DE2252815C3

DE2252815C3 - Verfahren zur Herstellung von !.-Asparaginsäure auf fermentativem Wege

Info

Publication number: DE2252815C3
Application number: DE19722252815
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Osaka; Tosa Tetsuya Kyoto; Sato Tadashi Takatsuki Osaka; Chibata (Japan)
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1971-10-28
Filing date: 1972-10-27
Publication date: 1977-03-24

Description

In »Chem. Abstracts, 73, 86574 (1970)« und »Chem. Die Reaktion wird bei Temperaturen von 10 bis 5O⁰C Abstracts, 72, 129359 (1970)« werden Methoden be- und vorzugsweise von 20 bis 4O⁰C durchgeführt, schrieben, denen nicht mehr die vorstehenden Nach- Die Reaktion kann innerhalb von 10 bis 60 Minuten teile anhaften. So geht man beispielsweise bei dem 65 zu Ende geführt werden. Beispiele für Aspartat-Verfahren gemäß »Chem. Abstracts, 73, 86574 (1970)« ammoniak-lyase bildende Mikroorganismen, die zur so vor, daß man die Aspartat-ammoniak-lyase an ein Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens Anionenaustauscher-Polysaccharid-Adsorptionsmittel eingesetzt werden können, sind folgende: Escherichia

³ 4

coli ATCC J1303, Pseudomonas aeruginosa OUT Kaliumfumarat und einem organischen Ammonium-

⁸²⁵^t 5S^^fl!cr^^aif?^eÄ^S» ο ■ ' ^{ProlcUR Vlllearis salz cnthält}· ^mit einer geeigneten Geschwindigkeit

OUT 8226 (FERM-P 526), Bacterium succinium IAM leitet. Als Ablauf wird eine wäßrige Lösung erhalten,

1017 oder Alcaligenes faccalis OUT 8030. Diese die L-Asparaginsäure enthält. Der Ablauf wird mit

Stämme stellen lediglich Beispiele dar. Die Erfindung 5 konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von

ist nicht auf den Einsatz dieser spezifischen Mikro- 2,8 bis 3,0 eingestellt. Auf diese Weise kann man

Organismen beschränkt, vielmehr können alle Aspar- L-Asparaginsaure in Form eines kristallinen Nieder-

tat-ammoniak-lyase bildenden Mikroorganismen ein- schlags erhalten. Bei der Durchführung der enzy-

gesetzt werden. Durch die durchgeführte Polymerisa- malischen Reaktion hängen die Umwandlungsge-

tionsreaktion werden die Mikroorganismen eng in 10 schwindigkciten von AmmoniumrumaratzuL-Aspara-

das Gitter des Polymeren eingefügt, wodurch über ginsäure hauptsächlich von der enzymatischen Wir-

I .age Zeitspannen hinweg eine hohe enzymatische kung der unbeweglich gemachten Mikroorganismen,

