl % ^hl cm	170,9	346	341
Beispiel	3

3-(2~Benzhydrylidenhydrazono)-methyl-rifamycin-SV

Die Verbindung wurde nach dem gleichen Verfahren wie in Beispiel 2 aus 7,5 g 3-Formylrifamycin-SV und 2 g Benzhydrylidenhydrazin in 100 ml Tetrahydrofuran hergestellt. Die Reaktion war nach 1 Stunde abgeschlossen. Ausbeute: 6,1 g; Schmelzpunkt: 260 °C (Zers.).

Analyse

Berechnet ft^lr" C₅₁H₅₇N₃O₁₂ : C 67,75, H 6,35, N 4,65 Gefunden ' : C 66,82, H 6,39, N 4,85

max ^5:L0 S50

ρ 1 un 1 y 7 R 7

^hl cm I4ü,i 2/8,/

Beispiel 4

3-L2~(p-Carboxybenzyliden)-hydrazono j-methyl-rifamycin-SV

Die Verbindung wurde im wesentlichen nach dem gleichen Verfahren wie in dem vorstehenden Beispiel hergestellt, wobei anstelle von Benzhydrylidenhydrazin eine äquimolare Menge (p-Carboxybenzyliden)-hydrazin verwendet wurde. Ausbeute: 55 %\ Schmelzpunkt: 205 - 215 °C (Zers.).

Analyse

Berechnet für C₁₊₆ H₅₃N₃O₁₁₊: C 63,36, H 6_}ί3-, Ν 4,82 Gefunden : C 62,04, H 6,25, N 5,00

^{313 50}°

V iino

^{1 Om} ' 309835/1162

Claims

Patentansprüche
\aJ 3-substituierte Rifamycine der allgemeinen Formel

in der R ein Wasserstoffatom oder einen Phenylrest, R₁ einen Phenyl- oder einen p-Carboxyphenylrest bedeuten und R und R₁ zusammen mit dem benachbarten Kohlenstoffatom einen Cycloalkylidenrest darstellen können, sowie deren 25-Desacetyl- und 16,17,18,19,2 8,29-Hexahydroderivate.
2. Verfahren zur Herstellung von 3-substituierten Rifamycinen und deren 25-Desacetyl- und 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivaten nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man 3-Formyl-rifamycin-SV oder dessen 25-Desacetyl- oder 16,17,18,19,28,29-Hexahydroderivate mit einem Hydrazin der allgemeinen Formel

H₂N-N=C

in der R und R₁ die in Anspruch 1 genannte Bedeutung besitzen, umsetzt.

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3. Therapeutische Zubereitung, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine oder mehrere Verbindungen nach Anspruch 1 sowie übliche Substanzen enthält.

Für

Gruppo Lepetit S.p.A,

Mailand/ Italien

(Dr. H. J. V/olff) Re ch t s anw alt

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