Aktivität erreicht wird. der Temperatur und der Reaktionszeit ab. Wird die

L-Asparaginsäurc wird in der Weise hergestellt, Säulcnmethode angewendet, dann können die oplidaß der unbeweglich gemachte Mikroorganismus mit i_S malen Reaktionsbedingungen zur vollständigen Um-(Ammoniumfumarat oder einem Gemisch aus einem Wandlung des Ammoniumfumarats zu L-Asparaginancrganischen Ammoniumsalz und Fumarsäure oder säure durch eine Einregulierung der FließgeschwindigiNalriumfumarat oder Kaliumfumarat bei 25 bis 45'C keil der Substratlösung eingestellt werden,
und einem pH-Wert von 7 bis 9 in Berührung Die erfindungsgemäß eingesetzten unbeweglich gegebracht wird. Beispiele für anorganische Ammo- ₂₀ machten Mikroorganismen behalten insbesondere in niumsalze sind Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat Gegenwart von zweiwertigen Metallionen einen hohen und Ammoniumphosphat. Beim Einsatz eines Gemi- enzymatischen Aktivitätswert bei. Außerdem ist durch sches aus Fumarsäure oder Natriumfumarat oder die lang andauernde enzymatische Aktivität der unbe-Kaliumfumarat und einem anorganischen Ammo- weglich gemachten Mikroorganismen eine wiederholte niumsalz liegt der bevorzugte Anteil des anorga- 25 Verwendung derselben möglich,
nischen Ammoniumsalzes in dem Gemisch zwischen Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. 1,5 und 2 Mol pro Mol Fumarsäure oder deren Unter »Niedrigalkylen« sind Alkylengruppen mit 1 bis Salz. Die Zugabe eines zweiwertigen Metallions zu 5 Kohlenstoffatomen zu verstehen,
der Lösung, in welcher die enzymatische Reaktion . .
,durchgeführt wird, bedingt einen hohen enzymatischen 30 Beispiel 1
Aktivitätswert der unbeweglich gemachten Mikro- 4,8 g der Mikrobenzellen von Escherichia coli ,Organismen während der Reaktion. Bei der Durch- ATCC 11203 werden in 48 ml einer physiologischen !führung der enzymatischen Reaktion in Gegenwart Kochsalzlösung suspendiert. Zu dieser Suspension von zweiwertigen Metallionen ist die enzymatische werden 9 g Acrylamid, 480 mg Ν,Ν'-Methylenbis-Wirkung d~·· unbeweglich gemachten Mikroorganis- 35 (acrylamid), 6 ml 5%ige Lösung von /?-(Dimethylmen selbst nach einem aufeinanderfolgenden Gebrauch amino)-propionitril und 6 ml 2,5%ige Lösung von ν ährend einer Zeitspanne von 1 Monat nicht wesent- .Kaliumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspenlich vermindert. Beispiele für geeignete zweiwertige sion 10 Minuten bei 37°C stehengelassen. Auf diese Metallionen sind Calcium-, Magnesium-, Mangan(ll)- Weise werden 120 ml einer unbeweglich gemachten und Strontiumionen. Bevorzugte Konzentrationen 40 Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303 der zweiwertigen Metallionen in der Reaktions- erhalten,
lösung liegen zwischen 0,1 und 10 mMoI/1. 120 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von

Die Konzentration des eingesetzten Substrats ist Escherichia coli ATCC 11303 werden in eine Säule

nicht kritisch. Dies bedeutet, daß Ammoniumfumarat mit Abmessungen von 2,1 cm χ 34,8 cm gegeben. In

oder ein Gemisch aus Fumarsäure oder Natrium- 45 900 ml Wasser werden 150 g Ammoniumfumarat

oder Kaliumfurmarat mit einem anorganischen Am- aufgelöst. Die wäßrige Lösung wird auf einen pH-Wert

moniumsalz in Wasser in jeder beliebigen Konzentra- von 8,5 mit wäßrigem Ammoniak eingestellt und mit

tion aufgelöst werden können. Der pH-Wert der Wasser auf ein Gesamtvolumen von 11 verdünnt.

Lösung wird dann auf 7 bis 9 eingestellt. Die unbe- Hierauf wird die wäßrige Lösung kontinuierlich durch

weglich gemachten Mikroorganismen werden in die 50 die Kolonne mit 37^JC bei einer Fließgeschwin-

Lösung eingetaucht, worauf das Gemisch bei Tem- digkeit von 20 ml/Stunde geleitet. Der Abstrom wird

peraturen von 25 bis 45⁰C unter Rühren über einen mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert

ausreichenden Zeitraum inkubiert wird, um die von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag

Reaktion zu beenden. Nach beendeter Reaktion wird wird durch Filtration gesammelt und mit Methanol

das Gemisch abfiltriert oder zentrifugiert, um die 55 gewaschen. Auf diese Weise werden 126,3 g (94,8%

unbeweglich gemachten Mikroorganismen für den der Theorie^L-Asparaginsäure erhalten,

nachfolgenden Gebrauch zu gewinnen. Aus dem («)" + 24,8° (C = 2, 6 NHCl).

Filtrat oder der überstehenden Flüssigkeit wird die Diesen Drehwert weist auch die gemäß Beispiel 4, 5, L-Asparaginsäure gewonnen. Die erfindungsgemäße 6, 7, 10, 11 und 12 isolierte L-Asparaginsäure auf.

enzymatische Reaktion kann wahlweise auch als 60 B i oi 1 2

Säulenverfahren durchgeführt werden, das die Durch- ^p

führung der Reaktion auf kontinuierliche Weise Nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 wird eine

ermöglicht. Man kann beispielsweise in der Weise unbeweglich gemachte Zubereitung von Escherichia

vorgehen, daß man den unbeweglich gemachten coli ATCC 11303 hergestellt. 50 ml der unbeweglich

Mikroorganismus in eine Säule einfüllt und durch die 65 gemachten Zubereitung werden in eine Säule mit

Säule bei 30 bis 45°C eine wäßrige Lösung mit einem Abmessungen von 2,1 cm χ 14,5 cm gegeben. Durch pH-Wert von 8 bis 9, die Diammoniumfumarat oder die Säule wird eine 1 M wäßrige Ammoniumfumaratein Gemisch aus Fumarsäure oder Natrium- oder Lösung (pH 8,5) kontinuierlich mit 37^CC und den in

C-.

der Tabelle I angegebenen Fließgeschwindigkeiten geleitet,

Die Konzentration der L Asparaginsäure im Abßtrom wird biologisch bestimmt, wozu Leuconostoc mcsentenoides P-60 als empfindlicher Mikroorganismus verwendet wird, Daraus wird das Umwandlungsverhältnis von Ammoniumfumarat zu L-Asparapinsiiure berechnet, Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt,

Tabelle I

Fliüßgcschwindigkcit	ο e i sp	Umwancllungs-
	vcrhilHnis zu
	L-Asparaginsäure
(ml/h)	%
25	45
12,5	92
6,5	100
3,5	100
iel 3

50 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ^TCC 11303, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden :r Jne Säule mit Abmessungen von =2,1 cm x 14,5 cm gegeben. Durch die Säule wird kontinuierlich eine 1 M wäßrige Ammoniumfumarat-Lösung (pH 8.5) mit 37⁰C bei den in Tabelle II angegebenen Fließgeschwindigkeiten geleitet. Zu bestimmten Zeitpunkten wird die Konzentration von L-Asparaginsäure in dem Abstrom nach der Methode des Beispiels 2 bestimmt. Daraus wird das Umwandlungs^fverhältnis von Ammoniumfumarat zu L-Asparaginsäure ei rechnet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

Unter Zugrundelegung derselben Methode wurden auch die in den Tabellen III bis XII aufgeführten Zahlenwerte bestimmt.

Tabelle II

Umwandlungsverhältnis von Ammoniumfumarat zu L-Asparagirtsäure (%)

Betriebszeit (Tage)	Fließgeschwindigkeit	6,5 ml/h
	25 ml/h	100
3	45	100
6	46	100
9	44	100
12	47	ioo
15	45	100
18	46	100
21	46	100
24	45	100
11	46	100
30	45

Tabelle TIT

Reaktionszeit

(h)

Urniwnndlungs·
verhältnis m
!.»Aspiiraginsilure

55

Beispiel 4

Eine wäßrige Lösung von 112,5 g Ammoniumfumarat in 450 ml Wasser wird mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml verdünnt. 60 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303, hergestellt gemäß Beispiel 1, werden in die wäßrige Lösung eingegeben. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitraum bei 37°C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

3	15
5
10	82
24	IOO

Nach 24stündigem Rühren wird das Gemisch filtriert, Das Filtrat wird mit konzentrierter Schwcfel- »5 säure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt, Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und sodann mit Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 89,7 g (90,6% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.
20

Beispiel 5

2,4 g der Mikrobenzellen vom Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 4,5 g Acrylamid, 240 mg N,N'-Me'hy!enbis(acrylamid), 3 ml 5%ige Lösung von /?-(Dimethvlaminn)-propionitril und 3 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 10 Minuten bei 37°C stehengelassen. Auf diese Weise werden 60 ml der unbeweglich gemachten 7ub ^itnne von Pseudomonas aeruginosa OUT 8257 erhalten.

60 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von

Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 werden in eine Säule mit Abmessungen von 2,1 cm χ 17,4 cm gegeben. Durch die Säule werden 500 ml einer 1 M wäßrigen Ammoniumfumarat-ILösung (pH 8,5) mit 37°C mit einer Fließgeschwitidigkeit von 10 ml/h geleitet.

Der Abstrom wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und mit Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 6,31 g (95,4% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.

Bei spie I 6

2,4 g der Mikrobenzellen von Serratia marcescens OUT 8259 werden in der Weise des Beispiels 5 behandelt. Es werden 60 mil einer unbeweglich gemachten Zubereitung von Serratia marcescens OUT 8259 erhalten. Ein Gemisch von 60 ml der unbeweglich gemachten Zuereitung, 58 g Fumarsäure und 37,1 g Ammoniurnchlorid wird zu 450 ml Wasser gegeben. Das Gemisch wird mit einer wäßrigen 1 N-Natriumhydroxidlösung auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und sodann mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 500 ml verdünnt. Das Gemiscfi wird 24 Stunden bei 37⁰C gerührt. Es wird sodann filtriert. Das Filtrat wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf ein?n pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der feristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und mit Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 62,9 g (95,2%) L-Asparaginsäure erhalten.

Bei spi e ] 7

Escherichia co!· ATCC11303 wird in 11 eines Mediums (pH 7,0) inokulier', welches 3% Ammoniumfumarat (Gewicht/Volumen), 0,2% Dikalium-

45

phosphat (Gewicht/Volumen), 0,05% Magnesiumsulfat · 7H₂O (Gewicht/Volumen), 4% Maisquellflüssigkeit (Gewicht/Volumen) und 0,05% Calciumcarbonat (Gewicht/Volumen) enthält. Das Nährmedium wird 20 Stunden bei 37°C unter Schütteln kultiviert. Nach der Kultivierung werden die Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC11303 durch Zentrifugieren gesammelt. Die Mikrobenzellen werden in 40 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 7,5 g Acrylamid, 0,4 g N,N'-Methylenbis(acrylamid), 5 ml 5%ige Lösung von /S-(Dimethylamino)-propionitril und 5 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 10 Minuten bei 37⁰C stehengelassen. Auf diese Weise werden 110 ml der unbeweglich gemachten Zubereitungen von Escherichia coli ATCC11303 erhalten.

110 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 werden in eine Säule mit Abmessungen von 2 cm x 35 cm gegeben. In 1,81 Wasser werden 300 g Ammoniumfumarat und 0,4 g Mangan(II)-chlorid · 4 H₂O aufgelöst. Die wäßrige Lösung wird mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 21 verdünnt. Sodann wird die wäßrige Lösung kontinuierlich durch die Säule mit einer Fließgeschwindigkeit von 55 ml/h geleitet. Der Abstrom wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und sodann mit kaltem Wasser und Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 252,9 g (94,8% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.

Beispiel 8

50 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303, hergestellt gemäß Beispiel 7, werden in eine Säule mit Abmessungen von 2 cm χ 16 cm gegeben. Durch die Säule wird kontinuierlich eine wäßrige Lösung (pH 8,5), welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und die in Tabelle IV angegebenen Metallionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält, bei 37° C und einer Fließgeschwindigkeit von 30 ml/h geleitet. Nach der Methode des Beispiels 2 wird die Konzentration von L-Asparaginsäure in dem nach einem bestimmten Zeitraum erhaltenen Abstrom bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV

Umwandlungsverhältnis von Ammoniumfumarat zu L-Asparaginsäure (%)

Betriebs	Zugegebene Mctallionen	Sr++	Ohne
zeit	Ca++ Mg++ Mn++		Zugabe von
			Metall
(Tage)		ionen

3	100	100	100	100	100
10	100	100	100	100	100
20	100	100	100	100	100
30	100	100	100	100	90
40	100	100	100	95	76
50	95	96	100	—.	40
60			90	₁ .	27

Beispiel 9

50 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303, hergestellt 'gemäß Beispiel 7, werden in eine Säule mit Abmessungen von 2 cm χ 16 cm gegeben. Durch' die Säule wird eine wäßrige Lösung (pH 8*5), welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration vor* Γ Mol/l und Mangan(II)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält, kontinuierlich bei 37⁰C mit den in Tabelle V angegebenen Fließgeschwindigkeiten geleitet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V	55
	60
Fließgeschwindigkeit Urawandlungs- verhiltnis zu L-Asparagin· (ml/h) »äure(%)	81
90	100
60	100
40	Beispiel 10
30
25

Eine wäßrige Lösung von 150 g Ammoniumfumarat und 0,2 g Mangan(II)-chlorid · 4 Η₈Ο in 900 ml Wässer wird mit wäßrigem Ammoniak auf einen pH-Wert von 8,5 eingestellt und sodann mit Wasser zu einem Gesamtvolumen von 11 verdünnt. 100 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303, hergestellt gemäß Beispiel 7, wird zu der wäßrigen Lösung gegeben. Das Gemisch wird einen bestimmten Zeitraum bei 37° C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammen* gestellt.

Tabelle VI

Reaktionszeit	Umwandlungs	30
	verhältnis zu	64
	!^-Asparagin	86
	säure (%)	100
3
5
8
10

Nach lOstündigem Rühren wird das Gemisch filtriert. Das Filtrat wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und sodann mit kaltem Wasser und Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 126,4 g (94,8% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.

Beispiel 11

Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 wird in 11 eines Mediums (pH 7,0) iokuliert, welches 3% Na-G5 triumfumarat (Gewicht/Volumen), 2% Ammoniumsulfat (Gewicht/Volumen), 0,2% Pepton (Gewicht/ Volumen) und 0,5% Hefeextrakt (Gewicht/Volumen) enthält. Das Medium wird Unter Schütteln 20 Stunden

709812/240

ίο

bei 37⁰C kultiviert. Nach der Kultivierung werden die Mikrobenzellen von Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 durch Zentrifugierung gesammelt. Die Mikrobenzellen werden in 48 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 9 g Acrylamid, 0,48 g N,N'-Methylenbis(acrylamid), 6 ml 5 %ige Lösung von /?-(Dimethylamino)-propionitril und 6 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat gegeben. Sodann wird die Lösung bei 37°C 10 Minuten lang stehengelassen. Auf diese Weise to werden 120 ml unbeweglich gemachte Zubereitung von Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 erhalten.

120 ml unbeweglich gemachte Zubereitung von Pseudomonas aeruginosa OUT 8252 werden in eine Säule mit Abmessungen von 2 cm x 38 cm gegeben. Durch die Säule wird 1 1 einer wäßrigen Lösung (pH 8,5), weiche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol und Mangan(H)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol enthält, kontinuierlich bei 37°C und einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/h »o geleitet.

Der Abstrom wird mit konzentrierter Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtration gesammelt und sodann mit kaltem Wasser und as Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 126,0 g (94,6% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.

30 Minuten bei 37°C stehengelassen. Auf diese Weise werden 60 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303 erhalten.

60 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303 werden zu 500 ml einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und Mangan(II)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol/l enthält. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitraum bei 37°C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VH zusammengestellt.

Tabelle VII

Reaktionszeit	Umwsndlungs-
	vcrhältnis zu
	L-Asparagin
(h)	säure (%)

5	57
8	80
10	100

Beispiel 14

2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC 11303 werden in 24 ml physiologischer Kocbsalz-

. , lösung suspendiert. Zu der Suspension werd<;:» 4,5 g

Beispiel 12 Acrylamid, 240 mg N,N' - Propytenbisiacrylamid),

Serratia marcescens OUT 8259 wird in 11 eines 30 3 ml 5%ige Lösung von /?-(Dimethylamino)-propio-Mediums (pH 7,0) inokuliert, welches 3% Natrium- nitril und 3 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat fumarat (Gewicht/Volumen), 2% Ammoniumsulfat (Gewicht/Volumen), 0,2% Pepton (Gewicht/Volumen) und 0,5% Hefeextrakt (Gewicht/Vojumen) enthält.

35

45

Das Gemisch wird unter Schütteln 20 Stunden bei 37^ C kultiviert. Nach der Kultivierung werden die Mikrobenzelien von Serratia niarccscens OUT 8259 durch Zentrifugation gesammelt. Die Mikrobenzellen werden in 32 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 6 g Acrylamid, 0,32 g N.N'-Methylenbis(acrylamid), 4 ml 5%ige Lösung von £-(Dimethylamino)-propionitril und 4 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 10 Minuten bei 37°C stehengelassen. Auf diese Weise werden 100 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Serratia marcescens OUT 8259 erhalten.

100 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Serratia marcescens OUT 8259 werden zu 11 einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, weiche ; 160 g Natriumfumarat, 4,2 g Ammoniumchlorid und iO,2g Mangan(II)-chlorid · 4 H,O enthält. Das Gelmisch wird 24 Stunden bei 37° C gerührt. Das Gemisch }wir<i filtriert. Das Filtrat wird mit konzentrierter !Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,8 bis 3,0 !eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird durch 'Filtration gesammelt und mit kaltem Wasser und ^Methanol gewaschen. Auf diese Weise werden 126,4 g (94,8% der Theorie) L-Asparaginsäure erhalten.

"}- Beispiel 13

2,4 g der Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC11303 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 4,5 g Acrylamid, 240 rag N,N'-Methyknbis(acryl amid), 3 ml 5%ige Lösung von /J-(DimethyIamino)- gegeben. Sodann wird die Suspension 30 Minuten bei 37°C stehengelassen, Auf diese Weise werden 57 ml einer unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC 11303 erhalten.

57 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 werdan zu 500 mi einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, weiche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 4= 1 Mol/i und Mangin(ii)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol/l enthält. Das Gemisch wird einen bestimmten Zeitraum bei 37°C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle Viii zusammengestellt.

Tabelle VIII	Umwandlungs
Reaktionszeit	verhältnis zu
	L-Ajparagin-
	säure(%)
(h)	35
5	64
8	89
10	100
15

Beispiel 15

2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC ea 11303 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension Werden 4,5 g Acrylamid, 240 mg Bis(acrylamidomethyl) - äther 3 ml 5%ige Lösung von /5-(Dimethylamino)-piOpiotu'tril und 3 ml 2,5%ige Lösung von Kaliumpersulfat gegeben. Sodann' wird die Lösung 30 Minuten bei

„ _ . . . stehengelassen. Auf diese Weise Werden 52 ml

propionitril und 3 ml 2,5%ige Lösung von Kalium- unbeweglich gemachte Zubereitung von'EscherichJ» persulfat gegeben. Sodann wird die Suspension coli ATCC11303 erhalten.

22 524815

52 ml unbeweglich gemachte Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 werden zu 500 ml einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, weiche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und Mangan(II)-ionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitraum bei 37° C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt.

Tabelle IX	Bei	Umwandlungs- verhältnis zu L-Aspatagin säure (%)
Reaktionszeit (h)		30
5	61
8	82
10	100
15	spiel 16

0,2 ml 2,5%ige Lösung von Ammoniumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 60 Minuten bei 37°C stehengelassen. Auf diese Weise werden 42 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 erhalten.

42 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia colt ATCC11303 werden zu 500 ml einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von ίο 1 Mol/l und Mangan(ll)-ionen in einer Konzentration von l mMol/1 enthält. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitrau··! bei 37°C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle Xi zusammengestellt.

2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC as 11303 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 60 mg N,N'-Methylenbis(acrylamid), 1,8 ml 0,112 %ige Lösung von Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin und 0,2 mi 2,5%ige Lösung von Ammoniumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 60 Minuten bei 37°C stehengelassen. Auf diese Weise werden 36 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 erhalten.

36 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coil ATCC11303 werden zu 500 ml einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und Mangan(II)-ionen in einer Konzentration von 1 mMoi/i enthält. Das Gemisch wird über 4s einen bestimmten Zeitraum bei 37° C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengestellt.

45

50

Tabelle X	Umwandlungs- vsrhältnlszu L-Asparagln- säure(%)
Reaktionszeit (h)	19
5	47
8	76
10	92
15	100
20

SS

Beispiel 17

2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC 11303 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 60 mg N.N'-Propylehbi^acfylämid), 1,8 ml Öill2%ige Lötung von N.N.N'.N'-Tetramethyläthylcndiamin und

Tabelle XI	Umwandlungs verhältnis zu L-Aspara gin säure (%)	eispie 1 18
Reaktionszeit (h)	14
5	23
8	47
10	71
15	89
20	100
25
B

2,4 g Mikrobenzellen von Escherichia coli ATCC 11303 werden in 24 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 60 mg Bis(acrylamidomethyl)-äther, 1,8 ml 0,112%ige Lösung von Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethylälhylendiamin und 0,2 m! 2,5%ige Lösung von Ammoniumpersulfat gegeben. Sodann wird die Suspension 60 Minuten bei 37⁰C stehengelassen. Auf diese Weise werden 35 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia tali ATCC11303 erhalten.

35 ml der unbeweglich gemachten Zubereitung von Escherichia coli ATCC11303 werden zu 500 ml einer wäßrigen Lösung (pH 8,5) gegeben, welche Ammoniumfumarat in einer Konzentration von 1 Mol/l und Mangan(U>ionen in einer Konzentration von 1 mMol/1 enthält. Das Gemisch wird über einen bestimmten Zeitraum bei 37° C gerührt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle XII zusammengestellt.

TabelleXH Reaktionszeit

(h)

Umwandlungsverhältni» zu LrAtparagin- »8ure(%)

5	17
8	27
10	55
15 , j	84
20	100

'■<>*■

Claims

'κ.

Patemansprüche: bindet, um einen im wesentlichen unlöslichen Korn-

_a 1. Verfahren zur Herstellung von L-Asparagin- plex zu bilden, worauf man Ammoniumfumarat mit 'säure auf fermentativem Wege unter Verwendung dem erhaltenen Aspartat-ammonmk-lyase-Komplcx eines Aspartat-ammoniak-iyasc bildenden Mikro- zur Umsetzung bringt. Bei der Durchführung des in Organismus in Gegenwart von Fumarsäure oder 5 »Chem. Abstracts, 72, 129359 (1970)« beschriebenen ,eines Salzes davon, dadurch gekenn- Verfahrens wird L-Asparaginsäurc in der Weise zeichnet, daß man Acrylamid, Ν,Ν'-Niedrig- hergestellt, daß man N,N'-Methylen-bis(acrylamid) ■■··? . alkylen-bis-(acrylamid) und/oder Bis-acrylamido- in einer wäßrigen Aspartat-ammoniak-Iyase-Lösung ','■ methyl)-äther in einer wäßrigen Suspension des polymerisiert und die erhaltene wasserunlösliche

Aspartat-ammoniak-lyase bildenden Mikroorga- io Aspartat-ammoniak-Iyase-Zubereitung mit Ammc-ninismus in Gegenwart eines Polymerisationsinitia- umfumarat einer enzymatischen Reaktion unterzieht, tors und eines Polymerisätfonsbeschleunjgers bei. .» >Diesem Verfahren haftet der Nachteil an, daß, falls 10 bis 50⁰C polymerisiert, Wodurch der Äspartat-* '"' der Einsatz einer aus einem Aspartat-ammoniak-lyase ammoniak-lyase bildende Mikroorganismus unbe- bildenden Mikroorganismus extrahierten Aspartat-_B,. weglich gemacht wird, und anschließend Am- 15 ammoniak-lyase erforderlich ist, in unvermeidlicher

H moniumfumarat oder ein Gemisch aus einem Weise eine Denaturierung des Enzyms und/oder ein

W, anorganischen Ammoniumsalz und Fumarsäure erheblicher Verlust der enzymatischen Aktivität wäh-

p oder Natriumfumarat oder Kaliumfumarat bei rend der Extraktion und der Konzentration des

gf 25 bis 45⁰C und bei einem pH-Wert von 7 bis 9 Extrakts erfolgt.

||, einer enzymatischen Reaktion an dem unbeweg- ao Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, die

Sf lieh gemachten, Aspartat-ammoniak-lyase bilden- Nachteile der vorstehend bechriebenen Verfahren

! den Mikroorganismus unterwirft. zu beseitigen. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß

P 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- bei einem Verfahren zur Herstellung von L-Asparagin-

zeichnet, daß man die enzymatische Reaktion in säure auf fermentativem Wegt unter Verwendung

t Gegenwart von 0,1 bis 10 mMol/1 eines zweiwer- 45 eines Aspartat-ammoniak-lyase bildenden Mikro-

tigen Metallions durchführt. Organismus in Gegenwart von Fumarsäure oder eines

ff Salzes davon dadurch gelöst, daß man Acrylamid,

f N.N'-Niedrigalkylen-bis-iacryiamid) und/oder Bis-

§ Aspartat-ammoniak-lyase besitzt die Fähigkeit, (acrylamidomethyl)-äther in einer wäßrigen Suspen-

^!f Ammoniumfumarat in L-Asparaginsäure umzuwan- 3° sion des Aspartat-ammoniak-lyase bildenden Mikro-

i. dein. Es sind bereits verschiedene Methoden be- Organismus in Gegenwart eines Polymerisationsinitia-

§ kannt, durch welche L-Asparaginsäire durch snzy- tors und eines Polymerisationsbeschleunigers bei 10 bis

X matische Reaktion mit Aspartat-ammoniak-lyase her- 5O⁰C polymerisiert, wodurch der Aspartat-ammoniak-

] gestellt wird. So kann beispielsweise L-Asparaginsäure lyase bildende Mikroorganismus unbeweglich gemacht

durch Züchten von Aspartat-ammoniak-lysase bil- 35 wird, und anschließend Ammoniumfumarat oder ein

denden Mikroorganismen in einem Nährmedium Gemisch aus einem anorganischen Ammoniumsalz und

hergestellt werden, das Fumarsäure und Ammoniak Fumarsäure oder Natriumfumarat oder Kaliumenthält (vgl. die US-PS 3214 345). Nach einem fumarat bei 25 bis 45⁰C und bei einem pH-Wert von ; anderen Verfahren kann man L-Asparaginsäure 7 bis 9 einer enzymatischen Reaktion an dem

■; erzeugen, indem man Aspartat-ammoniak-lyase aus 40 unbeweglich gemachten, A 5partat-an moniak-lyase bil-

einem Mikroorganismus extrahiert und das Enzym denden Mikroorganismus unterwirft,
mit Ammoniumfumarat umsetzt (vgl. »journal of Durch dieses Verfahren werden gegenüber den in

Agricultural Chemical Society of Japan«, Bd. 34, den vorstehend genannten »Chemical Abstracts«- S. 44 bis 48 [I960]). Referaten beschriebenen Verfahren folgende Vorteile

Diese Methoden sind jedoch für eine technische 45 erzielt:

Herstellung von L-Asparaginsäare nicht geeignet, da Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren unbe-

die auf diese Weise hergestellte L-Asparaginsäure mit weglich gemachten Mikroorganismen gestatten eine dem Enzym, mit groben Zellen, Nährquellen des wirksamere Ausnützung des Enzyms Aspartat-am-Mediums und/oder Protein verunreinigt ist. moniak-lyase (das in den Zellen der Aspartat-

Es sind daher zusätzliche Maßnahmen zur Besei- 50 ammoniak-lyase bildenden Mikroorganismen enthalten iigung des Enzyms und anderer Verunreinigungen ist) bei der enzymatischen Reaktion mit einem aus der L-Asparaginsäure erforderlich, um diese mit Fumarsäuresalz und behalten eine höhere Enzymhoher Reinheit herzustellen. Nachteilig ist ferner, aktivität über einen längeren Zeitraum hinweg, daß nach Beendigung der enzymatischen Reaktion Die erfindungsgemäße Polymerisationsreaktion wird die Reaktionslösung zum Sieden erhitzt und/oder SS in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines angesäuert wird, um das Enzym oder den Aspartat- Polymerisationsbeschleunigers durchgeführt. Als PoIyammoniak-lyase bildenden Mikroorganismus zu zer- merisationsinitiatoren kann man beispielsweise Kastören, wobei der erhaltene Niederschlag abfiltiert liumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B₂ oder wird. Dies bedeutet, daß man die Aspartat-ammoniak- Methylen-Blau verwenden. Beispiele für geeignete PoIylyase oder den Aspartat-ammoniak-lyase bildenden 60 merisationsbeschleuniger sind /J-(Dimethylamino)-pro-Mikroorganismus nur einmal verwenden kann. pionitril sowie N,N,N',NVTetramethyläthylendiamin.